專(zhuān)利名稱：產(chǎn)紫杉醇亮白曲霉菌及用其制備紫杉醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物生物技術(shù)、生物制藥領(lǐng)域，具體涉及產(chǎn)紫杉醇亮白
曲霉(^perg/〃w owcfe/ws)及一株產(chǎn)紫杉醇亮白曲霉HUST-RBB3菌株， 以及用其制備抗癌藥物紫杉醇的方法。
背景技術(shù)：
分離自紅豆杉樹(shù)皮的紫杉醇是目前國(guó)際上公認(rèn)的重要抗腫瘤藥物，但 由于紅豆杉資源的短缺，導(dǎo)致紫杉醇藥源緊張。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇 是解決紫杉醇藥源問(wèn)題的最有效途徑之一。微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇具有易 培養(yǎng)、易控制、生產(chǎn)成本低，可通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件等手段大幅度提高紫杉 醇產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn)，其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)比較容易實(shí)現(xiàn)，應(yīng)用前景廣闊。
自1993年Stierle等首次報(bào)道了從太平洋紅豆杉樹(shù)中分離到一種可產(chǎn)紫 杉醇的內(nèi)生真菌以來(lái)，國(guó)內(nèi)外己有30多種可產(chǎn)紫杉醇的真菌報(bào)道。但是，
目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫杉醇真菌的紫杉醇產(chǎn)量都比較低，首次發(fā)現(xiàn)的安德魯紫杉 菌(roxo附j(luò);c^ a"Aea"ae)的紫杉醇產(chǎn)率只有24 50 ng/L(Stierle et al.， 1993, &/ewCe， 260: 214-216)。因此，需要提供新的紫杉醇產(chǎn)量高的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)紫杉醇的亮白曲霉及用其制備紫杉醇的 方法，該菌種的發(fā)明為通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇提供了新的菌株。
本發(fā)明提供的新的紫杉醇產(chǎn)生菌亮白曲霉HUST-RBB3已于2008年11月10日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)，該菌種保藏號(hào)為CCTCC No. M208209,分類(lèi)命名為 亮白曲霉"s/ ergz7/ws cam/z'c/ws)。
本發(fā)明的亮白曲霉HUST-RBB3菌株具有以下特征在25 28。C溫度 下，在PDA (potato dextrose agar medium)平板上生長(zhǎng)，兩星期后菌落直徑 大約1cm,在CYA (Czapek yeast autolysate agar medium)平板上在可以達(dá) 到4 5cm，而在37。C不能生長(zhǎng)；菌落為白色，有光澤，菌落背面為淺黃 色；菌絲直徑約為5 8 Kim，分枝、有隔；分生孢子大小為2.5 3.5 ^m、 白色、表面光滑、水珠型；具有特征性的孢子頭結(jié)構(gòu)，直徑約為20 50拜， 白色，球形；分生孢子梗約600 900 nm，頂囊球形或近球形，小梗雙層， 在頂囊頭部著生。詳細(xì)的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征見(jiàn)圖1和表1。
上述亮白曲霉HUST-RBB3發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇可在18 32°C、 pH4.0 8.0、 需氧條件下進(jìn)行。該菌株產(chǎn)生的紫杉醇，主要儲(chǔ)藏于細(xì)胞中， 一部分分泌 于細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。本發(fā)明提供的由發(fā)酵制造紫杉醇的方法，其特征在 于:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)亮白曲霉HUST-RBB3菌株以在其細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中聚 集紫杉醇后，從其細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中提取紫杉醇。
在溫度為25°C、 180 rpm振蕩培養(yǎng)的條件下，野生亮白曲霉HUST-RBB3 菌株在300ml 土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中發(fā)酵10天，可以得到大約120pg/L 的紫杉醇，是首次發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫杉醇真菌安德魯紫杉菌(roxom^w ""Am"m) 的紫杉醇產(chǎn)量(24 50ng/L)的2 5倍，是目前己報(bào)道在未優(yōu)化培養(yǎng)條件 下的紫杉醇產(chǎn)量較高的野生菌株。上述土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基按下述配比 和條件制備馬鈴薯300 g，葡萄糖30 g，馬鈴薯去皮，切成塊后用800 ml 蒸餾水煮沸半小時(shí)，然后用紗布過(guò)濾，再加葡萄糖，溶化后補(bǔ)蒸餾水至1 L， 自然pH值，121 °C，滅菌15分鐘后使用。
亮白曲霉HUST-RBB3菌株所產(chǎn)紫杉醇已經(jīng)被本發(fā)明人證實(shí)，其結(jié)構(gòu)和 天然紅豆杉植物中分離、純化得到的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品完全一致。


圖1為亮白曲霉HUST-RBB3的形態(tài)觀察圖，其中，(A)為CYA平板 上的菌落，(B)為分生孢子頭(光學(xué)顯微鏡鏡)，(C)為分生孢子(電鏡)。
具體實(shí)施例方式
使用本發(fā)明提供的亮白曲霉HUST- RBB3菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)可以制備 紫杉醇，其發(fā)酵制備紫杉醇的優(yōu)化方案為
(1)將亮白曲霉HUST-RBB3菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板上，25°C 30。C靜置培養(yǎng)10 15天后，加入滅菌的蒸餾水，通過(guò)玻璃棉過(guò)濾器過(guò)濾收 集孢子，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 5次，然后用無(wú)菌生理鹽水稀釋至106 1()S個(gè)孢子/ml的數(shù)目。
(2) 按每300 500 ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種1 5 mi亮白曲霉 HUST-RBB3菌株的孢子懸液，將亮白曲霉HUST-RBB3菌株接種到液體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)是在需氧條件下、18 32°C、 pH4.0 8.0下進(jìn)行的，發(fā) 酵培養(yǎng)10 15天后，分別收集菌絲體和發(fā)酵液；
(3) 菌絲體在45。C 50。C條件下烘干，然后研磨粉碎，過(guò)200目篩子 收集細(xì)粉，每l.O g細(xì)粉用6 ml甲醇/氯仿抽提3 5次，合并所有抽提液，甲 醇/氯仿的體積比為l: 0 1: 1;
(4) 發(fā)酵液用氯仿振蕩抽提3 5次，發(fā)酵液與氯仿的體積比為l: l 3: 1，合并所有抽提液；
(5) 將(3)和(4)中得到的抽提液分別在45°C 50°C條件下減壓 蒸餾回收溶劑，并將蒸餾回收溶劑后的殘余物質(zhì)溶解在適量的100 %甲醇 中，即獲得紫杉醇粗提溶液。
上述發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化條件為在初始pH為6.0的300 ml液體發(fā) 酵培養(yǎng)基中接種1 ml濃度為1()S個(gè)孢子/ml的亮白曲霉HUST-RBB3菌株的 孢子懸液，200rpm， 30.(TC條件下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)13天。在該優(yōu)化的發(fā)酵條件下，亮白曲霉HUST-RBB3菌株可生產(chǎn)497.3 pg/L的紫杉醇。
上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基按下述配比和條件制備葡萄糖80 g，酵母粉10 g，蛋白胨5g， KH2P042g， MgS04-7H20 1 g，苯甲酸鈉10 mg，苯丙氨 酸25mg，絲氨酸15mg,甘氨酸20mg，水楊酸15mg，加入適量蒸餾水 溶化后，用蒸餾水定容至l L，調(diào)節(jié)pH至6.0， 121°C，滅菌15分鐘后使 用。
紫杉醇粗提溶液依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江，等。2002,林產(chǎn)化 學(xué)與工業(yè)，22: 45-48)進(jìn)行純化后可直接用于高相液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析。對(duì)于HPLC，色譜柱為 C18反向柱(5x300 mm， Waters)，流動(dòng)相為甲醇H20 (68:32， v/v)，流 速為1.0 ml/min，紫外波長(zhǎng)設(shè)定為227 nm。通過(guò)對(duì)比紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的吸收 峰停留時(shí)間、峰面積和亮白曲霉HUST-RBB3菌株發(fā)酵后分離純化獲得的紫 杉醇的吸收峰停留時(shí)間、峰面積，可計(jì)算其紫杉醇的濃度。
通過(guò)借助以下實(shí)施例將更加詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，且以下實(shí)施例僅是說(shuō)明 性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。 [實(shí)施例1]
采集華中科技大學(xué)校園苗圃種植的曼地亞紅豆杉樹(shù)皮組織，用無(wú)菌小 刀切成( 0.5x0.5xQ.5cm)小塊，用70% (v/v)酒精進(jìn)行表面消毒3 min， 用滅菌的ddH20漂洗3次，然后用無(wú)菌小刀剝?nèi)?nèi)表皮并均勻放置在含有 50嗎/mL的氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基平板上，在25。C 28。C的培養(yǎng)箱中 靜置培養(yǎng)，根據(jù)真菌生長(zhǎng)情況，采用菌絲頂端分離純化法將形態(tài)不同的真 菌分離到新的PDA培養(yǎng)基平板上。分離后的真菌在25。C 28。C培養(yǎng)傳代 并檢測(cè)純度，直至獲得單克隆。最后，每個(gè)真菌的單克隆再次通過(guò)菌絲頂 端分離法將真菌接種到新的PDA斜面進(jìn)行保藏，并收集相應(yīng)真菌的孢子制 備孢子懸液，加入終濃度為15% (v/v)的甘油在-70。C進(jìn)行低溫保藏。亮 白曲霉HUST-RBB3是依據(jù)實(shí)施例1從曼地亞紅豆杉內(nèi)表皮中自行分離到的一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌。
上述PDA培養(yǎng)基按下述配比和條件制備馬鈴薯300 g，葡萄糖30 g， 瓊脂20 g，馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時(shí)，然后用紗布過(guò)濾，再加葡萄 糖和瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1L,自然pH值，121°C，滅菌15分鐘后使用。
用接種針將保藏于PDA斜面的亮白曲霉HUST-RBB3挑取少許，接種 到300ml土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中(1L三角燒瓶)，在25。C、 180rpm條 件下培養(yǎng)10天。將發(fā)酵液在4'C、 12000 rpm條件下，離心10 min，分別 收集菌絲體和發(fā)酵液依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3) (5),制備獲得2ml溶 解在100%甲醇中的紫杉醇粗提液。依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江,等. 2002,林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22: 45-48)進(jìn)行純化后，獲得溶解在1 ml 100%甲醇 中的紫杉醇溶液。取10 ^用于HPLC分析，儀器為Agilent 1200 HPLC System,色譜柱為C18反向柱(5x300 mm， Waters)，流動(dòng)相為甲醇H20 (68:32, v/v)，流速為1.0 ml/min，紫外波長(zhǎng)設(shè)定為227 nm，柱溫為25°C。 通過(guò)HPLC法計(jì)算其紫杉醇的濃度發(fā)現(xiàn)，亮白曲霉HUST-RBB3菌株在該 條件下，可以生產(chǎn)約120 ^g/L的紫杉醇。
取實(shí)施例2中所得亮白曲霉HUST-RBB3菌株發(fā)酵后分離純化的紫杉醇 10 ^進(jìn)行質(zhì)譜分析(由華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心完成)。質(zhì)譜儀為 Agilent 1100 LC/MSD Trap, 采用電噴霧質(zhì)譜(electrospray mass spectrometry)技術(shù)，噴射電壓(a spray voltage ) : 2.2 kV;柱型C18分 離柱(5x300 mm， Waters);進(jìn)樣量10 pi;檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm;流動(dòng)相為 甲醇H20 (68:32， v/v);流速lml/min，以標(biāo)準(zhǔn)品紫杉醇做對(duì)照。結(jié)果 表明，亮白曲霉HUST-RBB3菌株所產(chǎn)紫杉醇和天然紅豆杉植物中分離的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品具有一樣的分子量。
取實(shí)施例2中所得亮白曲霉HUST-RBB3菌株發(fā)酵后分離純化的紫杉醇 500 ^，減壓蒸餾回收溶劑后，將蒸餾后的殘余物質(zhì)重新溶解在100%的氘 /(戈甲醇中，進(jìn)《亍核磁共振i普(Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR) 分析(由華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心完成)，儀器為Bruker 400 MHz instrument,結(jié)果表明，亮白曲霉HUST-RBB3菌株所產(chǎn)紫杉醇和天然紅豆杉 植物中分離純化得到的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的&、 UC-NMR譜完全一致，即二者 具有一樣立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。
在PDA培養(yǎng)基平板上，25'C靜置培養(yǎng)亮白曲霉HUST-RBB3菌株10 天后，加入滅菌的蒸餾水，通過(guò)玻璃棉過(guò)濾器過(guò)濾收集孢子，用無(wú)菌生理 鹽水洗滌3 5次，然后用無(wú)菌生理鹽水稀釋獲得濃度為10S個(gè)孢子/ml的亮 白曲霉HUST-RBB3菌株的孢子懸液。
配制以下初始發(fā)酵培養(yǎng)基各300ml，每升初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(I)中 各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖80 g，酵母粉10 g，蛋白胨5g， KH2P042g， MgS(V7H20 1 g， pH自然；每升初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(II)中各組分的質(zhì) 量分別為葡萄糖90g，酵母粉10g，蛋白胨5 g， KH2P04 4 g， MgS04'7H20 2g， pH自然；每升初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(III)中各組分的質(zhì)量分別為葡 萄糖100 g，酵母粉15 g，蛋白胨lg， KH2P045g， MgS04'7H20 3 g， pH 自然；每升初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(IV)中各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖100 g，酵母粉10 g，蛋白胨3g, KH2P043g， MgSCV7H20 3 g， pH自然。各 接入lml亮白曲霉HUST-RBB3菌株的孢子懸液，在25。C、 180rpm條件 下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)10天。將發(fā)酵液在4。C、 12000 rpm條件下，離心10min， 分別收集菌絲體和發(fā)酵液，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3) (5)，制備獲得 紫杉醇，并最終定容在2ml的100%甲醇中，依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江，等.2002，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22: 45-48)進(jìn)行純化后，獲得溶解在1 ml 100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10 ^用于HPLC分析(條件同[實(shí)施例2])， 測(cè)定其紫杉醇的含量，實(shí)施例結(jié)果表明，用初始發(fā)酵培養(yǎng)基(1)、 (11)、 (m)、 (IV)進(jìn)行亮白曲霉HUST-RBB3菌株的發(fā)酵，都有紫杉醇的合成， 其中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基(I)的紫杉醇產(chǎn)量最高，為135.1 pg/L。
依據(jù)實(shí)施例4的發(fā)酵培養(yǎng)基(I)組成配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并分別將初始 pH調(diào)至4.0、 4.5、 5.0、 5.5、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0，然后各接入1 ml亮 白曲霉HUST-RBB3的孢子懸液，在25"C、 180rpm條件下恒溫培養(yǎng)10天。 4°C、 12000 rpm離心10 min收集菌絲體和發(fā)酵液，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的 步驟(3) (5)制備獲得紫杉醇，并最終定容在2 ml的100%甲醇中，依據(jù)常 規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江,等.2002,林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),22: 45-48)進(jìn)行純化 后，獲得溶解在1 1111100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取10pl用于HPLC分 析(條件同[實(shí)施例2])，測(cè)定其紫杉醇的含量，實(shí)施例結(jié)果表明，用液體 發(fā)酵培養(yǎng)基(I)進(jìn)行亮白曲霉HUST-RBB3菌株發(fā)酵，初始pH為4.0 8.0 時(shí)，都有紫杉醇的合成，其中pH6.0是亮白曲霉HUST-RBB3菌株發(fā)酵產(chǎn)紫 杉醇的最適初始pH值，該條件下紫杉醇的產(chǎn)量為150.5 pg/L。
在實(shí)施例5的基礎(chǔ)上，亮白曲霉HUST-RBB3菌株分別在16.0°C、 18.0°C、 20.0°C、 22.0。C、 24.0°C、 26.0°C、 28,0°C、 30,0°C、 32.0°C、 34.0°C 條件下，180rpm發(fā)酵培養(yǎng)IO天后，4°C、 12000 rpm離心10 min收集菌絲 體和發(fā)酵液，依據(jù)上述優(yōu)化方案中的步驟(3) (5)制備獲得紫杉醇，并最終 定容在2ml的100%甲醇中，依據(jù)常規(guī)紫杉醇純化方法(余龍江，等.2002，林 產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，22: 45-48)進(jìn)行純化后，獲得溶解在1 ml 100%甲醇中的紫杉醇溶液。各取IO ^用于HPLC分析(條件同[實(shí)施例2])，測(cè)定其紫杉 醇的含量，實(shí)施例結(jié)果表明，用初始pH6.0的液體發(fā)酵培養(yǎng)基(I)進(jìn)行亮 白曲霉HUST-RBB3菌株發(fā)酵，培養(yǎng)溫度在18°〇 32°(:都有紫杉醇的合成， 其中，30.(TC是亮白曲霉HUST-RBB3菌株發(fā)酵產(chǎn)紫杉醇的最適培養(yǎng)溫度， 該條件下紫杉醇產(chǎn)量為171.6 pg/L。
在初始pH為6.0的300 ml優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1 ml濃度為 1()S個(gè)孢子/ml的亮白曲霉HUST-RBB3菌株的孢子懸液，在初步優(yōu)化后的 發(fā)酵條件下，即200 rpm， 30.(TC條件下恒溫發(fā)酵培養(yǎng)13天，亮白曲霉 HUST-RBB3菌株可生產(chǎn)497.3 pg/L的紫杉醇。每升優(yōu)化的液體發(fā)酵培養(yǎng)基 中各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖80 g，酵母粉10 g，蛋白胨5g, KH2P04 2g， MgS04.7H20 1 g，苯甲酸鈉10mg，苯丙氨酸25 mg,絲氨酸15mg， 甘氨酸20mg，水楊酸15mg。
以上所述為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于上述實(shí) 施例所公開(kāi)的內(nèi)容。所以，凡是不脫離本發(fā)明所公開(kāi)的精神下完成的等效 或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。表1:亮白曲霉HUST-RBB3菌株的形態(tài)特征和生理特征
檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果
形態(tài)特征碳源利用
菌苔顏色白色D-半乳糖+
基質(zhì)顏色無(wú)色D-半乳糖醛酸-
氣生菌絲豐茂龍膽二糖+
分 枝+D-葡萄糖酸-
次生分枝+D-葡萄糖胺-
菌絲隔膜+a-D-葡萄糖
分生孢子串珠狀葡萄醛酰胺-
枝 孢球形D-葡萄醛酸-
孢子顏色白色甘油+
糖原+
碳源利用m-肌醇+/-
D-阿拉伯糖+a-D-乳糖-
L-阿拉伯糖+乳果糖+/-
D-阿拉伯醇+/-麥芽糖醇-
熊果苷+麥芽糖+
D-纖維二糖+麥芽三糖+/-
(3-環(huán)狀糊精-D-甘露醇+
i-赤藻糖醇-D-甘露糖+
D-果糖+D-松三糖+/-
L-海藻糖+D-蜜二糖+
蔗糖+P-甲基-D-半乳糖苷-
松二糖+木糖醇-
(注+- positive; negative)
權(quán)利要求
1、產(chǎn)紫杉醇亮白曲霉(Aspergillus candidus)具有產(chǎn)紫杉醇的能力，用于發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇，一株保藏號(hào)為CCTCC No.M208209的亮白曲霉HUST-RBB3菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)紫杉醇的能力。
2、 一種由發(fā)酵制造紫杉醇的方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)亮白 曲霉HUST-RBB3菌株以在其細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中聚集紫杉醇后，從其細(xì)胞內(nèi) 和培養(yǎng)基中提取紫杉醇。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該方法具體包括下述步(1) 將亮白曲霉HUST-RBB3菌株接種在PDA培養(yǎng)基平板上，25°C 28"C靜置培養(yǎng)10 15天后，加入滅菌的蒸餾水，通過(guò)玻璃棉過(guò)濾器過(guò)濾收 集孢子，用無(wú)菌生理鹽水洗滌3 5次，然后用無(wú)菌生理鹽水稀釋至106 1()8個(gè)孢子/ml的數(shù)目；(2) 按每300 500 ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種1 5 ml亮白曲霉 HUST-RBB3菌株的孢子懸液，將亮白曲霉HUST-RBB3菌株接種到液體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，在18 32-C、 pH4.0 8.0、需氧條件下發(fā)酵培養(yǎng)10 15天后，分 別收集菌絲體和發(fā)酵液；(3) 菌絲體在45i: 5(rC條件下烘干，然后研磨粉碎，過(guò)200目篩子 收集細(xì)粉，每l.O g細(xì)粉用6 ml甲醇/氯仿抽提3 5次，合并所有抽提液， 甲醇/氯仿的體積比為l: 0 1: 1;(4) 發(fā)酵液用氯仿振蕩抽提3 5次，發(fā)酵液與氯仿的體積比為l: l 3: 1，合并所有抽提液；(5) 將步驟(3)和(4)中得到的抽提液分別在45r 50。C條件下減 壓蒸餾回收溶劑，并將蒸餾回收溶劑后的殘余物質(zhì)溶解在適量的100 %甲醇中，即獲得紫杉醇粗提溶液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，每升優(yōu)化后的液體 發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量分別為葡萄糖80 g,酵母粉10 g,蛋白胨5 g， KH2P042g, MgS04'7H20 1 g，苯甲酸鈉10mg，苯丙氨酸25 mg,絲 氨酸15mg，甘氨酸20mg,水楊酸15mg。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，發(fā)酵的優(yōu)化條件為 在初始pH為6.0的300 ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種1 ml濃度為108個(gè)孢子 /ml的亮白曲霉HUST-RBB3菌株的孢子懸液，200rpm, 30.(TC條件下恒溫 發(fā)酵培養(yǎng)13天。
全文摘要
本發(fā)明涉及到從曼地亞紅豆杉(Taxus x media)中分離到的一種產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌亮白曲霉(Aspergillus candidus)。在溫度為25℃、180rpm振蕩培養(yǎng)的條件下，野生菌株亮白曲霉HUST-RBB3在300mL土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基中發(fā)酵10天，可以得到大約120μg/L的紫杉醇，是目前已報(bào)道在未優(yōu)化培養(yǎng)條件下的較高紫杉醇產(chǎn)量的野生菌株。在初步優(yōu)化的發(fā)酵條件下，亮白曲霉HUST-RBB3發(fā)酵可生產(chǎn)約497.3μg/L紫杉醇。通過(guò)該菌株發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇，具有生產(chǎn)周期短、菌種選育和保藏容易等優(yōu)點(diǎn)。該發(fā)明為利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇提供了新的菌種及相應(yīng)的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
文檔編號(hào)C12R1/66GK101586082SQ200810236809
公開(kāi)日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者余龍江, 周蓬蓬, 鵬 張 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)