專利名稱：反饋補料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法，具體地說涉及一種通過pH反饋控制補加底物 (糖)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法。
背景技術：
乳酸有D-和L-兩種構型，乳酸及其鹽和酯用途很廣。傳統(tǒng)上乳酸及其鹽和酯主 要用于食品工業(yè)中做添加劑使用，化學工業(yè)中做清洗劑和溶劑使用；近年，乳酸及其鹽和酯 在醫(yī)藥(如體液平衡調(diào)節(jié)劑、補鈣補鐵劑)和農(nóng)業(yè)(如植物促進劑)等行業(yè)的用途獲得 了很大的進步。 近年來，可降解塑料的興起大大促進了 L-乳酸的生產(chǎn)和應用。L-乳酸可用于合 成聚L-乳酸。聚L-乳酸塑料具有透明度高、成型度好、安全等優(yōu)點，成為可降解塑料領域 中的主要品種。美、日等國都在努力實現(xiàn)聚L-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)。聚L-乳酸塑料生產(chǎn)的 日用品、容器、玩具、薄膜、醫(yī)療衛(wèi)生用品等，正逐漸投入市場。隨著石油資源的短缺，聚乳酸 可以用于替代石油基高分子材料，具有可生物降解的特點。如果10 20年后替代石油基 原料聚合物消費量的10%，我國則聚乳酸年需求量每年近500萬噸，產(chǎn)值約500億元/年。 用聚乳酸薄膜替代不可降解石油基的高分子材料作為農(nóng)用地膜，可以增加糧食產(chǎn)量10%， 約5000萬噸，產(chǎn)值約500億元/年。乳酸甲酯和乙酯是優(yōu)良的有機溶齊U，可以替代70%的 石油基有機溶劑。 乳酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝目前還比較粗放，發(fā)酵生產(chǎn)波動大。有些企業(yè)采用了一些自動 控制設備或程序控制方法，可以實現(xiàn)pH、溫度等常規(guī)參數(shù)的控制。 乳酸的發(fā)酵過程中，如果一次性投料時加入較多的底物(糖)，會產(chǎn)生底物抑制， 影響菌體生長。目前生產(chǎn)一般采用的是補料批式發(fā)酵模式，即在開始時只加入適量(限制 濃度以上)的底物(糖)，然后在發(fā)酵過程中以某種方式再繼續(xù)補加，以維持底物(糖)濃 度在適宜的范圍內(nèi)，使之既不產(chǎn)生底物(糖)抑制，也不構成限制(缺乏)。
乳酸發(fā)酵生產(chǎn)目前采用了一些流加技術，有連續(xù)流加、不連續(xù)流加，有恒速流加、 指數(shù)流力口 (Bacteriocin production with Lactococcus amylovorusDCE 471 is improved and stabilized by fed-batch fermentation. Appl. Environ. Microbiol. ，2000，66 : 606 613 ;Fed_batch fermentation of Lactobacillus lactisfor hyper—production of L-lactic acid， Biotech丄etters， 2003， 25 :1833 1835 ;Ammonium lactate production by Lactobacillus lactis BME5-18M inpH_controlled fed-batch fermentations, Biochem. Eng. ，2004,19 :47 51)，目的都是為了控制基質(zhì)濃度。雖然這些補料的方法可以 消除限制性底物的抑制或缺乏，控制菌體的比生長速率，提高目的產(chǎn)物的濃度，以及實現(xiàn)細 胞的高密度培養(yǎng)。但是這些現(xiàn)有的補料方法都是按照事先設定的程序進行操作，不能真實 反映發(fā)酵過程中底物(糖)濃度的變化。由于發(fā)酵生產(chǎn)的多變性，各批次之間有差異，而底 物(糖)又不能在線檢測，所以難以確切知道發(fā)酵過程中底物的實際變化，其補料具有盲目 性，影響生產(chǎn)控制。
要精確控制基質(zhì)濃度，必須進行反饋控制。由于不能在線測定底物濃度，因此在線 監(jiān)測底物濃度的直接反饋流加目前難以應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法在補料時具有盲目性、影響生產(chǎn) 控制、使得發(fā)酵濃度低的缺陷，提供一種通過檢測發(fā)酵液中的PH變化，利用pH值反饋控制 補料，從而簡化生產(chǎn)工藝，在不增加額外設備的情況下使乳酸的發(fā)酵濃度提高的反饋補料 發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法。 本發(fā)明的反饋補料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法包括使用常規(guī)方法制備發(fā)酵菌種的種液，
然后接入裝有底物的發(fā)酵罐中進行好氧、厭氧或兼性厭氧乳酸發(fā)酵，其特征是在乳酸發(fā)酵
過程中，利用底物的消耗量和酸的產(chǎn)生量之間的比例關系，通過pH反饋控制加入底物和堿
性物質(zhì)的混合流加液來控制體系的pH，從而維持體系中的底物濃度在一適宜乳酸發(fā)酵的范
圍內(nèi)，使乳酸發(fā)酵時既不產(chǎn)生底物抑制，也不構成限制；該發(fā)酵過程進行至乳酸的濃度達到
所需時停止，得到含有乳酸的發(fā)酵液。
該方法的具體步驟如下 1)發(fā)酵菌種的種液制備配制種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌；將菌種接入種子培 養(yǎng)基中進行好氧或厭氧(取決于菌種特性)培養(yǎng)至對數(shù)期； 所述的好氧發(fā)酵菌種有根霉屬(Rhizopus)的米根霉(RhizopusOryzae)、行走 *艮毒(Rhizopus Stolonifer)、曰本豐艮毒(Rhizopus JaponicuS)或少豐艮豐艮毒(Rhiozopus Arrhizus)等；所述的厭氧發(fā)酵菌種有乳桿菌屬(Lactobacillus)的德式乳桿菌 (Xactobacillus delbreuckii)、擬干酪乳桿菌(Xactobacillus paracasei)、鏈球菌屬 (str印toccoccus)的唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)或芽孢桿菌屬(Bacillus) 的凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)等。 所述的種子培養(yǎng)基取決于發(fā)酵菌種的特性，為本領域常規(guī)的種子培養(yǎng)基。
發(fā)酵類型包括D-型乳酸發(fā)酵、L-型乳酸發(fā)酵或DL-型乳酸發(fā)酵。
2)好氧、厭氧或兼性厭氧乳酸發(fā)酵將步驟1)制得的種液接入經(jīng)常規(guī)方法滅菌的 初始底物濃度為10 150克/升的發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制適宜的發(fā)酵溫度，適度攪拌，不通空 氣或通入適量空氣以保持所需的溶解氧環(huán)境；乳酸發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵液中的底物轉(zhuǎn)化 為乳酸，發(fā)酵液的pH降低；當發(fā)酵液的pH(人工監(jiān)測或用pH傳感器監(jiān)測)降至設定點以下 時，(人工或由pH傳感器的信號自動反饋控制)加入底物和堿性物質(zhì)的混合流加液，直至 發(fā)酵液的PH回升至設定點；該發(fā)酵過程進行至乳酸的濃度達到所需時停止，得到含有乳酸 的發(fā)酵液。 所述的種液的接入量是發(fā)酵培養(yǎng)基重量的1 10%。 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基取決于發(fā)酵菌種的特性和產(chǎn)物乳酸的構型。 所述的好氧乳酸發(fā)酵的溫度為25 35°C ;所述的厭氧乳酸發(fā)酵的溫度為35
60°C。 所述的發(fā)酵液的pH設定點一般在3. 5 8之間，取決于發(fā)酵菌種的特性。 所述底物和堿性物質(zhì)的混合流加液中的底物濃度為150 600克/升，底物與堿
性物質(zhì)的比例為90 210克底物/摩爾堿。
所述的底物選自蔗糖、葡萄糖、木糖、果糖、麥芽糖、乳糖中一種或大于一種以上的 混合物。 所述的堿性物質(zhì)為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸銨或碳酸氫銨。 所述的pH值的反饋控制可通過市售的pH電極(傳感器)和儀表完成，或由人工 完成。 對于乳酸產(chǎn)生菌而言，乳酸合成與底物消耗存在較好的線性關系，這就為pH反饋 控制的實施提供了前提條件。 本發(fā)明提供的反饋補料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法，是基于這樣的構思由于乳酸產(chǎn)生 菌將底物(如葡萄糖)轉(zhuǎn)化為乳酸，從而導致發(fā)酵體系的PH降低，在發(fā)酵過程中需要補加 堿性物質(zhì)來維持pH的穩(wěn)定。本發(fā)明根據(jù)底物消耗速率和乳酸產(chǎn)生速率的關系，將底物和堿 性物質(zhì)按此關系配在同一溶液中，用該混合液中和發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸從而調(diào)節(jié)pH值。在向發(fā) 酵體系補加該混合溶液以調(diào)節(jié)PH的過程中，通過將pH控制在很窄的范圍內(nèi)，使得加入的堿 性物質(zhì)量(按當量計)與產(chǎn)酸量相等，所以補加該混合液控制PH的同時，隨同加入發(fā)酵體 系的底物量正好補充了消耗的底物量，從而使底物濃度維持在一定范圍。因而，只要將PH 控制在很窄的范圍內(nèi)，就可以保證發(fā)酵體系中的底物濃度只在很窄的范圍內(nèi)波動。這樣的 方法可以在不改變生產(chǎn)設備的情況下，僅在補料罐中加入堿性物質(zhì)和底物，就能夠在控制 pH的同時實現(xiàn)發(fā)酵液中底物濃度的控制，即通過pH信號的反饋來間接控制底物的補加。而 pH的控制是很成熟的技術，可以很方便的使用市售的pH電極(傳感器)、控制儀表和執(zhí)行 機構來完成，也可由人工完成。用儀表設定擬控制的pH值的范圍，由儀表自動控制。該擬 設定的PH值的范圍取決于菌種發(fā)酵的最佳pH值。 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的反饋補料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法的優(yōu)益之處在于 通過利用pH信號反饋控制底物的補加，從而間接控制了發(fā)酵液中的底物濃度，達到較準確 的控制底物濃度的目的，并且可以提高目的產(chǎn)物乳酸的濃度。在發(fā)酵過程中不需要增加額 外設備，而且補加的底物和堿性物質(zhì)的混合液可以省去滅菌操作，使生產(chǎn)操作更簡單，適合 于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式

比較例1 使用的微生物菌種為擬干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei，NERCB0401 (工業(yè)
微生物，第37巻，2007，第4期，1 5))，用上述菌株進行分批補料發(fā)酵。所用培養(yǎng)基有兩 種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L， 檸檬酸氫二銨2g/L，乙酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀2g/L，吐溫801mL/L，硫酸鎂0. 6g/L，硫酸錳 0.25g/L。 2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏6g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉 0. 03g/L，硫酸亞鐵0. 01g/L，醋酸鈉4g/L，檸檬酸二胺2g/L，磷酸二氫鉀2g/L，吐溫801mL/ L，硫酸鎂0. 2g/L，硫酸錳0. 2g/L。 將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 0，于12rC滅菌15分鐘，其中葡萄糖單獨滅菌后再混合。 菌種接入含150mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘， 37t:振蕩培養(yǎng)12小時，得到種液。種液按5%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動 控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度控制在37士0.5t:，不通氣，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘。發(fā)酵過程中 通過流加質(zhì)量濃度為25%的氨水將pH值控制在5. 9 6. 1。第14小時開始分批補糖，每 兩小時補加一次，每次補加60mL，補加的糖液葡萄糖濃度為500g/L，到第48小時停止補糖。 發(fā)酵50小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到186g/L，葡萄糖對 乳酸的轉(zhuǎn)化率為93%。
實施例1 使用的微生物菌種為擬干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei，NERCB0401 (工業(yè) 微生物，第37巻，2007，第4期，1 5))，用上述菌株進行pH反饋補料發(fā)酵。所用培養(yǎng)基有 兩種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L， 檸檬酸氫二銨2g/L，乙酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀2g/L，吐溫801mL/L，硫酸鎂0. 6g/L，硫酸錳 0.25g/L。 2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏6g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉 0. 03g/L，硫酸亞鐵0. 01g/L，醋酸鈉4g/L，檸檬酸二胺2g/L，磷酸二氫鉀2g/L，吐溫801mL/ L，硫酸鎂0. 2g/L，硫酸錳0. 2g/L。 將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 0，于12rC滅菌15 分鐘，其中葡萄糖單獨滅菌后再混合。 菌種接入含150mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘， 37t:振蕩培養(yǎng)12小時，得到種液。種液按5%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動 控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度控制在37士0.5t:，不通氣，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘。在第8小時 之前通過流加質(zhì)量濃度25%的氨水控制pH值在5. 9 6. 1。第8小時后采用pH反饋控制 補糖，通過流加葡萄糖與氨水的混合液控制pH及糖濃度，流加液中葡萄糖濃度為500g/L， 氨濃度為98g/L，當pH降至5. 9時自動流加葡萄糖與氨水的混合液至pH升至6. 1，殘?zhí)菨?度維持在8 12g/L之間。第48小時停止pH反饋補糖，改用質(zhì)量濃度25X的氨水調(diào)節(jié)pH 值在5.9 6. 1。發(fā)酵50小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到 192g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率達96%。與比較例1相比，乳酸濃度提高了 3. 2%。
實施例2 其它發(fā)酵條件同實施例l。調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所用的堿為氫氧化鈉。在第8小時之前 通過流加10mol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值。第8小時后采用pH反饋控制補糖，通過 流加葡萄糖與氫氧化鈉的混合液控制pH及糖濃度，流加液中葡萄糖濃度為600g/L，氫氧化 鈉的濃度為272g/L，當pH降至5. 9以下時自動流加葡萄糖與氫氧化鈉的混合液至pH升至 6. l，殘?zhí)蔷S持在8 12g/L。第48小時停止pH反饋補糖，改用1Omol/L的氫氧化鈉水溶液 調(diào)節(jié)pH值在5. 9 6. 1 。發(fā)酵50小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸 濃度達到178g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率為89%。
實施例3 其它發(fā)酵條件同實施例l。調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所用的堿為氫氧化鉀。在第8小時之前通過流加10mol/L的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值。第8小時后采用pH反饋控制補糖，通過 流加葡萄糖與氫氧化鉀的混合液控制PH及糖濃度，流加液中葡萄糖濃度為400g/L，氫氧化 鉀的濃度為250g/L，當pH降至5. 9以下時自動流加葡萄糖與氫氧化鉀的混合液至pH升至 6. 1，殘?zhí)蔷S持在8 12g/L。第48小時停止pH反饋補糖，改用1Omol/L的氫氧化鉀水溶液 調(diào)節(jié)pH值在5. 9 6. 1 。發(fā)酵50小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸 濃度達到176g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率為88%。
實施例4 其它發(fā)酵條件同實施例l。調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所用的堿為碳酸鈉。在第8小時之前通 過流加5mol/L的碳酸鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值。第8小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加 葡萄糖與碳酸鈉的混合液控制PH及糖濃度，流加液中葡萄糖濃度為500g/L，碳酸鈉的濃度 為294g/L，當pH降至5. 9以下時自動流加葡萄糖與碳酸鈉的混合液至pH升至6. 1，殘?zhí)蔷S 持在8 12g/L。第48小時停止pH反饋補糖，改用5mol/L的碳酸鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值在
5. 9 6. 1 。發(fā)酵50小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到175g/ L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率為87%。 實施例5 其它發(fā)酵條件同實施例1。調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所用的堿為碳酸氫鈉。在第8小時之前通 過流加5mol/L的碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值。第8小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加 葡萄糖與碳酸氫鈉的混合液控制PH及糖濃度，流加液中葡萄糖濃度為500g/L，碳酸氫鈉的 濃度為455g/L，當pH降至5. 9以下時自動流加葡萄糖與碳酸氫鈉的混合液至pH升至6. 1， 殘?zhí)蔷S持在8 12g/L。第48小時停止pH反饋補糖，改用5mol/L的碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié) pH值在5.9 6. 1。發(fā)酵50小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達 到176g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率為88%。
實施例6 其它發(fā)酵條件同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖改為蔗糖，蔗糖初始濃度為60g/ L。在第12小時之前通過流加質(zhì)量濃度25%的氨水調(diào)節(jié)pH值在5. 9 6. 1。第12小時后 采用PH反饋控制補糖，通過流加蔗糖與氨水的混合液控制pH及糖濃度，流加液中蔗糖濃度 為500g/L，氨的濃度為98g/L，當pH降至5. 9以下時自動流加蔗糖與氨的混合液至pH升至
6. l，殘?zhí)蔷S持在8 12g/L。第48小時停止pH反饋補糖，改用質(zhì)量濃度25%的氨水調(diào)節(jié) pH值在5.9 6. 1。發(fā)酵50小時，蔗糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到 190g/L，蔗糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率達95 % 。 實施例7 其它發(fā)酵條件同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖改為乳糖，乳糖初始濃度為80g/ L ;調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所用的堿為氫氧化鈉。在第18小時之前通過流加10moL/L的氫氧化鈉水溶 液調(diào)節(jié)pH值在5. 9 6. 1。第18小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加乳糖與氫氧化鈉 的混合液控制pH及糖濃度，流加液中乳糖濃度為500g/L，氫氧化鈉的濃度為227g/L，當pH 降至5.9以下時自動流加乳糖與氫氧化鈉的混合液至pH升至6. 1，殘?zhí)蔷S持在8 12g/L。 第48小時停止pH反饋補糖，改用1Omol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值在5. 9 6. 1。發(fā) 酵50小時，乳糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到176g/L，乳糖對乳酸的 轉(zhuǎn)化率達88%。
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實施例8 其它發(fā)酵條件同實施例1。發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為120g/L，調(diào)節(jié)發(fā)酵pH 所用的堿為碳酸銨。在第38小時之前通過流加5mol/L的碳酸銨水溶液調(diào)節(jié)pH值。第38 小時后采用PH反饋控制補糖，通過流加葡萄糖與碳酸銨的混合液控制pH及糖濃度，流加液 中葡萄糖濃度為500g/L，碳酸銨濃度為252g/L，當pH降至5. 9以下時自動流加葡萄糖與氨 水的混合液至pH升至6. 1 ，殘?zhí)蔷S持在8 12g/L。第50小時停止pH反饋補糖，改用5mo1/ L的碳酸銨水溶液調(diào)節(jié)pH值在5. 9 6. 1 。發(fā)酵54小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃 度為200g/L，乳酸濃度達到189g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率達94. 5%。
實施例9 其它發(fā)酵條件同實施例l。發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為80g/L，調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所 用的堿為碳酸氫銨。在第18小時之前通過流加5mol/L的碳酸氫銨水溶液調(diào)節(jié)pH值。第 18小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加葡萄糖與碳酸氫銨的混合液控制pH及糖濃度，流 加液中葡萄糖濃度為500g/L，碳酸氫銨濃度為413g/L，當pH降至5. 9以下時自動流加葡萄 糖與碳酸氫銨的混合液至PH升至6. 1，殘?zhí)蔷S持在8 12g/L。第48小時停止pH反饋補 糖，改用5mol/L的碳酸氫銨水溶液調(diào)節(jié)pH值在5. 9 6. 1 。發(fā)酵50小時，葡萄糖基本耗 盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到188g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率達94%。
比較例2 使用的微生物菌種為凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans， RS12-6 (氨基酸和生物 資源，2005，27巻，第l期，70 73))，用上述菌株進行分批補料發(fā)酵。所用培養(yǎng)基有兩種
1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，硫酸鎂0. 5g/L。
2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨0.5g/L。
將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 5，于121°C滅菌15 分鐘，其中葡萄糖單獨滅菌后再混合。 菌種接入含200mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘， 55t:振蕩培養(yǎng)14小時，得到種液。種液按8%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動 控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度控制在55士0.5t:，不通氣，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘。發(fā)酵過程中 通過流加質(zhì)量濃度25%的氨水將pH值控制在6. 4 6. 6。第24小時開始分批補糖，每兩 小時補加一次，每次補加60mL，補加的糖液葡萄糖濃度為500g/L，第58小時停止補糖。發(fā) 酵60小時，葡萄糖基本耗盡，消耗總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到181g/L，葡萄糖對乳酸 的轉(zhuǎn)化率為90.5%。
實施例10 使用的微生物菌種為凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans， RS12-6 (氨基酸和生物
資源，2005， 27巻，第1期，70 73))，用上述菌株進行pH反饋補料發(fā)酵。所用培養(yǎng)基有兩 種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，硫 酸鎂0. 5g/L。 2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨0. 5g/L，酵母粉15g/L，硫酸鎂0. 5g/L。
將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 5，于12rC滅菌 15min，其中葡萄糖單獨滅菌后再混合。
菌種接入含200mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘， 55t:振蕩培養(yǎng)14小時，得到種液。種液按8%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動 控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度控制在55士0.5t:，不通氣，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘。在第8小時 之前通過流加質(zhì)量濃度25%的氨水控制pH值在6. 4 6. 6。第8小時后采用pH反饋控制 補糖，流加液中葡萄糖濃度為500g/L，氨濃度為98g/L，當pH降至6. 4以下時自動流加葡萄 糖與氨的混合液至pH升至6. 6，殘?zhí)菨舛染S持在8 12g/L之間。第58小時停止pH反饋 補糖，改用質(zhì)量濃度25%的氨水調(diào)節(jié)pH值在6. 4 6. 6。發(fā)酵60小時，葡萄糖基本耗盡， 消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到187g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率達94. 5%。與比 較例2相比，乳酸濃度提高了 3. 3%。
實施例11 其它發(fā)酵條件同實施例10。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖改為木糖，木糖初始濃度為40g/ L ;調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所用的堿為氫氧化鈉。在第14小時之前通過流加10moL/L的氫氧化鈉水溶 液調(diào)節(jié)pH值在6.4 6.6。第14小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加木糖與氫氧化鈉 的混合液控制pH及糖濃度，流加液中木糖濃度為500g/L，氫氧化鈉的濃度為227g/L，當pH 降至6. 4以下時自動流加木糖與氫氧化鈉的混合液至pH升至6. 6，殘?zhí)蔷S持在8 12g/L。 第58小時停止pH反饋補糖，改用1Omol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值在6. 4 6. 6。發(fā) 酵50小時，木糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到173g/L，木糖對乳酸的 轉(zhuǎn)化率達86. 5% 。
實施例12 其它發(fā)酵條件同實施例10。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖改為麥芽糖，麥芽糖初始濃度 為60g/L ;調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所用的堿為氫氧化鉀。在第20小時之前通過流加10moL/L的氫氧 化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值在6. 4 6. 6。第20小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加麥芽糖 與氫氧化鉀的混合液控制PH及糖濃度，流加液中麥芽糖濃度為500g/L，氫氧化鉀的濃度為 313g/L，當pH降至6. 4以下時自動流加麥芽糖與氫氧化鉀的混合液至pH升至6. 6，殘?zhí)蔷S 持在8 12g/L。第58小時停止pH反饋補糖，改用1Omol/L的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值 在6. 4 6. 6。發(fā)酵60小時，麥芽糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為200g/L，乳酸濃度達到 171g/L，麥芽糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率達95 % 。
比較例3 使用的微生物菌種為米根霉(Rhizopus Oryzae，NRRL395 HS 99(華南師范大學學 報(自然科學版)，2002年2月，第1期，31 35))，用上述菌株進行分批補料發(fā)酵。所用 培養(yǎng)基有兩種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖50g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀0. 2g/L，硫酸鎂 0. lg/L，硫酸鋅0. 05g/L。 2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鋅lg/L，硫酸 鎂lg/L，消泡劑THIX-298 (煙臺恒鑫科技有限公司)0. 3mL/L。 將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 2，于121°C滅菌15 分鐘，其中葡萄糖單獨滅菌后再混合。 菌種接入含100mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘， 33t:振蕩培養(yǎng)24小時，得到種液。種液按3%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度控制在33 ±0. 5°C ，通無菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧控制 在20 30%。發(fā)酵過程中通過流加質(zhì)量濃度25X的氨水將pH值控制在6. 1 6. 3。第 24小時開始分批補糖，每兩小時補加一次，每次補加35mL，補加的糖液葡萄糖濃度為500g/ L，第58小時停止補糖。發(fā)酵60小時，葡萄糖基本耗盡，消耗總糖濃度為160g/L，乳酸濃度 達到135g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率為90. 5% 。
實施例13 使用的微生物菌種為米根霉(Rhizopus 0ryzae，NRRL395 HS 99(華南師范大學學 報(自然科學版)，2002年2月，第1期，31 35))，用上述菌株進行pH反饋補料發(fā)酵。所 用培養(yǎng)基有兩種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀0. 2g/L，硫酸鎂 0. lg/L，硫酸鋅0. 05g/L 2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鋅lg/L，硫酸 鎂lg/L，消泡劑THIX-298 (煙臺恒鑫科技有限公司)0. 3mL/L。 將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 2，于121°C滅菌15 分鐘，其中葡萄糖單獨滅菌后再混合。 菌種接入含100mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘， 33t:振蕩培養(yǎng)24小時，得到種液。種液按3%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動 控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度控制在33 ±0. 5°C ，通無菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧控制 在20 30%。在第16小時之前通過流加質(zhì)量濃度25%的氨水控制pH值在6. 1 6. 3。 第16小時后采用pH反饋控制補糖，流加液中葡萄糖濃度為500g/L，氨濃度為104g/L，當pH 降至6. 1以下時自動流加葡萄糖與氨的混合液至pH升至6. 3，殘?zhí)菨舛染S持在18 22g/L 之間。第56小時停止pH反饋補糖，改用質(zhì)量濃度25X的氨水調(diào)節(jié)pH值在6. 1 6.3。發(fā) 酵60小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為160g/L，乳酸濃度達到141g/L。與比較例 3相比，乳酸濃度提高了 4.4%。
實施例14 其它發(fā)酵條件同實施例13。發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為60g/L。調(diào)節(jié)發(fā)酵pH 所用的堿為氫氧化鈉。在第20小時之前通過流加10mol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值在 6. 1 6. 3。第20小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加葡萄糖與氫氧化鈉的混合液控制 pH及糖濃度，流加液中葡萄糖濃度為500g/L，氫氧化鈉濃度為250g/L，當pH降至6. 1以下 時，自動流加葡萄糖與氫氧化鈉的混合液至pH升至6.3，殘?zhí)蔷S持在18 22g/L。第56小 時停止pH反饋補糖，改用10mol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值在6. 1 6. 3。發(fā)酵60小 時，葡萄糖基本耗盡，消耗總糖濃度為160g/L，乳酸濃度達到128g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化 率達80%。
實施例15 其它發(fā)酵條件同實施例13。發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖濃度為120g/L。調(diào)節(jié)發(fā)酵 pH所用的堿為氫氧化鉀。在第36小時之前通過流加10mol/L的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值 在6. 1 6. 3。第36小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加葡萄糖與氫氧化鉀的混合液控 制pH及糖濃度，流加液中葡萄糖濃度為170g/L，氫氧化鉀濃度為121g/L，當pH降至6. 1以 下時，自動流加葡萄糖與氫氧化鉀的混合液至PH升至6. 3，殘?zhí)蔷S持在18 22g/L。第56
10小時停止pH反饋補糖，改用10mol/L的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值在6. 1 6. 3。發(fā)酵60 小時，葡萄糖基本耗盡，消耗總糖濃度為140g/L，乳酸濃度達到110g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn) 化率達78.6%。
實施例16 其它發(fā)酵條件同實施例13。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖改為蔗糖，蔗糖初始濃度為40g/ L。在第20小時之前通過流加質(zhì)量濃度25X的氨水調(diào)節(jié)pH值在6. 1 6. 3。第20小時后 采用PH反饋控制補糖，通過流加蔗糖與氨水的混合液控制pH及糖濃度，流加液中蔗糖濃度 為500g/L，氨的濃度為104g/L，當pH降至6. 1以下時自動流加蔗糖與氨的混合液至pH升 至6. 3，殘?zhí)蔷S持在18 22g/L。第56小時停止pH反饋補糖，改用質(zhì)量濃度25%的氨水調(diào) 節(jié)pH值在6. 1 6. 3。發(fā)酵60小時，蔗糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為160g/L，乳酸濃度 達到139g/L，蔗糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率達95X。
實施例17 其它發(fā)酵條件同實施例13。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖改為蔗糖，初始蔗糖濃度為60g/ L。調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所用的堿為氫氧化鈉。在第20小時之前通過流加1Omol/L的氫氧化鈉水 溶液調(diào)節(jié)PH值在6. 1 6. 3。第20小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加蔗糖與氫氧化 鈉的混合液控制pH及糖濃度，流加液中蔗糖濃度為500g/L，氫氧化鈉濃度為250g/L，當pH 降至6. 1以下時，自動流加蔗糖與氫氧化鈉的混合液至pH升至6. 3，殘?zhí)蔷S持在18 22g/ L。第56小時停止pH反饋補糖，改用1Omol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值在6. 1 6. 3。 發(fā)酵60小時，蔗糖基本耗盡，消耗總糖濃度為160g/L，乳酸濃度達到125g/L，蔗糖對乳酸的 轉(zhuǎn)化率達78%。
實施例18 其它發(fā)酵條件同實施例13。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖改為果糖，初始果糖濃度為80g/ L。調(diào)節(jié)發(fā)酵pH所用的堿為氫氧化鉀。在第24小時之前通過流加1Omol/L的氫氧化鉀水 溶液調(diào)節(jié)PH值在6. 1 6. 3。第24小時后采用pH反饋控制補糖，通過流加果糖與氫氧化 鉀的混合液控制pH及糖濃度，流加液中果糖濃度為500g/L，氫氧化鉀濃度為367g/L，當pH 降至6. 1以下時，自動流加果糖與氫氧化鉀的混合液至pH升至6. 3，殘?zhí)蔷S持在18 22g/ L。第56小時停止pH反饋補糖，改用10mol/L的氫氧化鉀水溶液調(diào)節(jié)pH值在6. 1 6. 3。 發(fā)酵60小時，蔗糖基本耗盡，消耗總糖濃度為160g/L，乳酸濃度達到124g/L，果糖對乳酸的 轉(zhuǎn)化率達77.5%。
實施例19 使用的微生物菌種為德式乳桿菌(Lactobacillus delbreuckii， CGMCC1. 2624T)， 用上述菌株進行批pH反饋控制補料發(fā)酵。所用培養(yǎng)基有兩種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L， 檸檬酸氫二銨2g/L，乙酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀2g/L，吐溫801mL/L，硫酸鎂0. 6g/L，硫酸錳 0.25g/L。 2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，玉米漿40mL/L，磷酸氫二鉀0. 2g/L， 硫酸鎂0. lg/L，硫酸錳0. 05g/L。 將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 5，于121°C滅菌15 分鐘，其中葡萄糖單獨滅菌后再混合。
菌種接入含300mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，37。C靜置培養(yǎng)20小時，得 到種液。種液按10X的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫 度控制在37±0. 5t:，不通氣，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘。在第14小時之前通過流加1Omol/L 的氫氧化鈉水溶液控制pH值在6.4 6.6。第14小時后采用pH反饋控制補糖，流加液中 葡萄糖濃度為250g/L，氫氧化鈉濃度為113g/L，當pH降至6. 4以下時自動流加葡萄糖與氫 氧化鈉的混合液至pH升至6. 6，殘?zhí)菨舛染S持在8 12g/L之間。第58小時停止pH反饋 補糖，改用10mol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值在6. 4 6. 6。發(fā)酵60小時，葡萄糖基本 耗盡，消耗的總糖濃度為100g/L，乳酸濃度達到96g/L。
實施例20 使用的微生物菌種為唾液鏈球菌(Str印tococcus salivarius， CGMCC1. 2498T)， 用上述菌株進行pH反饋補料發(fā)酵。所用培養(yǎng)基有兩種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L， 檸檬酸氫二銨2g/L，乙酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀2g/L，吐溫801mL/L，硫酸鎂0. 6g/L，硫酸錳 0.25g/L。 2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，酵母粉5g/L，玉米漿40mL/L，磷酸氫二鉀0. 2g/L， 硫酸鎂0. lg/L，硫酸錳0. 05g/L。 將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 5，于121°C滅菌15 分鐘。 菌種接入含300mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，37。C靜置培養(yǎng)20小時，得 到種液。種液按10X的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫 度控制在37 ±0. 5t:，不通氣，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘。在第14小時之前通過流加質(zhì)量濃 度25%的氨水控制pH值在6. 4 6. 6。第14小時后采用pH反饋控制補糖，流加液中葡萄 糖濃度為250g/L，氨濃度為49g/L，當pH降至6. 4以下時自動流加葡萄糖與氨的混合液至 pH升至6. 6，殘?zhí)菨舛染S持在8 12g/L之間。第58小時停止pH反饋補糖，改用質(zhì)量濃 度25%的氨水調(diào)節(jié)pH值在6. 4 6. 6。發(fā)酵60小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為 90g/L，乳酸濃度達到85g/L。
實施例21 使用的微生物菌種為行走根霉(Rhizopus Stolonifer， CICC 3146)，用上述菌株 進行pH反饋補料發(fā)酵。所用培養(yǎng)基有兩種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，硫酸銨3g/L，磷酸氫二鉀lg/L，硫酸鎂0. lg/ L。 2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鋅lg/L，硫酸 鎂lg/L。 將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 2，于121°C滅菌15 分鐘。 菌種接入含200mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘， 3(TC振蕩培養(yǎng)24小時，得到種液。種液按8%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動 控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度控制在30 ±0. 5°C ，通無菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧控制 在20 30% 。在第16小時之前通過流加1Omol/L的氫氧化鈉水溶液控制pH值在6. 1 6. 3。第16小時后采用pH反饋控制補糖，流加液中葡萄糖濃度為250g/L，氫氧化鈉濃度為 lllg/L，當pH降至6. 4以下時自動流加葡萄糖與氫氧化鈉的混合液至pH升至6. 6，殘?zhí)菨?度維持在18 22g/L之間。第56小時停止pH反饋補糖，改用1Omol/L的氫氧化鈉水溶液 調(diào)節(jié)pH值在6. 1 6. 3。發(fā)酵60小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為90g/L，乳酸濃 度達到64g/L。
實施例22 使用的微生物菌種為日本根霉(Rhizopus Japonicus， CGMCC 3. 1218)，用上述菌 株進行分批補料發(fā)酵。所用培養(yǎng)基有兩種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，硫酸銨3g/L，磷酸氫二鉀lg/L，硫酸鎂0. lg/ L。 2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鋅lg/L，硫酸 鎂lg/L。 將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 2，于121°C滅菌15 分鐘。 菌種接入含200mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘， 28t:振蕩培養(yǎng)24小時，得到種液。種液按5%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動 控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度控制在28 ±0. 5°C ，通無菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧控制 在20 30%。在第16小時之前通過流加質(zhì)量濃度25%的氨水控制pH值在6. 1 6. 3。 第16小時后采用pH反饋控制補糖，流加液中葡萄糖濃度為500g/L，氨濃度為104g/L，當pH 降至6. 1以下時自動流加葡萄糖與氨的混合液至pH升至6. 3，殘?zhí)菨舛染S持在18 22g/L 之間。第56小時停止pH反饋補糖，改用質(zhì)量濃度25X的氨水調(diào)節(jié)pH值在6. 1 6.3。發(fā) 酵60小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為90g/L，乳酸濃度達到65g/L。
實施例23 使用的微生物菌種為少根根霉(Rhiozopus Arrhizus， ACCC 30307)，用上述菌株 進行pH反饋補料發(fā)酵。所用培養(yǎng)基有兩種 1)液體種子培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，硫酸銨3g/L，磷酸氫二鉀lg/L，硫酸鎂0. lg/L
2)發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖40g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀lg/L，硫酸鋅lg/L，硫酸 鎂lg/L。 將上述兩種培養(yǎng)基按配方配制后用NaOH和鹽酸調(diào)pH值均為6. 2，于121°C滅菌15 分鐘。 菌種接入含200mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘， 28t:振蕩培養(yǎng)24小時，得到種液。種液按5%的接種量接入裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L自動 控制發(fā)酵罐中。發(fā)酵溫度控制在28 ±0. 5°C ，通無菌空氣，攪拌轉(zhuǎn)速500轉(zhuǎn)/分鐘，溶氧控制 在20 30%。在第16小時之前通過流加質(zhì)量濃度25X的氨水控制pH值在6. 1 6. 3。 第16小時后采用pH反饋控制補糖，流加液中葡萄糖濃度為500g/L，氨濃度為104g/L，當pH 降至6. 1以下時自動流加葡萄糖與氨的混合液至pH升至6. 3，殘?zhí)菨舛染S持在18 22g/L 之間。第56小時停止pH反饋補糖，改用質(zhì)量濃度25X的氨水調(diào)節(jié)pH值在6. 1 6.3。發(fā) 酵60小時，葡萄糖基本耗盡，消耗的總糖濃度為90g/L，乳酸濃度達到63g/L。
權利要求
一種反饋補料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法，該方法包括使用常規(guī)方法制備發(fā)酵菌種的種液，然后接入裝有底物的發(fā)酵罐中進行好氧、厭氧或兼性厭氧乳酸發(fā)酵，其特征是在乳酸發(fā)酵過程中，利用底物的消耗量和酸的產(chǎn)生量之間的比例關系，通過pH反饋控制加入底物和堿性物質(zhì)的混合流加液來控制體系的pH，從而維持體系中的底物濃度在一適宜乳酸發(fā)酵的范圍內(nèi)，使乳酸發(fā)酵時既不產(chǎn)生底物抑制，也不構成限制；該發(fā)酵過程進行至乳酸的濃度達到所需時停止，得到含有乳酸的發(fā)酵液。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵菌種是好氧發(fā)酵菌種或厭氧發(fā) 酵菌種，其中好氧發(fā)酵菌種選自根霉屬的米根霉、行走根霉、日本根霉或少根根霉中的一種； 厭氧發(fā)酵菌種選自乳桿菌屬的德式乳桿菌、擬干酪乳桿菌、鏈球菌屬的唾液鏈球菌或 芽孢桿菌屬的凝結芽孢桿菌中的一種。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是所述的pH反饋控制加入底物和堿性物質(zhì)的 混合流加液來控制體系的pH，是當發(fā)酵液的pH降至設定點以下時，加入底物和堿性物質(zhì)的 混合流加液，直至發(fā)酵液的pH回升至設定點。
4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征是所述的發(fā)酵液的pH設定點在3. 5 8之間。
5. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征是所述的底物和堿性物質(zhì)的混合流加液中的 底物濃度為150 600克/升，底物與堿性物質(zhì)的比例為90 210克底物/摩爾堿。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是在好氧、厭氧或兼性厭氧乳酸發(fā)酵中，發(fā)酵 培養(yǎng)基中的初始底物濃度為10 150克/升。
7. 根據(jù)權利要求1或6所述的方法，其特征是所述的好氧乳酸發(fā)酵的溫度為25 35°C ;所述的厭氧乳酸發(fā)酵的溫度為35 60°C。
8. 根據(jù)權利要求1、3、5或6所述的方法，其特征是所述的底物選自蔗糖、葡萄糖、木 糖、果糖、麥芽糖、乳糖中一種或大于一種以上的混合物。
9. 根據(jù)權利要求1、3或5所述的方法，其特征是所述的堿性物質(zhì)為氫氧化鈉、氫氧化 鉀、氨、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸銨或碳酸氫銨。
10. 根據(jù)權利要求1或3所述的方法，其特征是所述的pH反饋控制體系的pH，是通過 pH電極和儀表完成控制，或由人工完成控制。
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法，具體地說涉及通過pH反饋控制補加糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的方法。該方法包括使用常規(guī)方法制備發(fā)酵菌種的種液，然后接入裝有底物的發(fā)酵罐中進行好氧、厭氧或兼性厭氧乳酸發(fā)酵。在乳酸發(fā)酵過程中，利用底物的消耗量和酸的產(chǎn)生量之間的比例關系，通過pH反饋控制加入底物和堿性物質(zhì)的混合流加液來控制體系的pH，從而維持體系中的底物濃度在一適宜乳酸發(fā)酵的范圍內(nèi)，使乳酸發(fā)酵時既不產(chǎn)生底物抑制，也不構成限制；該發(fā)酵過程進行至乳酸的濃度達到所需時停止，得到含有乳酸的發(fā)酵液。本發(fā)明的方法利用pH值反饋控制補料，簡化了生產(chǎn)工藝，在不增加額外設備的情況下可提高乳酸的發(fā)酵濃度，使生產(chǎn)更穩(wěn)定，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/845GK101748164SQ20081023900
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權日2008年12月4日
發(fā)明者叢威, 劉輝, 吳霞, 張勇, 楊鵬波 申請人:中國科學院過程工程研究所