專利名稱：：一種檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在侵染的水稻葉片組織中表達量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在侵染水稻葉片組織中表達量的方法，屬于植物保護領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：人們在研究基因表達時常采用RT-PCR、Northern原位雜交技術(shù)和基因微陣列(基因芯片)技術(shù)。RT-PCR只能定性而不能定量的檢測基因基因的表達情況。Y.Takano采用了Northern原位雜交技術(shù)研究稻瘟病菌侵染水稻過程中其基因表達的情況。但是這種方法適于少量基因的表達研究，并且至少需要5-10)ig的總RNA。只能從RNA圖像的灰度粗略估計基因上調(diào)或下調(diào)的倍數(shù)，靈敏度和精確度都不高，而且在病害發(fā)生初期不能對寄主中病原菌表達量小的基因進行定量檢測。Y.Takano和C.Y.Kim采用了基因芯片技術(shù)研究基因的表達。與Northern原位雜交技術(shù)相比，這種技術(shù)適用于大量基因的表達研究，靈敏度也較高，但存在有假陽性結(jié)果，有效性不夠，還需實時熒光定量PCR或Northern原位雜交驗證，也不能進行基因表達差異的準(zhǔn)確定量。由Magnaporthegrisea引起的稻瘟病是世界性分布、危害最重的病害之一。稻瘟病菌致病性和水稻對稻瘟病菌的抗性是一個十分復(fù)雜的互作過程。從稻瘟病菌孢子萌發(fā)、附著胞形成、侵入、定植以及在水稻細胞間擴展，到產(chǎn)孢后再侵染的每個步驟都有大量基因參與，而且各個基因在不同時間點的表達情況也各不相同。要明確效應(yīng)蛋白(包括致病蛋白和無毒蛋白)在致病過程中的作用，精確了解致病相關(guān)基因在致病過程中表達的時間和表達量的變化。就需要一種具有高度靈敏性、特異性和高精度性的檢測技術(shù)對其進行檢測。并且，目前尚未見利用實時熒光定量PCR檢測稻瘟病菌侵染水稻初期其基因表達情況方面的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有方法的不足，提供了一種定量檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在水稻葉片組織中表達的PCR檢測方法，能夠快速、準(zhǔn)確、定量地檢測出稻瘟病菌在水稻中侵染的情況，以及其致病相關(guān)基因在侵染過程中不同時間點的表達情況。本方法的技術(shù)方案為(1)液體培養(yǎng)稻瘟病菌并提取其菌絲體的總RNA，并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(2)將稻瘟病菌的孢子接種到水稻植株葉片上，并在接種后早期的不同時間段24h、48h、72h、96h和168h提取侵染組織的總RNA并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(3)選擇稻瘟病菌MG039S2.5肌動蛋白ac^基因作為內(nèi)參基因，并根據(jù)該基因和稻瘟病菌致病相關(guān)基因AfGSW74.7、MGS0"&7和MGS7斬0./的cDNA序列，按照實時熒光定量PCR引物原則設(shè)計特異性引物，引物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(4)實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系為采用SYBRGreenI嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR，PCR混合液總體積為20|il,包括iQSYBRGreenSupermix1(^1，正向引物(F)1^1，反向引物(R)1^1，cDNA模板或梯度稀釋成不同濃度的質(zhì)粒DNA5pl，滅菌雙蒸水3^1;(5)實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95'C預(yù)變性5min;95'C變性30s，6CTC退火30s，72i:延伸20s，共45個循環(huán)；72。C延伸10min;55。C-95t:緩慢升溫，產(chǎn)生熔點曲線；(6)各cDNA樣品分別以上述引物進行定量PCR反應(yīng)得到檢測樣本的PCR擴增循環(huán)數(shù)(Ct);并分別以看家基因actin及致病相關(guān)基因的Ct值計算致病相關(guān)基因相對表達水平；其計算公式為基因表達倍數(shù)二2—AAQ△△Ct=[Ct目的基因(未知樣品)一Ct內(nèi)參基因(未知樣品)]一[Ct目的基因(對照樣品)一Ct內(nèi)參基因(對照樣品)]對照樣品是任何被選做代表1倍目的基因表達量的樣品。通過上述步驟，檢測在稻瘟病菌接種水稻植株葉片后24h、48h、72h、96h禾P168h等時間段稻瘟病菌治病相關(guān)基因MaSW74.八MaSW3S.7和MG幼/斬0./的表達倍數(shù)。本方法是在對稻瘟病菌侵染水稻的初期的不同時間點，不同稻瘟病菌致病相關(guān)基因的表達情況進行了檢測研究，并對多種檢測方法進行比較的基礎(chǔ)上，發(fā)明了應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在侵染的水稻葉片組織中表達量的方法。由于實時熒光定量PCR技術(shù)可以在病原菌侵染寄主植物的初期就對寄主組織內(nèi)所要研究的病原菌致病相關(guān)基因進行檢測和精確的定量。而且其既可以定量DNA分子，還可以定量RNA分子，從而進一歩定量基因的表達量，并且DNA或RNA的需求量都相對較少，靈敏度較高；這便克服了在稻瘟病菌侵染水稻的初期，水稻葉片組織中含有的稻瘟病菌量較少，難以檢測的條件限制。該方法有效地提高了檢測稻瘟病菌在侵染水稻初期，致病相關(guān)基因的表達情況的準(zhǔn)確性和靈敏度，并且對基因的表達情況能夠進行量化，是一種檢測病原菌侵染寄主植物初期致病相關(guān)基因表達量的十分有效的方法；并且可以通過檢測水稻葉片組織中稻瘟病菌致病相關(guān)基因進行檢測，為及時采取防治措施奠下面用實施例子來進一步詳述發(fā)明。實施例一(1)液體培養(yǎng)稻瘟病菌并提取其菌絲體的總RNA，并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(2)將稻瘟病菌的孢子接種到水稻感病品種麗江新團黑谷葉片上，并在接種后早期的不同時間段提取侵染組織的總RNA并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(3)cDNA的合成每個總認(rèn)A樣品取2.5嗎，加入0.5嗎/plOligo(dT)2.5|il，10mMdNTP2.5fi1，無RNase的水定容至30pl，65°C水浴5min，迅速置于冰上冷卻，加5xFirst-StrandBuffer10pi，O.IMDTT(二硫蘇糖醇)5pl，40U/plRNA酶抑制劑2.5(il，42。C水浴2|imin，再加入SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶2.5pl，42。C水浴50min，7(TC水浴15min中止反應(yīng)；(4)選擇稻瘟病菌7^GU^S25肌動蛋白(fl"/")基因作為內(nèi)參基因，并根據(jù)該基因和稻瘟病菌致病相關(guān)基因i^GSY^74J的cDNA序列，按照實時熒光定量PCR弓I物原則設(shè)計特異性引物，引物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(5)實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系為采用SYBRGreenI嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR，PCR混合液總體積為20^1，包括iQSYBRGreenSupermixlOjil，正向引物(F)1^1，反向引物(R)l|il，cDNA模板或梯度稀釋成不同濃度的質(zhì)粒DNA5pl，滅菌雙蒸水3^1;(6)實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5min;95。C變性30s，60。C退火30s，72。C延伸20s，共45個循環(huán)；72。C延伸10min;55"C-95'C緩慢升溫，產(chǎn)生熔點曲線；(7)各cDNA樣品分別以上述引物進行定量PCR反應(yīng)得到檢測樣本的PCR擴增循環(huán)數(shù)(Ct)，見表l;并分別以看家基因及致病相關(guān)基因的Ct值計算致病相關(guān)基因相對表達水平；其計算公式為基因表達倍數(shù)二2—AAQ△ACt=[Ct目的基因(未知樣品)一Ct內(nèi)參基因(未知樣品)]一[Ct目的基因(對照樣品)一Ct內(nèi)參基因(對照樣品)]表1:稻瘟病菌致病相關(guān)基因MGW274J在接種后不同時間點檢測到的Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以稻瘟病菌在液體培養(yǎng)狀態(tài)下的基因的表達情況為對照，根據(jù)公式計算得到稻瘟病菌致病蛋白基因MGW274./在接種后24h、48h、72h、96h、168h水稻葉片組織中的表達情況，見表2。表2:稻瘟病菌致病相關(guān)基因MGW274/在接種后不同時間點的表達情況<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由上表可以看出稻瘟病菌致病相關(guān)基因MG5Y27《/在接種后24h、48h、72h、96h、168h水稻葉片組織中的表達情況并不相同，此基因的表達量表現(xiàn)為在接種后表現(xiàn)為先上調(diào)，后下調(diào)；在接種后48小時其表達量最大，為17.08倍；在接種后168小時表達量最小，為0.06倍，可見其檢測的靈敏度很高。實施例二(1)液體培養(yǎng)稻瘟病菌并提取其菌絲體的總RNA，并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(2)將稻瘟病菌的孢子接種到水稻感病品種麗江新團黑谷葉片上，并在接種后早期的不同時間段提取侵染組織的總RNA并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(3)cDNA的合成每個總RNA樣品取2.5嗎，加入0.5嗎/plOligo(dT)2.5pl，10mMdNTP2.5^1，無RNase的水定容至30(il，65°C水浴5min，迅速置于冰上冷卻，加5xFirst-StrandBuffer10pl，O.IMDTT(二硫蘇糖醇)5pl，40U/(ilRNA酶抑制劑2.5pl，42。C水浴2pmin，再加入SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶2.5fil，42。C水浴50min,7(TC水浴15min中止反(4)選擇稻瘟病菌MG039S25肌動蛋白(a"z'")基因作為內(nèi)參基因，并根據(jù)該基因和稻瘟病菌致病相關(guān)基因MG^W3S./的cDNA序列，按照實時熒光定量PCR引物原則設(shè)計特異性引物，引物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(5)實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系為采用SYBRGreenI嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR，PCR混合液總體積為20W，包括iQSYBRGreenSupermix10^1，正向引物(F)1^1，反向引物(R)1^1，cDNA模板或梯度稀釋成不同濃度的質(zhì)粒DNA5pl，滅菌雙蒸水3pl;(6)實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95r預(yù)變性5min;95。C變性30s，6(TC退火30s，72。C延伸20s，共45個循環(huán)；72。C延伸10min;55。C-95"C緩慢升溫，產(chǎn)生熔點曲線；(7)各cDNA樣品分別以上述引物進行定量PCR反應(yīng)得到檢測樣本的PCR擴增循環(huán)數(shù)(Ct)，見表3;表3:稻瘟病菌致病相關(guān)基因MGWWS」在接種后不同時間點檢測到的Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>分別以看家基因及致病相關(guān)基因的Ct值計算致病相關(guān)基因相對表達水平；其計算公式為基因表達倍數(shù)二2—AAQ△△Ct=[Ct目的基因(未知樣品)一Ct內(nèi)參基因(未知樣品)]一[Ct目的基因(對照樣品)一Ct內(nèi)參基因(對照樣品)]以稻瘟病菌在液體培養(yǎng)狀態(tài)下的基因的表達情況為對照，根據(jù)公式計算得到稻瘟病菌致病蛋白基因MGSW3S.7在接種后24h、48h、72h、96h、168h水稻葉片組織中的表達情況，見表4。表4:稻瘟病菌致病相關(guān)基因MG'WJ3S.7在接種后不同時間點的表達情況<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由上表可以看出稻瘟病菌致病蛋白基因在接種后24h、48h、72h、96h、168h水稻葉片組織中的表達情況并不相同，此基因的表達量表現(xiàn)為在接種后表現(xiàn)為先上調(diào)，后下調(diào)；在接種后48小時其表達量最大，平均為1984.87倍；在接種后168小時表達量最小，為7.75倍?？梢娖錂z測的靈敏度很高。實施例三(1)液體培養(yǎng)稻瘟病菌并提取其菌絲體的總RNA，并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(2)將稻瘟病菌的孢子接種到水稻感病品種麗江新團黑谷葉片上，并在接種后早期的不同時間段提取侵染組織的總RNA并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(3)cDNA的合成每個總RNA樣品取2.5嗎，加入0.5嗎/(ilOligo(dT)2.5ji1，10mMdNTP2.5^1,無RNase的水定容至30pl，65°C水浴5min，迅速置于冰上冷卻，力卩5xFirst-StrandBuffer10pl，O.IMDTT(二硫蘇糖醇)5pl，40U/plRNA酶抑制劑2.5pl，42。C水浴2pmin，再加入SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶2.5)il，42。C水浴50min，70。C水浴15min中止反應(yīng)；(4)選擇稻瘟病菌MG059S25肌動蛋白(flc"M)基因作為內(nèi)參基因，并根據(jù)該基因和稻瘟病菌致病相關(guān)基因A/GSW46a7的cDNA序列，按照實時熒光定量PCR引物原則設(shè)計特異性引物，引物如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(5)實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系為采用SYBRGreenI嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR，PCR混合液總體積為20^1，包括iQSYBRGreenSupermix10^1，正向引物(F)lpl，反向引物(R)1^1，cDNA模板或梯度稀釋成不同濃度的質(zhì)粒DNA5(al，滅菌雙蒸水3pl;(6)實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5min;95。C變性30s，60。C退火30s，72。C延伸20s，共45個循環(huán)；72。C延伸10min;55X:-95'C緩慢升溫，產(chǎn)生熔點曲線；(7)各cDNA樣品分別以上述引物進行定量PCR反應(yīng)得到檢測樣本的PCR擴增循環(huán)數(shù)(Ct)，見表5。表5:稻瘟病菌致病相關(guān)基因MGS0W60./在接種后不同時間點檢測到的Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>分別以看家基因及致病相關(guān)基因的ct值計算致病相關(guān)基因相對表達水平；其計算公式為基因表達倍數(shù)二2一AAQ△△Ct=[Ct目的基因(未知樣品)一Ct內(nèi)參基因(未知樣品)]一[Ct目的基因(對照樣品)一Ct內(nèi)參基因(對照樣品)]以稻瘟病菌在液體培養(yǎng)狀態(tài)下的基因的表達情況為對照，根據(jù)公式計算得到稻瘟病菌致病蛋白基因MGSWWOJ在接種后24h、48h、72h、96h、168h水稻葉片組織中的表達情況，見表6。表6:稻瘟病菌致病相關(guān)基因A/GS0/460J在接種后不同時間點的表達情況<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>由上表可以看出稻瘟病菌致病蛋白基因Ti/G5^/46a/在接種后24h、48h、72h、96h、168h水稻葉片組織中的表達情況并不相同，此基因的表達量表現(xiàn)為在接種后表現(xiàn)為先上調(diào)，后下調(diào)；在接種后48小時其表達量最大，為68552.80倍；在接種后168小時表達量最小，為229.57倍?？梢娖錂z測的靈敏度很高。權(quán)利要求1、一種檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在侵染的水稻葉片組織中表達量的方法，其步驟為(1)液體培養(yǎng)稻瘟病菌并提取其菌絲體的總RNA，并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；(2)將稻瘟病菌的孢子接種到水稻植株葉片上，并在接種后早期的不同時間段24h、48h、72h、96h和168h提取侵染組織的總RNA并將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；(3)選擇稻瘟病菌MG03982.5肌動蛋白actin基因作為內(nèi)參基因，并根據(jù)該基因和稻瘟病菌致病相關(guān)基因MGS0274.1、MGS0338.1和MGS1460.1的cDNA序列，按照實時熒光定量PCR引物原則設(shè)計特異性引物，引物如下引物編號引物序列(5′-3′)PCR產(chǎn)物長度MG03982.5(actin)FGTCGCTCTTGACTTTGAGCARATACCACCGCTCTCAAGACC109bpMGS0274.1FGATCCATGCGTCACAATCAGRGAGATGAATAACCGCGGACA117bpMGS0338.1FGTCAACGAGGCGCATCTACTRGCACTCGCCATTCTGGATCT123bpGS01460.1FGTGCCGCCTCAATATACGACRACCGCCTTGTGAGGACTTAG105bp(4)實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系為采用SYBRGreenI嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR，PCR混合液總體積為20μl，包括iQSYBRGreenSupermix10μl，正向引物(F)1μl，反向引物(R)1μl，cDNA模板或梯度稀釋成不同濃度的質(zhì)粒DNA5μl，滅菌雙蒸水3μl；(5)實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共45個循環(huán)；72℃延伸10min；55℃-95℃緩慢升溫，產(chǎn)生熔點曲線；(6)各cDNA樣品分別以上述引物進行定量PCR反應(yīng)得到檢測樣本的PCR擴增循環(huán)數(shù)(Ct)；并分別以看家基因及致病相關(guān)基因的Ct值計算致病相關(guān)基因相對表達水平；其計算公式為基因表達倍數(shù)＝2-△△Ct△△Ct＝[Ct目的基因(未知樣品)—Ct內(nèi)參基因(未知樣品)]—[Ct目的基因(對照樣品)—Ct內(nèi)參基因(對照樣品)]對照樣品是任何被選做代表1倍目的基因表達量的樣品。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在侵染的水稻葉片組織中表達量的方法，其特征是檢測稻瘟病菌治病相關(guān)基因MGW274./在水稻組織中的表達情況，采用權(quán)利要求1中的步驟檢測稻瘟病菌菌絲體中AfOS0274J基因的Ct值與該稻瘟病菌孢子接種到水稻植株葉片上后，其在稻瘟病菌侵染水稻的早期即在接種后的24h、48h、72h、96h和168h時間段a"/"基因和MG幼274J基因的Ct值，并計算基因MOSY^74/的表達倍數(shù)。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在侵染的水稻葉片組織中表達量的方法，其特征是檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在水稻組織中的表達情況，采用權(quán)利要求1中的步驟檢測稻瘟病菌菌絲體中ac^基因和A^OW33S./基因的Ct值與該稻瘟病菌孢子接種到水稻植株葉片上后，其在稻瘟病菌侵染水稻的早期即在接種后的24h、48h、72h、96h和168h時間段基因和基因的Ct值，并計算基因MGW3M./的表達倍數(shù)。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在侵染的水稻葉片組織中表達量的方法，其特征是檢測稻瘟病菌治病相關(guān)基因MGWWMJ在水稻組織中的表達情況，采用權(quán)利要求1中的步驟檢測稻瘟病菌菌絲體中的fl"/"基因和MGW/46a/基因的Ct值與該稻瘟病菌孢子接種到水稻植株葉片上后，其在稻瘟病菌侵染水稻的早期即在接種后的24h、48h、72h、96h和168h時間段ac""基因禾口MOSW德7基因的Ct值，并計算基因7krGW/4MJ的表達倍數(shù)。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測稻瘟病菌致病相關(guān)基因在侵染的水稻葉片組織中表達量的方法。本發(fā)明提供了一種檢測稻瘟病菌侵染水稻后不同時間點致病相關(guān)基因表達量的方法，該方法的技術(shù)方案是將稻瘟病菌孢子噴霧接種到水稻葉片上，取樣并提取總RNA，應(yīng)用SYBRGreenI嵌合熒光法對稻瘟病菌致病相關(guān)基因片段進行實時熒光定量PCR檢測，記錄待測樣品的C(t)值，根據(jù)公式計算其致病相關(guān)基因片段的表達量。采用本方法可快速準(zhǔn)確地檢測水稻接種稻瘟病菌早期不同時間段稻瘟病菌致病相關(guān)基因的表達量；分析不同致病相關(guān)基因在不同水稻品種中的表達量及其在接種后不同時間段的變化情況；分析稻瘟病菌致病相關(guān)基因的時空表達模式等。其檢測結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，有助于說明這些基因的功能。文檔編號C12Q1/68GK101418346SQ20081023364公開日2009年4月29日申請日期2008年11月25日優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日發(fā)明者于欽亮,林劉,孔垂思,悅張,朱有勇,華李,李成云,李進斌,靜楊,飛梁,王云月,源蘇申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)