專利名稱：一種用于檢測番茄不孕病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物病毒的檢測領(lǐng)域，特別涉及一種檢測番茄不孕病毒的 方法，該方法利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)(LAMP)檢測番茄不孕病毒。
背景技術(shù)：
菊花是中國傳統(tǒng)名花，也是世界四大切花之一,但由于病毒病的危害,使 菊花品質(zhì)、產(chǎn)量下降,品種退化十分嚴重。危害菊花的病毒種類很多，已報 道的有20余種。番茄不孕病毒(tomato aspermy virus, TAV)是危害菊花 的一種的重要病原，在觀賞性菊花上普遍發(fā)生。番茄不孕病毒歸屬為黃瓜 花葉病毒屬，患病菊花病時出現(xiàn)花葉、扭曲，植株萎縮，花色不正常。汁 液、桃蚜和其他一些蚜蟲作非持久性傳播。少數(shù)能種傳。帶毒桿頭也能傳 播病毒?；ɑ懿《静∈怯刹《疽鸬奈：ɑ苤参锏囊活愄厥獠『Γ摬?在癥狀特點、發(fā)生規(guī)律及防治措施等方面與一般病害差異較大。隨著國內(nèi) 外花卉貿(mào)易的發(fā)展，種苗的流通和種苗的自繁，病毒病問題也變得非常突 出，近年來已上升到公次于真菌性病害的地位，它影響了花丼的產(chǎn)量和品 質(zhì)，也影響了花卉的出口創(chuàng)匯。以及國外引種時海關(guān)檢疫、莖尖脫毒檢測 等要求在組織病毒含量極低時及早檢測。因此，發(fā)展快速準確、操作簡便 的檢測與鑒定病毒的方法一直是相關(guān)研究的熱點。因此，發(fā)展的檢測與鑒 定病毒的方法一直是相關(guān)研究的熱點。目前，普遍采用的聚合酶鏈式反應(yīng)
(PCR)檢測方法需要專門的儀器，檢測成本高，而且存在易交叉污染、 操作繁瑣的缺點，且不利于現(xiàn)場的快速檢測，推廣應(yīng)用難度較大。所以， 科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐中均需要一種快速準確、操作簡便的番茄不孕病毒的 檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測番茄不孕病毒的方法，該方法利用環(huán)介 導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)(LAMP)檢測番茄不孕病毒(TAV)。 該方法包括的步驟依次為
A. 配制反應(yīng)體系；
B. 將所述的反應(yīng)體系進行溫育處理，得到溫育產(chǎn)物；該溫育處理的溫度為65。C，時間為30-80min;
C. 將所述的溫育產(chǎn)物進行滅活處理，得到滅活產(chǎn)物；該滅活處理的 溫度為80°C ，時間為5-15min;
D. 將所述的滅活產(chǎn)物進行檢測，得到檢測結(jié)果。
所述的反應(yīng)體系中包括 B etaine0 5 -1.5 mol/L ， dNTP2-25mmol/L， Mg2+2-15mmol/L ，
外引物，內(nèi)引物；所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1: l一l: 8;
上述反應(yīng)體系中，根據(jù)GenBank公布的番茄不孕病毒中的保守序列設(shè) 計的特異性的LAMP引物，該保守序列為TAV外殼蛋白(Genbank登陸 號EU499736);該引物包括兩條外引物f3、 B3和兩條內(nèi)引物FIP、 BIP。
引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。該引物的核苷酸序列如 下
F3: 5' -AAGCCGATGAAATGGTGATC-3 ，， B3: 5' -GTTCAAAGGCACCTCATCGA-3 ，；
該方法適用的菊花品種為匍匐小菊，如粉地毯；大菊，如神馬。 本發(fā)明的有益效果為
1. 本發(fā)明不需要特殊儀器(如PCR儀)，較實驗室常規(guī)律方法更快捷， 經(jīng)濟。
2. 本發(fā)明鑒定簡便，有極高的特異性，只要用肉眼觀察或濁度儀紫外 成像系統(tǒng)檢測沉淀濁度就能夠判斷目的片段擴增與否，從而判斷出用于檢 測的樣品植株是否感染有番茄不孕病毒，而不必用凝膠電泳的方法來觀
察o


圖1:番茄不孕病毒的LAMP法反應(yīng)產(chǎn)物和PCR法反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖。
具體實施例方式實施例l:
一種檢測番茄不孕病毒的方法，該方法利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng) (LAMP)檢測番茄不孕病毒(TAV)。 該方法包括的步驟依次為
A. 在1.5-2.0ml的Eppendof滑中配制反應(yīng)體系；所用的溶劑為重蒸水 (ddH20);
B. 將所述的反應(yīng)體系進行溫育處理，得到溫育產(chǎn)物；該溫育處理的
溫度為65。C，時間為30-80min，優(yōu)選為60min;該溫育處理在金屬恒溫混勻 儀中進行，也可以在水浴鍋或金屬浴中進行；
C. 將所述的溫育產(chǎn)物進行滅活處理，得到反應(yīng)產(chǎn)物；該滅活處理的 溫度為8(TC，時間為5-15min，優(yōu)選為10min;該滅活處理在在金屬恒溫混 勻儀中進行；
D. 將所述的反應(yīng)產(chǎn)物進行檢測，得到檢測結(jié)果；
檢測的方法為可以是1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測；也可以使用比濁儀檢
測該反應(yīng)產(chǎn)物的濁度變化，也可以用肉眼直接觀察；也可以對該反應(yīng)產(chǎn)物 中進行染色處理，該染色處理的方法為向該滅活產(chǎn)物中加入0.1U1的核 酸結(jié)合染料SYBR Green I，在紫外燈下觀察如果反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)出熒光， 則證明樣品中含有番茄不孕病毒。
本實施例中所述的金屬恒溫混勻儀購自德國Eppendorf公司。 該方法適用的菊花品種為匍匐小菊，如粉地毯；大菊，如神馬。 本實施例中采用的即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)(Loop- mediatedisothermal amplification, LAMP),是日本學(xué)者Notomi等開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸 擴增方法。其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，LAMP反 應(yīng)產(chǎn)生許多不同大小的條帶，是由環(huán)狀結(jié)構(gòu)所構(gòu)成的花椰菜樣結(jié)構(gòu)，條帶 大小相差100bp左右,利用鏈置換DNA聚合酶(BstDNApoLymerase)在 等溫條件(65。C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)。此方法較實 驗室常用的RT-PCR更快捷，經(jīng)濟，不需要特殊儀器，其結(jié)果可以利用儀器 檢測或肉眼觀察核酸擴增過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀判定。目前,國外已有 較多的此類報道，如檢測番茄黃曲葉病毒、番茄斑點枯萎病毒、腸侵襲性 埃希(氏)大腸桿菌、雞蛋中沙門氏菌、河蝦中白斑綜合癥病毒等,并建立了 專門的官方網(wǎng)站(http: / / loopamp.eiken.co.jp / e / tech /index.htm)。而國內(nèi)起步較晚，2002年和2003年北京奶牛中心2次引進LAMP法檢測胚胎的性別。 同時，人們還在不斷對LAMP技術(shù)進行改良,使其能在疾病基因診斷、食品分
析和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域更好地發(fā)揮作用。
本實施例中采用的LAMP法具有以下特點(l)高特異性應(yīng)用6個區(qū) 段、4種引物，并且這6個區(qū)段的順序也有規(guī)定。因此LAMP法擴增的特異 性很高，可以根據(jù)是否擴增就能判斷目標基因的存在與否，即能夠進行細 菌或病毒的定性檢測。(2)只需一恒定溫度就能擴增反應(yīng)。不需要特殊試劑 以及昂貴的儀器，不需要預(yù)先進行雙鏈DNA的變性。(3)快速、高效擴增 整個擴增在不到一個小時即可完成，且產(chǎn)率很高。若在引物上再進一步改 進，可大大提高其擴增效率，擴增時間在原來的基礎(chǔ)上減少l /3 1 /2(4) 靈敏度高擴增模板可達1 10拷貝(5)鑒定簡便在核酸大量合成時，從 dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg離子結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物—— 焦磷酸鎂沉淀。它有極高的特異性，只要用肉眼觀察或濁度儀紫外成像系 統(tǒng)檢測沉淀濁度就能夠判斷擴增與否。雖然對于某些病毒的檢驗,LAMP 法的靈敏度和特異性尚未超越特殊方法的PCR ;焦磷酸鎂的濁度檢測法其 靈敏度也低于瓊脂糖凝膠電泳分析法;但是在很大程度上，LAMP法已經(jīng) 符合了臨床所需的要求。如果對LAMP法方法進行進一步完善、優(yōu)化和推 廣，該技術(shù)將會在在檢測病毒方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
實施例2:
本實施例是實施例1中所述的反應(yīng)體系的組成。該反應(yīng)體系中包括
Betaine 0.5-1.5mol/L， dNTP 2-25mmol/L， Mg2+ 2-15mmol/L ，
外引物，內(nèi)引物，所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1: l一l: 8; 本實施例中引入Mg^的方法為向該反應(yīng)體系中加入濃度為
2-15mmol/L的MgCl;
該內(nèi)引物的用量為0.2umol/L，該外引物的用量為0.8y mol/L;以體 積為25 u 1體系為例，所述的體系中還包括1 UBstDNA聚合酶大片段1 y 1， 10XBst polymerse buffer 1 u 1， DNA模板(濃度為15 u g/ml) 1 ul，足量的ddH20;
該反應(yīng)體系的體積可也可以為50 u 1。該反應(yīng)體系的體積可以為25ul，也可以為50ul。 所述的DNA模板提取自感染有番茄不孕病毒的菊花植株，該DNA模 板的制備方法為
首先，按照TRIZOL Reagent(購自Invitrogen公司)的產(chǎn)品說明書的方 法用Trizo1法提取菊花葉片RNA，再按照的M-MLV第一鏈cDNA合成試 劑盒(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)的產(chǎn)品說明書中的方法， 通過RT-PCR擴增得到所述的DNA模板；
上述反應(yīng)體系中，根據(jù)GenBank公布的番茄不孕病毒中的保守序列設(shè) 計的特異性的LAMP引物，該保守序列為TAV外殼蛋白(Genbank登陸 號EU499736);該引物包括兩條外引物f3、 B3和兩條內(nèi)引物FIP、 BIP。 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物的核苷酸序列如 下
F3: 5' -AAGCCGATGAAATGGTGATC-3,， B3: 5' -GTTCAAAGGCACCTCATCGA-3 ，；
本實施例中使用的試劑及設(shè)備均為常規(guī)產(chǎn)品，均可在市場上購買得到。
本實施例中所述的Bst DNA PoLymerase購于New England Biolabs公 司，所述的Betaine購于Solarbio公司，TRIZOL Reagent購自Invitrogen 公司，SYBR Green I染料購于百泰克生物；
在本實施例中，所述反應(yīng)體系中的各組分可以在給出的配比范圍內(nèi)靈 活組合，在此不一一枚舉。
實施例3:
本實施例是在實施例2基礎(chǔ)上的優(yōu)選方案，所用反應(yīng)體系中各個組分
的品質(zhì)和來源與實施例2相同。該反應(yīng)體系中包括
Betaine 0.6mol/L， dNTP 3mmol/L， Mg2+3mmol/L ，
外引物，內(nèi)引物，所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1: 1; 本實施例中引入Mg"的方法為向該反應(yīng)體系中加入濃度為3mmol/L
8的MgCl;
該內(nèi)引物的用量為0.2nmol/L，該外引物的用量為0.2ixmol/L;以體 積為25 u 1體系為例，所述的體系中還包括1 UBstDNA聚合酶大片段1 P 1， 10XBst polymerse buffer 1 y 1， DNA模板(濃度為15 y g/ml) 1 u 1，足量的ddH20;
該反應(yīng)體系的體積可也可以為50n 1。
本實施例中所用的引物及其來源與實施例1中相同。
實施例4:
本實施例是在實施例2基礎(chǔ)上的優(yōu)選方案，所用反應(yīng)體系中各個組分
的品質(zhì)和來源與實施例2相同。該反應(yīng)體系中包括
Betaine lmol/L， dNTP 12mmol/L， Mg2+ 9mmol/L ，
外引物，內(nèi)引物，所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1: 5;
本實施例中引入Mg^的方法為向該反應(yīng)體系中加入濃度為9mmol/L
的MgCl;
該內(nèi)引物的用量為0.2iimol/L，該外引物的用量為lumol/L;以體積 為25 1體系為例，所述的體系中還包括1 U Bst DNA聚合酶大片段1 U 1， 10XBst polymerse buffer 1 n 1， DNA模板(濃度為15 u g/ml) 1 u 1，足量的ddH20;
該反應(yīng)體系的體積可也可以為50 II 1。 本實施例中所用的引物及其來源與實施例1中相同。
實施例5:
本實施例是在實施例2基礎(chǔ)上的優(yōu)選方案，所用反應(yīng)體系中各個組分
的品質(zhì)和來源與實施例2相同。該反應(yīng)體系中包括
Betaine 1.6mol/L， dNTP 25mmol/L， Mg2+ 14mmol/L ，
外引物，內(nèi)引物，所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1: 8; 本實施例中引入Mg^的方法為向該反應(yīng)體系中加入濃度為 14mmol/L的MgCl;該內(nèi)引物的用量為0.2u mol/L，該外引物的用量為1.6umol/L;以體 積為25 u 1體系為例，所述的體系中還包括1 UBstDNA聚合酶大片段1 ixl， 10XBst polymerse buffer 1 n 1， DNA t莫板(濃度為15 u g/ml) 1 u 1，足量的ddH20;
該反應(yīng)體系的體積可也可以為50" 1。
本實施例中所用的引物及其來源與實施例1中相同。
實施例6:
本實施例將LAMP法與PCR法對番茄不孕病毒檢測的靈敏度做出比較。
檢測步驟依次為
A. 取原始濃度為15ug/ml的DNA模板分別進行倍比稀釋，稀釋后模 板的濃度分別為原始濃度的10'1 ， 10—2 ， 10—3 ， l(T4， 10—5， 10—6;
B. 將稀釋后的模板分別進行LAMP法和PCR法反應(yīng)；所述的LAMP法反 應(yīng)中，應(yīng)用實施例4中所述的反應(yīng)體系和實施例1中的檢測步驟，分別得到 LAMP法反應(yīng)產(chǎn)物和PCR法反應(yīng)產(chǎn)物。
所述的PCR反應(yīng)中，反應(yīng)體系為25"1，包括以下組分 DNA模板1 iU， Taq聚合酶Buffer 2. 5u 1， dNTP2ul， Taq 聚合酶Buffer 0.25ul，上游引物l u 1，下游引物l U 1， ddH20 17. 25 y 1;
該引物的核苷酸序列為
上游弓I物5 ， - TTCACCACTGTCACACACTCTAGA -3 ， 下坊,引物5'- GGTTCAAAGGCACCTCATCGATCA - 3' 反應(yīng)程序為
94 °C 5min
94 °C lmin 、
60°C lmin ^ 35個循環(huán)
72 °C lmin J
72 °C lOmin;
C.上述的反應(yīng)結(jié)束后，分別取9plLAMP法反應(yīng)產(chǎn)物和PCR法反應(yīng)產(chǎn)物， 進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，紫外觀察結(jié)果。
圖1中，泳道M中為DL2000 marker;泳道1,3,5,7，9,11，13中分別為LAMP法反應(yīng)產(chǎn)物，得到該產(chǎn)物的DNA模板稀釋后的濃度依次為原始濃度的
10" ， l(T2 ， 10-3 ， l(T4， l(T5， 10-6;泳道2， 4， 6， 8， 10， 12中分別為 PCR法反應(yīng)產(chǎn)物，得到該產(chǎn)物的DNA模板稀釋后的濃度依次為原始濃度 的10—1 ， l(T2 ， 10'3 ， l(T4， 10'5， 1(T6;泳道13中為陰性對照。
從圖l中可知應(yīng)用LAMP法，當所述的DNA模板的濃度稀釋至原始 濃度的10—6時依然可以檢測出番茄不孕病毒；而應(yīng)用PCR法，當所述的DNA 模板的濃度稀釋至原始濃度的10—2時就無法檢測出番茄不孕病毒。所以， 應(yīng)用LAMP法對番茄不孕病毒的檢測靈敏度明顯優(yōu)于PCR法。
權(quán)利要求
1. 一種用于檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，其特征在于該方法利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)(LAMP)檢測番茄不孕病毒(TAV)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，其特征在 于該方法包括的步驟依次為A. 配制反應(yīng)體系；B. 將所述的反應(yīng)體系進行溫育處理，得到溫育產(chǎn)物；該溫育處理的溫度為65。C，時間為30-80min;C. 將所述的溫育產(chǎn)物進行滅活處理，得到滅活產(chǎn)物；該滅活處理的 溫度為80。C，時間為5-15min;D. 將所述的滅活產(chǎn)物進行檢測，得到檢測結(jié)果。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，其特征 在于所述的反應(yīng)體系中包括B etaineO .5-1.5 mol/L ， dNTP2-25mmol/L， Mg2+2-15mmol/L ，外引物，內(nèi)引物；所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1: l一l: 8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，其特征 在于所述的反應(yīng)體系中包括Betaine 0.6mol/L， dNTP 3 mmol/L， Mg2+3mmol/L ，外引物，內(nèi)引物，所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1: 1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，其特征 在于所述的反應(yīng)體系中包括Betaine lmol/L， dNTP 12mmol/L， Mg2+ 9mmol/L ，外引物，內(nèi)引物，所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1: 5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，其特征在于所述的反應(yīng)體系中包括 Betaine 1.6mol/L， dNTP 25mmol/L， Mg2+ 14mmol/L ，外引物，內(nèi)引物，所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1: 8。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，其特征在于所述的外引物的核苷酸序列為5' -AAGCCGATGAAATGGTGATC-3'， 5' -GTTCAAAGGCACCTCATCGA-3';。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，其特征 在于所述的內(nèi)引物的核苷酸序列為5' -GCTCTAAACTATCTGAAGTCTTTTAGCCGTTAGCTGGATG-3'。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，其特征在于該方法適用的菊花品種為粉地毯，神馬。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種檢測番茄不孕病毒(TAV)的方法，該方法利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)(LAMP)檢測番茄不孕病毒(TAV)；該方法包括的步驟依次為配制反應(yīng)體系、溫育處理、滅活處理、產(chǎn)物檢測；所述的反應(yīng)體系中包括Betaine0.5-1.5mol/L，dNTP2-25mmol/L，Mg²⁺2-15mmol/L，外引物，內(nèi)引物；所述的內(nèi)引物和外引物的濃度之比為1∶1-1∶8。本發(fā)明的有益效果為不需要特殊儀器(如PCR儀)，較實驗室常規(guī)律方法更快捷，經(jīng)濟；鑒定簡便，有極高的特異性，只要用肉眼觀察或濁度儀紫外成像系統(tǒng)檢測沉淀濁度就能夠判斷目的片段擴增與否，從而判斷出用于檢測的樣品植株是否感染有番茄不孕病毒，而不必用凝膠電泳的方法來觀察。
文檔編號C12Q1/70GK101451166SQ20081024041
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者佳 劉, 吳忠義, 張秀海, 李春華, 梁宏霞, 王永勤, 黃叢林 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院