專利名稱：：從精漿中提取胞外rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及RNA的提取方法，尤其涉及從精漿中提取游離RNA的方法。
背景技術(shù)：
：胞外RNA是存在于細(xì)胞外的RNA，近年來被認(rèn)為在基因表達(dá)研究、疾病診斷、法醫(yī)鑒定等方面有很好的應(yīng)用前景[參見VlassovVV，LaktionovPP，RykovaEY.Extracellularnucleicacids.Bioessays2007,29:654-67]。精液是生殖系統(tǒng)多個(gè)器官共同分泌和排除液體的混合物，是進(jìn)行生殖系統(tǒng)疾病診斷的重要標(biāo)本[參見熊承良，主編.《臨床生殖醫(yī)學(xué)》.人民衛(wèi)生出版社.2007.p23-8]。目前，研究和檢測男性生殖系統(tǒng)器官(如睪丸、前列腺、精囊腺等)的某些基因的表達(dá)，及臨床診斷某些男性生殖系統(tǒng)疾病，如腫瘤、睪丸精子發(fā)生情況，都依賴于穿剌，穿剌的有創(chuàng)性和不易接受性，在很大程度上限制了對(duì)生殖系統(tǒng)器官基因表達(dá)分析的研究和應(yīng)用。胞外RNA是指存在于細(xì)胞膜外的RNA，一般認(rèn)為來源于細(xì)胞死亡后釋放或活細(xì)胞分泌至胞外(圖2)[參見FleischhackerM，SchmidtB.Circulatingnucleicacids(CNAs)andcancer_Asurvey.BiochimBiophysActa2007.1775:181-232]，并可會(huì)g與其他物質(zhì)結(jié)合[參見ParkNJ，LiY，YuTW，BrinkmanBM，WongDT.CharacterizationofRNAinsaliva.ClinChem2006.52:988-94]，增加其穩(wěn)定性[參見ZubakovD，HanekampE，KokshoornM，etal.StableRNAmarkersforidentificationofbloodandsalivastainsrevealedfromwholegenomeexpressionanalysisoftime—wisedegradedsamples.IntJLegalMed2008，122:135-42]，逃脫RNA酶的降解作用。國外對(duì)胞外RNA的研究開始于1999年，兩個(gè)小組在腫瘤患者外周血血漿中檢測腫瘤來源的RNA[參見丄oKW，LoYMD，LeungSF，etal.Analysisofcell_freeEpstein_BarrvirusassociatedRNAintheplasmaofpatientswithnasopharyngealcarcinoma.ClinChem1999，45:1292—4;KopreskiMS，BenkoFA，KwakLW，etal.DetectionoftumormessengerRNAintheserumofpatientswithmalignantmelanoma.ClinCancerRes1999，5:1961-5]。目前，對(duì)于胞外RNA的研究成為一個(gè)新的熱點(diǎn)，除外周血血漿外，已在唾液、支氣管灌洗液、尿液中發(fā)現(xiàn)有胞外RNA的存在[參見LiY，ZhouX，JohnS，etal.RNAprofilingofcell-freesalivausingmicroarraytechnology.JDentRes2004,83:199-203;SchmidtB，CarstensenT，EngelE，etal.Detectionofcell—freenucleicacidsinbronchiallavagefluidsupernatantsfrompatientswithlungcancer.EurJCancer2004,40:452-60]，其中以血槳和唾液中胞外RNA研究相對(duì)較多。由于胞外RNA對(duì)其來源器官基因表達(dá)的全面代表性，分子生物學(xué)技術(shù)的快速、敏感而準(zhǔn)確，及其快速發(fā)展趨勢和前景，胞外RNA被認(rèn)為在疾病診斷、法醫(yī)鑒定、產(chǎn)前診斷等方面有很好的應(yīng)用價(jià)值[參見VlassovVV，LaktionovPP，RykovaEY.Extracellularnucleicacids.Bioessays2007，29:654-67]。雖然目前已有一些關(guān)于胞外RNA的研究，但卻缺少一種廉價(jià)而可靠的提取這些胞外RNA的方法，目前所用的方法主要是用昂貴的試劑盒，如聯(lián)合應(yīng)用TRIzolLS和QIAGENRNasyKit來提取胞外RNA。目前也未見精漿胞外RNA的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的任務(wù)是提供一種從精漿中提取游離RNA的方法，使其具有價(jià)廉、安全可靠、容易操作、易于推廣應(yīng)用、所提取的胞外RNA含量高、質(zhì)量好、無創(chuàng)等特點(diǎn)，可替代現(xiàn)行的穿剌方法，從而克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種從精漿中提取胞外RNA的方法包括以下步驟(1)配制變性液A:變性液A由pH值和濃度分別為7.0和50mmol/L的檸檬酸鈉.2H20、8mol/L的硫氰酸胍、1%的N_十二烷基肌氨酸鈉、2%的TritonX-100組成，在臨用前，按每毫升變性液A加入14.4mol/L的P-巰基乙醇14ul;(2)取1ml高速離心后精漿，置5ml離心管中，加入等體積變性液A，用吸頭吹打混勻；(3)依次加入pH和濃度分別為4.0和2mol/L的醋酸鈉0.2ml、苯酚2ml和按氯仿與異戊醇體積比為49:l的比例混合的氯仿與異戊醇混合液0.4ml，每加一種后倒置混勻，全部加完后劇烈振蕩30秒；(4)冰浴15分鐘；(5)在離心力為12000g和4t:條件下離心15分鐘；(6)小心吸取上清入另一離心管中，向該上清離心管中加入與上清等體積的預(yù)先冷藏的異丙醇，用吸頭吹打混勻，置-201:沉淀1小時(shí)；(7)在離心力為12000g和4t:條件下離心15分鐘；(8)配制變性液B:變性液B由pH和濃度分別為5.2和300mmol/L的乙酸鈉濃度、濃度為4mol/L的硫氰酸胍組成；(9)棄上清，收集沉淀，加入0.5ml變性液B溶解沉淀，沉淀溶解后移入1.5ml離心管中；(10)加入0.5ml預(yù)先冷藏的異丙醇，用吸頭吹打混勻，置-2(TC沉淀1小時(shí)；(11)在離心力為12000g和4t:條件下離心15分鐘；(12)棄上清，向沉淀中加入用不含RNA酶的水配制的75X乙醇lml，用吸頭吹打使沉淀溶解；(13)在離心力為12000g和4t:條件下離心5分鐘；(14)棄上清，干燥5分鐘，向沉淀中加入50iil不含RNA酶的水溶解沉淀，即為所提取的精漿胞外RNA。本發(fā)明在研究精子mRNA工作中，發(fā)現(xiàn)精槳中有胞外RNA，建立了從精槳中提取胞外RNA的方法，這種方法結(jié)合精液的生物化學(xué)特點(diǎn)和胞外RNA的特點(diǎn)，有針對(duì)性地選擇和組合RNA提取試劑，主要有①精漿中含豐富的蛋白質(zhì)，在變性液A中加入N-十二烷基肌氨酸鈉，促進(jìn)硫氰酸胍對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用；且在獲得RNA沉淀后，再用變性液B處理一次。②胞外RNA—般與某種物質(zhì)結(jié)合[參見VlassovVV，LaktionovPP，RykovaEY.Extracellularnucleicacids.Bioessays2007，29:654-67]，在變性液A中加入TritonX-100，有利于RNA與所結(jié)合物質(zhì)的分離。③選用了廉價(jià)而可靠的試劑。從RNA的量及質(zhì)量來看，本方法所提取的RNA比較理想。在量方面，所提取的12例標(biāo)本的胞外RNA量平均值達(dá)到1.73±0.57ug/ml，能滿足很多研究和功能檢測及評(píng)定的需要。在質(zhì)量方面，經(jīng)Agilent2100電泳檢測的結(jié)果表明，本方法所提取的RNA質(zhì)量較好，2100RIN>7.0并且28S/18S>0.7。由于精漿由前列腺、睪丸液、附睪液、精囊腺液等混合而成，而胞外RNA—般認(rèn)為來源于細(xì)胞死亡后釋放或活細(xì)胞分泌，所以，精漿胞外RNA應(yīng)含有男性生殖系統(tǒng)精液組成器官表達(dá)的基因mRNAs。本研究證實(shí)了這一點(diǎn)，用RT-PCR檢測到了精漿胞外RNA不僅含有看家基因，還含有睪丸、附睪、前列腺等特異性表達(dá)基因mRNAs。同時(shí)，也進(jìn)一步證實(shí)了本方法所提取RNA的質(zhì)量。本方法所提取的精漿胞外RNA可望成為一種新的分子標(biāo)志物，能反映精漿來源器官的基因表達(dá)事件，闡明精漿來源器官某些疾病的發(fā)生機(jī)制，在精漿來源器官某些疾病的診斷、性犯罪法醫(yī)鑒定等方面有很好的應(yīng)用前景。其優(yōu)勢在于①人們對(duì)于生殖系統(tǒng)器官的認(rèn)識(shí)偏見和過激的保護(hù)意識(shí)，使男性生殖系統(tǒng)器官標(biāo)本不易獲得，精漿胞外RNA獲得的無創(chuàng)性有很好的優(yōu)勢；②可全面代表器官整體的基因表達(dá)信息，克服穿剌標(biāo)本有可能代表性欠佳的缺點(diǎn)；③在某些疾病的診斷中，檢測基因表達(dá)是更敏感而準(zhǔn)確的方法，如通過檢測腫瘤特異性標(biāo)記物的mRNA診斷腫瘤。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)精漿中存在細(xì)胞外RNA，為男性生殖系統(tǒng)器官來源的mRNAs，可作為一種無創(chuàng)性的新分子標(biāo)志物，替代穿剌，用于分析男性生殖系統(tǒng)器官的基因表達(dá)情況。本發(fā)明首次建立提取精液胞外RNA的方法，該方法成本低廉、結(jié)果可靠、易于推廣應(yīng)用，所提取的胞外RNA含量高、質(zhì)量好，為一種無創(chuàng)性的手段，可替代現(xiàn)行的穿剌方法而應(yīng)用于男性生殖器官基因表達(dá)研究和器官功能檢測、評(píng)定。圖1為所提取精漿胞外RNA經(jīng)Agilent2100電泳檢測代表圖。NRNA為提取的精槳胞外RNA樣品；圖2為逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測精槳cell-freeRNA含多種基因的mRNAs。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l本發(fā)明實(shí)驗(yàn)資料1.本發(fā)明實(shí)驗(yàn)所用試劑焦碳酸二乙酯DNA酶I匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶RNA酶抑制劑Olig(dT)18TaqDNA聚合酶Sigma(St.Louis，USA)FermentasLifeScience(Hanover,USA)ToyoboCompany(Osaka,Japan)ToyoboCompany(Osaka,Japan)ToyoboCompany(Osaka,Japan)TaKaRaBiotechnology(大連，中國)欲3變性液B苯酚氯仿_異戊醇異丙醇無水乙醇2mol/L乙酸鈉變性液A50mmol/L檸檬酸鈉.2H20(pH7.0)8mol/L硫氰酸胍1%N-十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)2%(v/v)TritonX-1000.2mol/LP-巰基乙醇(臨用前加，每ml加14.4mol/LP-巰基乙醇14ul)300,1/L乙酸鈉(pH5.2)4mol/L硫氰酸胍分子生物學(xué)級(jí)，水飽和分子生物學(xué)級(jí)，49:1分子生物學(xué)級(jí)分子生物學(xué)級(jí)去RNA酶水配，pH5.21.本發(fā)明實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器電子天平(AE-240型)低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(LDZ5-2型)高速冷凍離心機(jī)(BR4i型)恒溫水浴箱(DK-S22型)超凈工作臺(tái)(FLC-3型)微量核酸測定儀(Photometer)普通PCR儀(ThermalCycler480)瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)BiometraAgilent2100電泳系統(tǒng)Agilent2.精漿標(biāo)本收集與處理人精液標(biāo)本均取自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，供精者知情同意，禁5天，手淫法采集精液[參見WorldHealthOrganization丄Eibo:ratoryMEirumlfor上海梅特勒_托利多儀器有限公司北京醫(yī)用離心機(jī)廠Thermo上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠哈爾濱市東聯(lián)公司BiometraPerkinElmer(Weliesley,USA)BioRadtheexaminationofhumansemenandsperm—cervicalmucusinteraction.1999，4thedn，CambridgeUniversityPress,NewYork,USA]，用一次性無菌采精杯收集射出全部精液。精液37t:液化30min后，15，000g離心10min，取上清，普通光學(xué)顯微鏡高倍鏡下確認(rèn)無細(xì)胞和胞漿殘余體等顆粒性物質(zhì)。3.精槳RNA提取(1)配制變性液A:變性液A由pH值和濃度分別為7.0和50mmol/L的檸檬酸鈉.2H20、8mol/L的硫氰酸胍、1%的N_十二烷基肌氨酸鈉、2%的TritonX-100組成，在臨用前，按每毫升變性液A加入14.4mol/L的P-巰基乙醇14ul;(2)取1ml高速離心后精漿，置5ml離心管中，加入等體積變性液A，用吸頭吹打混勻；(3)依次加入pH和濃度分別為4.0和2mol/L的醋酸鈉0.2ml、苯酚2ml和按氯仿與異戊醇體積比為49:l的比例混合的氯仿與異戊醇混合液0.4ml，每加一種后倒置混勻，全部加完后劇烈振蕩30秒；(4)冰浴15分鐘;(5)在離心力為12000g和4t:條件下離心15分鐘；(6)小心吸取上清入另一離心管中，向該上清離心管中加入與上清等體積的預(yù)先冷藏的異丙醇，用吸頭吹打混勻，置-201:沉淀1小時(shí)；(7)在離心力為12000g和4t:條件下離心15分鐘；(8)配制變性液B:變性液B由pH和濃度分別為5.2和300mmol/L的乙酸鈉濃度、濃度為4mol/L的硫氰酸胍組成；(9)棄上清，收集沉淀，加入0.5ml變性液B溶解沉淀，沉淀溶解后移入1.5ml離心管中；(10)加入0.5ml預(yù)先冷藏的異丙醇，用吸頭吹打混勻，置-2(TC沉淀1小時(shí)；(11)在離心力為12000g和4t:條件下離心15分鐘；(12)棄上清，向沉淀中加入用不含RNA酶的水配制的75X乙醇lml，用吸頭吹打使沉淀溶解；(13)在離心力為12000g和4t:條件下離心5分鐘；(14)棄上清，干燥5分鐘，向沉淀中加入50iil不含RNA酶的水溶解沉淀，即為所提取的精漿胞外RNA。4.微量核酸測定儀測定RNA的濃度和純度按0D26。值計(jì)算RNA的濃度，1OD=40iigRNA，純度按0D26。/0D28。評(píng)價(jià)。5.檢測所提取RNA的質(zhì)量根據(jù)測定濃度，取2ugRNA上樣，經(jīng)Agilent2100電泳檢測所提取RNA的質(zhì)量。6.逆轉(zhuǎn)錄-PCR逆轉(zhuǎn)錄-PCR用于檢測所提取的RNA中是否存在男性生殖系統(tǒng)器官表達(dá)基因的mRNA。所提取RNA先經(jīng)DNA酶I處理在0.2mlRNase-free的PCR管中加入并混勻以下成份1yg總RNA，1ii110XReactionBuffer(含Mg2+)，1ii1DNA酶I(lIU/ii1)，加DEPC處理雙蒸水至終體積為10ii1;置普通PCR儀上37。C孵育30min;加入1y125mmol/LEDTA，置65。C孵育lOmin滅活DNA酶I。逆轉(zhuǎn)錄在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為25ill。取1yg用DNA酶I處理過的總RNA，加入lyg01ig(dT、，75。C變性5min后置冰上，加入5iU5X逆轉(zhuǎn)錄Buffer(含Mg2+)，2.5iUdNTPs(10mmol/L)，20IURNA酶抑制劑和100IU匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶，加DEPC處理雙蒸水至25iU。42t:逆轉(zhuǎn)錄lh后，95t:5min滅活RNA酶。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA作為模板用于PCR。PCR所有引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，為了避免可能殘存基因組DNA的污染，引物設(shè)計(jì)在不同的外顯子，引物序列見表1和序列表。PCR體系體積為25iil，體系主要組分終濃度為10mmol/LTris-HCl(pH8.3)，50mmol/LKCl，2mmol/LMgCl2，200iimol/LdNTPs，1.5IUTaqDNA聚合酶，0.4iimol/L引物，1ii1cDNA。陰性對(duì)照以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中未加逆轉(zhuǎn)錄酶的精漿RNA為模板。PCR反應(yīng)條件為94°C5min(預(yù)變性)后進(jìn)入循環(huán)(35個(gè))94t:變性20sec;退火20sec(退火溫度見表1);72。C延伸80sec;循環(huán)結(jié)束后72"延伸5min。表l.RT-PCR所用引物目的基因表達(dá)器官引物序列a產(chǎn)物長度(bp)退火溫度(°c)n藩廣泛表達(dá)5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3'5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3'(F)(R)4丄663睪丸5'-TCTGCGAAACATAGGGGATGA-3'5'-CTGCCAGTATTCCCACAACGA-3(F)'(R)31562附睪5'-GCCCACGCAAGCCCTTGCTAT-3'5'-CTCGGCTCACTGCAACCTCTG-3'(F)(R)18162力r,前列腺5，-AGGCAGAATTGGCCAGCTACT-3'5'-TCAGAAGATTGTTCTCATCACCA(F)-3'(R)44360代表上游引物，代表下游引物.7.PCR產(chǎn)物鑒定和測序PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步經(jīng)測序鑒定。結(jié)果1.本發(fā)明方法所提取精漿胞外RNA的濃度共收集和提取了12例病例標(biāo)本，經(jīng)微量核酸測定儀檢測，精漿中胞外RNA濃度范圍為1.212.02ug/ml，平均值為1.73±0.57ug/ml。2.本發(fā)明方法所提取精漿胞外RNA的質(zhì)量共有3例標(biāo)本的精漿胞外RNA經(jīng)Agilent2100電泳檢測所提取RNA的質(zhì)量，結(jié)果表明，本方法所提取的RNA質(zhì)量較好，2100RIN>7.0并且28S/18S>0.7，見圖1。3.男性生殖系統(tǒng)器官表達(dá)基因mRNA的存在情況在所有精槳標(biāo)本胞外RNA都檢測到看家基因13-ACTIN的mRNA，表明每份標(biāo)本都成功提取了胞外RNA并逆轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測了男性生殖系統(tǒng)器官特異性表達(dá)基因的mRNA，結(jié)果表明，在所提取的精槳標(biāo)本胞外RNA中，都檢測到了睪丸特異性表達(dá)基因hVASA，附睪特異性表達(dá)基因hWFDC8，前列腺特異性表達(dá)基因hTGM4，見圖2。實(shí)施例2方法收集和分離12例精漿，經(jīng)兩次變性液處理后，分別用異丙醇和乙醇沉淀和洗滌RNA。用核酸測定儀測定0D260值，計(jì)算胞外RNA濃度。采用Agilent2100電泳觀察所提取胞外RNA的質(zhì)量。將所提取胞外RNA用于逆轉(zhuǎn)錄-PCR，擴(kuò)增看家基因P-ACTI隊(duì)睪丸特異性表達(dá)基因hVASA、附睪特異性表達(dá)基因hWFDC8、前列腺特異性表達(dá)基因hTGM4的mRNA，結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測序鑒定，進(jìn)一步檢驗(yàn)所提取胞外RNA的質(zhì)量。結(jié)果12例標(biāo)本均從精液中成功提取胞外RNA，每毫升精液胞外RNA含量為1.73±0.57ug。Agilent2100電泳檢測所提取RNA的質(zhì)量的結(jié)果表明所提取的RNA質(zhì)量較好，2100RIN>7.0并且28S/18S>0.7。在所有精漿標(biāo)本胞外RNA都檢測到看家基因13-ACTIN的mRNA，睪丸特異性表達(dá)基因hVASA，附睪特異性表達(dá)基因hWFDC8，前列腺特異性表達(dá)基因hTGM4。以下為本發(fā)明專利申請中RT-PCR所用引物的序列表，表中各序列依次為序列1為13-ACTIN基因上游引物；序列2為|3-ACTIN基因下游引物；序列3為hVASA基因上游引物；序列4為hVASA基因下游引物；序列5為hWFDC8基因上游引物；序列6為hWFDC8基因下游引物；序列7為hTGM4基因上游引物;序列8為hTGM4基因下游引物。序列表〈110〉華中科技大學(xué)〈120〉從精槳中提取胞外RNA的方法〈130>-<160>8〈170>PatentInversion3.5〈210>1〈211>20<212>DNA〈213〉人類〈400>1gagctacgagctgcctgacg20<210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉人類〈400>2cctagaagcatttgcggtgg20〈210>3〈211>21〈212>DNA〈213〉人類〈400>3tctgcga朋c3taggggatga21〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213〉人類〈400>4ctgccagtattcccacaacga21〈210>5〈211>21〈212>DNA〈213〉人類〈400>5gcccacgcaagcccttgctat21〈210>6〈211>21〈212>DNA〈213〉人類〈400>6ctcggctcactgcaacctctg21〈210>7<211>21〈212>DNA〈213〉人類〈400>7aggcagaattggccagctact21〈210>8〈211>23〈212>DNA〈213〉人類〈400>8tcagaagattgttctcatcacca2權(quán)利要求一種從精漿中提取胞外RNA的方法，包括以下步驟(1)配制組份及終濃度如下的變性液A50mmol/L檸檬酸鈉.2H2O(pH7.0)8mol/L硫氰酸胍1％N-十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)2％(v/v)TritonX-1000.2mol/Lβ-巰基乙醇(臨用前加，每ml加14.4mol/Lβ-巰基乙醇14ul)在臨用前，按每毫升變性液A加入14.4mol/L的β-巰基乙醇14ul；(2)取1ml高速離心后精漿，置5ml離心管中，加入等體積變性液A，用吸頭吹打混勻；(3)依次加入pH和濃度分別為4.0和2mol/L的醋酸鈉0.2ml、苯酚2ml和按氯仿與異戊醇體積比為49∶1的比例混合的氯仿與異戊醇混合液0.4ml，每加一種后倒置混勻，全部加完后劇烈振蕩30秒；(4)冰浴15分鐘；(5)在離心力為12000g和4℃條件下離心15分鐘；(6)小心吸取上清入另一離心管中，向該上清離心管中加入與上清等體積的預(yù)先冷藏的異丙醇，用吸頭吹打混勻，置-20℃沉淀1小時(shí)；(7)在離心力為12000g和4℃條件下離心15分鐘；(8)配制組份及終濃度如下的變性液B300mmol/L乙酸鈉(pH5.2)4mol/L硫氰酸胍(9)棄上清，收集沉淀，加入0.5ml變性液B溶解沉淀，沉淀溶解后移入1.5ml離心管中；(10)加入0.5ml預(yù)先冷藏的異丙醇，用吸頭吹打混勻，置-20℃沉淀1小時(shí)；(11)在離心力為12000g和4℃條件下離心15分鐘；(12)棄上清，向沉淀中加入用不含RNA酶的水配制的75％乙醇1ml，用吸頭吹打使沉淀溶解；(13)在離心力為12000g和4℃條件下離心5分鐘；(14)棄上清，干燥5分鐘，向沉淀中加入50μl不含RNA酶的水溶解沉淀，即為所提取的精漿胞外RNA。2.—種用于從精漿中提取胞外RNA的變性液，其組份和終濃度為50mmol/L擰檬酸鈉.2H20(pH7.0)，8mol/L硫氰酸胍，1%N-十二烷基肌氨酸鈉(sarcosyl)，2%(v/v)TritonX_100，0.2mol/LP-巰基乙醇(臨用前加，每ml加14.4mol/LP-巰基乙醇14ul)。3.—種用于從精漿中提取胞外RNA的變性液，其組份和終濃度為300,1/L乙酸鈉(pH5.2)，4mol/L硫氰酸胍。全文摘要本發(fā)明提供了一種從精漿中提取胞外RNA的方法，包括將收集和分離精漿、對(duì)精漿進(jìn)行兩次變性液處理、用異丙醇和乙醇沉淀和洗滌RNA等步驟，該方法結(jié)合精液的生物化學(xué)特點(diǎn)和胞外RNA的特點(diǎn)，有針對(duì)性地選擇和組合RNA提取試劑，針對(duì)精漿中含豐富的蛋白質(zhì)，在變性液中加入了N-十二烷基肌氨酸鈉，以促進(jìn)硫氰酸胍對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用；針對(duì)胞外RNA一般與某種物質(zhì)結(jié)合的特點(diǎn)，在變性液中加入了TritonX-100，有利于RNA與所結(jié)合物質(zhì)的分離。該方法成本低廉、結(jié)果可靠、易于推廣應(yīng)用，所提取的胞外RNA含量高、質(zhì)量好，為一種無創(chuàng)性的手段，可替代現(xiàn)行的穿刺方法而應(yīng)用于男性生殖器官基因表達(dá)研究和器官功能檢測、評(píng)定。文檔編號(hào)C12N15/10GK101747398SQ20081023689公開日2010年6月23日申請日期2008年12月19日優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日發(fā)明者李紅鋼,熊承良申請人:華中科技大學(xué)