專利名稱：：一種獲得丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種獲得丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法。
背景技術(shù)：
：丁醇是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等，全球年需求量超過140萬噸。丁醇又是一種極具潛力的新型生物燃料，其熱值、辛烷值與汽油相當(dāng)；丁醇的含氧量與汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，且不會(huì)腐蝕管道，便于管道輸送；丁醇的蒸汽壓低，安全性高，能與汽油以任意比混合。丁醇可用化學(xué)合成法和發(fā)酵法生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法的主要路線包括兩條，一是以丙烯為原料，經(jīng)羰基合成法生成正、異丁醛，加氫后分餾得到正丁醇；二是以乙醛為原料，經(jīng)醇醛縮合成丁醇醛，脫水生成丁烯醛，再經(jīng)加氫后得到正丁醇。發(fā)酵法則是以糧食為原料，經(jīng)發(fā)酵獲得丙酮、丁醇、乙醇(三者質(zhì)量比為3:6:1)，再經(jīng)精餾后分別制得丙酮、丁醇和乙醇。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇曾經(jīng)是僅次于乙醇發(fā)酵的全球第二大發(fā)酵工業(yè)。隨著石油價(jià)格的不斷上漲，使得丙酮丁醇發(fā)酵重新獲得人們的重視，僅以丁醇為例，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)價(jià)格在2006年上半年內(nèi)由1萬元/噸上漲到1.8萬元/噸，仍然供不應(yīng)求，丁醇發(fā)酵工業(yè)已迎來復(fù)蘇產(chǎn)業(yè)的大好時(shí)機(jī)。在過去20年中，圍繞著丁醇產(chǎn)生菌的篩選、丁醇合成的分子遺傳機(jī)制和調(diào)控、高丁醇比菌種改造、發(fā)酵原料的替換、發(fā)酵和提取工藝等方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了廣泛、深入的研究，為大規(guī)模實(shí)現(xiàn)丁醇生物制備奠定了基礎(chǔ)。丁醇發(fā)酵中，溶劑毒性是影響溶劑產(chǎn)量的一個(gè)關(guān)鍵限制因素。在所產(chǎn)生的溶劑中，丁醇是毒性最大的，當(dāng)其濃度達(dá)到13g/L時(shí)，發(fā)酵就基本停止。研究發(fā)現(xiàn)，丁醇毒性的機(jī)制與其疏水性有關(guān)，它會(huì)破壞細(xì)胞膜的磷脂成份，使膜的流動(dòng)性提高，可能會(huì)導(dǎo)致膜的不穩(wěn)定，破壞與膜相關(guān)的功能，如抑制與膜結(jié)合的ATP酶活性、降低胞內(nèi)ATP水平、抑制細(xì)胞維持胞內(nèi)pH的能力、破壞細(xì)胞膜的pH梯度等。丁醇毒性對(duì)細(xì)胞膜的進(jìn)一步影響是抑制糖和氨基酸的吸收，從而使代謝完全停滯。由于丁醇毒性是丙酮丁醇發(fā)酵中影響溶劑產(chǎn)量最主要的限制性因素，目前普遍認(rèn)為提高對(duì)丁醇的抗性，可能會(huì)提高溶劑的產(chǎn)量。目前，多以傳統(tǒng)誘變選育或擴(kuò)增耐受丁醇相關(guān)的基因來提高產(chǎn)生菌對(duì)丁醇的耐受性?；蚬こ滩僮餍枰獪?zhǔn)確的基因信息，但與丁醇耐受相關(guān)的基因比較多，很可能是多種基因共同作用的結(jié)果，單個(gè)或少量基因的過量表達(dá)或缺失往往不能達(dá)到提高宿主菌丁醇耐受性的目的，因此突變篩選仍然是獲得高丁醇耐受突變株最為有效的途徑。但傳統(tǒng)的誘變正突變率很低，篩選工作量大，改良菌種所用周期較長(zhǎng)，并且所用的菌種在經(jīng)過多次誘變后，會(huì)產(chǎn)生對(duì)誘變劑的"鈍化"現(xiàn)象，導(dǎo)致誘變效率下降。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種獲得丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法。本發(fā)明所提供的獲得丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法，包括以下步驟1)將丁醇產(chǎn)生菌進(jìn)行化學(xué)誘變；32)將上述步驟1)誘變后的丁醇產(chǎn)生菌之間進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到融合子；3)將上述步驟2)獲得的融合子進(jìn)行化學(xué)誘變；4)將上述步驟3)誘變后的融合子之間再進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株。上述方法還包括將所述步驟4)獲得的丁醇產(chǎn)生菌突變株再進(jìn)行化學(xué)誘變，將經(jīng)過誘變的丁醇產(chǎn)生菌之間進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株的步驟。上述過程至少重復(fù)一次。當(dāng)然，上述獲得丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法也可以只包括步驟1)_4)的過程。上述方法中，所述化學(xué)誘變所使用的誘變劑為甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯和/或亞硝基胍。所述誘變劑為硫酸二乙酯和亞硝基胍，所述硫酸二乙酯的終濃度為0.21%，具體可為0.5%，所述誘變時(shí)間為1040min，具體可為15min;所述亞硝基胍的終濃度為0.1lg/L，具體可為0.2g/L，所述誘變時(shí)間為1050min，具體可為30min。上述方法中，所述原生質(zhì)體融合中，培養(yǎng)突變株的培養(yǎng)基的組成為淀粉10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對(duì)氨基苯甲酸lmg/L、生物素2yg/L、維生素BJmg/L，其余為水。上述方法中，所述丁醇產(chǎn)生菌可為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)及糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutyri固)等，具體可為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287?？蓪⒉煌亩〈籍a(chǎn)生菌之間進(jìn)行原生質(zhì)體融合，如將丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)禾口拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)之間進(jìn)行原生質(zhì)體融合；也可以將不同的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)進(jìn)行原生質(zhì)體融合。采用上述方法獲得的丁醇產(chǎn)生菌突變株也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述丁醇產(chǎn)生菌突變株DGF4，經(jīng)16srDNA基因序列分析及生理生化特征分析，鑒定為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DGF4已于2008年12月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCCN22279。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備丁醇的方法。本發(fā)明所提供的制備丁醇的方法，是培養(yǎng)按照上述方法獲得的丁醇產(chǎn)生菌突變株，得到丁醇。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種原生質(zhì)體融合用培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的原生質(zhì)體融合用培養(yǎng)基，其組成為淀粉10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對(duì)氨基苯甲酸lmg/L、生物素2iig/L、維生素BJmg/L，其余為水。本發(fā)明以丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)或拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)為出發(fā)菌株，用誘變劑進(jìn)行處理，得到丁醇耐受性提高和產(chǎn)量提高的突變株，將獲的突變株制備成原生質(zhì)體，進(jìn)行原生質(zhì)體融合，從融合子中篩選丁醇耐受性較高的菌株，經(jīng)產(chǎn)物分析，得到高產(chǎn)融合子；再將所得的融合子進(jìn)行誘變，將獲得的突變株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，循環(huán)進(jìn)行以上步驟，最終得到對(duì)產(chǎn)物有較高耐受性的丁醇產(chǎn)生菌突變菌。采用上述方法獲得的丁醇產(chǎn)生菌突變株DGF4對(duì)丁醇的耐受性可達(dá)19g/L，發(fā)酵液中丁醇的產(chǎn)量可達(dá)10.43g/L。本發(fā)明方法結(jié)合了傳統(tǒng)誘變育種和基因組重排技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，無需了解微生物的代謝途徑、生物合成酶編碼基因或與菌株生理性狀相關(guān)的分子基礎(chǔ)，通過表型的變化就可對(duì)突變株進(jìn)行多輪次遞進(jìn)式突變篩選，保留了對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)生有利的基因并使之得到提高，可以有效提高正向突變株的篩選效率，縮短突變和菌種篩選的時(shí)間和周期。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中的化學(xué)誘變及原生質(zhì)體融合的操作均在嚴(yán)格厭氧的條件下進(jìn)行。實(shí)施例1、丁醇產(chǎn)生菌突變株的獲得丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.2287。(中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00810102673.2)。實(shí)驗(yàn)中所涉及的培養(yǎng)基和試劑的組成如下RCM培養(yǎng)基的組成葡萄糖5.0g/L、酵母粉3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、淀粉10.0g/L、氯化鈉5.Og/L、醋酸鈉3.Og/L，其余為水。pH6.8。115。C條件下滅菌20分鐘。7.5%質(zhì)量百分含量玉米醪培養(yǎng)基的組成7.5g玉米粉加100mL水，加熱糊化，分裝。115。C條件下滅菌20分鐘。CBM培養(yǎng)基的組成葡萄糖10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對(duì)氨基苯甲酸lmg/L、生物素2iig/L、維生素Bilmg/L，其余為水。pH6.9。115。C條件下滅菌20分鐘。改良的CBM培養(yǎng)基CBM培養(yǎng)基中，以淀粉代替葡萄糖。115。C條件下滅菌20分鐘。再生培養(yǎng)基在CBM培養(yǎng)基中添加蔗糖和瓊脂，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為171g/L和2X。115。C條件下滅菌20分鐘。pH7.0的磷酸鹽緩沖液將5.29gKH2P04和13.94gK2HP04.3H20溶于1L水中，pH7.0。115。C條件下滅菌20分鐘。pH6.0的磷酸鹽緩沖液將8.OOgKH2P04和2.OOgK2HP04.3H20溶于1L水中，pH6.0。115。C條件下滅菌20分鐘。亞硝基胍溶液用甲酰胺溶解亞硝基胍，然后加入p朋.0的磷酸緩沖溶液使其完全溶解，得到終濃度為2g/L的亞硝基胍溶液。高滲緩沖溶液在CBM培養(yǎng)基中添加蔗糖和還原型谷胱甘肽(購(gòu)自Sigma公司)，使蔗糖在培養(yǎng)基中的終濃度為171g/L，使還原型谷胱甘肽在培養(yǎng)基中的終濃度為5mmo1/L。過濾除菌獲得。PEG溶液將40g聚乙二醇(PEG-6000)溶于lOOmL上述高滲緩沖溶液中得到。5115t:條件下滅菌20分鐘。生理鹽水在300ml0.75%質(zhì)量百分含量的氯化鈉溶液中加入0.46g還原型谷胱甘肽，使還原型谷胱甘肽在培養(yǎng)基中的終濃度為5mmol/L。過濾除菌獲得。具體方法如下1、化學(xué)誘變丙酮丁醇梭菌為嚴(yán)格厭氧菌，氧氣對(duì)其有毒害作用，所有的操作均在無氧條件下進(jìn)行，并用含有還原型谷胱甘肽(終濃度為5mmol/L)的高滲緩沖溶液和生理鹽水來洗滌菌體，以提高菌體的存活率。將丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(對(duì)丁醇的耐受濃度為12g/L)接種于RCM培養(yǎng)基中，3638t:厭氧培養(yǎng)3648h，此時(shí)菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期；取培養(yǎng)液離心，將菌體沉淀用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入pH7.0的磷酸鹽緩沖液，再加入硫酸二乙酯(購(gòu)于Sigma公司)，使其在混合液中的終濃度為0.5%，誘變15min;加入質(zhì)量百分含量為25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)液離心，用生理鹽水洗滌兩次，去除剩余的誘變劑，將誘變后的菌體接入RCM培養(yǎng)基中37t:培養(yǎng)2436h，然后將菌體分別涂布于含有丁醇終濃度為1320g/L的RCM固體培養(yǎng)基上，3638。C厭氧培養(yǎng)4872h;挑選單菌落，接入到7.5%質(zhì)量百分含量玉米醪培養(yǎng)基中，3638。C培養(yǎng)72h，待醪蓋形成后測(cè)定丁醇的產(chǎn)量，選擇培養(yǎng)基中丁醇濃度和產(chǎn)物中丁醇產(chǎn)量都較高的突變株進(jìn)行原生質(zhì)體融合。2、原生質(zhì)體融合實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以淀粉為唯一碳源培養(yǎng)菌體時(shí)更有利于形成原生質(zhì)體，因此選用改良的CBM進(jìn)行菌體的培養(yǎng)，用于制備原生質(zhì)體。將上述步驟1篩選到的突變株接種至改良的CBM培養(yǎng)基中，363『C厭氧培養(yǎng)1224h，此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；取培養(yǎng)液離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，最后一次取沉淀懸浮于高滲緩沖溶液中，加入溶菌酶作用0.5lh，使溶菌酶的終濃度為1.0mg/mL;待95%以上的細(xì)胞形成原生質(zhì)體后，低速(3000rmp/min)離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，取沉淀加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高滲緩沖液稀釋，吸取稀釋液涂布于再生培養(yǎng)基上，363『C厭氧培養(yǎng)3672h，挑取單菌落接入到7.5%質(zhì)量百分含量玉米醪培養(yǎng)基中，同時(shí)分別點(diǎn)接到含有丁醇終濃度為1320g/L的RCM固體培養(yǎng)基中，待醪蓋形成后測(cè)定丁醇的產(chǎn)量，選擇培養(yǎng)基中丁醇濃度和產(chǎn)物中丁醇產(chǎn)量都較高的融合子繼續(xù)進(jìn)行化學(xué)誘變。3、化學(xué)誘變將上述步驟2獲得的融合子接種于RCM培養(yǎng)基中，3638t:厭氧培養(yǎng)3648h，此時(shí)菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期；取培養(yǎng)液離心，將菌體沉淀用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入pH6.0的磷酸緩沖溶液，再加入亞硝基胍(購(gòu)于Sigma公司)，使其在混合液中的終濃度為0.2g/L，誘變30min，將反應(yīng)液離心用生理鹽水洗滌數(shù)次，去除剩余的誘變劑，將誘變后的菌體接入RCM培養(yǎng)基中37t:培養(yǎng)2436h，將菌體分別涂布于含有丁醇終濃度為1320g/L的RCM固體培養(yǎng)基上，3638。C厭氧培養(yǎng)4872h;挑選單菌落，接入到7.5%質(zhì)量百分含量玉米醪培養(yǎng)基中，363『C培養(yǎng)72h，待醪蓋形成后測(cè)定丁醇的產(chǎn)量，選擇培養(yǎng)基中丁醇濃度和產(chǎn)物中丁醇產(chǎn)量都較高的突變株進(jìn)行原生質(zhì)體融合。64、原生質(zhì)體融合將上述步驟3篩選到的突變株接種至改良的CBM培養(yǎng)基中，3638。C厭氧培養(yǎng)1224h，此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；取培養(yǎng)液離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，最后一次取沉淀懸浮于高滲緩沖溶液中，加入溶菌酶作用0.5lh，使溶菌酶的終濃度為1.0mg/mL;待95%以上的細(xì)胞形成原生質(zhì)體后，低速(3000rmp/min)離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，取沉淀加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高滲緩沖液稀釋，吸取稀釋液涂布于再生培養(yǎng)基上，363『C厭氧培養(yǎng)3672h，挑取單菌落接入到7.5%質(zhì)量百分含量玉米醪培養(yǎng)基中，同時(shí)分別點(diǎn)接到含有丁醇終濃度為1320g/L的RCM固體培養(yǎng)基中，待醪蓋形成后測(cè)定丁醇的產(chǎn)量，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株。實(shí)施例2、丁醇產(chǎn)生菌突變株的獲得丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.2287。中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00810102673.2)。實(shí)驗(yàn)中所涉及的培養(yǎng)基和試劑的組成同實(shí)施例1。1、化學(xué)誘變與實(shí)施例1步驟1不同的是，使用的硫酸二乙酯在混合液中的終濃度為0.2%，誘變時(shí)間為40min。2、原生質(zhì)體融合同實(shí)施例1步驟2。3、化學(xué)誘變與實(shí)施例1步驟3不同的是，加入亞硝基胍，使其在混合液中的終濃度為0.lg/L，誘變時(shí)間為50min。4、原生質(zhì)體融合同實(shí)施例1步驟4。實(shí)施例3、丁醇產(chǎn)生菌突變株的獲得丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1(保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.2287。中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00810102673.2)。拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)購(gòu)自英國(guó)食品工業(yè)與海洋細(xì)菌菌種保藏中心)，保藏號(hào)為NC濕8052。實(shí)驗(yàn)中所涉及的培養(yǎng)基和試劑的組成同實(shí)施例1。具體方法如下1、化學(xué)誘變丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1的誘變方法同實(shí)施例1步驟1。拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)NCIMB8052為嚴(yán)格厭氧菌，氧氣對(duì)其有毒害作用，所有的操作均在無氧條件下進(jìn)行，并用含有還原型谷胱甘肽(終濃度為5mmol/L)的高滲緩沖溶液和生理鹽水來洗滌菌體，以提高菌體的存活率。將拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)NCMB8052(對(duì)丁醇的耐受濃度為13g/L，接種于RCM培養(yǎng)基中，3638t:厭氧培養(yǎng)3648h，此時(shí)菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期；取培養(yǎng)液離心，將菌體沉淀用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入PH7.0的磷酸鹽緩沖液，再加入硫酸二乙酯，使其在混合液中的終濃度為1X，誘變20min;加入質(zhì)量百分含量為25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)液離心，用生理鹽水洗滌兩次，去除剩余的誘變劑，將誘變后的菌體接入RCM培養(yǎng)基中37t:培養(yǎng)2436h，將菌體分別涂布于含有丁醇終濃度為1420g/L的RCM固體培養(yǎng)基上，3638。C厭氧培養(yǎng)4872h;挑選單菌落，接入到7.5X質(zhì)量百分含量玉米醪培養(yǎng)基中，3638t:培養(yǎng)72h，待醪蓋形成后測(cè)定丁醇的產(chǎn)量，選擇培養(yǎng)基中丁醇濃度和產(chǎn)物中丁醇產(chǎn)量都較高的突變株進(jìn)行原生質(zhì)體融合。2、原生質(zhì)體融合將上述步驟1篩選到的丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌的突變株分別接種至改良的CBM培養(yǎng)基中，363『C厭氧培養(yǎng)1224h，此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；分別取培養(yǎng)液離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，最后一次取沉淀懸浮于高滲緩沖溶液中，加入溶菌酶作用0.5lh，使溶菌酶的終濃度為1.Omg/mL;待95%以上的細(xì)胞形成原生質(zhì)體后，低速(3000rmp/min)離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，取沉淀等量混合加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高滲緩沖液稀釋，吸取稀釋液涂布于再生培養(yǎng)基上，363『C厭氧培養(yǎng)3672h，分別挑取丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌突變株的單菌落接入到7.5%質(zhì)量百分含量玉米醪培養(yǎng)基中，同時(shí)分別點(diǎn)接到含有丁醇終濃度為1420g/L的RCM固體培養(yǎng)基中，待醪蓋形成后測(cè)定丁醇的產(chǎn)量，選擇培養(yǎng)基中丁醇濃度和產(chǎn)物中丁醇產(chǎn)量都較高的融合子繼續(xù)進(jìn)行化學(xué)誘變。3、化學(xué)誘變將上述步驟2獲得的融合子接種于RCM培養(yǎng)基中，3638。C厭氧培養(yǎng)3648h，此時(shí)菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期；取培養(yǎng)液離心，將菌體沉淀用生理鹽水離心洗滌兩次，最后一次取沉淀加入pH6.0的磷酸緩沖溶液，再加入亞硝基胍(購(gòu)于Sigma公司)，使其在混合液中的終濃度為0.2g/L，誘變30min，將反應(yīng)液離心用生理鹽水洗滌數(shù)次，去除剩余的誘變劑，將誘變后的菌體接入RCM培養(yǎng)基中37t:培養(yǎng)2436h，將菌體分別涂布于含有丁醇終濃度為1420g/L的RCM固體培養(yǎng)基上，3638。C厭氧培養(yǎng)4872h;挑選單菌落，接入到7.5%質(zhì)量百分含量玉米醪培養(yǎng)基中，363『C培養(yǎng)72h，待醪蓋形成后測(cè)定丁醇的產(chǎn)量，選擇培養(yǎng)基中丁醇濃度和產(chǎn)物中丁醇產(chǎn)量都較高的突變株進(jìn)行原生質(zhì)體融合。4、原生質(zhì)體融合將上述步驟3篩選到的突變株接種至改良的CBM培養(yǎng)基中，363『C厭氧培養(yǎng)1224h，此時(shí)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；取培養(yǎng)液離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，最后一次取沉淀懸浮于高滲緩沖溶液中，加入溶菌酶作用0.5lh，使溶菌酶的終濃度為1.Omg/mL;待95%以上的細(xì)胞形成原生質(zhì)體后，低速(3000rmp/min)離心，將菌體沉淀用高滲緩沖液洗滌兩次，取沉淀加入PEG溶液，作用2min，然后立即用高滲緩沖液稀釋，吸取稀釋液涂布于再生培養(yǎng)基上，363『C厭氧培養(yǎng)3672h，挑取單菌落接入到7.5%質(zhì)量百分含量玉米醪培養(yǎng)基中，同時(shí)分別點(diǎn)接到含有丁醇終濃度為1420g/L的RCM固體培養(yǎng)基中，待醪蓋形成后測(cè)定丁醇的產(chǎn)量，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株。實(shí)施例4、丁醇產(chǎn)生菌突變株對(duì)丁醇的耐受程度及丁醇的產(chǎn)量采用上述方法共獲得15株丁醇產(chǎn)生菌突變株。將上述獲得的丁醇產(chǎn)生菌突變株中的8株接種于含有表1所示丁醇終濃度的RCM培養(yǎng)基中，3638t:培養(yǎng)48120h，檢測(cè)突變株對(duì)丁醇的耐受性，結(jié)果這8株菌在表1所示丁醇終濃度的RCM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好；然后將上述8株菌以5%的接種量接種于上述7.5%的玉米醪培養(yǎng)基中，3638t:培養(yǎng)7296h，測(cè)定丁醇的產(chǎn)量。丁醇產(chǎn)量用高效液相法測(cè)定，條件為HPX-87H，柱溫15t:，檢測(cè)器為示差檢測(cè)器，流動(dòng)相為O.05mmol/L112504，流速為0.5ml/L。以上實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，采用上述方法獲得的丁醇產(chǎn)生菌突變株對(duì)丁醇的耐受情況及丁醇產(chǎn)量的平均結(jié)果如表1所示。表l部分突變株對(duì)丁醇的耐受情況及丁醇產(chǎn)量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表1中可以看出，菌株DGF4對(duì)丁醇的耐受程度和丁醇的產(chǎn)量最高，可耐受19g/L的丁醇，培養(yǎng)該丁醇產(chǎn)生菌突變株，丁醇的平均產(chǎn)量為10.43g/L。丁醇產(chǎn)生菌突變株DGF4，經(jīng)16srRNA基因序列分析(丁醇產(chǎn)生菌突變株DGF4的16srDNA序列如序列表中序列1所示)及生理生化特征分析，鑒定為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)。丙酮丁酉享梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DGF4已于2008年12月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCCN22799。序列表〈160>1〈210>1〈211>952〈212>DNA〈213〉丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyli固)〈400〉1ctgattcgcgattectegcaactccggcttcatgteggcgagtttcagccactgggatggggttttgagttttgctccaccttgcggtettgcatcttttattgtegcacgtgtgtegccctegacateaggggcatgatgatttgacgtttcctcccggtteacccgggcagtctcactagagtgctcaacteaatgttgateagggttgcgctcgttgcgggactteacccaacatctcacgacacgaaccatgcaccacctgtcatcctgtccccgaagggacttcatccattecgggagatgtcaagtcteggteaggttcttcgcgttgcttcgaatteaaccactecaatccga60tgtccccacc120catccccacc180agc朋cteat240gctgacgaca300acteattcag360atgctccgct4209gcttgtgcgggtccccgtcaattcctttgagtttteatcttgcgaccgtecttcccaggc■gg皿tecttettgtgtteactgcggcarag皿ggagtcgatecctcctecacctegtett540catcgtttecggcgtggactaccagggtetcteatcctgtttgctccccacgctttcatg600cctcagcgtcagttecagtcC3g皿ggCCgccttcgccactggtettcttccteatctct660acgcatttcaccgctecactagg皿ttctgccttcctctcctgcactccagacatccagt720gcccccaagtteagcccggggatttcacatctcactteaatetccgccte780cacatcctttacgcccagte皿tCCgg3C3acgcttgccacctecgtettaccgcggctg840ctggcacgtegttegccgtggcttcctcctatggteccgtcattetcgtcccate3g3C3■gagttttecgatccg^gaccttcatcactcacgcggcgttgctgcatca95210權(quán)利要求一種獲得丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法，包括以下步驟1)將丁醇產(chǎn)生菌進(jìn)行化學(xué)誘變，得到突變株；2)將上述步驟1)獲得的突變株之間進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到融合子；3)將上述步驟2)獲得的融合子進(jìn)行化學(xué)誘變，得到突變株；4)將上述步驟3)獲得的突變株之間進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法還包括將所述步驟4)獲得的丁醇產(chǎn)生菌突變株進(jìn)行化學(xué)誘變，將經(jīng)過誘變的丁醇產(chǎn)生菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株的步驟。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述權(quán)利要求2的過程至少重復(fù)一次。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述化學(xué)誘變所使用的誘變劑為甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯和/或亞硝基胍。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述誘變劑為硫酸二乙酯和亞硝基胍，所述硫酸二乙酯的終濃度為0.2-1%，優(yōu)選為0.5%，所述誘變時(shí)間為10-40min，優(yōu)選為15min;所述亞硝基胍的終濃度為0.l-lg/L，優(yōu)選為0.2g/L，所述誘變時(shí)間為10-50min，優(yōu)選為30min。6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述原生質(zhì)體融合中，培養(yǎng)突變株的培養(yǎng)基的組成為淀粉10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對(duì)氨基苯甲酸lmg/L、生物素2iig/L、維生素BJmg/L，其余為水。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述丁醇產(chǎn)生菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)及糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutyricum)，優(yōu)選為丙酮丁酉享梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SMB1CGMCCNo.2287。8.—種制備丁醇的方法，是培養(yǎng)按照權(quán)利要求1-7中任一所述的方法得到的丁醇產(chǎn)生菌突變株，得到丁醇。9.丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)DGF4，其保藏號(hào)為CGMCCN22799。10.—種原生質(zhì)體融合用培養(yǎng)基，其組成為淀粉10g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.01g/L、硫酸鐵0.01g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、對(duì)氨基苯甲酸lmg/L、生物素2iig/L、維生素BJmg/L，其余為水。全文摘要本發(fā)明公開了一種獲得丁醇產(chǎn)生菌突變株的方法。該方法包括以下步驟1)將丁醇產(chǎn)生菌進(jìn)行化學(xué)誘變，得到突變株；2)將上述步驟1)獲得的突變株之間進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到融合子；3)將上述步驟2)獲得的融合子進(jìn)行化學(xué)誘變，得到突變株；4)將上述步驟3)獲得的突變株之間進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到丁醇產(chǎn)生菌突變株。本發(fā)明以丙酮丁醇梭菌SMB1CGMCCNo.2287為出發(fā)菌株，采用化學(xué)誘變和原生質(zhì)體融合交替進(jìn)行的方法，最終得到對(duì)產(chǎn)物有較高耐受性的丁醇產(chǎn)生菌突變菌。采用本發(fā)明方法獲得的丁醇產(chǎn)生菌突變株DGF4對(duì)丁醇的耐受性可達(dá)19g/L，丁醇的產(chǎn)量為10.43g/L。文檔編號(hào)C12R1/145GK101748114SQ20081023955公開日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年12月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日發(fā)明者張?zhí)烊?張延平,李寅申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所