專利名稱：：利用生物催化生產(chǎn)亞氨基二乙酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及一種亞氨基二乙酸的生產(chǎn)方法，特別涉及利用生物催化生產(chǎn)亞氨基二乙酸的方法，尤其涉及利用腈水解酶催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸的方法。
背景技術(shù)：
：亞氨基二乙酸(IDA)其分子中含有亞氨基和羧基，化學(xué)性質(zhì)活潑，是一種重要的化工產(chǎn)品，用途廣泛。其最大的用途是與三氯化磷、曱醛在酸性條件下反應(yīng)生成雙甘膦，再經(jīng)濃硫酸或雙氧水氧化生產(chǎn)除草劑草甘膦。此外還廣泛地用作螯合劑、化工或醫(yī)藥中間體等。目前，亞氨基二乙酸的生產(chǎn)方法主要有氯乙酸法、氮川三乙酸法和二乙醇胺法等。以上各種方法都有其缺點(diǎn)，普遍都存在污染嚴(yán)重的問題，而且不是收率低、能耗高、生產(chǎn)成本高和反應(yīng)條件苛刻，就是對(duì)設(shè)備要求高。為此，許多研究單位和機(jī)構(gòu)都在開發(fā)能耗低、環(huán)境友好的IDA合成新工藝。但是，僅通過改進(jìn)化學(xué)法生產(chǎn)工藝無法根本解決化學(xué)法生產(chǎn)亞氨基二乙酸對(duì)環(huán)境造成的污染。工業(yè)上應(yīng)用比較普遍的是利用亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸的工藝，主要采用酸法或堿法進(jìn)行水解，具有較高的水解轉(zhuǎn)化率，相比其他幾種化學(xué)法生產(chǎn)並氨基二乙酸的工藝具有一定的優(yōu)勢(shì)。但由于需要用到高濃度的酸或堿，對(duì)設(shè)備的腐蝕嚴(yán)重，且給后續(xù)的產(chǎn)品分離與應(yīng)用都帶來較大困難。現(xiàn)有的研究表明腈化合物可以由腈水解酶催化水解，且酶法水解具有高效性、高選擇性、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、成本低、產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)，符合原子經(jīng)濟(jì)型和綠色化學(xué)的發(fā)展方向，與反應(yīng)條件苛刻、副產(chǎn)物多、環(huán)境污染嚴(yán)重的化學(xué)法相比，有著無可比擬的優(yōu)越性?，F(xiàn)有技術(shù)中還沒有發(fā)現(xiàn)用腈水解酶水解亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為亞氨基二乙酸的生產(chǎn)開辟一條新的途徑，為此，本發(fā)明提出一種利用生物催化生產(chǎn)亞氨基二乙酸的方法，具體地，釆用腈水解酶催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸。具體地，可以通過以下方法來實(shí)現(xiàn)。1、利用生物催化生產(chǎn)亞氨基二乙酸方法，其特征在于，采用腈水解酶催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸。2、如1所述的方法，包括i)將包含腈水解酶的催化載體在水溶液中攪拌懸浮得到懸浮液；ii)在攪拌下向懸浮液中一次性或逐次加入亞氨基二乙腈，使得亞氨基二乙腈的濃度為50-500mmol/L;iii)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH保持在6.5-9.0,溫度保持在20-45°C;經(jīng)過5-15小時(shí)的催化，得到亞氨基二乙酸。3、如2所述的方法，其中所述的包含腈水解酶的催化載體是游離細(xì)胞、固定化細(xì)胞或固定化酶。4、如3所述的方法，其中所述的細(xì)胞是基因工程大腸桿菌BL21(DE3)/pET-Nit。5、如1所述的方法，其中所述的腈水解酶是基因工程大腸桿菌BL21(DE3)/pET-Nit所產(chǎn)生的。6、如2所述的方法，其中用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH。本發(fā)明的方法在溫和反應(yīng)條件下即可以達(dá)到高轉(zhuǎn)化率，并能大大減小常規(guī)化學(xué)生產(chǎn)方法對(duì)環(huán)境的污染。因此，本方法是一種清潔生產(chǎn)方法，具體實(shí)施例方式以下更詳細(xì)地介紹本發(fā)明的各種實(shí)施方式。1)用于本發(fā)明的菌抹作為用于本發(fā)明的菌抹，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，能產(chǎn)生腈水解酶的菌抹都可以用于本發(fā)明中，但是作為詳細(xì)介紹本發(fā)明的例子，列舉了基因工程大腸桿菌BL21(DE3)/pET-Nit(LuoHui，etal.ApplBiochemBiotechnol.DOI10.1007/sl2010隱008畫8324國(guó)y)。基因工程大腸桿菌BL21(DE3)/pET-Nit的培養(yǎng)培養(yǎng)基LBK培養(yǎng)基(胰蛋白胨1%、酵母粉0.5%、NaCll%，甘油0.3%,20mM乳糖，卡那霉素50^ig/mL，pH7.0)玉米漿培養(yǎng)基(5。/。玉米漿，0.017MKH2PO4,0.072MK2HPO4,0.4%葡萄糖，20mM乳糖，50嗎/mL卡那霉素，pH7.5)培養(yǎng)在LBK培養(yǎng)基中，37°C,200r/min,對(duì)基因工程大腸桿菌BL21(DE3)/pET-Nit進(jìn)行培養(yǎng)10h,以4%接種量接種到玉米漿培養(yǎng)基中，30。C，200r/min，培養(yǎng)12h。收集10000rpm離心5min收獲菌體。2)游離細(xì)胞制備將菌體用去離子水或磷酸緩沖液重懸得到菌體懸液。3)固定化細(xì)胞的制備將菌體用去離子水重懸制成菌體濃度為2%的菌懸液100ml，邊攪拌邊加入1.5g的海藻酸鈉，攪拌均勻后，將菌懸液用針筒注射到500ml濃度為2%的CaCl2水溶液中，形成的海藻酸鈣小J^的直徑為約3-4mm。將燒杯于4。C冰箱中放置24小時(shí)，使形成的海藻酸鈣小球固化，再用去離子水清洗小球三次，用紗布過濾即得到所需的海藻酸鈣的固定化細(xì)胞。4)固定化酶的制備將菌體用去離子水重懸，超聲波破碎菌體。超聲的條件是超聲3秒，間隔3秒，99個(gè)循環(huán)，超聲功率200W,共破碎兩次。4。C下，10000rpm5離心10min，上清液即為腈水解酶酶液。調(diào)節(jié)腈水解酶酶液pH7.5，加入共價(jià)偶聯(lián)固定化酶載體VTE(購(gòu)自南開大學(xué)化工廠)，在20。C搖床中振蕩24小時(shí)。用去離子水清洗三次，真空抽濾得到所需的固定化腈水解酶。以下通過實(shí)施例對(duì)腈水解酶催化亞氨基二乙腈生成亞氨基二乙酸的方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述。實(shí)施例1:游離細(xì)胞的催化將游離細(xì)胞懸浮液用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH8.0,溫度保持在20。C,逐次加入亞氨基二乙腈，使得亞氨基二乙腈濃度為70mmol/L，加入HC1控制反應(yīng)體系pH8.0，同時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中亞氨基二乙酸含量的變化，經(jīng)過13h的連續(xù)催化，亞氨基二乙酸的質(zhì)量濃度累積達(dá)到73.2g/L，亞氨基二乙腈的轉(zhuǎn)化率98.5%。按照實(shí)施例1的催化方法，根據(jù)表1改變游離細(xì)胞催化的催化條件進(jìn)行了實(shí)施例2-4，產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率見表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>從表1可知，在本發(fā)明的條件下，可以通過腈水解酶游離細(xì)胞的催化實(shí)現(xiàn)亞氨基二乙腈的高效率轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物亞氨基二乙酸的濃度在70g/L以上，轉(zhuǎn)化率高于96%。但在底物亞氨基二乙腈濃度較高的情況下，其轉(zhuǎn)化率有所下降。實(shí)施例5:固定化細(xì)胞的催化在0.05mol/L濃度的pH6.5磷酸鉀緩沖液中加入上述得到的固定化細(xì)胞，在35。C下保溫，磁力攪拌。逐次加入亞氨基二乙腈，使得亞氨基二乙腈濃度為100mmol/L，加入HC1控制反應(yīng)體系pH8.0,同時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中亞氨基二乙酸含量的變化，經(jīng)過13h的連續(xù)催化，亞氨基二乙酸的質(zhì)量濃度累積達(dá)到118.9g/L,亞氨基二乙腈的轉(zhuǎn)化率98.7%。紗布過濾得到固定化細(xì)胞后，再以相同的條件進(jìn)行亞氨基二乙腈的催化，經(jīng)過15h的連續(xù)催化，亞氨基二乙酸的質(zhì)量濃度累積達(dá)到106.3g/L，亞氨基二乙腈的轉(zhuǎn)化率97.6°/0。按照實(shí)施例5的催化方法，根據(jù)表2改變固定化細(xì)胞催化的催化條件進(jìn)行了實(shí)施例6-8,產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*其中前一數(shù)值是第一次催化，后一數(shù)值是用回收的固定化細(xì)胞進(jìn)行的第二次催化。從表2可知，在本發(fā)明的條件下，可以通過腈水解酶固定化細(xì)胞的催化實(shí)現(xiàn)亞氨基二乙腈的高效率轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物亞氨基二乙酸的濃度在100g/L以上，轉(zhuǎn)化率高于96%。但在底物亞氨基二乙腈濃度較高的情況下，其轉(zhuǎn)化率有所下降。利用腈水解酶固定化細(xì)胞催化，比游離細(xì)胞催化積累更高濃度的產(chǎn)物亞氨基二乙酸，且固定化細(xì)胞回收后進(jìn)行第二次催化，產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率也保持較高水平。實(shí)施例9:固定化酶的催化在0.1mol/L濃度的pH7.5磷酸鉀緩沖液中加入一定的固定化腈水解酶，在25。C下保溫，磁力攪拌。逐次加入亞氨基二乙腈，使得亞氨基二乙腈濃度為60mmol/L,加入HC1控制反應(yīng)體系pH8.0，同時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系中亞氨基二乙酸含量的變化，經(jīng)過12h的連續(xù)催化，亞氨基二乙酸的質(zhì)量濃度累積達(dá)到102.4g/L，亞氨基二乙腈的轉(zhuǎn)化率99.3%。抽濾得到固定化酶后，再以上述相同的反應(yīng)條件進(jìn)行亞氨基二乙腈的催化，經(jīng)過13h的連續(xù)催化，亞氨基二乙酸的質(zhì)量濃度累積達(dá)到102.1g/L，亞氨基二乙腈的轉(zhuǎn)化率99.2%。按照實(shí)施例9的催化方法，根據(jù)表3改變固定化細(xì)胞催化的催化條件進(jìn)行了實(shí)施例11-12，產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*其中前一數(shù)值是第一次催化，后一數(shù)值是用回收的固定化細(xì)胞進(jìn)行的第二次催化。從表2可知，在本發(fā)明的條件下，可以通過腈水解酶固定化酶的催化實(shí)現(xiàn)亞氨基二乙腈的高效率轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物亞氨基二乙酸的濃度在100g/L以上，轉(zhuǎn)化率高于97%。利用腈水解酶固定化酶催化，比游離細(xì)胞催化具有更高的產(chǎn)物積累濃度和轉(zhuǎn)化率，比固定化細(xì)胞催化的產(chǎn)物濃度略低，但轉(zhuǎn)化率更高。且固定化酶回收后進(jìn)行第二次催化，產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率也保持較高水平。權(quán)利要求1、利用生物催化生產(chǎn)亞氨基二乙酸方法，其特征在于，采用腈水解酶催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其中包括i)將包含腈水解酶的催化載體在水溶液中攪拌懸浮得到懸浮液；ii)在攪拌下向所述懸浮液中一次性或逐次加入亞氨基二乙腈，使得亞氨基二乙腈的濃度為50-500mmol/L;iii)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH保持在6.5-9.0，溫度保持在20-45°C,經(jīng)過5-15小時(shí)的催化，得到亞氨基二乙酸。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的包含腈水解酶的催化載體是游離細(xì)胞、固定化細(xì)胞或固定化酶。4、如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的細(xì)胞是基因工程大腸桿菌BL21(DE3)/pET國(guó)Nit。5、如權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的腈水解酶是基因工程大腸桿菌BL21(DE3)/pET-Nit所產(chǎn)生的。6、如權(quán)利要求2所述的方法，其中用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用生物催化制備亞氨基二乙酸的方法，具體地，涉及用腈水解酶催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸的方法。本發(fā)明的方法包括將包含腈水解酶的催化載體在水溶液中攪拌懸浮得到懸浮液；在攪拌下向所述懸浮液中一次性或逐次加入亞氨基二乙腈，使得亞氨基二乙腈的濃度為50-500mmol/L；調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH保持在6.5-9.0，溫度保持在20-45℃，經(jīng)過5-15小時(shí)的催化，得到亞氨基二乙酸。所述的包含腈水解酶的催化載體是游離細(xì)胞、固定化細(xì)胞或固定化酶。本發(fā)明的方法反應(yīng)條件溫和，無需加入大量的酸或堿，因而對(duì)環(huán)境造成的污染非常小，而且還有利于后續(xù)的產(chǎn)品分離及應(yīng)用。文檔編號(hào)C12P13/00GK101429532SQ20081024101公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期2008年12月24日優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日發(fā)明者衛(wèi)海珍,常雁紅,寧李,溫荔鈞,王春霞,暉羅申請(qǐng)人:北京科技大學(xué)