專利名稱：誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)載體，特別涉及一種誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生 的植物雙元表達(dá)載體，還涉及該表達(dá)載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
利用基因工程技術(shù)把特定的外源基因?qū)胫参锸荏w中，達(dá)到改變植物性狀 (如抗蟲、抗病、抗逆等)以及快速培育植物新品種的目的，是現(xiàn)代遺傳育種 的重要途徑。
植物基因工程的核心是植物的遺傳轉(zhuǎn)化。植物遺傳轉(zhuǎn)化方法主要分為兩類 即利用載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化(如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、脂質(zhì)體法等)和直接遺傳轉(zhuǎn)化(如基 因槍法、PEG法、電激法、顯微注射法、花粉管通道法、超聲波法等)。其中， 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是采用含有目的基因的農(nóng)桿菌浸染植物受體，通過(guò)誘導(dǎo)抗性植物 再生從而獲得轉(zhuǎn)基因植抹。由于其具有易操作、低費(fèi)用、高效率、插入片段確 定性好和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)低等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為植物遺傳轉(zhuǎn)化的首選方法。目 前，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法獲得轉(zhuǎn)基因植抹的植物已達(dá)100種以上，包括水稻、 玉米、馬鈴薯、棉花、大豆、油菜、番茄、黃瓜、苜蓿、核桃、蔬菜和牧草等。 但是，該方法仍然存在以下問(wèn)題(1) 一些重要植物(如木本植物、單子葉植 物)的轉(zhuǎn)化頻率低，轉(zhuǎn)化植抹難于再生；(2)同種植物不同品種之間的轉(zhuǎn)化頻 率和再生頻率差異大；(3 ) —些在生產(chǎn)上運(yùn)用較廣的植物品種難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn) 化等。研究發(fā)現(xiàn)，存在上述問(wèn)題的主要原因在于植物再生困難，組織培養(yǎng)中 無(wú)法獲得再生苗。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為克服現(xiàn)有植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的之一
6在于提供一種誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達(dá)載體，不僅可以利用 外源基因的超量表達(dá)促進(jìn)植物愈傷組織形成胚狀體，再誘導(dǎo)形成轉(zhuǎn)基因植林， 顯著提高植物的轉(zhuǎn)化頻率和再生頻率，而且可以從轉(zhuǎn)基因植抹的基因組中有效 地刪除外源基因，以消除外源基因的超量表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因植抹的負(fù)面影響。
為達(dá)到此目的，本發(fā)明的植物雙元表達(dá)載體，包含Aii1/基因和FLP-FRT位 點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，所述FLP-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)包含F(xiàn)LP基因和兩個(gè)同 向FRT位點(diǎn)，所述i9iW基因和FLP基因位于兩個(gè)同向FRT位點(diǎn)之間，^gfil/基因由 組成型啟動(dòng)子控制，F(xiàn)LP基因由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制。
進(jìn)一步，所述組成型啟動(dòng)子選自花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、甘露 堿合成酶基因(mas)啟動(dòng)子或章魚堿合成酶基因(ocs)啟動(dòng)子；
進(jìn)一步，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自熱激啟動(dòng)子HSP18. 2、 Gmhspl7. 5-E或 Gmhspl7. 5C;
進(jìn)一步，所述植物為雙子葉植物；
進(jìn)一步，所述雙子葉植物為楊樹(shù)；
進(jìn)一步，所述才直物雙元表達(dá)載體為pLFFLPBBM。
胚狀體誘導(dǎo)是植物組織培養(yǎng)的常用方法，具有增殖率高、可免去生根步驟 等優(yōu)點(diǎn)。AiW(BABY BOOM)基因(核苷酸序列如SEQ ID No.l4所示)來(lái)自于油 菜(Brassica napus )，為AP2/ERF家族成員，在發(fā)育的胚中特異性表達(dá)，可以 促進(jìn)細(xì)胞分裂和體細(xì)胞胚胎的形態(tài)發(fā)生變化，起誘導(dǎo)植物激素的作用或提高細(xì) 胞對(duì)激素的敏感性。朋W基因超量表達(dá)，可以使外植體在沒(méi)有外源激素的條件下 產(chǎn)生大量的胚狀體，顯著提高植物的再生頻率。
FLP-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)來(lái)自于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ) 細(xì)胞核內(nèi)2 ^im質(zhì)粒，由FLP基因(核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示)和FLP 重組識(shí)別位點(diǎn)(FLP recognition target, FRT)組成，重組酶FLP可催化位于 同一分子上兩個(gè)同向FRT ( loxPFRT)位點(diǎn)間DNA片段的切除。由于55#基因的 超量表達(dá)會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植抹產(chǎn)生一些負(fù)面影響，如植物矮化、形成玫瑰型葉片、花器官異型和降低植物育性等，在AW基因發(fā)揮完誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生
的作用后，在轉(zhuǎn)基因植林中誘導(dǎo)FLP表達(dá)，催化位于5fil/基因兩側(cè)loxPFRT位 點(diǎn)間的重組反應(yīng)，即可從轉(zhuǎn)基因植抹的基因組中有效地刪除朋#基因，消除其 對(duì)轉(zhuǎn)基因植林的負(fù)面影響。
植物基因啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，處于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心環(huán)節(jié)。 組成型啟動(dòng)子(constitutive promoter)是指在該類啟動(dòng)子控制下，結(jié)構(gòu)基因 的表達(dá)在一定水平上保持恒定，在不同組織、部位表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，包 括但不限于CaMV 35S啟動(dòng)子、mas啟動(dòng)子和ocs啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 (inducible promoter)是指在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，該類啟 動(dòng)子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，如光誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子、熱誘導(dǎo)表 達(dá)基因啟動(dòng)子等，其中熱誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子包括但不限于 HSP18. 2 (Characterizat ion of two genes encoding smal 1 heat-shock proteins in Arabidopsis thaiiana. Takahashi T et al. Mo 1 Gen Genet, Vol. 219， 365 ~ 372， 1989) 、 Gmhspl7. 5-E ( DNA sequence and transcript mapping of a soybean gene encoding a small heat-shock protein. Czarnecka E et al. Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 82， 3726 ~ 3730， 1985 )和Gmhspl7. 5C ( A heat shock-switchable gene expression system. Chen M et al. Agr Sci China, Vol. 2， 722 ~ 728. 2003.)。
在植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM中，朋W基因和FLP基因位于兩個(gè)同向FRT 位點(diǎn)之間，AW基因由CaMV 35S啟動(dòng)子控制，F(xiàn)LP基因由熱激啟動(dòng)子HSP18. 2 控制，F(xiàn)LP基因位于i ^/基因的上游。當(dāng)然，F(xiàn)LP基因也可位于》_5#基因的下游， 同樣可以達(dá)到發(fā)明目的。
本發(fā)明的目的之二在于提供一種構(gòu)建所述植物雙元表達(dá)載體的方法，操作 筒便、成本低廉。
為達(dá)到此目的，本發(fā)明的構(gòu)建所述植物雙元表達(dá)載體的方法，包括以下步驟
a、 DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT的制備
人工合成包含兩個(gè)同向FRT位點(diǎn)以及fcdll、 //wl、 iWI、 ^cl、 和 I酶切位點(diǎn)的DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT，其核普酸序列如SEQ ID No. 1 所示；
b、 中間載體pHSP-FLP-NOSl的構(gòu)建
bl、以載體pBI121為模板，以核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的引物N0S1-F 和核苷S臾序列如SEQ IDNo. 3所示的引物N0S1-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得包含終止子NOS且5，端含有酶切位點(diǎn)、3，端含有^cl酶切位點(diǎn)的DNA 片段I ;
b2、以載體pTT119為^t板，以核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示的引物 HSP18. 2-F和核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示的引物HSP18, 2-R為上、下游引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含熱激啟動(dòng)子HSP18. 2且5'端含有//wl和5WI酶切位 點(diǎn)、3'端含有酶切位點(diǎn)的DNA片段II;
b3、以載體pFLP2為模板，以核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示的引物FLP-F 和核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示的引物FLP-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得包含F(xiàn)LP基因且5'端和3'端均含有J力ol酶切位點(diǎn)的DNA片段III;
b4、將步驟bl所得DNA片段I用J力ol和^cl雙酶切后，連接到用 和5"5cl雙酶切的載體pBlueScript (SK+)上，獲得載體pN0Sl;
b5、將步驟b2所得DNA片段II用i>I和化ol雙酶切后，連接到用化/ I 和J力ol雙酶切的步驟b4所得載體pN0Sl上，獲得載體pHSP-NOSl;
b6、將步驟b3所得DNA片段III用J力ol酶切后，連接到用J力ol酶切的步驟 b5所得載體pHSP-N0S1上，獲得中間載體pHSP-FLP-NOSl;
c、 中間載體p35S-BBM-N0S2的構(gòu)建
cl、以載體pBI121為模板，以核苷酸序列如SEQ IDNo. 8所示的引物N0S2-F 和核苷酸序列如SEQ IDNo. 9所示的引物N0S2-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含終止子N0S且5'端含有J力"酶切位點(diǎn)、3，端含有和酶切位 點(diǎn)的DNA片,殳IV;
c2、以載體pBI121為模板，以核苷酸序列如SEQ ID No. IO所示的引物35S-F 和核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示的引物35S-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得包含組成型啟動(dòng)子35S且5'端含有和酶切位點(diǎn)、3'端含有 酶切位點(diǎn)的DNA片,史V;
c3、從油菜中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以所得cDNA為模板，以核苷 酸序列如SEQ ID No. 12所示的引物BBM-F和核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示 的引物BBM-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含^5^基因且5'端和3，端 均含有酶切位點(diǎn)的DNA片段VI;
c4、將步驟cl所得DNA片段IV用和雙酶切后，連接到用 和雙酶切的載體pBlueScript (SK+)上,獲得載體pN0S2;
c5、將步驟c2所得DNA片段V用和雙酶切后，連接到用 和J力ol雙酶切的步驟c4所得載體pN0S2上，獲得載體p35S-NOS2;
c6、將步驟c3所得DNA片段VI用"ot酶切后，連接到用酶切的步驟 c5所得載體p35S-NOS2上，獲得中間載體p35S-B賜-N0S2;
d、植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM的構(gòu)建
dl、將步驟a所得DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT用和^力el雙酶切 后，連接到用和觔el雙酶切去除T-DNA序列的載體pBIN19上，獲得載 體pLF;
d2、將步驟c所得中間載體p35S-BBM-NOS2用^cl和雙酶切后，獲 得DNA片段35S-BBM-N0S,將其插入到用Acl和5WI雙酶切的步驟dl所得載 體pLF上，獲得載體pLFBBM;
d3、將步驟b所得中間載體pHSP-FLP-N0S1用酶切后，獲得DNA片段 HSP-FLP-N0S，將其插入到用酶切的步驟d2所得載體pLFBBM上，即獲得 才直物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM。本發(fā)明的目的之三在于提供一種利用所述植物雙元表達(dá)載體誘導(dǎo)胚狀體形 成和植物再生的方法，操作簡(jiǎn)便、成本低廉、效果好。
為達(dá)到此目的，本發(fā)明的利用所述植物雙元表達(dá)載體誘導(dǎo)胚狀體形成和植
物再生的方法，包括以下步驟
a、 將植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，獲得含有植物雙元表達(dá)栽體的根 瘤農(nóng)桿菌；
b、 將步驟a所得含有植物雙元表達(dá)載體的根瘤農(nóng)桿菌浸染植物愈傷組織， 在不添加植物激素的條件下誘導(dǎo)植物愈傷組織形成胚狀體，再誘導(dǎo)胚狀體形成 幼苗，獲得轉(zhuǎn)基因植林；
c、 在步驟b所得轉(zhuǎn)基因植抹的幼苗中誘導(dǎo)FLP表達(dá)，從轉(zhuǎn)基因植抹的基因 組中刪除AW基因和FLP基因，消除55yl/基因?qū)D(zhuǎn)基因植抹的負(fù)面影響。
進(jìn)一步，所述植物為雙子葉植物；
進(jìn)一步，所述植物雙元表達(dá)載體為pLFFLPBBM。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明克服了現(xiàn)有植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)存在的不足， 公開(kāi)了一種誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達(dá)載體，不僅可以利用超 量表達(dá)的S^/基因促進(jìn)植物愈傷組織形成胚狀體，再誘導(dǎo)形成轉(zhuǎn)基因植林，顯 著提高植物的轉(zhuǎn)化頻率和再生頻率，而且可以從轉(zhuǎn)基因植抹的基因組中有效地 刪除5^l/基因，以消除AW基因的超量表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因植抹產(chǎn)生的負(fù)面影響；本 發(fā)明還公開(kāi)了 一種構(gòu)建所述植物雙元表達(dá)載體的方法及一種利用所述植物雙元 表達(dá)載體誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的方法，操作簡(jiǎn)便、成本低廉、效果好； 本發(fā)明為難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的植物品種提供了 一種新的遺傳轉(zhuǎn)化策略，在誘導(dǎo) 胚狀體形成和;f直物再生領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。
ii


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)
明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1為植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM的構(gòu)建示意圖； 圖2為熱激處理刪除35S::i5^/基因和HSP18. 2::FLP基因示意圖； 圖3為i^i/基因超量表達(dá)誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的示例圖； 圖4為熱激處理前后轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹的Southern雜交結(jié)果； 圖5為及W基因在轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹中表達(dá)的RT-PCIU企測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中 未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第 三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例釆用CaMV 35S啟動(dòng)子控制55#基因超量表達(dá)，促進(jìn)植 物愈傷組織形成胚狀體，再誘導(dǎo)形成轉(zhuǎn)基因植抹，從而促進(jìn)植物再生和遺傳轉(zhuǎn) 化；同時(shí)，采用熱激啟動(dòng)子HSP18. 2控制FLP基因，通過(guò)對(duì)所得轉(zhuǎn)基因柏4朱進(jìn) 行熱激處理誘導(dǎo)FLP表達(dá)，將35S::BBM基因和HSP18. 2::FLP基因從轉(zhuǎn)基因植 抹的基因組中刪除，從而消除了超量表達(dá)5^/基因?qū)D(zhuǎn)基因植抹產(chǎn)生的負(fù)面影 響。
1、植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM的構(gòu)建
圖1為植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM的構(gòu)建示意圖；如圖1所示，植物雙 元表達(dá)載體pLFFLPBBM的構(gòu)建包括以下步驟 a、 DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT的制備
人工合成包含兩個(gè)同向FRT位點(diǎn)以及fcoRI、 A>/ I、 5^cl、 J力W和
順el酶切位點(diǎn)的DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT,其核苷酸序列如下(粗斜體部分為FRT位點(diǎn)，下劃線部分為酶切位點(diǎn))
fcoRI FRT 》I
gtcgacgtagagctcgactcgag卵財(cái)〃g"a fac","3弱^34 ^紐aaCc敘aa
iWI Acl 勘I FRT
Cctagcggc-3， (SEQ ID No. 1 ) I
b 、中間載體pHSP-FLP-NOS 1的構(gòu)建
bl、合成l對(duì)引物N0S1-F: 5，-aactcgaggatcgttcaaacaUtggca-3， ( SEQ ID No. 2)，下劃線部分為勘I酶切位點(diǎn)；N0S1-R: 5，-aagagctccgatctagtaacata gatgac-3， (SEQ ID No. 3 )，下劃線部分為i^cl酶切位點(diǎn)；以載體pBI121 (美 國(guó)Clontech公司)為模板，以N0S1-F和N0S1-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 反應(yīng)條件為溫度94。C變性5分鐘，然后溫度94。C變性30秒、56。C退火30秒、 72。C延伸45秒，共4Q個(gè)循環(huán)，最后溫度72。C延伸8分鐘；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳，切膠回收純化PCR產(chǎn)物，獲得包含終止子NOS且5，端含有^01 酶切位點(diǎn)、3'端含有S"I酶切位點(diǎn)的DNA片段I ;
b2、合成1對(duì)引物HSP18. 2-F: 5"-ttggtacctgtcgacagtggatcccccgtcatttc -3， (SEQ ID No. 4)，下劃線部分分別為//wl和酶切位點(diǎn)；HSP18. 2-R: 5，-ttctcgagatgg ttcgttgcttttcggg-3， ( SEQ ID No. 5 ),下劃線部分為一I酶 切位點(diǎn)；以載體pTT119 ("l要照文獻(xiàn)方法制得Characterization of two genes encoding small heat—shock proteins in JraZj/dci/^/s f力a7/a力a. Takahashi T et al, Molecular and General Genetics MGG， Vol.219, 365 ~ 372， 1989 ) 為模板，以HSP18. 2-F和HSP18. 2-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件 與步驟M所述相同；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收純化PCR產(chǎn)物， 獲得包含熱激啟動(dòng)子HSP18. 2且5'端含有J/wI和酶切位點(diǎn)、3'端含有i^ot 酶切位點(diǎn)的DNA片,殳II;
b3、合成l對(duì)引物FLP-F: 5，-Uctcgagaaatgcgtacttatatgcgtc-3， ( SEQ IDNo. 6 )，下劃線部分為勘I酶切位點(diǎn)；FLP-R: 5，-Uctcgaggaggttgtatgccacaattt -3， (SEQ ID No. 7)，下劃線部分為酶切位點(diǎn)；以載體pFLP2 (按照文獻(xiàn)方 法制得A broad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located DM sequences: application for isolation of unmarked /^ei^o/Haoas aer收/刀osa mutants. Hoang TT et al， Gene, Vol. 212， 77 ~ 86, 1998 )為才莫板，以FLP-F和FLP-R為上、下游引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件與步驟bl所述相同；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，切膠回收純化PCR產(chǎn)物，獲得包含F(xiàn)LP基因(SEQ ID No. 15 )且5'端和3， 端均含有J力ot酶切位點(diǎn)的DM片段III;
b4、將步驟bl所得DNA片段I用和化cl雙酶切后，連接到用5WI 和雙酶切的載體pBlueScript (SK+)(美國(guó)Stratagene />司)上，獲得載 體pN0Sl;
b5、將步驟b2所得DM片段II用和雙酶切后，連接到用化/ I 和雙酶切的步驟b4所得載體pN0Sl上，獲得載體pHSP-N0S1;
b6、將步驟b3所得DNA片段III用酶切后，連接到用酶切的步驟 b5所得載體pHSP-N0Sl上，獲得中間載體pHSP-FLP-N0S1;
c 、中間載體p35S-BBM-N0S2的構(gòu)建
cl、合成l對(duì)引物N0S2-F: 5，-aactcgaggatcgttcaaacatttggca-3， ( SEQ ID No. 8),下劃線部分為勘I酶切位點(diǎn)；N0S2-R: 5，-aagagctctgtcgaccgatcUgtaa catagatgac-3， (SEQ ID No. 9)，下劃線部分分別為H和iWI酶切位點(diǎn)；以 載體pBI121為模板，以N0S2-F和N0S2-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng) 條件與步驟bl所述相同；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收純化PCR 產(chǎn)物，獲得包含終止子N0S且5'端含有酶切位點(diǎn)、3'端含有5WI和i^cl 酶切位點(diǎn)的DNA片^殳IV;
c2、合成l對(duì)引物35S-F: 5，-ttggtacctgtcgacgcccacagatggttagagag-3， (SEQ ID No. 10)，下劃線部分分別為和酶切位點(diǎn)；35S-R:5，-ttctcgagccgtgttctctcc aaatgaa-3， ( SEQ ID No. 11 ),下劃線部分為勘I 酶切位點(diǎn)；以載體pBI121為模板，以35S-F和35S-R為上、下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件與步驟bl所述相同；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回 收純化PCR產(chǎn)物，獲得包含啟動(dòng)子35S且5'端含有和酶切位點(diǎn)、3， 端含有酶切位點(diǎn)的DNA片段V;
c3、合成l對(duì)引物BBM-F: 5,-Uctcgagatgaactcgatgaataactgg-3， ( SEQ ID No. 12)，下劃線部分為酶切^f立點(diǎn)；BBM-R: 5，-ttctcgagctaagtgtcgttccaa actg-3， ( SEQ ID No, 13 )，下劃線部分為勘I酶切位點(diǎn)；采用TRIzol試劑(美 國(guó)Promega公司)提取油菜總RNA,按試劑說(shuō)明書操作；以所得油菜總RNA為模 板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)合成cDNA,按照試劑盒說(shuō)明書操 作；以所得cDNA為模板，以BBM-F和BBM-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反 應(yīng)條件為溫度94。C變性5分鐘，然后溫度94。C變性30秒、56。C退火30.秒、 72匸延伸l分鐘，共40個(gè)循環(huán)，最后溫度72。C延伸IO分鐘；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行 瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收純化PCR產(chǎn)物，獲得包含朋M基因(SEQ ID No. 14) 且5'端和3'端均含有酶切位點(diǎn)的DNA片,爻VI;
c4、將步驟cl所得DM片段IV用J力ol和雙酶切后，連接到用5WI 和Sacl雙酶切的載體pBlueScript (SK+)上，獲得載體pN0S2;
c5、將步驟c2所得DNA片段V用和雙酶切后，連接到用 和Jbl雙酶切的步驟c4所得載體pN0S2上，獲得載體p35S-N0S2;
c6、將步驟c3所得DM片段VI用酶切后，連接到用酶切的步驟 c5所得載體p35S-NOS2上，獲得中間載體p35S-BBM-NOS2;
d、植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM的構(gòu)建
dl、將步驟a所得DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT用fcMI和順el雙酶切 后，連接到用和順el雙酶切去除T-DNA序列的載體pBIN19 (按照文獻(xiàn)方 法制得Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Bevan, Nucleic Acids Research, vol. 12， 8711 - 8720, 1984 )上，獲得載體pLF;
15d2、將步驟c所得中間載體p35S-BBM-N0S2用^cl和雙酶切后，獲 得DNA片段35S-BBM-NOS,將其插入到用5^cl和雙酶切的步驟dl所得載 體pLF上，獲得載體pLFBBM;
d3、將步驟b所得中間載體pHSP-FLP-N0S1用酶切后，獲得DNA片段 HSP-FLP-N0S,將其插入到用5WI酶切的步驟d2所得載體pLFBBM上，即獲得 植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM。
2、才直物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM的應(yīng)用
植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM可用于誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生。以雙子 葉植物楊樹(shù)為例，利用植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再 生的方法，包括以下步驟
a、 用凍融法將植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM轉(zhuǎn)化入才艮瘤農(nóng)桿菌LBA4404菌 抹，再用含有卡那霉素和鏈霉素的YEB平板篩選陽(yáng)性克隆，獲得含有植物雙元 表達(dá)載體pLFFLPBBM的才艮瘤農(nóng)桿菌LBA4404;轉(zhuǎn)化及篩選方法為將pLFFLPBBM 1 pg加至LBA4404感受態(tài)細(xì)胞100 中，冰浴30分鐘，液氮速凍5分鐘，溫 度37。C水浴5分鐘，立即水浴2分鐘，再轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至溫度28。C的YEB液體培 養(yǎng)基1000 中，在溫度28。C條件下振搖培養(yǎng)3小時(shí)，離心收集菌體，用YEB 液體培養(yǎng)基100 |iL重懸后，均勾涂布在含有濃度為50 mg/L的卡那霉素和濃度 為125 mg/L的鏈霉素的YEB平板上，在溫度37。C條件下培養(yǎng)48小時(shí)，從平板 上挑取單個(gè)菌落(即陽(yáng)性克隆)，置溫度-8(TC保存，備用；
b、 取楊樹(shù)葉片作為外植體，用水清洗干凈，置質(zhì)量百分濃度為10%的次氯 酸鈉溶液中滅菌10分鐘，再用水清洗干凈，置愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(由MS基本培 養(yǎng)基、濃度為2 mg/L的玉米素和濃度為0. 5 mg/L的萘乙酸組成)上誘導(dǎo)愈傷， 避光培養(yǎng)20天后，獲得楊樹(shù)白色愈傷組織；將步驟a所得含有植物雙元表達(dá)載 體pLFFLPBBM的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404接種于含有濃度為50 mg/L的卡那霉素和 濃度為125 mg/L的鏈霉素的YEB平板上，在溫度28。C條件下培養(yǎng)2天，從平板 上挑取單個(gè)菌落，接種于含有濃度為50 mg/L的卡那霉素和濃度為125 mg/L的鏈霉素的YEB液體培養(yǎng)基5 mL中，在溫度28。C、振搖速度200 r/min條件下振 搖培養(yǎng)，待0D鋼值達(dá)到0. 8時(shí)(0D,值在0. 5 ~ 0. 8之間都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的)， 浸染所得楊樹(shù)愈傷組織，10分鐘后除去菌液(10 ~ 30分鐘都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目 的)，將楊樹(shù)愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基(由MS基本培養(yǎng)基、濃度為2 mg/L的玉 米素和濃度為0.5 mg/L的萘乙酸組成)上，在溫度28。C、避光條件下共培養(yǎng)2 天(2 ~ 3天都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的)，再將楊樹(shù)愈傷組織轉(zhuǎn)移到未添加任何激素 的MS基本培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)約20天后形成胚狀體，再將胚狀體轉(zhuǎn)移到0.5 xMS基本培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)至形成幼苗，獲得轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植林；
c、將步驟b所得轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹的幼苗進(jìn)行熱激處理在溫度37i:(溫度 在37 ~ 42。C之間都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的)條件下保溫1小時(shí)，在溫度25。C (溫 度在15 ~ 30。C之間都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的)條件下放置1小時(shí)，再在溫度37°C (溫度在37 ~ 42。C之間都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的)條件下保溫1小時(shí)，最后在溫 度25°C (溫度在15 ~ 3(TC之間都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的)條件下培養(yǎng)，即得已刪 除35S::BBM基因和HSP18. 2::FLP基因的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹，如圖2所示。
^^基因超量表達(dá)誘導(dǎo)楊樹(shù)胚狀體形成和植物再生的結(jié)果如圖3所示，其中， A為未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的楊樹(shù)愈傷組織，未見(jiàn)胚狀體形成；B為用含有植物雙元表達(dá)載 體pLFFLPBBM的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的楊樹(shù)愈傷組織，可見(jiàn)胚狀體形 成，黑色箭頭所指處為胚狀體；C為胚狀體形成的幼苗。
應(yīng)用效果驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植株的分子鑒定 (1) Southern雜交
取步驟b所得未經(jīng)過(guò)熱激處理的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹和步驟c所得經(jīng)過(guò)熱激處理 的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植林，分別參照文獻(xiàn)(Isolation of plant DNA from fresh tissue. Doyle JJ et al， Focus, Vol. 12: 13 ~ 15， 1990 )采用改良CTAB法提取基因組 DNA;將所得基因組DNA用Hind III酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量百分濃度為1 %的瓊脂 糖電泳分離后轉(zhuǎn)移至尼龍膜(美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech^^司)上，與 采用4笨4十制備i式劑盒(美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech乂;^司)才示i己的^g^I/cDNA探針進(jìn)行雜交，雜交完畢后洗膜，壓X光片，放射性自顯影。結(jié)果如圖4所示， 其中，1 6為未經(jīng)過(guò)熱激處理的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹，1T 6T為經(jīng)過(guò)熱激處理的轉(zhuǎn) 基因楊樹(shù)植抹，WT是未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的對(duì)照楊樹(shù)植抹，P是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；從圖可 知，在6個(gè)未經(jīng)過(guò)熱激處理的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹中，除了植4朱4以外，植4朱1、 2、 3、 5和6均顯示AW基因的雜交條帶，表明除了4為假陽(yáng)性植抹以外，1、 2、 3、 5和6 均為轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植林，朋^基因已經(jīng)整合到植抹的基因組中；而在除了假陽(yáng)性植 抹4T以外的5個(gè)經(jīng)過(guò)熱激處理的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹中，植株1T、 2T、 3T和5T未顯示 7 ^/基因的雜交條帶，表明^25#基因已經(jīng)成功地從轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植林11\ 2T、 3T和 5T的基因組中刪除。 (2 ) RT-PCR4全測(cè)
取上述經(jīng)過(guò)Southern雜交鑒定的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹l、 2、 3、 5和6，采用TRIzol 試劑(美國(guó)Promaga公司)提取總RNA,按照試劑盒說(shuō)明書操作；以所得總RNA為 模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)合成cDNA,按照試劑盒說(shuō)明書操 作；以所得cDNA為模板，以BBM-F和BBM-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條 件為溫度94。C變性5分鐘，然后溫度94。C變性30秒、56。C退火30秒、72。C延伸 l分鐘，共40個(gè)循環(huán)，最后溫度72。C延伸10分鐘；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量百分濃度 為1%的瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖5所示，其中，1、 2、 3、 5和6是轉(zhuǎn)基因楊樹(shù) 植抹，WT是未進(jìn)行轉(zhuǎn)化的對(duì)照楊樹(shù)植抹；從圖可知，；5m基因在轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植抹 1、 2、 3、 5和6中均有明顯表達(dá)，與Southern雜交結(jié)果一致。
最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管 通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所 附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。序列 表
<110> 重慶大學(xué)
< 12 0〉 誘導(dǎo)胚狀體形成和才直物再生的植物雙元表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
<160> 15
<210> 1
<211> 145
<212> 歸
<213> 人工序列
<220>
<223〉 人工序列的描述loxPFRT-MCS-loxPFRT片賴二 <400> 1
gcgaattcga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg aacttcggta 60 cctatgtcga cgtagagctc gactcgagga agttcctata ctttctagag aataggaact 120 tcggaatagg aacttcgcta gcggc 145
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物N0S1-F <400> 2
aactcgagga tcgttcaaac atttggca 28
<210〉 3
<211> 29
<212> 腿
<213> 人工序列
<220><223> 人工序列的描述引物N0S1-R <權(quán)〉3
aagagctccg atctagtaac atagatgac 29
<210〉 4
<211〉 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220〉
<223> 人工序列的描述引物HSP18. 2-F <楊〉4
Uggtacctg tcgacagtgg atcccccgtc atttc 35
<210> 5
<211> 28
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220>
<223〉 人工序列的描述引物HSP18. 2-R
<400〉 5
ttctcgagat ggttcgttgc ttttcggg 28
<210> 6
<211> 29
<212〉 醒
<213〉 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述引物FLP-F
<400> 6
Uctcgagaa atgcgtactt atatgcgtc 29
<210> 7<211〉 28
<212> 艦
<213〉 人工序列
<220>
<223〉 人工序列的描述引物FLP-R
<400> 7
ttctcgagga ggttgtatgc cacaattt 28
<210〉 8
<211〉 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220〉
<223> 人工序列的描述引物N0S2-F
<400〉 8
aactcgagga tcgttcaaac atttggca 28
<210〉 9
<211> 36
<212> DM <213>人工序列
<220〉
<223> 人工序列的描述引物N0S2-R
<400> 9
aagagctctg tcgaccgatc tagtaacata gatgac 36
<210> 10
<211> 35
<212> ■
<213> 人工序列
<220>
<223〉 人工序列的描述引物35S-F
21<formula>formula see original document page 22</formula><212〉 腿
<213〉 油菜(Brassica napus )
<220〉
<221> CDS <222〉 (1).
(1755)
<400> 14
atgaactcga
cgtacggatg
tttgatctgg
ttcggtgtca
atcaatggtg
aatttcctcg
ggcgaUgtg
acatggctga
cgaggcttgt
gatgatgtcg
attgagagtt
ggtagatacg
ggaagacaag
ttagccgcac
gagaaagagg
aggaaaagta
caacatggaa
ggaactttcg
agaggattaa
gagagcccga
gttccagcta
caaaacactg
gagaggtacg
Ucaaacaag
gttgatcatc
tatggtggtt
actgctgctg
caacagcaga
agctctaaca
tggaacgaca
tgaataactg ttgactcctc ccgctccctc ccctcgaagc gtgcatgcaa gccgcaccac gaggaggaga gtaatcattc ccctctctat tccaagagaa Uggacaaag aggcacattt tttatctggg taaagtattg tagaagagat gtggtttctc ggtggcaagc gcacacagga gcgcagtgac gtctacctat tgatgattag cgtttcagca ttggttatta aggagg嵐a atagctcgac atcaaggatt agattgctta ttcagcagtc tgtactttca cttag
gttaggcttc caccaccaga cgatgaatct tttcaccaga tacat taacc cacgatttac cggtggtggt ggttgctaat gaattcatct gactattgtt gacgtctata atgggacaat aggttatgac gggacccacc gaagcacatg tcgtggtgca taggatcgga agaggctgct taacttcgac tggtagttct taataacgtt tcatcaggga caatggagga acaacacttc ctctgatgat cgcaatccct caacgcaaga gccgggagga cggggaaggt
tctctctctc accgccgtag tctgccgttc gacaataata aataacgaac aataccaacg ggcggctcac gctaatcatc actagtgata gatgtcgtag taccgcggtg agttgcaaaa aaagaagaaa actactacta acgaggcaag tcgatttatc agagtcgccg gaggcttatg atgaacagat gcgaaacgtc tcagagagtg atggatttga aacttgtcta ttgagaaact tctgt taccg gt tggaacat aatcattatt gatUtccgg ggtggagaag
ctcatgatca atgttgccgg aaacatcttt gtcactcccg aaaatggacc agaccgttgt taggcctttc aagacaatgg gcaacaacta aaactacacc ttacaaggca gagaaggcca aagcagctag acttcccctt agtatgttgc gaggagtaac gtaacaaaga acattgcagc acaatgttaa tcaaggacgt caaataatgt gcttattgca ccgagagtac cgccgagtca Utgtggaaa cggttaatta actatgctca tggcgatttc gggctccaac
aaatcatcac 60 agggtactgt 120 tctttctcct 180 agattgggac 240 aaagcttgag 300 agatggaaat 360 gatgataaaa 420 taacggtgca 480 caacaacaat 540 gaagaaaact 600 tcggtggaca 660 gactcgcaaa 720 ggcttacgat 780 gagtgaatat 840 ctctctgcgc 900 aaggcatcac 960 cctctacttg 1020 cattaaattc 1080 agcaatcctc 1140 taacaatccg 1200 Ugcggttgg 1260 gcaacagcag 1320 tagggtttgt 1380 catgactaat 1440 tgttgttagt 1500 cgatcccttt 1560 gcatcagcaa 1620 gaataaccat 1680 gtUtcagtt 1740 1755<210> 15
<211> 1272
<212> 腿
<213〉 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) <220〉
<221〉 CDS
<222> (1)…(1272)
<400> 15
atgccacaat
g纖ggtttg
Uatgttgga
aatact"ca
tacaagacgc
gaatttacaa
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aaaaaaatgc
atactaaatt
ctcttcctag
aaatcat t ta
gagacaaaga
ccacttgtat
aggaccggca
agatcgtaca
ggcccaaaat
acggagttga
acaacgtata
tactatgcat
attgaggagt
cccgcatgga
agacgcatat
ttggtatatt aaagaccttc tgattacaca taagcaattc aaaaagcaac ttattcctta aattacagtt ttaaagcact cgtttgagta ctactttcat aat tagtcca caagcgttag atttggatga attcttcaag ataaagcttt ctcacattgg ctaatgttgt ctcatcagat atgatccaat ggcagc"at atgggataat aa
atgtaaaaca aggtgag, taacggaaca gctgagtttc aattctggEiEi ctatggacaa cgaatcatcg tctaagtgag tacttcgaga caattgtgga aaataagtat taggcacata atttttgagg caataaacag gaagaaaaat aagacatttg gggaaattgg aacagcaata atcaaaggaa agaacagcta atcacaggag
ccacctaagg atagcattat gcaatcaaga gatattgtca gcctcattaa aaacatcaat gaagaagcag ggtg譜gca tttacaaaaa agattcagcg ctgggagtaa tacttcttta aattctgaac gaataccaat gcgccttatt atgacctcat agcgataagc cctgatcact atgatagcat aagggtagtg gtactagact
tgcttgttcg gtgctgctga gagccacatt ataaatcact agaaattgat ctgatatcac ataagggaaa tctgggagat caaaaacttt atattaagaa taatccagtg gcgcaagggg cagtcctaaa tattaaaaga caatctttgc ttctttcaat gtgcttctgc acttcgcact tgaaggatga ctgaaggaag acctttcatc
tcagtttgtg 60 actaacctat 120 catgagctat 180 ccagtttaaa 240 tcctgcttgg 300 tgatattgta 360 tagccacagt 420 cactgagaaa . 480 ataccaattc 540 cgttgatccg 600 tttagtgaca 660 taggatcgat 720 acgagtaaat 780 taacttagtc 840 tataaaaaat 900 gaagggccta 960 cgtggccagg 1020 agtttctcgg 1080 gactaatcca 1140 catacgatac .1200 ctacataaat 1260 1272
2權(quán)利要求
1、誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達(dá)載體，其特征在于包含BBM基因和FLP-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，所述FLP-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)包含F(xiàn)LP基因和兩個(gè)同向FRT位點(diǎn)，所述BBM基因和FLP基因位于兩個(gè)同向FRT位點(diǎn)之間，BBM基因由組成型啟動(dòng)子控制，F(xiàn)LP基因由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達(dá)載體， 其特征在于所述組成型啟動(dòng)子選自花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子、甘露堿合成 酶基因啟動(dòng)子或章魚堿合成酶基因啟動(dòng)子。
3.其特征在于所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子選自熱激啟動(dòng)子HSP18. 2、 Gmhspl7. 5-E或 Gmhspl7. 5C。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元 表達(dá)載體，其特征在于所述植物為雙子葉植物。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達(dá)載體， 其特征在于所述雙子葉植物為楊樹(shù)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達(dá)載體， 其特征在于所述沖直物雙元表達(dá)載體為pLFFLPBBM。
7、 一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達(dá) 載體的方法，其特征在于包括以下步驟a、 DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT的制備人工合成包含兩個(gè)同向FRT位點(diǎn)以及fcoRI、《p/ I、 5WI、 i^cl、 和 飾I酶切位點(diǎn)的DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示；b、 中間載體pHSP-FLP-N0S1的構(gòu)建bl、以載體pBI121為模板，以核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的引物N0S1-F和核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示的引物N0S1-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得包含終止子NOS且5'端含有J/ W酶切位點(diǎn)、3，端含有5^cl酶切位點(diǎn)的DNA片段l;b2、以載體pTT119為模板，以核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示的引物 HSP18. 2-F和核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示的引物HSP18. 2-R為上、下游引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含熱激啟動(dòng)子HSP18. 2且5'端含有7Tp/ I和<5WI酶切位 點(diǎn)、3'端含有酶切位點(diǎn)的DNA片段II;b3、以載體pFLP2為模板，以核苦酸序列如SEQ ID No. 6所示的引物FLP-F 和核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示的引物FLP-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得包含F(xiàn)LP基因且5'端和3'端均含有化ol酶切位點(diǎn)的DNA片段m;b4、將步驟bl所得DNA片段I用和i^cl雙酶切后，連接到用 和Acl雙酶切的載體pBlueScript (SK+)上，獲得載體pNOSl;b5、將步驟b2所得DNA片段II用"/ I和J力ol雙酶切后，連接到用 和J力ol雙酶切的步驟b4所得載體pN0Sl上，獲得載體pHSP-N0S1;b6、將步驟b3所得DNA片段III用J力ol酶切后，連接到用酶切的步驟 b5所得載體pHSP-N0Sl上，獲得中間載體pHSP-FLP-N0S1;c、中間載體p35S-BBM-N0S2的構(gòu)建cl、以載體PBI121為模板，以核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示的引物N0S2-F 和核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示的引物N0S2-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得包含終止子NOS且5，端含有酶切位點(diǎn)、3，端含有A/I和Acl酶切位 點(diǎn)的DNA片段IV;c2、以載體pBI121為模板，以核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示的引物35S-F 和核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示的引物35S-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得包含組成型啟動(dòng)子35S且5'端含有《pijl和酶切位點(diǎn)、3，端含有JZ oI 酶切位點(diǎn)的DNA片段V;c3、從油菜中提取總RM，反轉(zhuǎn)錄成cDM,再以所得cDM為模板，以核香酸序列如SEQ ID No. 12所示的引物BBM-F和核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示 的引物BBM-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含A^/基因且5，端和3，端 均含有酶切位點(diǎn)的DNA片段VI;c4、將步驟cl所得DNA片段IV用J力ol和雙酶切后，連接到用5WI 和Acl雙酶切的載體pBlueScript (SK+)上，獲得載體pN0S2;c5、將步驟c2所得DNA片段V用化/ I和7力o1雙酶切后，連接到用化/ I 和雙酶切的步驟c4所得栽體pN0S2上，獲得載體p35S-N0S2;c6、將步驟c3所得DNA片段VI用酶切后，連接到用酶切的步驟 c5所得載體p35S-NOS2上，獲得中間載體p35S-BBM-N0S2;d、植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM的構(gòu)建dl、將步驟a所得DNA片段loxPFRT-MCS-loxPFRT用AcMI和順el雙酶切 后，連接到用^cMI和船el雙酶切去除T-DNA序列的載體pBIN19上，獲得載 體pLF;d2、將步驟c所得中間載體p35S-BBM-N0S2用i^cl和雙酶切后，獲 得DNA片段35S-BBM-N0S，將其插入到用i^cl和5WI雙酶切的步驟dl所得載 體pLF上，獲得載體pLFBBM;d3、將步驟b所得中間載體pHSP-FLP-NOSl用5WI酶切后，獲得DNA片段 HSP-FLP-NOS，將其插入到用酶切的步驟d2所得載體pLFBBM上，即'獲得 植物雙元表達(dá)載體pLFFLPBBM。
8、利用權(quán)利要求1所述的植物雙元表達(dá)載體誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的 方法，其特征在于包括以下步驟a、 將植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，獲得含有植物雙元表達(dá)載體的根 瘤農(nóng)桿菌；b、 將步驟a所得含有植物雙元表達(dá)載體的根瘤農(nóng)桿菌浸染植物愈傷組織， 在不添加植物激素的條件下誘導(dǎo)植物愈傷組織形成胚狀體，再誘導(dǎo)胚狀體形成 幼苗，獲得轉(zhuǎn)基因植株；c、在步驟b所得轉(zhuǎn)基因植林的幼苗中誘導(dǎo)FLP表達(dá)，從轉(zhuǎn)基因植林的基因 組中刪除iS/W基因和FLP基因。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的方法，其特征在于 所述植物為雙子葉植物。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的方法，其特征在 于所述植物雙元表達(dá)載體為pLFFLPBBM。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的植物雙元表達(dá)載體，包含BBM基因和FLP-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，F(xiàn)LP-FRT位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)包含F(xiàn)LP基因和兩個(gè)同向FRT位點(diǎn)，BBM基因和FLP基因位于兩個(gè)同向FRT位點(diǎn)之間，BBM基因由組成型啟動(dòng)子控制，F(xiàn)LP基因由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制；還公開(kāi)了構(gòu)建該植物雙元表達(dá)載體的方法及利用該植物雙元表達(dá)載體誘導(dǎo)胚狀體形成和植物再生的方法；本發(fā)明不僅可以促進(jìn)植物愈傷組織形成胚狀體，再誘導(dǎo)形成轉(zhuǎn)基因植株，顯著提高植物的轉(zhuǎn)化頻率和再生頻率，而且可以消除外源基因?qū)D(zhuǎn)基因植株的負(fù)面影響，為難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的植物品種提供了一種新的遺傳轉(zhuǎn)化策略，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101445809SQ20081023700
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者李正國(guó), 楊迎武, 羅克明, 偉 鄧, 凱 金 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)