專利名稱：一種用褐藻膠裂解酶制備褐藻膠寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用褐 1^酶^arira/ms YKW-34制備褐^^的方法。
背景技術(shù)：
褐m^是褐翻鵬的錢結(jié)構(gòu)多糖，是由D"甘賺^^和a-L-古羅糖M兩 種單體會(huì)賊的線性無分支多糖。褐^l^ 酶是一類催化褐繊,鵬的麟，根據(jù) 其底物專一性可分為甘露^ 卩古羅、 ^ 酶。褐^IMP酶具有廣泛的 應(yīng)用。首先，它可催化褐 為具有#^活性的褐 (A0S)。 AOS可以顯著 提高植物的發(fā)芽和芽的生長，具有清除自由凝啦癌活性，可提高巨噬細(xì)胞的白細(xì)胞吞 噬活性以提高人體免疫力，能有效iSS人角鄉(xiāng)胞的擴(kuò)增用于AX艦的制造，謝腿 MW益菌如雙itJ^菌和乳酸菌的生長，因此可廣^^于 、食品及制藥^^域。相 對(duì),方法，酶解效去反應(yīng)割中溫和，設(shè)備簡單，會(huì)謝氐，污染小的優(yōu)勢(shì)。其次，褐藻 ^ 酶可用于^l翻鵬，而這種縦人體內(nèi)是敗的。褐藻的細(xì)lfell破損后， 其細(xì)胞內(nèi)部的營^t/質(zhì)可以^A^動(dòng)物獲得，海藻的營養(yǎng)價(jià)值得至腿一步提高。齡卜， 褐^^f酶還;im藻類學(xué)和舒生物學(xué)的工具酶用于海^iM體的制備。
近幾+￥以來，國內(nèi)外的許多工作者開展了褐^l^酶的分離純化方面的研虹
作。海洋微生物 (:類酶的錢來源。 一些褐^Mi 斷目職弧菌、交替單胞菌、假
單胞菌、交纖單胞菌中分離出來。f踐由于海洋環(huán)境的微性如較低盼鵬，導(dǎo)致海 洋m^物產(chǎn)生的海藻多糖,獻(xiàn)繊定性不好或活性有限。尋找性狀穩(wěn)定、高活力的海
藻多糖,HiM是研虹作者的棘。
々a^'7or朋s屬是2004年建立的新屬，檢索niProtKB/TrEMBLiyg庫，目前僅有四 個(gè)^rirar朋s屬!t4物產(chǎn)生的瓊膠酶的記錄，M微生物倉^生瓊,，在瓊膠平板 上頓凹陷的菌圈，其命名依據(jù)即是鑒于其瓊膠,(agar"devoring)會(huì)旨力。除瓊膠酶 外，沒有驗(yàn)到關(guān)于^ar^or朋s產(chǎn)褐M^酶附隨。本發(fā)明人于2005年;WiW
3道中^^獲得的菌株々arjVo7ms W^/sYKW-34既會(huì)^生瓊膠酶，又育^生褐^S^f 酶。目前尚未JW褐^^酶v4^Wp^a^ W力m YKW-34制備褐^|$,0<^。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的^f共一種用褐^l^ 酶^arip^ms Wfe/s YKW-34帝恪褐,寡 糖的方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有fe^的，不足。
一種用褐^M^酶^az7Vora^a7Z^YKW-34帝i恪褐ill^MI的方法，^#征是 先制備褐m^ 酶^a^Vo7msa/Z^YKW-34酶液，另將褐ll^溶解于水中，加入制 備的酶液，于20-55。 C水浴中，分解2-180小時(shí)，升溫60 - IO(TC滅活，MJl濾，濃
縮，冷凍千燥，娜^m
本發(fā)明制備褐^^ 酶時(shí)用的培養(yǎng)基纟M^濟(jì)簡單，酶產(chǎn)量高，制得的褐mi^
解酶^az7'rara/ s a7Zws YKW-34具有獨(dú)特的Na+/『離子 性，優(yōu)良的^和pH的穩(wěn) 定性，高的比活力，肯詷時(shí)(^i繊的甘露糖^^和古羅M斷段，妒的聚合度 為2—12的褐^M具有良好的OT前景。
本發(fā)明用褐^i^ 酶^az^cra/7s a^肪YKW-34制備褐ill^^的;^法，，征 是先帝(J備褐^^^酶4garirara/zsa乃〃sYKW-34酶液，另將褐^l^溶解于水中，加入 制備的酶液，于20-55° C水浴中，爐2-180小時(shí)，升溫60 - 100。C滅活，M 濾，
繊，冷凍千燥，娜^m
帝U備褐^^i 酶/4gar/rar朋s a"〃s YKW—34酶液時(shí)，取海水1000ml，力口入50g ^^和10g硝,，以Na0H水溶液調(diào)1^刀始pH働7.0，滅菌荊轉(zhuǎn)卩體溫，力口入 100ml 12h種齡的^an'rara/z YKW-34謝，在25° C 110rpm振蕩J:歸48h，
取歸液，離心W:清液，加入10g聚iifflK除掉多糖及褐藻膠的降解產(chǎn)物，離心除 掉絮狀沉淀。將上清肚樣至DEAE-S印h畫e FF色譜柱，線性升梯度法繊，將酶活 組始并。酶肚樣至Phenol S印harose 6 FF色譜柱，線性,度法繊，將酶^^且 始并。酶^h樣至S印hacryl S-100服色譜柱，^I^得單一酶峰。得到活力為3731 U/mg 的褐^^i 酶純酶液50ml，純化倍數(shù)為20倍。
用褐^^l酶v^ar2'rar朋s a歷i/s YKW-34制備褐^l^^時(shí)，取10g褐^^溶解于1000ml水中，力口入5ml4garjVor朋sa歷iAsYKW-34褐ili^i軍酶純酶液，于35。 C 水浴中，分解16小時(shí)，升溫90。C，滅活1小時(shí)，鵬:濾，濃縮，冷凍千燥，得7.8g聚 合度為2-12的褐 成品。
本發(fā)明制備的褐藻膠裂解酶^a^Vo2ms a^os YKW-34的基本酶學(xué)性質(zhì)如下 SDS-PAGE種ll^l濾色i歸明此酶由單一肽^^賊，好量為60kDa。等電聚焦實(shí)驗(yàn)表 明其等電點(diǎn)為5.5- 5.7。 it鵬的最適pH為7.0， ； 溫度為30- 40° C，低于50° C時(shí) 穩(wěn)定。ji鵬具有鈉/鉀離子^^性。透析除去反應(yīng)體系中鈉/鉀離子后，酶活力喪失；添 加鈉/鉀離子后，酶活力可完全咴復(fù)。此酶對(duì)還原劑如H鎮(zhèn)乙醇和DTT、金屬離子絡(luò) 合劑如EDTA和EGTA具有耐受性；變性劑如SDS和尿素可使酶活力提高30%。底物專一 性實(shí)驗(yàn)表明，此酶能同時(shí)糊軍甘露糖^^和古羅M^t斷。該離良的酶學(xué)I4M使得 其具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明帝lJ備褐^I^ 酶^a^'rar朋sa7^sYKW-34時(shí)，所用的培養(yǎng)基由海水、海 藻粉及硝,戶形賊，海,的M百分?jǐn)?shù)范圍為0.001-10%，硝酸鉀的M百分?jǐn)?shù)范 圍為0.01-20%，其余為海水，培養(yǎng)基初始pH值范圍為6.5-10.0;所述的海藻粉為, 粉、馬尾藻粉、江蘺粉、麒JH^粉、紫菜粉、裙帶菜粉、稱苔粉、角叉菜粉、凝ra^粉、 螺旋藻粉^f^^;戶脫的制備褐^^解^>離純化方法為在海擬咅養(yǎng)基中，以重 量百分?jǐn)?shù)范圍為1-20%的接種量，接種12h種齡的^arz'rara/zs s歷ws YKW-34菌種，在 25° C，振蕩培養(yǎng)2-180小時(shí)，上清液，加入重量百分?jǐn)?shù)范圍為0. 0001-5%的絮》齩驟醚 St3EI安，上清液依 :^圣DEAE-S印harose FF色i普柱、Phenol S印harose 6 FF色i普柱和 S印hacrylS-100HR色i普柱線性升梯度法tt， 、M得單一酶峰，為^feaz7'rar朋sa歷〃s YKW-34的褐^^l早酶；所述的褐^feK中的Si百分?jǐn)?shù)范圍為0. 00卜30%的溶液， 褐1^ ^7K中的韓百分?jǐn)?shù)范圍為0. 001-20%，戰(zhàn)的褐^l^鎌的聚合度范圍 為2- 12。
權(quán)利要求
1. 一種用褐藻膠裂解酶Agarivorans albus YKW-34制備褐藻膠寡糖的方法，其特征是先制備褐藻膠裂解酶Agarivorans albus YKW-34酶液，另將褐藻膠溶解于水中，加入制備的酶液，于20-55°C水浴中，分解2-180小時(shí)，升溫60-100℃滅活，膜過濾，濃縮，冷凍干燥，得褐藻膠寡糖。2.如權(quán)利要求1所述的用褐藻膠裂解酶Agarivorans albus YKW-34制備褐藻膠寡糖的方法，其特征是所述褐藻膠裂解酶Agarivorans albus YKW-34的培養(yǎng)基由海水、海藻粉及硝酸鉀所組成，海帶粉的重量百分?jǐn)?shù)范圍為0.001-10％，硝酸鉀的重量百分?jǐn)?shù)范圍為0.01-20％，其余為海水，培養(yǎng)基初始pH值范圍為6.5-10.0；所述的海藻粉為海帶粉、馬尾藻粉、江蘺粉、麒麟菜粉、紫菜粉、裙帶菜粉、滸苔粉、角叉菜粉、凝花菜粉、螺旋藻粉或羊棲菜粉。
2、 如權(quán)利要求1所述的用褐藻膠裂解酶J^3nVors77s YKW-34制備 褐藻膠寡糖的方法，其特征是所述褐藻膠裂解酶^ah^raM aM"s YKW-34 的培養(yǎng)基由海水、海藻粉及硝酸鉀所組成，海帶粉的重量百分?jǐn)?shù)范圍為 O.OO卜10%，硝酸鉀的重量百分?jǐn)?shù)范圍為0.01-20%，其余為海水，培養(yǎng)基初 始pH值范圍為6.5-10.0;所述的海藻粉為海帶粉、馬尾藻粉、江蘺粉、麒 麟菜粉、紫菜粉、裙帶菜粉、滸苔粉、角叉菜粉、凝花菜粉、螺旋藻粉或 羊棲菜粉。
3、 如權(quán)利要求1所述的褐藻膠裂解酶^anVora/Ls YKW-34制備褐 藻膠寡糖的方法，其特征是所述的制備藻膠裂解酶^卵^Vora/7s 3""S YKW-34酶液時(shí)，在海水培養(yǎng)基中，以重量百分?jǐn)?shù)范圍為1-20%的接種量， 接種12h種齡的如ri,愿WteYKW-34菌種，在25° C，振蕩培養(yǎng)2-180 小時(shí)，上清液，加入重量百分?jǐn)?shù)范圍為0.0001-5%的絮凝劑聚醚酰亞胺，上 清液依次經(jīng)DEAE-S印harose FF色譜柱、Phenol S印harose 6 FF色譜柱禾口 Sephacirl S-100 HR色譜柱線性升梯度法洗脫，洗脫得單一酶峰，為 ^^anVara/^ a7Zws YKW-34的褐藻膠裂解酶。
4、 如權(quán)利要求1所述的用褐藻膠裂解酶Z卵2^Vora/ s a"i/s YKW-34制備 褐藻膠寡糖的方法，其特征是所述的褐藻膠在水中的重量百分?jǐn)?shù)范圍為 0.001-30%，褐藻膠裂解酶在水中的重量百分?jǐn)?shù)范圍為0.001-20%，所述的褐藻膠寡糖的聚合度范圍為2- 12。
全文摘要
一種用褐藻膠裂解酶Agarivorans albus YKW-34制備褐藻膠寡糖的方法，其特征是先制備褐藻膠裂解酶Agarivorans albus YKW-34酶液，另將褐藻膠溶解于水中，加入制備的酶液，于20-55℃水浴中，分解2-180小時(shí)，升溫60-100℃滅活，膜過濾，濃縮，冷凍干燥，得褐藻膠寡糖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是制備褐藻膠裂解酶用的培養(yǎng)基組成經(jīng)濟(jì)簡單，褐藻膠裂解酶酶產(chǎn)量高，具有獨(dú)特的Na⁺/K⁺離子依賴性，優(yōu)良的溫度和pH的穩(wěn)定性，高的比活力，能同時(shí)降解褐藻膠的甘露糖醛酸和古羅糖醛酸片段，生產(chǎn)的聚合度為2-12的褐藻膠寡糖具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101423854SQ20081023777
公開日2009年5月6日 申請(qǐng)日期2008年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者付曉婷, 杰 徐, 李來好, 楊賢慶, 洪 林, 王永昌, 王經(jīng)佐, 薛長湖, 許加超, 金相武, 昕 高 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)