專利名稱：一種培養(yǎng)雞的胚胎生殖細胞的方法及其專用培養(yǎng)液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)雞的胚胎生殖細胞的方法及其專用培養(yǎng)液。
背景技術：
具有多向分化潛能的胚胎干細胞有兩種來源 一是來自于早期胚胎囊胚階段內(nèi) 細胞團的胚胎干細胞(embryonic stem cell,簡稱ES細胞)，另一種是來自于胚 胎生殖腺原生殖細胞(primordial germ cells, PGCs)的胚胎生殖細胞(embryonic germ cell,簡稱EG細胞)。自Evans和Kaufman (1981)從延遲著床的小鼠早期胚 胎中分離得到ES細胞后，早期胚胎一直成為分離克隆ES細胞的唯一來源。直到1992 年，Matsui等以附植后小鼠胎兒的原始生殖細胞為材料，培養(yǎng)獲得EG細胞，并首次 比較全面地證實了PGCs同樣可作為ES細胞分離克隆的原材料。目前，從PGCs中培養(yǎng) EG細胞，在小鼠、大鼠、豬、人、牛和雞等動物上已取得了重要的進展。越來越多 的研究發(fā)現(xiàn)，PGCs來源的EG細胞跟ES細胞一樣，可被用于研究胚胎早期發(fā)育和細胞 譜系分化，并可對其進行各種遺傳操作，且由于二者在形態(tài)和生物學特性上很相近， 所以一般又將它們統(tǒng)稱為ES細胞。
雞的世代周期短，生產(chǎn)性能高，非常適合于轉(zhuǎn)基因技術的應用。應用轉(zhuǎn)基因技 術除進行雞品種改良、抗病育種和基礎理論研究外，作為生物反應器生產(chǎn)藥用蛋白， 雞也具有其它動物無法比擬的優(yōu)勢。然而雞的胚胎發(fā)育與哺乳類動物的胚胎發(fā)育相
比有很多不同點，雞的卵子位于卵黃表面，受精后雄原核被胚胎遮掩，蛋被產(chǎn)出時， 胚胎已發(fā)育成大約由60，000個細胞組成的胚盤階段，這使得在哺乳動物中已廣泛 應用的轉(zhuǎn)基因技術，例如受精卵顯微注射法并不適合在禽類中應用?；陔u胚胎發(fā) 育的特殊性，目前ES細胞途徑被認為是轉(zhuǎn)基因雞制作最理想的技術路線之一。
ES細胞法的突出優(yōu)點是可對ES細胞進行特定遺傳修飾，任何形成的體細胞操 作如外源DNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、電脈沖等對細胞內(nèi)基因的定點修飾均可適用于ES 細胞。用ES細胞介導的轉(zhuǎn)基因技術來提高禽類的生產(chǎn)性能和抗病性能將為養(yǎng)禽業(yè) 帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
EG細胞的培養(yǎng)以及染色體核型的檢測還存在種種困難，其中的很多問題有待于 進一步解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培養(yǎng)雞的胚胎生殖細胞的方法及其專用培養(yǎng)液。
本發(fā)明提供的雞的胚胎生殖細胞培養(yǎng)液為高糖DMEM，含有如下溶質(zhì) 3. 5-4. 5g/L葡萄糖、1. 5-2. 5mM L-谷氨酰胺、(4.5-5.5) X 1(T5M 0-巰基乙醇、 1-1. 5mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、100-120IU/ml (100-120units/ml)白血病抑制因 子、4-6ng/ml干細胞生長因子、10-12ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、10-12ng/ml 類胰島素生長因子-1、 10-15%胎牛血清(體積比)、1-3%雞血清(體積比)、1-1.2% 雞胚浸出液(體積比)、抗菌素。
所述雞胚浸出液可采用市售的雞胚浸出液也可以用如下方法制備得到
1) 正常受精的雞卵于3『C孵箱或恒溫箱內(nèi)孵化。孵箱內(nèi)放一盛水器保持箱內(nèi) 空氣濕潤。每日翻動雞卵1或2次。
2) 將孵化9 12天的雞卵浸于95%酒精中10 15分鐘，取出后置一小燒杯中， 氣室端朝上，用碘酒和酒精棉球消毒氣室端的蛋殼。
3) 敲碎氣室端的蛋殼，用鑷子剝?nèi)サ皻?，小心剝離氣囊和尿囊膜，用彎頭鑷 子夾住雞胚頸部，輕輕取出雞胚，置于平皿中。
4) 去除雞胚眼睛，血塊和卵黃，用Hanks液沖洗數(shù)次。
5) 將整個雞胚徹底剪碎，置于組織勻漿器中研磨，或置入注射器中，加壓將 組織液擠入離心管中。
6) 加入與雞胚組織等量的Hanks液，用吸管輕輕吹打混勻，密封后置于37°C 恒溫箱中30分鐘，待雞胚組織中的營養(yǎng)成分浸出。
7) 3000r/min離心30min，用消毒玻璃小瓶分裝，封口。于-2(TC冰箱內(nèi)保存。 所述抗菌素具體可為青霉素和鏈霉素；所述培養(yǎng)液中含有100-150IU/ml青霉
素、100-120 u g/ml鏈霉素。
1 IU青霉素的定義1 11^0.60ug結(jié)晶青霉素G鈉鹽。
所述雞的胚胎生殖細胞培養(yǎng)液具體含有如下溶質(zhì)4.5g/L葡萄糖、2mML-谷氨 酰胺、5. 5X10—5M 巰基乙醇、1 mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、100IU/ml青霉素、 100ug/ral鏈霉素、100IU/ml白血病抑制因子、5ng/ml干細胞生長邁子、10ng/ml堿 性成纖維細胞生長因子、10ng/ml類胰島素生長因子-l、 10%胎牛血清(體積比)、 2%雞血清(體積比)、1% (體積比)雞胚浸出液。
本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)雞的胚胎生殖細胞的方法，是將雞的胚胎生殖細胞置于雞胚成纖維細胞培養(yǎng)層上培養(yǎng)。
所述雞的胚胎生殖細胞是將分離到的雞的胚胎生殖腺原生殖細胞細胞和雞胚 生殖腺加入所述的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)得到的。
所述雞胚PGCs細胞為5. 5-8. 5胚齡的細胞。
本發(fā)明提供了一種有效的培養(yǎng)雞的胚胎生殖細胞(EG)的方法。PGCs是配子的 前體細胞，參與性腺的形成，因而利用PGCs培養(yǎng)的胚胎生殖細胞(EG細胞)來生產(chǎn) 轉(zhuǎn)基因雞具有很大的優(yōu)勢。外源基因可根據(jù)需要定位整合到細胞染色體基因組的特 定位置，通過對EG細胞的改造與修飾可高效培育出雞的新品種。
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 以下實施例中用到的試驗材料如下
(一) 試驗動物
壽光黑雞聊城市嘉明種雞場(四只)，毛色基因型為CC00EE， E為色素擴散 基因，黑色對顯性白羽為隱性，C為色素基因，0為氧化酶基因。
海蘭白種蛋購自山東省泰安市東岳種雞場(200枚)，海蘭白雞的毛色基因
型為IICCOO， I為色素抑制基因，可掩蓋黑色和淺黃色。
(二) 試驗材料
高糖DMEM(高葡萄糖)SigmaCat No D5648; Hanks: GibcoCat No 61200-036; 鼠白血病抑制因子(mLIF) : SigmaCat No L5158; 堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) : GibcoCat No 13256-029; 人干細胞生長因子(hSCF) : SigmaCat No S7901; 類胰島素生長因子-1 (IGF-1) : SigmaCat No 13769; 胎牛血清(FBS): GibcoCat No 16141-061; PAS染色液SigmaCat No 395-B; 雞血清(CBS) : GibcoCat No 16110-082; 胰蛋白酶(Trypsin) : GibcoCat No 27250-034; 絲裂霉素-C: SigmaCat No M0503;
巰基乙醇GibcoCat No 21985-023。(三)溶液
1、 PBS的配制
NaCl 8. 0g、 Na2HP04 12H20 1. 44g、 KC1 0. 25g、 KH2P04 0 . 25g，加適量超純水 使其溶解，用lOOOml容量瓶定容。調(diào)節(jié)pH值7.2左右，100ml/瓶分裝。15磅高壓 滅菌30min， 4。C保存?zhèn)溆?用前每瓶加一管步驟13的青霉素/鏈霉素溶液)。
2、 青霉素/鏈霉素溶液(IOO倍濃度)的配制
青霉素1.0X106IU、鏈霉素lg，加PBS至10ml， 0.22um微孔濾膜過濾除菌。 100ul/管分裝，-2(TC保存。
3、 Hanks液的配制
取Hanks—包(9. 8克)用超純水溶解，稱取NaHC03 0 . 35g，溶于Hanks中混 勻，用超純水定容至1000ml。 1M的HCl調(diào)pH7.2左右，0. 22 ix m微孔濾膜過濾除菌， 100ml/瓶分裝。4'C保存?zhèn)溆?用前每瓶加一管步驟2的青霉素/鏈霉素溶液)。
4、 絲裂霉素-C的分裝
取一個包裝的絲裂霉素-C加入4ml PBS使其完全溶解，0. 22 y m微孔濾膜過濾 除菌后200 u 1分裝，-20°C密封保存。使用時用高糖DMEM稀釋為最終濃度10 u g/ml 。
5、 0. 1%明膠的配制
稱取0. lg明膠充分溶解于lOOml超純水中，15磅高壓滅菌，30min。 5ml分裝， 4"C保存?zhèn)溆谩?br> 6、 雞胚浸出液的制作
1) 正常受精的雞卵于38r孵箱或恒溫箱內(nèi)孵化。孵箱內(nèi)放一盛水器保持箱內(nèi) 空氣濕潤。每日翻動雞卵1或2次。
2) 將孵化9 12天的雞卵浸于95%酒精中10 15分鐘，取出后置一小燒杯中， 氣室端朝上，用碘酒和酒精棉球消毒氣室端的蛋殼。
3) 敲碎氣室端的蛋殼，用鑷子剝?nèi)サ皻?，小心剝離氣囊和尿囊膜，用彎頭鑷 子夾住雞胚頸部，輕輕取出雞胚，置于平皿中。
4) 去除雞胚眼睛，血塊和卵黃，用Hanks液沖洗數(shù)次。
5) 將整個雞胚徹底剪碎，置于組織勻漿器中研磨，或置入注射器中，加壓將 組織液擠入離心管中。
6) 加入與雞胚組織等量的Hanks液，用吸管輕輕吹打混勻，密封后置于37°C 恒溫箱中30分鐘，待雞胚組織中的營養(yǎng)成分浸出。7) 3000r/min離心30min，用消毒玻璃小瓶分裝，封口。于-2(TC冰箱內(nèi)保存。
8) 用前用超純水l: l稀釋，使用時用1%濃度(體積比)配制。 7、消化液的配制
稱取胰蛋白酶0.25g、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 0. 040g溶于100ml PBS中， 置于37。C水浴中使其完全溶解，以0.22um微孔濾膜過濾除菌，lml/管分裝，4°C 保存?zhèn)溆谩?、 成纖維細胞培養(yǎng)液的配制
含有如下溶質(zhì)的高糖DMEM: 4.5g/L葡萄糖、10%新生牛血清(NCS)(體積比)、 2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100u g/ml鏈霉素。10、 雞的胚胎生殖細胞培養(yǎng)液的配制
雞的胚胎生殖細胞培養(yǎng)液為高糖DMEM，含有如下溶質(zhì)4.5g/L葡萄糖、2mML-谷氨酰胺、5.5X10—5M P-巰基乙醇、lmM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、100IU/ml青霉素、 100ug/ml鏈霉素、100IU/ml白血病抑制因子、5ng/ml干細胞生長因子、10ng/ml堿 性成纖維細胞生長因子、10ng/ml類胰島素生長因子-1、 10%胎牛血清(體積比)、 2%雞血清(體積比)、1% (體積比)雞胚浸出液。 (四)雞胚成纖維細胞(PCEFs)的制備 1、 雞胚的處理
① 取9 11日齡的雞胚，氣室處用碘酊和酒精消毒(由中央向四周涂抹)。
② 用鑷子去除氣室處卵殼及殼膜，取出雞胚置于無菌平皿中(平皿中事先放入 Hanks液)，用眼科剪去除雞胚的四肢、頭、尾及內(nèi)臟等，Hanks液沖洗2 3次(在 超凈工作臺上)。
③ 洗后的組織用眼科剪剪成1咖3的小組織塊，Hanks液沖洗2 3次，去除血 細胞，色素物質(zhì)及細胞碎片等。 2、 細胞的消化
① 4 5倍于培養(yǎng)組織體積的消化液，置于37。C消化15min，中間可輕搖幾次， 發(fā)現(xiàn)組織塊變得疏松，表面發(fā)毛時說明消化合適。
② 消化液倒出，Hanks液清洗2 3次后加入高糖DMEM 5 10ml，用大吸管吹 打，以打散組織塊。
③ 離散后的細胞用2 4層紗布過濾，收集細胞懸液。 3、 細胞的培養(yǎng)① 取少量細胞懸液，臺盼藍染色后細胞計數(shù)。
② 用高糖DMEM稀釋細胞懸液至最終細胞密度為2 5Xl(^個/ml，置于培養(yǎng)瓶 中培養(yǎng)。
37°C，5%C02，飽和濕度條件下培養(yǎng)。
④24小時后換液，去除細胞塊及死細胞，2 3天傳代一次。 4、細胞的傳代
① 成纖維細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，即可傳代。
② 去除高糖DMEM培養(yǎng)液后用Hanks液清洗2 3次。
③ 加入Hanks液2 3ml，消化液200 300 u 1， 37。C孵育2 3rain后，吸去消 化液。
④ 用高糖DMEM 5 6ml中和殘存的胰蛋白酶，用大吸管吹打分散細胞。
⑤ 收集細胞懸液，1000rpm離心8 10min，去上清。
⑥ 高糖DMEM重懸細胞團并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為2 5X 1()5個/ml左 右，置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
37°C，5%C02，飽和濕度條件下培養(yǎng)。 (五)雞胚成纖維細胞(PCEFs)飼養(yǎng)層的制備
1、 提前2小時以上把0. 1%的明膠溶液鋪于培養(yǎng)板中，使用前吸去明膠，PBS 溶液洗2 3次。
2、 選取生長良好的傳至3 6代的雞胚成纖維細胞吸去培養(yǎng)液后，PBS洗兩次， 加入事先配制好的絲裂霉素-C溶液，37X:孵育2 2. 5小時。
3、 倒出絲裂霉素-C溶液并用PBS洗7次，以確保絲裂霉素-C完全去除。加入 PBS 2 3ml，消化液200 300ul， 37。C孵育2 3min后，吸去消化液。
4、 加入高糖DMEM 5 6ml，用大吸管吹打使其分散為單細胞懸液。
5、 收集細胞懸液，1000rpra離心8 10min，去上清。
6、 高糖DMEM重懸細胞團并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為3.5X105個/ml， 接種于24孔培養(yǎng)板中。
7、 37°C，5%C02，飽和濕度條件下培養(yǎng)。
8、 24小時后觀察細胞生長情況，若發(fā)現(xiàn)細胞過稀則補加處理后的細胞以保證 細胞能連成一片而沒有間隙。
將制備好的飼養(yǎng)層放置在培養(yǎng)箱中備用，在5天內(nèi)使用，使用前更換為EG細胞培養(yǎng)液。
實施例1、 EG細胞的培養(yǎng)
1、 取出孵化到期的雞卵(壽光黑雞)30枚，令氣室端向上，用碘酒和酒精消 毒蛋殼。
2、 用消毒剪剪除氣室端蛋殼，小心撥開尿囊膜，用彎玻璃棒或彎頭鑷子伸到 胚體頸下方，輕輕挑起雞胚置于平皿中。
3、 去掉胚眼、血塊、尿囊膜等物，用PBS沖洗雞胚。
4、 將雞胚置于盛有PBS的平皿中，小心撥開雞胚腹部，去除腹內(nèi)的內(nèi)臟，暴 露出中腎及生殖腺。在體視顯微鏡鏡下用玻璃針挑取生殖腺及其周圍組織，Hanks 液沖洗2-3次。
5、 將Hanks液倒出，消化液消化1 2rain (37。C)。
6、 消化完畢，中和胰酶，用槍頭吹散細胞，200g離心5 8min。
7、 分離得到的PGCs和含PGCs的小組織團塊經(jīng)消化后，200g離心5min。
8、 移入事先經(jīng)0.01%明膠包被的24孔培養(yǎng)板上，每個板上加入3 4份生殖 腺(按所取的生殖腺的個數(shù)估計)。
9、 加入新鮮的雞的胚胎生殖細胞培養(yǎng)液。
10、 保持濕度90%、溫度37。C的C02培養(yǎng)箱中孵育，隔一天半量換液，直至出 現(xiàn)較多典型的細胞克隆(約7-10天)。
11、 挑出細胞克隆，用吸管小心吹打，0.25。/。的消化液消化30sec，終止消化。
12、 lOOOrpra離心8 10min，移入鋪有PCEFs細胞飼養(yǎng)層的新鮮培養(yǎng)板上培養(yǎng)。
實施例2、 EG細胞的鑒定
將實施例1培養(yǎng)的EG細胞傳至第四代，進行如下鑒定
一、 形態(tài)學鑒定
EG細胞克隆呈規(guī)則的島狀或集落狀生長，多層分布，且有明顯的花紋，細胞間 并不緊密排列，有時可看清內(nèi)部的細胞界限。類EG細胞含大的細胞核和相對較少 的胞質(zhì)，核仁不明顯。
二、 PAS染色反應
EG細胞在1。/o戊二醛中固定5min后，1XPBS沖洗2次，室溫下浸入過碘酸試劑中約5min，再用1XPBS沖洗，接著浸入希夫試劑中約15min， 1XPBS沖洗2次， 經(jīng)PAS染色的EG細胞在倒置顯微鏡下觀察。
EG細胞集落和單個PGCs及呈深紫紅色，顯陽性；雞胚成纖維細胞不著色。
三、 體外分化實驗
1、 自發(fā)分化
聚集的EG細胞集落去除培養(yǎng)液中的生長因子，不更換詞養(yǎng)層，長時間不進行 傳代，觀察其自發(fā)分化的集落形態(tài)。
可見細胞生長緩慢，自發(fā)分化，首先表現(xiàn)為失去原有的形態(tài)，細胞體積變大， 進而與周圍細胞界限不清，集落外圍的細胞與飼養(yǎng)層連成一片。
2、 懸浮培養(yǎng)
為了鑒定EG細胞是否可形成類胚體，挑出細胞克隆后經(jīng)吸管小心吹打后離心。 EG細胞在無mLIF的EG培養(yǎng)基(EG培養(yǎng)基配方見實施例1的步驟一的(三)的10) 中重懸培養(yǎng)，培養(yǎng)液每隔一天更換一次。每天鏡檢，觀察EG細胞分化和類胚體形 成的情況。
3 4天后，可見部分細胞團形成簡單的胚體，最外層分化為由較大細胞組成的 內(nèi)胚層樣結(jié)構(gòu)，中心為未分化的細胞，類似早期胚胎。
四、 嵌合體雞的制作
① 培養(yǎng)的傳至3代、4代的雞EG細胞為供體。首先挑選細胞克隆，PBS清洗后 用消化液37T:消化2 3min。
② 將EG細胞克隆移入高糖DMEM中洗兩次后移入PBS中。
③ 用口吸管輕輕吹打并借助剝離針的作用將細胞團分散為單細胞懸液， 1000rpra離心8 10min，去上清，收集細胞團。
用PBS重懸細胞團，制成細胞密度為100個/ul的細胞懸液備用。
⑤ 以海蘭白種蛋為受體(45枚)，將供體細胞注入受體種蛋的胚下腔內(nèi)，轉(zhuǎn)入 代用蛋殼I中，補加蛋清(雙抗終濃度為青霉素250IU/ml、鏈霉素250ug/ml)至 滿，保鮮膜封口 (38.2°C、翻％、 90°翻蛋角)孵化至72小時。
⑥ 然后轉(zhuǎn)入代用蛋殼II中(38.2°C、 RH60%、 30°翻蛋角)孵化直至21天出雛。 成活4只，有一只弱雛為毛色嵌合體。
權利要求
1、雞的胚胎生殖細胞培養(yǎng)液，它為高糖DMEM溶液，含有如下溶質(zhì)3.5-4.5g/L葡萄糖、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、(4.5-5.5)×10-5Mβ-巰基乙醇、1-1.5mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、100-120IU/ml白血病抑制因子、4-6ng/ml干細胞生長因子、10-12ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、10-12ng/ml類胰島素生長因子-1、10-15％胎牛血清(體積比)、1-3％雞血清(體積比)、1-1.2％雞胚浸出液(體積比)、抗菌素。
2、 如權利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于所述抗菌素為青霉素和鏈霉素； 所述培養(yǎng)液中含有100-150IU/ml青霉素、100-120n g/ml鏈霉素。
3、 如權利要求1或2所述的培養(yǎng)液，其特征在于培養(yǎng)液含有如下溶質(zhì)4.5g/L 葡萄糖、2raML-谷氨酰胺、5. 5X10—5M P -巰基乙醇、1 mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、100IU/ml 青霉素、100ug/ml鏈霉素、100IU/ml白血病抑制因子、5ng/ml干細胞生長因子、 10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、10ng/ral類胰島素生長因子-l、 10%胎牛血清(體 積比)、2%雞血清(體積比)、1% (體積比)雞胚浸出液。
4、 一種培養(yǎng)雞的胚胎生殖細胞的方法，是將雞的胚胎生殖細胞置于雞胚成纖維 細胞培養(yǎng)層上培養(yǎng)。
5、 如權利要求4所述的方法，其特征在于所述雞的胚胎生殖細胞是將分離到 的雞的胚胎生殖腺原生殖細胞細胞和雞胚生殖腺加入權利要求1至3中任一所述的細 胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)得到的。
6、 如權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述雞胚PGCs細胞為5.5-8.5胚齡的細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)雞的胚胎生殖細胞的方法及其專用培養(yǎng)液。本發(fā)明提供培養(yǎng)液為高糖DMEM溶液，含有如下溶質(zhì)3.5-4.5g/L葡萄糖、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、(4.5-5.5)×10^-5M β-巰基乙醇、1-1.5mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、100-120IU/ml白血病抑制因子、4-6ng/ml干細胞生長因子、10-12ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、10-12ng/ml類胰島素生長因子-1、10-15％胎牛血清、1-3％雞血清、1-1.2％雞胚浸出液、抗菌素。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法，是將雞的胚胎生殖細胞置于雞胚成纖維細胞培養(yǎng)層上培養(yǎng)。通過對EG細胞的改造與修飾可高效培育出雞的新品種。
文檔編號C12N5/06GK101423818SQ20081024009
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者李宏濱, 杜立新, 娟 王, 郝小靜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所