專利名稱：：產(chǎn)紫杉醇枝狀枝孢霉菌及用其制備紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)、生物制藥領(lǐng)域，具體涉及產(chǎn)紫杉醇枝狀枝孢霉(C7fldo^on'wwc/a^wpor/oWas)及一株產(chǎn)紫杉醇枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株，以及用其制備抗癌藥物紫杉醇的方法。
背景技術(shù)：
：從紅豆杉樹皮中提取的紫杉醇是目前國際上公認(rèn)的重要抗腫瘤藥物。由于紅豆杉資源的短缺，導(dǎo)致紫杉醇藥源緊張。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇是解決紫杉醇藥源問題的最有效途徑之一。自1993年Stierie等首次報道了從太平洋紅豆杉樹皮中分離到一種可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌以來，國內(nèi)外已有多種可產(chǎn)紫杉醇的真菌報道，這為人們展示了一個利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的誘人前景。微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇具有易培養(yǎng)、易控制、生產(chǎn)成本低，可通過優(yōu)化發(fā)酵條件等手段大幅度提高紫杉醇產(chǎn)量等優(yōu)點，其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)比較容易實現(xiàn)，應(yīng)用前景廣闊。但是，目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫杉醇真菌的紫杉醇產(chǎn)量都比較低，首次發(fā)現(xiàn)的安德魯紫杉菌(roxowycas(3"J^fl"ae)的紫杉醇產(chǎn)率只有2450ng/L(Stierleetal.，1993，5We"ce，260:214-216)。因此，需要提供新的紫杉醇產(chǎn)量高的菌株。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)紫杉醇的枝狀枝孢霉及用其制備紫杉醇的方法。本發(fā)明提供的枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的分類鑒定是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection,CCTCC)根據(jù)其形態(tài)特征與生理生化特性、以及18SrDNA序列(GenBankno.EU375523)等進行鑒定并鑒定到種。該菌種保藏號為CCTCCNo.M208208,保藏日期為2008年11月10日，分類命名為枝狀枝孢霉(C7a^w/x^wm本發(fā)明枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的形態(tài)特征和生理生化特征見圖1和表1。本發(fā)明提供的由發(fā)酵制造紫杉醇的方法，是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株以在其細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中聚集紫杉醇后，從其細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中提取紫杉醇。在溫度為25°C、180rpm振蕩培養(yǎng)的條件下，野生枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株在300ml土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中發(fā)酵10天，可以得到大約160p^L的紫杉醇，是首次發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫杉醇真菌安德魯紫杉菌的紫杉醇產(chǎn)量(2450ng/L)的36倍，是目前已報道在未優(yōu)化培養(yǎng)條件下的紫杉醇產(chǎn)量較高的野生菌株。上述土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基按下述配比和條件制備馬鈴薯300g，葡萄糖30g，馬鈴薯去皮，切成塊后用800ml蒸餾水煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加葡萄糖，溶化后補蒸餾水至1L，自然pH值，121°C，滅菌15分鐘后使用。枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株所產(chǎn)紫杉醇已經(jīng)被本發(fā)明人證實，其結(jié)構(gòu)和天然紅豆杉植物中分離、純化得到的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品完全一致。圖1為枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的形態(tài)觀察圖，其中，(1A)為菌落，(1B)為分生孢子梗(光學(xué)顯微鏡)，(1C)為分生孢子(電鏡)。具體實施方式使用本發(fā)明提供的枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)可以制備紫杉醇，其發(fā)酵制備紫杉醇的優(yōu)化方案為(1)將枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板上，25°C28'C靜置培養(yǎng)1015天后，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌35次，然后用無菌生理鹽水稀釋至1061()S個孢子/ml的數(shù)目。(2)按每300500ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種15ml枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的孢子懸液，將枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)是在需氧條件下、20°C30°C、pH4.08.0下進行的，發(fā)酵培養(yǎng)1015天后，分別收集菌絲體和發(fā)酵液；(3)菌絲體在45-C5(TC條件下烘干，然后研磨粉碎，過200目篩子收集細(xì)粉，每l.Og細(xì)粉用6ml甲醇/氯仿抽提35次，合并所有抽提液，甲醇/氯仿的體積比為l:01:1;(4)發(fā)酵液用氯仿振蕩抽提35次，發(fā)酵液與氯仿的體積比為l:l3:1，合并所有抽提液；(5)將步驟(3)和(4)中得到的抽提液分別在45"C5(TC條件下減壓蒸餾回收溶劑，并將蒸餾回收溶劑后的殘余物質(zhì)溶解在適量的100%甲醇中，即獲得紫杉醇粗提溶液。紫杉醇粗提溶液依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江,等。2002,林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22:45-48)進行純化后可直接用于高相液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC)分析。對于HPLC，色譜柱為C18反向柱(5x300mm，Waters),流動相為甲醇H20(68:32,v/v)，流速為1.0ml/min，紫外波長設(shè)定為227nm。通過對比紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的吸收峰停留時間、峰面積和枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株發(fā)酵后分離純化獲得的紫杉醇的吸收峰停留時間、峰面積，可計算其紫杉醇的濃度。上述發(fā)酵條件的進一步優(yōu)化條件為在初始pH為5.0的300ml液體發(fā)6酵培養(yǎng)基中接種1ml濃度為1()S個孢子/ml的枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的孢子懸液，220rpm，28.0'C條件下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)14天。在該優(yōu)化的發(fā)酵條件下，枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株可生產(chǎn)591.3pg/L的紫杉醇。上述優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基按下述配比和條件制備葡萄糖100g，酵母粉15g，蛋白胨6g，KH2P045g，MgS04-7H203g，苯甲酸鈉15mg,苯丙氨酸25mg,絲氨酸5mg，甘氨酸15mg，水楊酸25mg，加入適量蒸餾水溶化后，用蒸餾水定容至lL，調(diào)節(jié)pH至5.0，121'C，滅菌15分鐘后使用。下面通過借助實施例將更加詳細(xì)說明本發(fā)明，且以下實施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實施例的限制。采集華中科技大學(xué)校園苗圃種植的曼地亞紅豆杉樹皮組織，用無菌小刀切成(0.5x0.5x0.5cm)小塊，用70%(v/v)酒精進行表面消毒3min，用滅菌的ddH20漂洗3次，然后用無菌小刀剝?nèi)?nèi)表皮并均勻放置在含有50pg/ml的氨節(jié)青霉素的PDA培養(yǎng)基平板上，在25。C28-C的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，根據(jù)真菌生長情況，采用菌絲頂端分離純化法將形態(tài)不同的真菌分離到新的PDA培養(yǎng)基平板上。分離后的真菌在25。C28'C培養(yǎng)傳代并檢測純度，直至獲得單克隆。最后，每個真菌的單克隆再次通過菌絲頂端分離法將真菌接種到新的PDA斜面進行保藏，并收集相應(yīng)真菌的孢子制備孢子懸液，加入終濃度為15%(v/v)的甘油在-7(TC進行低溫保藏。枝狀枝孢霉HUST-RBB2是依據(jù)實施例1從曼地亞紅豆杉樹皮內(nèi)表皮中自行分離到的一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌。上述PDA培養(yǎng)基按下述配比和條件制備馬鈴薯300g，葡萄糖30g，瓊脂20g，馬鈴薯去皮，切成塊后用800ml蒸餾水煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補蒸餾水至1L，自然pH值，121°C，滅菌15分鐘后使用。用接種針將保藏于PDA斜面的枝狀枝孢霉HUST-RBB2挑取少許，接種到300ml土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中(1L三角燒瓶)，在25-C、180rpm條件下培養(yǎng)10天。將發(fā)酵液在4。C、12000rpm條件下，離心10min，分別收集菌絲體和發(fā)酵液,依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3)(5)，制備獲得2ml溶解在100%甲醇中的紫杉醇粗提液。依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江,等.2002,林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22:45-48)進行純化后，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。取10pi用于HPLC分析，儀器為Agilent1200HPLCSystem,色譜柱為C18反向柱(5x300mm，Waters)，流動相為甲醇H20(68:32,v/v)，流速為1.0ml/min，紫外波長設(shè)定為227nm，柱溫為25。C。通過HPLC法計算其紫杉醇的濃度發(fā)現(xiàn)，枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株在該條件下，可以生產(chǎn)約160pg/L的紫杉醇。取實施例2中所得枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株發(fā)酵后分離純化的紫杉醇10進行質(zhì)譜分析(由華中科技大學(xué)分析測試中心完成)。質(zhì)譜儀為Agilent1100LC/MSDTrap,采用電噴霧質(zhì)譜(electrospraymassspectrometry)技術(shù)，噴射電壓(asprayvoltage):2.2kV;柱型C18分離柱(5x300mm,Waters);進樣量10pi;檢測波長227nm;流動相為甲醇H20(68:32，v/v);流速lml/min，以標(biāo)準(zhǔn)品紫杉醇做對照。結(jié)果表明，枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株所產(chǎn)紫杉醇和天然紅豆杉植物中分離的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品具有一樣的分子量。取實施例2中所得枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株發(fā)酵后分離純化的紫杉醇500pl，減壓蒸餾回收溶劑后，將蒸餾后的殘余物質(zhì)重新溶解在100%的氖f^甲醇中，進1亍核磁共振i普(Nuclearmagneticresonancespectroscopy,NMR)分析(由華中科技大學(xué)分析測試中心完成)，儀器為Bruker400MHzinstrument,結(jié)果表明，枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株所產(chǎn)紫杉醇和天然紅豆杉植物中分離純化得到的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的iH、"C-NMR譜完全一致，即二者具有一樣立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。上述枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株用于生產(chǎn)紫杉醇是目前公布的紫杉醇產(chǎn)生菌中的優(yōu)勢菌，對該菌株的進一步工程改造以及發(fā)酵條件優(yōu)化，必將會使其紫杉醇產(chǎn)量更高。發(fā)酵條件的初步優(yōu)化結(jié)果，通過借助以下實施例將更加詳細(xì)說明。在PDA培養(yǎng)基平板上，25"C靜置培養(yǎng)枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株10天后，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌35次，然后用無菌生理鹽水稀釋獲得濃度為10S個孢子/ml的HUST-RBB2菌株的孢子懸液。配制以下初始發(fā)酵培養(yǎng)基各300ml，每升初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(I)中各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖80g，酵母粉50g，蛋白胨3g，KH2P042g，MgSCV7H201g，pH自然；每升初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(II)中各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖90g，酵母粉10g，蛋白胨5g，KH2P044g，MgS04'7H202g，pH自然；每升初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(III)中各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖100g，酵母粉15g,蛋白胨6g，KH2P045g，MgS04，7H203g，pH自然；每升初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(IV)中各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖IOOg，酵母粉10g，蛋白胨5g，KH2P043g，MgS04'7H203g，pH自然。各接入1ml枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的孢子懸液，在25°C、180rpm條件下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)10天。將發(fā)酵液在4"C、12000rpm條件下，離心lOmin,分別收集菌絲體和發(fā)酵液，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3)(5)，制備紫杉醇，并最終定容在2ml的100%甲醇中，依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江，等.2002,林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),22:45-48)進行純化后，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10pl用于HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結(jié)果表明，用初始發(fā)酵培養(yǎng)基(i)、(n)、(m)、(IV)進行枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的發(fā)酵，都有紫杉醇的合成，其中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基(III)的紫杉醇產(chǎn)量最高，為179pg/L。依據(jù)實施例4的發(fā)酵培養(yǎng)基(III)組成配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并分別將初始pH調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然后各接入1ml枝狀枝孢霉HUST-RBB2的孢子懸液，在25°C、180rpm條件下恒溫培養(yǎng)IO天。4°C、12000rpm離心10min收集菌絲體和發(fā)酵液，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3)(5),制備紫杉醇，并最終定容在2ml的100%甲醇中，依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江，等.2002，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),22:45-48)進行純化后，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10pl用于HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結(jié)果表明，用發(fā)酵培養(yǎng)基(III)進行枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株發(fā)酵，初始pH為4.08.0時，都有紫杉醇的合成，其中pH5.0是枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的最適初始pH值，該條件下紫杉醇的產(chǎn)量為191pg/L。在實施例5的基礎(chǔ)上，枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株分別在16.0°C、18.0°C、20.0°C、22.0°C、24.0°C、26.0°C、28.0°C、30.0。C條件下，180rpm發(fā)酵培養(yǎng)IO天后，4°C、12000rpm離心10min收集菌絲體和發(fā)酵液，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3)(5)制備獲得紫杉醇，并最終定容在2ml的100%甲醇中，依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江，等.2002，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22:45-48)進行純化后，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取lOpl用于HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結(jié)果表明，用初始pH5.0的初始發(fā)酵培養(yǎng)基(III)進行枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株發(fā)酵，培養(yǎng)溫度在20'C3(TC都有紫杉醇的合成，其中，28.(TC是枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的最適培養(yǎng)溫度，該條件下紫杉醇產(chǎn)量為211.5^g/L。在實施例6的基礎(chǔ)上，枝狀枝孢霉HUST-RBB2分別在搖床轉(zhuǎn)速為100rpm、120rpm、140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm、240rpm、260rpm條件下，28.0。C恒溫發(fā)酵培養(yǎng)IO天后，4°C、12000rpm離心10min收集菌絲體和發(fā)酵液，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3)(5)制備獲得紫杉醇，并最終定容在2ml的100c/。甲醇中，依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江,等.2002，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22:45-48)進行純化后，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取IOpl用于HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結(jié)果表明，搖床轉(zhuǎn)速為100rpm260rpm時都有紫杉醇的合成，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為220rpm時，紫杉醇產(chǎn)量最高，為241.1pg/L。依據(jù)實施例7的發(fā)酵條件，進行枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的產(chǎn)紫杉醇發(fā)酵，并在發(fā)酵過程中，從第三天開始采樣，每天采樣一次，每次300ml，共采樣15天。4°C、12000rpm離心10min收集菌體，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3)(5)制備獲得紫杉醇，并最終定容在2ml的100Q/。甲醇中，依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江，等.2002，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22:45-48)進行純化后，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10用于HPLC分析(條件同[實施例2]),測定其紫杉醇的含量，實施例結(jié)果表明，發(fā)酵第5天出現(xiàn)紫杉醇，發(fā)酵第14天時，紫杉醇產(chǎn)量最高，為299.1pg/L。在實施例8的基礎(chǔ)上，分^j在發(fā)酵培養(yǎng)基(III)中添加不同濃度的苯甲酸鈉、苯丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸，進行枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株產(chǎn)紫杉醇發(fā)酵，發(fā)酵14天后，4'C、12000rpm離心10min收集菌體，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3)(5)制備獲得紫杉醇，并最終定容在2ml的100%甲醇中，依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江，等.2002，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22:45-48)進行純化后，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10pl用于HPLC分析(條件同[實施例2])，測定其紫杉醇的含量，實施例結(jié)果表明，苯甲酸鈉添加量為15mg/L時，紫杉醇產(chǎn)量最高，為329.0pg/L;苯丙氨酸添加量為20mg/L時，紫杉醇產(chǎn)量最高，為345.0pg/L;絲氨酸添加量為10mg/L時，紫杉醇產(chǎn)量最高，為323.5pg/L;甘氨酸添加量為15mg/L時，紫杉醇產(chǎn)量最高，為314.2pg/L。選擇添加終濃度各為10mg/L、15mg/L、20mg/L的苯甲酸鈉，15mg/L、20mg/L、25mg/L苯丙氨酸、5mg/L、10mg/L、15mg/L絲氨酸，10mg/L、15mg/L、20mg/L甘氨酸進行正交試驗分析，實施例結(jié)果表明，前體物組合為15mg/L苯甲酸鈉、25mg/L苯丙氨酸、5mg/L絲氨酸、15mg/L甘氨酸時，枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇的產(chǎn)量最高，為569.5在實施例9的基礎(chǔ)上，分別添加不同終濃度的水楊酸到狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的發(fā)酵體系中，發(fā)酵培養(yǎng)14天后，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3)(5)制備獲得紫杉醇，依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江，等.2002，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22:45-48)進行純化后，獲得溶解在1ml100%甲醇中的紫杉醇溶液。并通過HPLC法(條件同[實施例2])測定其紫杉醇的含量，實施例結(jié)果表明，添加水楊酸濃度為25mg/L時，紫杉醇產(chǎn)量最高，為591.3綜上，枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株優(yōu)化后的每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖100g，酵母粉15g，蛋白胨6g，KH2P045g，MgS04.7H203g，苯甲酸鈉15mg,苯丙氨酸25mg，絲氨酸5mg，甘氨酸15mg，水楊酸25mg。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為在初始pH為5.0的300ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1ml濃度為10S個孢子/ml的枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的孢子懸液，220rpm，28.0。C條件下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)14天。以上所述為本發(fā)明的較佳實施例而己，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于上述實施例所公開的內(nèi)容。所以，凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護的范圍。12表1:枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的形態(tài)特征和生理特征<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1、產(chǎn)紫杉醇枝狀枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)具有產(chǎn)紫杉醇的能力，用于發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇，一株保藏號為CCTCCNo.M208208的枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株具有較強的產(chǎn)紫杉醇的能力。2、一種由發(fā)酵制造紫杉醇的方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株以在其細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中聚集紫杉醇后，從其細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中提取紫杉醇。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該方法具體包括下述步驟(1)將枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板上，25°C28"C靜置培養(yǎng)1015天后，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌35次，然后用無菌生理鹽水稀釋至106108個孢子/ml的數(shù)目。(2)按每300500ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種15ml枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的孢子懸液，將枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在203(TC、pH4.08.0、需氧條件下發(fā)酵培養(yǎng)1015天后，分別收集菌絲體和發(fā)酵液；(3)菌絲體在45-C5(TC條件下烘干，然后研磨粉碎，過200目篩子收集細(xì)粉，每1.0g細(xì)粉用6ml甲醇/氯仿抽提35次，合并所有抽提液，甲醇/氯仿的體積比為l:01:1;(4)發(fā)酵液用氯仿振蕩抽提35次，發(fā)酵液與氯仿的體積比為l:l3:1，合并所有抽提液；(5)將步驟(3)和(4)中得到的抽提液分別在45t:5(rC條件下減壓蒸餾回收溶劑，并將蒸餾回收溶劑后的殘余物質(zhì)溶解在適量的100%甲醇中，即獲得紫杉醇粗提溶液。4、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，每升優(yōu)化后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖100g，酵母粉15g，蛋白胨6g，KH2P045g，MgS04.7H203g，苯甲酸鈉15mg,苯丙氨酸25mg，絲氨酸5mg，甘氨酸15mg，水楊酸25mg。5、根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，發(fā)酵的優(yōu)化條件為在初始pH為5.0的300ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種1ml濃度為108個孢子/ml的枝狀枝孢霉HUST-RBB2菌株的孢子懸液，220rpm、28.(TC條件下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)14天。全文摘要本發(fā)明涉及到從曼地亞紅豆杉(Taxusxmedia)中分離到的一種產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌枝狀枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)。在溫度為25℃、180rpm振蕩培養(yǎng)的條件下，野生菌株枝狀枝孢霉HUST-RBB2在300ml土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中發(fā)酵10天，可以得到大約160μg/L的紫杉醇，是目前已報道在未優(yōu)化培養(yǎng)條件下的較高紫杉醇產(chǎn)量的野生菌株。在初步優(yōu)化的發(fā)酵條件下，枝狀枝孢霉HUST-RBB2發(fā)酵可生產(chǎn)約591.3μg/L紫杉醇。通過該菌株發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇，具有生產(chǎn)周期短、菌種選育和保藏容易等優(yōu)點。該發(fā)明為利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇提供了新的菌種及相應(yīng)的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。文檔編號C12N1/14GK101486972SQ200810236808公開日2009年7月22日申請日期2008年12月10日優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日發(fā)明者余龍江,周蓬蓬,鵬張申請人:華中科技大學(xué)