專利名稱：禾谷鐮孢菌鑒定及其對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平確認的一管檢測法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是禾谷鐮孢菌鑒定及其是否對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性(即，中抗)水平確認一管(即， 在一個PCR反應管中)檢測法，屬于植物病原菌抗藥性亞群體的檢測方法，專用于檢測抗多菌靈 等苯并咪唑類殺菌劑的未谷鐮孢菌。
二背景技術：
小麥赤霉病是由禾谷鐮孢菌(Gibberella zeae,無性態(tài)Fusarium graminearum)引起的一種 世界性病害，嚴重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。長期以來采用苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的復 配劑進行化學防治。苯并咪唑類殺菌劑作為一類髙效、廣譜內(nèi)吸性殺菌劑在生產(chǎn)上應用，解決了保 護性殺菌劑的環(huán)境毒性問題，提高了人類控制該病害的能力。苯并咪唑類殺菌劑包括多菌靈、苯菌 靈、噻菌靈、甲基硫菌靈等。這些殺菌劑具有相同的抗菌譜和抗菌機制，它們也具有相同的抗藥性 機制，相互之間存在正交互抗藥性。由于這類藥劑的高度?；裕饔梦稽c單一，加上施用頻率高， 使用20年后許多植物病原真菌群體中就會出現(xiàn)抗藥性亞群體，使藥劑防治完全失去效果。對苯并咪
唑類藥劑的殺菌機制和抗藥性機制研究表明，藥劑主要是結(jié)合在病菌的e-微管蛋白上從而阻止細胞
的有絲分裂,達到抑制病菌生長的目的。己有的對幾種植物病原菌的分子生物學研究表明,病菌對苯 并咪唑類殺菌劑的抗藥性自然突變體主要是其P-微管蛋白196 202位氨基酸的改變,這些改變使該 蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象發(fā)生改變，從而阻止了藥劑與靶標結(jié)合，使病菌表現(xiàn)抗藥性。在人工誘變菌株中除 上述位點外還涉及其它一些位點,如165,257等的氨基酸變異。通過定點突變也確認了198和200位氨
基酸類型與抗感性密切相關。但是未谷鐮孢菌對多菌靈的抗藥性機制并非像其它絲狀真菌一樣由e
-微管蛋白198位等氨基酸突變所致。
早期檢測病原群體中抗藥性亞群體/抗藥性基因的頻率，及早實施抗藥性治理策略，是延緩抗藥 性亞群體的發(fā)展，防止抗藥性病害流行危害最有效的措施。傳統(tǒng)的檢測方法需要分離培養(yǎng)病原菌， 然后在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再根據(jù)藥劑對菌絲生長的效應鑒別抗藥性。這種對藥劑的敏感性測定方 法通常需要幾周時間，工作量大，測定樣本數(shù)量有限，難以早期發(fā)現(xiàn)抗藥性亞群體的存在，也不能 用于當年的抗藥性短期預測。在抗藥性機制研究基礎上，根據(jù)基因點突變的原理，應用核酸技術如 寡核苷酸一聚合酶鏈式反應(ASO-PCR技術)等檢測病原真菌對多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的抗藥 性，則能快速、準確檢測大量樣本，使在早期檢測低頻率的抗藥性基因成為可能。
三
發(fā)明內(nèi)容
3技術問題本發(fā)明的目的在于提供禾谷鐮孢菌鑒定及其是否對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平的一種 快速檢測方法。針對未谷鐮孢菌抗多菌靈的檢測基因設計特異性引物檢測，有時會因其他植物病原 菌與該基因非特異性結(jié)合而誤判?，F(xiàn)有研究中尚沒有在一個聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,簡稱PCR)體系中，同時評價待測樣品是否為未谷鐮孢菌及其是否對多菌靈產(chǎn)生中斷抗藥 性水平的方法。
技術方案提取的基因組DNA或病?？芍苯佑糜贏SO-PCR禾谷鐮孢菌對多菌靈中抗水平菌株的基 因檢測，其^-微管蛋白基因，長度為1713bp,相應的編碼/32-微管蛋白的447個氨基酸，檢測基因包 含中抗菌株A-微管蛋白基因編碼的第167位氨基酸的抗藥性突變位點Phe(TTT)密碼字突變?yōu)?Tyr(TAT)密碼字。編碼167位氨基酸的密碼子發(fā)生點突變導致對多菌靈的中等抗藥性水平，占田間突 變類型的99.5%。
(1) 設計特異性的引物檢測未谷鐮孢菌；
(2) 設計特異性的引物檢測對多菌靈中等抗性的引物；
(3) 在一個聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,簡稱PCR)體系中(即，在一個 PCR反應管中)，同時加入特異性檢測禾谷鐮孢菌種類和多菌靈抗藥性水平的兩對引物，在 同一個PCR反應程序控制下與待測樣品的核基因組結(jié)合，擴增，電泳檢測，可同時評價待 測樣品是否為禾谷鐮孢菌及其是否對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平。
有益效果本發(fā)明未谷鐮孢菌鑒定及其對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平確認一管檢測法，具有如下 優(yōu)點和積極效果
(1) 本發(fā)明是國際上首次報道在一個聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,簡稱 PCR)體系中，同時加入特異性檢測禾谷鐮孢菌(/^ ^"附§^附/蛇0^附，有性態(tài)6沾& ;//0
種類和多菌靈抗藥性水平的兩對引物，與待測樣品的核基因組結(jié)合，擴增，電泳檢 觀"可同時評價待測樣品是否為未谷鐮孢菌及其是否產(chǎn)生對多菌靈中等抗藥性水平，為今 后禾谷鐮孢菌的多菌靈抗藥性菌株檢測提供技術支撐。
(2) 目前國內(nèi)其他研究單位均采用菌絲生長法檢測禾谷鐮孢菌抗藥性，但該方法涉及采樣、分 離培養(yǎng)需要3d和室內(nèi)大量的藥劑敏感性測定實驗至少要6天，周期較長，工作繁瑣，費時 費力。
(3) 隨著殺菌劑抗藥性分子機制研究的深入，利用分子生物學技術的檢測方法快速、簡便、有 效地檢測殺菌劑抗性成為研究熱點。本發(fā)明從基因組的提取到ASO-PCR整個檢測過程只需 6h即可，且操作簡單易學。因此AS0-PCR技術使快速、簡便地檢測和監(jiān)測田間抗藥性菌株成為可能，且方法簡便便于基層工作人員掌握。這對及時了解抗藥性病原群體的發(fā)展動態(tài)， 及時、合理地指導科學用藥，有效治理抗藥性，以及降低成本和減少環(huán)境污染具有現(xiàn)實意 義。
(4)直接從田間采集回來的病穗用ASO-PCR檢測整個過程只需6h，檢測準確率達99%，達到對 多菌靈中等抗藥性菌株的快速、簡便、準確、靈敏的檢測。
五具體實施例方式
實施例l采用PCR方法對^鐮孢菌對多菌靈抗藥性中抗菌沐險測
擴增體系50nL中含dNTP0,2nM,上游引物和下游引物均為lnM， Taq (申能博彩生物技術有 限公司)2,5U，模板DNA100ng， 10 X buffer (IO^iM Tris-HCl， 50mM KC1) 5|uL，用d2H20補足 至50nL。擴增條件94°C 5min; 94°C 60s, 56°C 60s, 72'C 60s, 35次循環(huán)；72°C 15min。
通過設計特異性的探針上游引物MBCF(5' -TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3')下游引 物MBCR(5' -CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3')，對田間中抗菌株(Codon167 TTT— TAT) 進行了檢測(圖l)，該探針對中抗菌株具有很好的特異性。
實施例2對禾谷鐮孢菌特異性檢測的結(jié)果與分析
擴增體系50nL中含dNTP(X2nM,上游引物和下游引物均為lpM, Taq (申能博彩生物技術有 限公司)2.5U，模敵DNA100ng， 10 X buffer (10, Tris-HCl， 50mMKCl) 5pL，用d2H20補足至 50pL。擴增條件為94°C 5min; 94°C 45s， 56°C 45s， 72°C 45s， 35次循環(huán)；72°C 15min。
引物對FGa/FGb對禾谷鐮孢菌具有很強的特異性。將引物對FGa (5'-AGTCCAAAATGTCCCGATGC-3') /FGb (5，-GCTGGGACCTGAGAAGTA-3，)用于26種其他 不同菌種菌株后，均無條帶(圖2)。
實施例3采用一管法進行^鐮孢菌及其對多菌靈的敏感性的測試
50nL擴增體系中含上述兩對弓I物FGa/FGb和MBCR/MBCF使反應體系中弓I物濃度均為1 pM, dNTP 0.2pM, Taq (申能博彩生物技術有限公司)2.5U,模板DNA100 ng, 10Xbuffer (lO^M Tris-HCl, 50mMKCl)5nL，用d2H20補足至50nL。擴增條件為94°C 5min; 94°C 45s， 56°C 45s， 72°C 45s, 35次循環(huán)；72°C 15min。取5pLPCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖TBE膠上電泳，通過熒光成像系統(tǒng)觀察(圖 3)。
經(jīng)引物對FGa/FGb擴增后，模板NT-21、 NT-29均有明顯條帶(小的電泳條帶)，而水稻惡苗病 (G. fujikuroi)無條帶，說明NT-21、 NT-29均屬禾谷鐮孢菌，而水稻惡苗病(G. fujikuroi)非禾谷鐮孢菌。 經(jīng)引物對MBCR/MBCF擴增后，NT-29有明顯條帶，而NT-21無條帶(大的電泳條帶)，說明NT-21 對多菌靈抗藥性基因Codonl67存在突變，而NT-29無突變，但引物對MBCR/MBCF能夠與水稻惡 苗病(G.ftijikuroi)非特異性結(jié)合，出現(xiàn)條帶。因此表明，在一個PCR反應管及同一個控制程序下，引 物對FGa/FGb、 MBCR/MBCF可同時用于測試禾谷鐮孢菌及其對多菌靈的敏感性。
5附困說明
圖l 禾谷鐮孢菌對多菌靈抗藥性基因Codon"" (TTT— TAT)突變的檢測結(jié)果。泳道1 11為屮抗菌 株，12 17為敏感菌株。
圖2未谷鐮孢菌特異性檢測結(jié)果。
(引物對均為FGa/FGb,泳道1 27分別對應水稻惡苗病(G >/i')fcura/)、辣椒黑點病(C. ca;w/d)、小 麥全蝕病(G gra柳'w"var)、西瓜枯萎病(F oj^sporww)、柑桔干腐病(F mo",7!/ome)、棉花枯萎病(F ox"porwM)、番茄早疫病(A so/aw')、油菜菌核病(S. sc/eTOrion n)、番茄灰霉病(5. cz'werea、梨 腐爛病(C. cflA^o^ema)、蘋果斑點落葉病(P附aZ/)、青菜黑斑病04 6ra訓'cae)、香蕉炭疽病(C miwae)、 梨輪紋病(M fowa加faiO、葡萄灰霉病(A c&erea)、水稻黑霉病(JV. wyzae)、西瓜蔓枯病(M附e/o"")、 蘆筍莖枯病(P osparag0、黃瓜黑星病(C.c"c"weW"M加)、柑桔青霉病CP Wcoft'a"ae)、辣椒根腐病(K /a"'')、黃瓜立枯病(兄so/an/)、大蒜葉枯病(S. 6o吵o/m0、茄子褐紋病(P ve:ca/w)、香蕉炭疽病(C. WM5ae)、甜菜褐斑病(C. 6erico/a)、稻瘟病(P gr&ea))
圖3采用一管法測試禾谷鐮孢菌及其對多菌靈的敏感性
(泳道l 3分別對應模板水稻惡苗病(G/"力Jbwi')、和未谷鐮孢菌對多菌靈的抗藥性菌株NT-29和 未谷鐮孢菌對多菌靈的敏感菌株NT-21)
權利要求
1、在一個聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，簡稱PCR)體系中(即，在一個PCR反應管中)，同時加入能夠特異性檢測禾谷鐮孢菌(Gibberella zeae，無性態(tài)Fusarium graminearum)及其是否對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平的兩對引物，以待測樣品的核基因組為模板，擴增，電泳，電泳結(jié)果可同時評價待測樣品是否為禾谷鐮孢菌及其是否對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平。特異性檢測禾谷鐮孢菌的引物FGa(5’-AGTCCAAAATGTCCCGATGC-3’)和FGb(5’-GCTGGGACCTGAGAAGTA-3’)特異性檢禾谷鐮孢菌樣品對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平的引物MBCF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′)和MBCR(5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGC TGT-3′)。
全文摘要
本發(fā)明是禾谷鐮孢菌(Gibberella zeae，無性態(tài)Fusarium graminearum)檢測及其對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性水平確認的一管檢測法，專門用于禾谷鐮孢菌菌株及其對多菌靈產(chǎn)生中等抗藥性的特異性檢測。該法可以從田間采集回來的病穗、病組織和病殘體上的病原菌采用ASO-PCR檢測，整個過程只需6h，檢測準確率達99％。該法具有快速、簡便、準確、靈敏的特點。
文檔編號C12Q1/68GK101475983SQ20081023508
公開日2009年7月8日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權日2008年11月17日
發(fā)明者周明國, 王建新, 陳長軍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學 被以下專利引用 (2),