專利名稱：植物抗病基因的克隆的制作方法
技術領域：
植物抗病基因的克隆，屬于生物工程領域。
背景技術：
植物在其長期的進化過程中常受到一些病原微生物的侵襲.它們在生態(tài)系統(tǒng)中 長期并存，相互影響乃至協(xié)同進化，在這一過程中植物逐漸獲得了一系列防御機制來保護
自己。90年代初以前，人們在植物抗性生理及抗病性在生產(chǎn)中的應用等方而做了大量的工 作，但植物抗病的分子生物學研究進展一直很緩慢。近幾年來，轉座子標簽技術、定位克隆 技術及染色體登陸技術的應用使人們克隆到了一系列植物抗病基因。

發(fā)明內(nèi)容
基因克隆就是利用體外重組技術，將特定的基因插入到能夠自主復制的DNA載體 上，從而引入到寄主細胞中進行增殖的操作。
1 、常用的植物基因克隆技術
1)轉座子標簽技術 轉座子標簽技術是將轉座子或T-DNA插入到欲分離基因的內(nèi)部或附近，基因發(fā)生 突變而被標識然后利用插入DNA片段做探針克隆到該基因。利用轉座子標簽技術克隆到的 有玉米的Hml基因，蕃茄的Cf-9基因，煙草的N基因和亞麻的L6基因。玉米中的可轉移因 子如Ac/Ds， Spm及Mu為克隆植物中未知結構和功能的抗病基因帶來了一線希望。但是由 于太高的突變率而使R基因的克隆受到阻滯，如玉米的Rpl。 第一個利用轉座子技術克隆到的是玉米的Hml基因，Hml定位于第一染色體的 長臂上，它對真菌病原物Cochliobolus carbo皿m的一號小種有抗性，它編碼一個依賴于 NADra的HC毒素還原酶，并與二氫葉酸還原酶高度同源，造成HC毒素分子毒性位點羰基的 失活。與那些依賴于Avr基因的R基因不同，其抗病機制并不符合基因對基因模式，因為Hml 的毒素降解方式并不涉及到Avr基因，不能誘導過敏性植物細胞死亡，沒有基因對基因的 一些顯著標志。Hm2基因對該病原物有部分抗性，它被定位在第九染色體的長臂上，是Hml 的復等位基因。轉座子標簽技術運用的前提條件是被操作的植物有現(xiàn)成的操作系統(tǒng)或有成 熟的根癌農(nóng)桿菌轉化系統(tǒng)以及有效的大規(guī)模突變體篩選的手段。
2)圖位克隆技術 圖位克隆技術是根據(jù)目標基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法，目標 基因精確定位在染色體特定位置之后，用目標基因兩側緊密連鎖的標記篩選含有大的插入 片段的基因組文庫(如BAC和YAC)，通過染色體步行(Chromosome Walking)篩選到含有目 標基因的克隆，最后通過遺傳轉化和功能互補實驗進行驗證。其核心技術是染色體步行，如 果能找到與目標基因很近的標記，以至于二者之間的距離小于基因組文庫中克隆的平均插 入片段大小，就可以直接篩選到含有目標基因的克隆，最終得到候選基因，這種策略稱為染 色體登陸(Chromosome Landing) (Tanksley et al，1995)。
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圖位克隆技術的發(fā)展大大加速了抗病基因的克隆，利用圖位克隆技術克隆到的抗 病基因有蕃茄的Pto基因、Cf-2基因，擬南芥的RPS2基因、RPM基因、NPR1基因和水稻的 Xa21、 Xal、 Pi_b等基因。蕃茄的Pto基因是第一個圖位克隆到的抗病基因，它符合基因對 基因模式，利用與Pto緊密連鎖的RFLP標記得到一個含有Pto區(qū)域的YAC克隆，此YAC克 隆用于分離Pto區(qū)域的cDNA，然后利用遺傳互補試驗鑒定cDNA克隆。此基因含有一個由 963bp構成的開放閱讀框架(ORF)，其蛋白產(chǎn)物是一個沒有明顯跨膜結構域和細胞外結構
域的絲_蘇氨酸蛋白激酶，它在信號傳導中起重要作用。
3)同源克隆法 同源克隆法的理論基礎是，幾乎所有的基因之間都彼此相關。人們將功能相似，來 自相同始祖的基因歸為一個家族，基因家族的成員往往成簇存在，幾個基因家族組成一個 超基因家族，超基因家族各成員之間既有高度同源區(qū)域，也有高度趨異區(qū)。首先根據(jù)基因家 族各成員間保守氨基酸序列設計簡并引物，然后用簡并引物對含有目的基因的DNA文庫進 行PCR擴增，再對PCR擴增產(chǎn)物進行擴增、克隆和功能鑒定。
4)差異表達基因的克隆 生物體的生長發(fā)育以及衰老過程是遺傳信息有序地時空表達的結果，因而分離差 異表達基因將是認識生命活動過程的切入點。分離差異表達基因的有三種方法差異篩選 (differentialscreening)、扣除雜交(subtraction hybridization)禾口差異顯不反轉錄 PCR(differential displayreverse transcription PCR，DDRT-PCR)，前兩種方法因缺點較 多，應用較少，DDRT-PCR技術在實際應用較多。DDRT-PCR技術利用真核生物成熟mRNA具有 3' -Poly (A)結構，用Oligo-dTMN(M = ACG， N = AGCT)作為錨定引物與mRNA的Poly (A) 結合，在反轉錄酶的作用下將mRNA反轉錄為cDNA，然后以原Oligo-dTMN和10bp隨機引物 組成的引物對在不同來源的cDNA中進行PCR擴增。把用相同引物對在不同來源cDNA中獲 得的PCR擴增產(chǎn)物并排在聚丙烯酰胺測序膠上電泳分離，由于擴增的cDNA片段被放射性同 位素或熒光素標記，通過自顯影或顯色，即可獲得差異表達基因擴增的條帶。將差異表達的 cDNA條帶回收、克隆后，作為探針通過Northern雜交驗證，即可用于全長基因的分離。該技 術具有簡便、靈敏、RNA用量少、效率高，可同時比較多種生理狀態(tài)細胞內(nèi)mRNA樣品等優(yōu)點。
5)表達序列標簽法 表達序列標簽是完整基因上能夠特異性標記基因的一部分序列，通常包含了基因 足夠的結構信息區(qū)，從而與其它基因相區(qū)分?；具^程為對已知的部分序列進行數(shù)據(jù)庫分 析，篩選出代表新基因的EST及相應的重疊群、定位信息等，根據(jù)所得信息設計引物，制備 探針；用探針進行cDNA文庫篩選，得cDNA陽性克隆，接著用所設計的引物與所得cDNA陽 性克隆載體臂進行巢式PCR和5'、3' -RACE，得S'端和、3'端部分序列；對所得陽性克隆和 末端序列進行測序；通過數(shù)據(jù)庫對新序列進行分析；若第一步有新EST的定位信息，即可對 基因進行定位和結構分析，若無定位信息，還要篩選基因組文庫，進行測序和熒光原位雜交 (FISH)定位等工作；最后對新發(fā)現(xiàn)的基因進行突變檢測和表達分析。
權利要求
常用的植物基因克隆技術1)轉座子標簽技術轉座子標簽技術是將轉座子或T-DNA插入到欲分離基因的內(nèi)部或附近，基因發(fā)生突變而被標識然后利用插入DNA片段做探針克隆到該基因，利用轉座子標簽技術克隆到的有玉米的Hm1基因，蕃茄的Cf-9基因，煙草的N基因和亞麻的L6基因，玉米中的可轉移因子如Ac/Ds，Spm及Mu為克隆植物中未知結構和功能的抗病基因帶來了一線希望，但是由于太高的突變率而使R基因的克隆受到阻滯，如玉米的Rp1，2)圖位克隆技術圖位克隆技術是根據(jù)目標基因在染色體上的位置進行基因克隆的一種方法，目標基因精確定位在染色體特定位置之后，用目標基因兩側緊密連鎖的標記篩選含有大的插入片段的基因組文庫(如BAC和YAC)，通過染色體步行(Chromosome Walking)篩選到含有目標基因的克隆，最后通過遺傳轉化和功能互補實驗進行驗證。其核心技術是染色體步行，如果能找到與目標基因很近的標記，以至于二者之間的距離小于基因組文庫中克隆的平均插入片段大小，就可以直接篩選到含有目標基因的克隆，最終得到候選基因，這種策略稱為染色體登陸(Chromosome Landing)(Tanksley et al，1995)，3)同源克隆法同源克隆法的理論基礎是，幾乎所有的基因之間都彼此相關。人們將功能相似，來自相同始祖的基因歸為一個家族，基因家族的成員往往成簇存在，幾個基因家族組成一個超基因家族，超基因家族各成員之間既有高度同源區(qū)域，也有高度趨異區(qū)。首先根據(jù)基因家族各成員間保守氨基酸序列設計簡并引物，然后用簡并引物對含有目的基因的DNA文庫進行PCR擴增，再對PCR擴增產(chǎn)物進行擴增、克隆和功能鑒定。4)差異表達基因的克隆生物體的生長發(fā)育以及衰老過程是遺傳信息有序地時空表達的結果，因而分離差異表達基因將是認識生命活動過程的切入點。分離差異表達基因的有三種方法差異篩選(differentialscreening)、扣除雜交(subtraction hybridization)和差異顯示反轉錄PCR(differential displayreverse transcription PCR，DDRT-PCR)，前兩種方法因缺點較多，應用較少，DDRT-PCR技術在實際應用較多。DDRT-PCR技術利用真核生物成熟mRNA具有3′-Poly(A)結構，用Oligo-dTMN(M＝ACG，N＝AGCT)作為錨定引物與mRNA的Poly(A)結合，在反轉錄酶的作用下將mRNA反轉錄為cDNA，然后以原Oligo-dTMN和10bp隨機引物組成的引物對在不同來源的cDNA中進行PCR擴增。把用相同引物對在不同來源cDNA中獲得的PCR擴增產(chǎn)物并排在聚丙烯酰胺測序膠上電泳分離，由于擴增的cDNA片段被放射性同位素或熒光素標記，通過自顯影或顯色，即可獲得差異表達基因擴增的條帶。將差異表達的cDNA條帶回收、克隆后，作為探針通過Northern雜交驗證，即可用于全長基因的分離。該技術具有簡便、靈敏、RNA用量少、效率高，可同時比較多種生理狀態(tài)細胞內(nèi)mRNA樣品等優(yōu)點。5)表達序列標簽法表達序列標簽是完整基因上能夠特異性標記基因的一部分序列，通常包含了基因足夠的結構信息區(qū)，從而與其它基因相區(qū)分?；具^程為對已知的部分序列進行數(shù)據(jù)庫分析，篩選出代表新基因的EST及相應的重疊群、定位信息等，根據(jù)所得信息設計引物，制備探針；用探針進行cDNA文庫篩選，得cDNA陽性克隆，接著用所設計的引物與所得cDNA陽性克隆載體臂進行巢式PCR和5’、3’-RACE，得5’端和、3’端部分序列；對所得陽性克隆和末端序列進行測序；通過數(shù)據(jù)庫對新序列進行分析；若第一步有新EST的定位信息，即可對基因進行定位和結構分析，若無定位信息，還要篩選基因組文庫，進行測序和熒光原位雜交(FISH)定位等工作；最后對新發(fā)現(xiàn)的基因進行突變檢測和表達分析。
全文摘要
基因克隆就是利用體外重組技術，將特定的基因插入到能夠自主復制的DNA載體上，從而引入到寄主細胞中進行增殖的操作。
文檔編號C12N15/29GK101760462SQ20081023857
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權日2008年12月19日
發(fā)明者李祥 申請人:李祥