專利名稱:一種培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)液的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)液。
背景技術:
胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells, ES細胞)是通過分離內細胞團(Inner Cell Mass, ICM)細胞或早期胚胎的原始生殖細胞(Primordial Germ Cells, PGCs),在體
外合適的條件下抑制分化培養(yǎng)而得到的具有無限增殖能力,能進行自我更新
(self-renewing),具有分化為包括生殖系細胞在內的多種細胞的潛能的未分化 細胞。ES細胞具有早期胚胎細胞的特征,在體外能進行傳代、冷凍、復蘇等操作仍 保持正常二倍體核型。自從1981年英國劍橋大學的Evans和Kaufman、美國加州大 學的Martin分別成功建立了小鼠的ES細胞系以來,胚胎干細胞的研究成為全世界 范圍內關注的焦點。1999年末,美國Science (《科學》雜志)公布的年度世界十 大科學成果評選中,"干細胞研究的新發(fā)現(xiàn)"榮登榜首,而人類基因組計劃工程卻 屈居第二。美國Time (《時代》周刊)將干細胞研究成果列為20世紀末世界十大 科技成就之首。干細胞尤其是胚胎干細胞的研究成為21世紀生命科學領域中最具 有發(fā)展和應用前景的一大熱門話題,已成為繼人類基因大規(guī)模測序完成后生命科學 中最活躍的領域之一。
ES細胞在生命科學多個領域都有著廣泛的用途,其中最令人興奮的是醫(yī)學應用 潛能。ES細胞具有多向分化潛能,可在體外誘導分化為各種類型的干細胞或成熟細 胞,在合適的條件下可能發(fā)育為完整器官,因此可能成為臨床組織或器官移植材料 的新來源,以取代病人體內損壞的細胞組織或器官,達到治療組織缺損、遺傳缺陷、 器官障礙等難治疾病的目的。動物實驗顯示,ES細胞來源的血液細胞、神經(jīng)細胞、
心肌細胞、軟骨細胞、肌肉細胞等移植入體內可發(fā)揮相應功能,體外培養(yǎng)膀胱組織 已經(jīng)取得成功,表明ES細胞走入臨床應用已經(jīng)為期不遠(Thomson, 2000)。"治 療性克隆"是ES細胞在醫(yī)學上應用的又一途徑,具體程序是將病人體細胞(如皮 膚細胞)的細胞核,移植到去核的卵母細胞內,然后使之融合,體外培養(yǎng)胚胎,發(fā) 育到囊胚后取其內細胞團,建成ES細胞系,再誘導分化成供醫(yī)療使用的細胞或組 織(Solter, 1999)。ES細胞研究提供了在細胞和分子水平上研究人及動物早期發(fā)育過程中相關問 題的方法,可以幫助我們解決動物發(fā)育過程中的復雜問題,促進胚胎發(fā)育細節(jié)的基 礎研究,是研究脊椎動物早期胚胎發(fā)育的理想模型,有著廣闊的應用前景。ES細胞 技術結合基因打靶技術,用來研究動物體某些基因的功能。傳統(tǒng)上,多用轉基因或 基因敲除動物模型作為基因功能分析方法,但周期較長。而利用ES細胞系可通過
基因缺失和過度表達兩種途徑進行研究,縮短了周期。
利用ES細胞介導的轉基因技術是目前認為最有效的轉基因途徑之一,可將所 有的優(yōu)良基因直接轉入待改良的種群中,可形成有優(yōu)良遺傳品質的品系和高抗病力 的品系。轉移到雞體內的基因有牛生長激素基因、人類生長因子基因、雞生長因
子基因、潮霉素抗病毒基因、雞抗馬立克抗體基因、乙酰氯霉素轉移酶基因等
(Allioili, 1994; Ebara, 2000)。
ES細胞提供了對新藥的藥理、藥效、毒理和藥物代謝等研究的細胞水平研究手 段,可大大減少藥物檢測所需動物的數(shù)量,降低成本。類胚體(EB)可用于某種新 藥或化學物質的毒性及效能的評估,這對藥理學、化肥工業(yè)等領域的發(fā)展有重要意 義。
關于雞胚胎干細胞(CES細胞)的研究是目前國際上研究的熱點之一。CES細 胞的研究具有非常重要的意義。首先,雞胚胎是研究脊椎動物早期發(fā)育的主要模型 之一。其次,CES技術的一個主要應用就是通過對ES細胞的體外遺傳操作,并篩選 陽性細胞獲得轉基因雞。通過ES途徑用商品雞生產(chǎn)藥物蛋白。第三,生產(chǎn)有生物 功能的治療性藥物。第四,進行轉基因育種。在CES細胞細胞的研究的20年里, 其ES細胞的建系很大程度上受小鼠全能或多能干細胞研究方法的影響,雞的ES細 胞系大都是通過分離培養(yǎng)未孵化的X期胚盤細胞或發(fā)育早期雞胚PGCs所獲得。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)液。 本發(fā)明提供的胚胎干細胞培養(yǎng)液,是將80% (體積比)大鼠肝細胞條件培養(yǎng)基 和20% (體積比)ES細胞基礎培養(yǎng)液混合得到的;
所述大鼠肝細胞條件培養(yǎng)基是培養(yǎng)BRL細胞得到的培養(yǎng)液; 所述ES細胞基礎培養(yǎng)液為高糖DMEM,含有如下溶質3. 5-4. 5g/L葡萄糖、 10-15%胎牛血清(體積比)、1.5-2. 5mM L-谷氨酰胺、0. l-O. 15mM 0-巰基乙醇、 l-1.5慮羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3%雞血清(體積比)、抗菌素。所述ES細胞基礎培養(yǎng)液中,所述抗菌素具體可為青霉素、鏈霉素和慶大霉素; 所述ES細胞基礎培養(yǎng)液中含有100-150IU/ml青霉素、100-120 u g/ml鏈霉素、 10-12ng/ml慶大霉素。
所述ES細胞基礎培養(yǎng)液具體含有如下溶質4.5g/L葡萄糖、15%胎牛血清(體 積比)、2raM L-谷氨酰胺、0. ImM 巰基乙醇、lrnM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞 血清(體積比)、100IU/ml青霉素、100yg/ml鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
具體可采用含有如下溶質的高糖DMEM培養(yǎng)BRL細胞4. 5g/L葡萄糖、10%胎牛 血清(體積比)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素。
所述培養(yǎng)BRL細胞得到的培養(yǎng)液,自接種開始每3天收集一次,可以收集1-5次。
本發(fā)明還提供了一種培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法,包括將雞的胚胎干細胞重懸于 所述的胚胎干細胞培養(yǎng)液中,然后置于密度為(2-3) Xl(f細胞/孔的小鼠成纖維細 胞飼養(yǎng)層上進行原代培養(yǎng)的步驟。
所述小鼠成纖維細胞的密度具體可為2. 5X105細胞/孔。
所述方法中還包括將原代培養(yǎng)后的細胞重懸于ES細胞完全培養(yǎng)液或所述胚胎 干細胞培養(yǎng)液中,然后置于密度為(2-3) 乂105的小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層上進行繼 代培養(yǎng)的步驟;
所述ES細胞完全培養(yǎng)液為高糖DMEM,含有如下溶質3. 5-4. 5g/L葡萄糖、 10-15°/。胎牛血清(體積比)、1.5-2. 5mM L-谷氨酰胺、0. 1-0. 15raM P -巰基乙醇、 l-1.5mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3%雞血清(體積比)、15-25ng/ml伴白蛋白、抗 菌素。
所述ES細胞完全培養(yǎng)液中,所述抗菌素具體可為青霉素、鏈霉素和慶大霉素; 所述ES細胞完全培養(yǎng)液中,含有100-150IU/ml青霉素、100-120 u g/ml鏈霉素、 10-12ng/ml慶大霉素。
所述ES細胞完全培養(yǎng)液具體含有如下溶質4.5g/L葡萄糖、10%胎牛血清(體 積比)、2raM L-谷氨酰胺、0. ImM P -巰基乙醇、lmM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞 血清(體積比)、20ng/ml伴白蛋白、100IU/ml青霉素、lOOu g/ml鏈霉素、10ng/ml 慶大霉素。
所述小鼠成纖維細胞的密度具體可為2.5乂105細胞/孔。 1 IU青霉素的定義1 11M).60ug結晶青霉素G鈉鹽。本發(fā)明提供的培養(yǎng)CES的方法,具有經(jīng)濟、高效的優(yōu)點。 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。 以下實施例中用到的試驗材料如下
(一) 試驗動物
壽光黑雞壽光慈倫種雞場,毛色基因型為CC00EE, E為色素擴散基因,黑色 對顯性白羽為隱性,C為色素基因,0為氧化酶基因。
海蘭白種蛋山東省泰安市東岳種雞場,海蘭白雞的毛色基因型為nccoo, i
為色素抑制基因,可掩蓋黑色和淺黃色。
(二) 試驗材料
高糖DMEM(高葡萄糖)Gibco Cat No 12800-058;
伴白蛋白(Conalburain) : Sigroa Cat No C-7786;
PBS: Gibco Cat No 21600-051;
L-谷氨酰胺(L-Glutamine) : Gibico Cat No 5445;
絲裂霉素-C: SigmaCat No M0503;
鼠白血病抑制因子(mLIF) : SigmaCat No L5158;
堿性成纖維細胞生長因子(bFGF) : Sigma Cat No F-5392;
人干細胞生長因子(hSCF) : SigmaCat No S7901;
類胰島素生長因子-1 (IGF-1) : SigmaCat No 13769;
胎牛血清(FBS): GibcoCat No 16141-061;
BCIP/NBT染色液上海生工 E116;
胰蛋白酶(Trypsin)GibcoCat No 27250-034;
雞血清(CBS) : GibcoCat No 16110-082;
e-巰基乙醇GibcoCat No 21985-023。
(三) 溶液
1、 BRL培養(yǎng)液
含有如下溶質的高糖DMEM: 4.5g/L葡萄糖、10%胎牛血清(體積比)、2mM L_ 谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100 u g/ml鏈霉素。
2、 成纖維細胞培養(yǎng)液含有如下溶質的高糖DMEM: 4.5g/L葡萄糖、10%新生牛血清(NCS)(體積比)、 2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和100y g/ml鏈霉素。 3、 ES細胞基礎培養(yǎng)液
含有如下溶質的高糖DMEM: 4.5g/L葡萄糖、15%胎牛血清(體積比)、2mM L-谷氨酰胺、0. lmM P-巰基乙醇、lraM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞血清(體積比)、 100IU/ml青霉素、100lig/ml鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
5、 ES細胞完全培養(yǎng)液
含有如下溶質的高糖DMEM: 4.5g/L葡萄糖、10%胎牛血清(體積比)、2mM L-谷氨酰胺、0. lmM 3-巰基乙醇、lmM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞血清(體積比)、 20ng/ml伴白蛋白、100IU/ml青霉素、100ng/ml鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
6、 0. 1%明膠的配制
稱取100mg明膠,溶于無菌PBS,過夜使其充分溶解于100ml超純水中。15磅 高壓滅菌,30min。 5ml分裝,4。C保存?zhèn)溆谩?br>
7、 消化液的配制
稱取胰蛋白酶0.25g、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA) 0. 040g溶于100ml PBS中, 置于37X:水浴中使其完全溶解,以0.22iim微孔濾膜過濾除菌,lml/管分裝,4°C 保存?zhèn)溆谩?br>
8、 大鼠肝細胞條件培養(yǎng)基(BRL-CM)的制備
以1Xl()5cells/ml密度接種BRL細胞(上海銳聰科技發(fā)展有限公司),待細胞 鋪滿后,每75cm2細胞加入13ml BRL培養(yǎng)液,于37r、 5%C02、飽和濕度下培養(yǎng), 每3d收集一次培養(yǎng)液(培養(yǎng)液可連續(xù)收集多次),-2(TC保存,用前調節(jié)PH到7.5 并用0. 22^m的微孔濾膜過濾。
9、 胚胎干細胞培養(yǎng)液
將80% (體積比)大鼠肝細胞條件培養(yǎng)基(BRL-CM)和20% (體積比)ES細胞 基礎培養(yǎng)液混合,得到胚胎干細胞培養(yǎng)液。
(四)小鼠成纖維細胞系(STO)飼養(yǎng)層的制備
取生長良好的小鼠成纖維細胞(上海亞培生物科技有限公司),用PBS洗兩遍 后加入含10(ig/ml絲裂霉素-C的成纖維細胞培養(yǎng)液,37°(3孵育1. 5-2h。吸出溶液 并用PBS液洗多次,完全去除絲裂霉素-C。常規(guī)胰蛋白酶消化,輕輕吹打使其分散 為單細胞懸液。調整細胞至合適密度,接種于明膠包被的24孔培養(yǎng)板。37°C、 5%C02、飽和濕度下培養(yǎng)。24h后觀察細胞生長情況,若發(fā)現(xiàn)細胞過稀則補加處理后的 細胞以保證細胞能鋪成單層。將制備好的飼養(yǎng)層放置在培養(yǎng)箱中備用,在5d內使用。
實施例1、雞胚胎干細胞(CES)的培養(yǎng)
一、 雞胚X期胚盤細胞的分離
(1) 取新鮮的壽光黑雞種蛋,0.1% (體積比)新潔爾滅浸洗后,用75% (體 積比)的酒精擦拭消毒。
(2) 在超凈工作臺內小心的剝去卵殼,取出胚盤。
(3) 將胚盤放入PBS中,小心的除去附著的卵黃和卵黃膜。
(4) 去除胚盤暗區(qū),將明區(qū)用無菌PBS洗2-3遍,放入離心管中輕輕吹打后, 100g離心8-10min,去上清。
(5) 高糖DMEM重懸細胞團,100g離心8-10min,去上清。
(6) 將胚盤細胞加入100|il消化液,37。C消化l-2min后,高糖DMEM中和消 化液,吹打使其分散為單細胞懸液。100g離心8-10min,去上清,收集細胞團。
二、 雞胚X期胚盤細胞的原代培養(yǎng)
飼養(yǎng)層是密度為2.5Xl()5細胞/孔(24孔板)的小鼠成纖維細胞系,每孔再加 500ul用胚胎干細胞培養(yǎng)液重懸的步驟一制備的細胞團,盡量保持培養(yǎng)板平衡,以 避免細胞分布不均勻。置于培養(yǎng)箱中37"C、 5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng),每24h 換液一半。
三、 CES細胞的繼代培養(yǎng)
(1) 注意觀察雞胚盤細胞的生長情況,選擇細胞克隆生長良好,隆起明顯, 形態(tài)未表現(xiàn)分化或剛剛表現(xiàn)分化跡象的集落進行傳代。
(2) 用口吸管和剝離針剝離周圍的飼養(yǎng)層細胞和有分化跡象的細胞,選擇好 的克隆和未分化部分挑出,置于PBS中洗一次后,移入消化液中,37。C消化2-3rain。
(3) 用口吸管將細胞克隆從消化液中吸出,置于高糖DMEM中,洗2次后,移 入ES細胞完全培養(yǎng)液中,用口吸管輕輕吹打并借助剝離針的作用將細胞團分散為 小細胞團(20-40個)懸液,置于新制備的飼養(yǎng)層(飼養(yǎng)層是密度為2.5X105細胞/ 孔(24孔板)的小鼠成纖維細胞系)中37匸、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng),每24h 換液一半。實施例2、 CES細胞的鑒定
1、 形態(tài)學鑒定
對實施例1中傳至3代的CES細胞進行形態(tài)學鑒定。借助倒置顯微鏡及體視顯 微鏡,每天觀察細胞集落的外部特征。
培養(yǎng)4h后CES細胞大部分細胞都已經(jīng)貼壁,24h后開始出現(xiàn)小的克隆,以后克 隆逐漸長大,克隆上有液滴,6d左右長成較大的克隆,將要分化時便需要傳代。CES 細胞克隆具有和小鼠ES細胞相似的形態(tài)ES細胞呈克隆狀生長,邊緣光滑,細胞 致密的聚集在一起,細胞間界限不清,形成鳥巢樣集落,也有的呈不規(guī)則形態(tài)(如 山包樣、葵花樣等);克隆周圍有時可見單個ES細胞和分化的扁平狀細胞。核大, 核質比高,核仁明顯。
2、 AKP染色鑒定
對實施例1中傳至3代的CES細胞進行AKP染色鑒定。吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液, 用PBS洗滌兩遍后,用4X的多聚甲醛4"C固定15min,然后用AKP染色液在37°C 或室溫染5-30min,直至出現(xiàn)理想的顏色。該反應可用添加EDTA或PBS洗滌而終止。 流水輕輕沖洗,晾干后中性樹膠封片,在倒置顯微鏡下觀察染色結果。AKP染色陽 性的細胞呈藍紫色。
BRL-CM培養(yǎng)的CES細胞表現(xiàn)出強AKP陽性,染色后呈藍紫色;分化的細胞及詞 養(yǎng)層細胞不著色。
3、 自發(fā)分化
不更換飼養(yǎng)層,長時間不進行傳代,觀察雞的ES細胞克隆自發(fā)分化的形態(tài)。 分別對實施例1中傳至3、 4、 5、 6、 7代的CES細胞進行自發(fā)分化鑒定。第3 至5代的CES克隆在長期不更換飼養(yǎng)層、不傳代、無分化抑制因子的情況下,l-2d 即可出現(xiàn)分化現(xiàn)象,分化的克隆形態(tài)發(fā)生明顯變化,邊界變得不清晰甚至消失,同 時伸展面積增大。3-4d大部分可觀察到幾種細胞類型。培養(yǎng)至第6、 7代的CES細 胞可以自發(fā)分化為成纖維樣細胞、肌肉樣細胞、神經(jīng)細胞等多種細胞類型。這些分 化的細胞或呈區(qū)域性集中分布,或散落生長,或互相混雜,有時可見血管樣結構出 現(xiàn),表明體外培養(yǎng)的CES細胞具有自發(fā)分化為多種細胞的潛能。
4、 懸浮培養(yǎng)
為了鑒定所培養(yǎng)的CES細胞是否可形成類胚體,將生長良好的實施例1中傳至3代的CES細胞克隆挑出后置于無伺養(yǎng)層細胞、無raLIF的ES細胞培養(yǎng)體系中懸浮 培養(yǎng),培養(yǎng)液每隔一天更換一次。每天鏡檢,觀察類ES細胞克隆形成類胚體的情 況。聚集的CES細胞集落去除培養(yǎng)液中的生長因子,不更換飼養(yǎng)層,長時間不進行 傳代,觀察其自發(fā)分化的集落形態(tài)。
將形態(tài)生長良好的CES細胞克隆挑出,在預先鋪有明膠的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)板上, 用普通無外源LIF的ES培養(yǎng)液培養(yǎng),每2d更換一次培養(yǎng)液。3-5d時有類似前述的 自發(fā)分化情況;5d后有囊胚樣結構出現(xiàn)。
5、嵌合體雞的培養(yǎng)
① 實施例1培養(yǎng)的傳至3代的CES細胞為供體。首先挑選細胞克隆,PBS清洗 后用消化液37。C消化2 3min。
② 將CES細胞克隆移入高糖DMEM中洗兩次后移入PBS中。
③ 用口吸管輕輕吹打并借助剝離針的作用將細胞團分散為單細胞懸液, 1000rpm離心8 10min,去上清,收集細胞團。
用PBS重懸細胞團,制成細胞密度為100個/ul的細胞懸液備用。
⑤ 以海蘭白種蛋為受體(45枚),將供體細胞注入受體種蛋的胚下腔內,轉入 代用蛋殼I中,補加蛋清(雙抗終濃度為青霉素250IU/ml、鏈霉素250ug/ml)至 滿,保鮮膜封口 (3S.2。C、 RH50%、 90°翻蛋角)孵化至72小時。
⑥ 然后轉入代用蛋殼II中(38.2°C、 RH60%、 30°翻蛋角)孵化直至21天出雛。 孵化率及嵌合率分別為45%和10.5%,證明CES具有參與受體體細胞發(fā)育的潛能。
權利要求
1、一種胚胎干細胞培養(yǎng)液,是將80%(體積比)大鼠肝細胞條件培養(yǎng)基和20%(體積比)ES細胞基礎培養(yǎng)液混合得到的;所述大鼠肝細胞條件培養(yǎng)基是培養(yǎng)BRL細胞得到的培養(yǎng)液;所述ES細胞基礎培養(yǎng)液為高糖DMEM,含有如下溶質3.5-4.5g/L葡萄糖、10-15%胎牛血清(體積比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0.1-0.15mMβ-巰基乙醇、1-1.5mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3%雞血清(體積比)、抗菌素。
2、 如權利要求1所述的培養(yǎng)液,其特征在于所述ES細胞基礎培養(yǎng)液中,抗菌 素為青霉素、鏈霉素和慶大霉素;所述ES細胞基礎培養(yǎng)液中含有100-150IU/ml青霉 素、100-120 n g/ml鏈霉素、10-12ng/ml慶大霉素。
3、 如權利要求2所述的培養(yǎng)液,其特征在于所述ES細胞基礎培養(yǎng)液含有如下 溶質4.5g/L葡萄糖、15%胎牛血清(體積比)、2mML-谷氨酰胺、0. lraM P-巰基乙 醇、lraM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞血清(體積比)、100IU/ml青霉素、100ug/ml 鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
4、 如權利要求1至3中任一所述的培養(yǎng)液,其特征在于所述培養(yǎng)BRL細胞得 到的培養(yǎng)液,自接種BRL細胞開始每3天收集一次。
5、 如權利要求4所述的培養(yǎng)液,其特征在于所述培養(yǎng)液收集l-5次。
6、 一種培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法,包括將雞的胚胎干細胞重懸于所述的胚胎干 細胞培養(yǎng)液中,然后置于密度為(2-3) X105細胞/孔的小鼠成纖維細胞詞養(yǎng)層上進行 原代培養(yǎng)的步驟。
7、 如權利要求6所述的方法,其特征在于所述小鼠成纖維細胞的密度為2.5 乂105細胞/孔。
8、 如權利要求6或7所述的方法,其特征在于所述方法中還包括將原代培養(yǎng) 后的細胞重懸于ES細胞完全培養(yǎng)液或權利要求1至5中任一所述胚胎干細胞培養(yǎng)液 中,然后置于密度為(2-3) X105的小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層上進行繼代培養(yǎng)的步驟;所述ES細胞完全培養(yǎng)液為高糖DMEM,含有如下溶質3. 5-4. 5g/L葡萄糖、10-15% 胎牛血清(體積比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0. 1-0. 15mM 0-巰基乙醇、1-1. 5mM 羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3%雞血清(體積比)、15-25ng/ml伴白蛋白、抗菌素。
9、 如權利要求8所述的方法,其特征在于所述ES細胞完全培養(yǎng)液中,所述抗 菌素為青霉素、鏈霉素和慶大霉素;所述ES細胞完全培養(yǎng)液中含有100-150IU/ml青 霉素、100-120lig/ml鏈霉素、10-12ng/ml慶大霉素。
10、如權利要求8或9所述的方法,其特征在于所述小鼠成纖維細胞的密度為2.5X105細胞/孔;所述ES細胞完全培養(yǎng)液含有如下溶質4.5g/L葡萄糖、10%胎牛血清(體積比)、 2mM L-谷氨酰胺、0. ImM P-巰基乙醇、lmM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、2%雞血清(體積 比)、20ng/ml伴白蛋白、100IU/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素、10ng/ml慶大霉素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法及其專用培養(yǎng)液。本發(fā)明提供的胚胎干細胞培養(yǎng)液,是將80%(體積比)大鼠肝細胞條件培養(yǎng)基和20%(體積比)ES細胞基礎培養(yǎng)液混合得到的;所述大鼠肝細胞條件培養(yǎng)基是培養(yǎng)BRL細胞得到的培養(yǎng)液;所述ES細胞基礎培養(yǎng)液為高糖DMEM,含有如下溶質3.5-4.5g/L葡萄糖、10-15%胎牛血清(體積比)、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、0.1-0.15mM β-巰基乙醇、1-1.5mM羥乙基呱嗪乙硫磺酸、1-3%雞血清(體積比)、抗菌素。本發(fā)明還提供了應用所述胚胎干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)雞胚胎干細胞的方法。本發(fā)明提供的培養(yǎng)CES的方法,具有經(jīng)濟、高效的優(yōu)點。
文檔編號C12N5/06GK101423819SQ20081024009
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者孟春花, 張傳生, 李宏濱, 杜立新 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所