專利名稱：：單一波長的dna測序裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種DNA測序裝置，具體是單一波長的DNA測序裝置。
背景技術(shù)：
：DNA序列分析是基因組學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的技術(shù)之一，是了解基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。目前使用的DNA序列分析裝置主要是以電泳分離理論為基礎(chǔ)而設(shè)計的，具有操作簡單、經(jīng)濟實用、探測靈敏、分離效率高等優(yōu)點。Smith等人采用4種熒光試劑標記，4光譜通道檢測系統(tǒng)，首次進行了毛細管電泳激光熒光檢測的DNA序列分析，Mathies和Kambara等提出另一種測序裝置，即采用20只毛細管并列電泳，激光熒光電荷藕合陣列檢測器(CCD)檢測，進一步提高了檢測的靈敏度。Ye皿g等又提出了100只毛細管陣列電泳裝置，采用CCD檢測器同時檢測IOO只毛細管的DNA分離樣品，均獲得滿意效果。但上述檢測裝置有一個共同點，即是均采用多個激光光源，對應(yīng)激發(fā)多個不同熒光染料的多光子熒光，以實現(xiàn)DNA序列的毛細管電泳分離和多光子熒光探測，因此，價格十分昂貴，且體積較大，不利于儀器的小型化和固定化；此外，當藍、綠光照射時，凝膠層、玻璃等的熒光背景較強，影響儀器的靈敏度。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明就是提供一種能有效降低系統(tǒng)成本，體積較小且易于固定，靈敏度高的單一波長的DNA測序裝置。單一波長的DNA測序裝置，包括工作臺，工作臺上依次分別設(shè)置有熒光激發(fā)系統(tǒng)，陣列毛細管系統(tǒng)，熒光探測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，其特征在于所述熒光激發(fā)系統(tǒng)由760-960nm波長的一個激光器，及激光器光束位置上設(shè)置的反射鏡，與反射鏡中軸線呈45°的位置設(shè)置有一低倍物鏡和在低倍物鏡光束的垂直線位置上設(shè)置的一觀測目鏡構(gòu)成。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的不同之處就是是用波長范圍為760-960nm的一個激光器取代現(xiàn)有技術(shù)中的多個激光器，實現(xiàn)多光子激發(fā)。所謂多光子激發(fā)熒光，通常情況下，一個分子或者原子每次只能吸收一個光子，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當光強足夠高時，就會產(chǎn)生多光子躍遷，即一次可以吸收多個光子。許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜要比單光子激發(fā)光譜寬闊，這樣，可以用單一波長的激發(fā)光同時激發(fā)多種染料，從而得到同一生命現(xiàn)象中的不同信息，便于相互對照。所以，可以用一個激光器取代多個激光器，同時激發(fā)四種不同熒光染料的多光子熒光，實現(xiàn)DNA序列的毛細管電泳分離和多光子熒光探測，極大地簡化了傳統(tǒng)的檢測系統(tǒng)。采用長波長激發(fā)光源，可避開拉曼散射和瑞利散射，且遠離發(fā)射光譜，有利于降低背景的噪聲，提高儀器系統(tǒng)的靈敏度。同時還具有成本低和噪聲低的特點。本發(fā)明包括熒光激發(fā)系統(tǒng)，陣列毛細管系統(tǒng)，熒光探測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)四大部分。熒光激發(fā)系統(tǒng)提供高功率激發(fā)光，并聚焦在毛細管上，同時實現(xiàn)不同熒光試劑的多光子激發(fā)；陣列毛細管系統(tǒng)由方形毛細管并排構(gòu)成，在高壓電源的驅(qū)動下，實現(xiàn)4種不同熒光標記的DNA堿基對序列的分離；熒光探測系統(tǒng)通過4個通道探測四種不同熒光試劑的多光子激發(fā)的熒光；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，通過自動控制收集熒光并處理，最終得到DNA序列。圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖2是利用本發(fā)明對6種熒光染料分子的分離圖譜圖；圖3是用本發(fā)明對DNA質(zhì)粒樣本的分離圖譜圖。圖中l(wèi)-工作臺，2-激光器，3-反射鏡，4-低倍物鏡，5-觀測目鏡，6-陣列毛細管，7-熒光收集物鏡，8-四通道熒光過濾輪，9-光纖陣列探測器，10-光電二極管，ll-數(shù)據(jù)采集卡，12-計算機，13-控制器。具體實施例方式圖1中示出的是構(gòu)成本發(fā)明的熒光激發(fā)系統(tǒng)、陣列毛細管系統(tǒng)、熒光探測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中各儀器之間按光路順序排列的相對位置及構(gòu)成情況。本發(fā)明包括在工作臺1上設(shè)置的熒光激光系統(tǒng)，它由長波長激發(fā)光源即波長范圍為760-960nm的激光器2，反射鏡3，數(shù)值孔徑為0.22-0.45的低倍物鏡4，觀測目鏡5構(gòu)成。激光器2實現(xiàn)多光子激發(fā)，反射鏡設(shè)置在激光器的光束位置上，低倍物鏡設(shè)置在與反射鏡中軸線呈45。的位置，觀測目鏡則設(shè)置在與低倍物鏡所發(fā)光束的垂直線上；所述毛細管系統(tǒng)是陣列毛細管6，它可以采用單根方形毛細管或多根方形毛細管并排組成；所述熒光探測系統(tǒng)由熒光收集物鏡7，四通道熒光過濾輪8，光纖陣列探測器9和光電二極管10構(gòu)成，熒光收集物鏡和上述觀測目鏡分別設(shè)置在陣列毛細管兩側(cè)，四通道熒光過濾輪設(shè)置在熒光收集物鏡之后，光纖陣列探測器和光電二極管均設(shè)置在四通道熒光過濾輪的后部。所述數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)包括計算機數(shù)據(jù)采集處理硬件和處理軟件，其中硬件包括數(shù)據(jù)采集卡11、計算機12和控制器13，該控制器分別連接計算機和四通道熒光過濾輪，并對四通道熒光過濾輪進行控制。本發(fā)明的工作過程是激光器提供長波長激發(fā)光源，實現(xiàn)多光子激發(fā)，反射鏡將激光束反射經(jīng)低倍物鏡垂直照射在陣列毛細管上，實現(xiàn)高通量、高效率分離，并通過觀測目鏡實現(xiàn)聚焦于毛細管正中心；熒光收集物鏡收集來自陣列毛細管的熒光后，經(jīng)過四通道熒光過濾輪，過濾掉環(huán)境散雜光，熒光信號為光纖陣列探測器所探測，并在光電二極管中實現(xiàn)轉(zhuǎn)換，光信號變成電流信號；計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)采集卡收集到光電二極管電流信號后，進一步放大和濾波，數(shù)據(jù)采集卡收集的信號，結(jié)合控制器對四通道熒光過濾輪的控制信號，運用相應(yīng)軟件計算并處理出DNA序列。具體實驗操作要求1、毛細管處理①多種熒光染料分離每次進樣前分別以0.lmol/LHC1、0.lmol/L氫氧化鈉、水和25mmol/L硼砂pH9.50溶液，高壓沖洗未涂層石英毛細管(57cmX75ym)10min;②DNA分離每次進樣前分別以0.lmol/LHC1、0.lmol/L氫氧化鈉、水和2%HEC/lXTBE/20mmol/L高壓沖洗未涂層石英毛細管(57cmX75ym)10min，再用1XPVA對處理后的毛細管進行表面改性；③分離高壓20KV。實驗前，毛細管需要先進行高壓平衡10分鐘。2、進樣方式①多種熒光染料進樣采用虹吸進樣，15cmX60s;②DNA進樣電動進樣，-6kVX10s。3、DNA樣本衍生化反應(yīng)P1和P2為5'端FITC修飾。4、實驗步驟41)熒光檢測系統(tǒng)調(diào)節(jié)好，將熒光焦點對準方形毛細管中央。2)高壓平衡毛細管10分鐘；3)調(diào)節(jié)計算機，控制器和四通道熒光過濾輪處于工作狀態(tài)，同時使檢測系統(tǒng)，毛細管系統(tǒng)等處于工作狀態(tài)。4)進樣檢測。為了論證本發(fā)明，進行了下列實驗1、單一波長實現(xiàn)激發(fā)波長不同的多種熒光試劑的同時激發(fā)。6種熒光染料分子的激發(fā)波長和發(fā)射波長如表l，如果采用單光子激發(fā)則需要多種波長的激光器，也就說要同時實現(xiàn)6種熒光染料分子的同時激發(fā)，需要多個波段的激光器。本發(fā)明采用單一波長可以同時實現(xiàn)激發(fā)和收集。實驗成功地表明本發(fā)明同時實現(xiàn)多種染料分子的激發(fā)，并實現(xiàn)毛細管電泳分離和熒光探測。實驗結(jié)果如圖2。表l6種熒光染料分子的激發(fā)波長和發(fā)射波長<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、采用本發(fā)明對DNA樣本進行了多光子熒光電泳分離，實驗結(jié)果如圖3。實驗表明可以對DNA進行測序。權(quán)利要求單一波長的DNA測序裝置，包括工作臺，工作臺上依次分別設(shè)置有熒光激發(fā)系統(tǒng)，陣列毛細管系統(tǒng)，熒光探測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，其特征在于所述熒光激發(fā)系統(tǒng)由760-960nm波長的一個激光器，及激光器光束位置上設(shè)置的反射鏡，與反射鏡中軸線呈45°的位置設(shè)置的一低倍物鏡和在低倍物鏡光束的垂直線位置上設(shè)置的一觀測目鏡構(gòu)成。全文摘要單一波長的DNA測序裝置，包括工作臺，工作臺上依次分別設(shè)置有熒光激發(fā)系統(tǒng)，陣列毛細管系統(tǒng)，熒光探測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所述熒光激發(fā)系統(tǒng)由760-960nm波長的一個激光器，及激光器光束位置上設(shè)置的反射鏡，與反射鏡中軸線呈45°的位置設(shè)置的一低倍物鏡和在低倍物鏡光束的垂直線位置上設(shè)置的一觀測目鏡構(gòu)成；本發(fā)明用一個激光器取代現(xiàn)有測序儀的多個激光器，同時激發(fā)四種不同熒光染料的多光子熒光，實現(xiàn)DNA序列的毛細管電泳分離和多光子熒光探測，極大地簡化了傳統(tǒng)的檢測系統(tǒng)，具有靈敏度高、儀器成本低、噪聲低、體積小等特點。文檔編號C12Q1/68GK101748207SQ20081023671公開日2010年6月23日申請日期2008年12月9日優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日發(fā)明者司佑全,張少武,李艷生,王秀章,陳勝,黃燕霞申請人:湖北師范學(xué)院