專利名稱：蝦白斑綜合癥病毒病檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測病毒的試劑盒及檢測方法，具體涉及一種檢測蝦白斑 綜合癥病毒的試劑盒及檢測方法。
背景技術：
自1993年以來，我國沿海對蝦養(yǎng)殖業(yè)常常遭受暴發(fā)性流行病的侵襲。該 病傳染性強、宿主廣、致死率髙，嚴重制約著我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展?，F 已證實對蝦暴發(fā)病的病原是白斑綜合癥病毒(WSSV)。目前WSSV已遍及亞洲 主要對蝦養(yǎng)殖國家和地區(qū)，并已傳播到北美洲。在已報道的所有對蝦病毒中， 該病毒毒力最強，危害最大，南美白對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦、墨吉對蝦、 長毛對蝦、中國對蝦、印度對蝦、桃紅對蝦、藍對蝦、白對蝦、褐對蝦、刀額 新對蝦、脊尾白蝦、斑節(jié)對蝦等，大部分養(yǎng)殖對蝦皆可被WSSV侵染，在浮 游生物、?？?、糠蝦、白蝦、毛蝦、天津厚蟹、日本大眼蟹等動物中可檢測出 WSSV，在蟲下池的蟹、橈足類和昆蟲(EphydHdae)體內也檢到過WSSV，表明 WSSV地域分布及宿主范圍非常廣泛，早在1995年國際獸疫局(OIE)、聯合 國糧農組織(FAO)以及亞太地區(qū)水產養(yǎng)殖發(fā)展網絡中心(NACA)將其列為 需要報告的重要的水生動物病毒病病原之一。
有關WSSV的研究在病原學、病理學、流行病學以及診斷學研究方面已 深入到分子水平，但由于諸多原因，到目前為止還不能完全控制WSSV的疫 情，面對WSSV的傳布所能采取最主要的措施是及早發(fā)現和消滅傳染源，果 斷切斷傳播途徑。這樣就需要建立和完善靈敏、準確、高效、快捷、方便的檢 測方法，現有的檢測WSSV感染的方法很多，大致可以分為三類，即病原學、 免疫學以及基因組檢測。
用組織病理學和電子顯微鏡的方法來來檢測WSSV耗時長，操作繁瑣， 靈敏度低，極易漏檢，不宜對大批樣品進行檢測。
免疫學檢測制備髙效價抗體是WSSV免疫檢測的關鍵，其最佳方案是制備單克隆抗體。wssv的單克隆抗體免疫檢測，其特異性、靈敏性和可重復性
大大提髙，方法快速、靈敏、簡單、低成本，在實驗條件一般的實驗室內均能 進行，但這類方法的發(fā)展落后于現代分子生物學技術。
通過基因組來檢測，以WSSV的特有序列為靶序列進行檢測，其中PCR 檢測由于其快速而又特異，應用方便，還可以進一步衍生出巢式 PCR(nested-PCR)，但為避免假陽性結果需設置內控引物，同時因PCR反應 時間長、還需要專門的PCR儀，新近還有利用實時PCR (real-time PCR)來 檢測WSSV,更是需要專用的儀器。另外還有利用核酸雜交技術，通過原位雜 交或斑點雜交來完成，原位雜交需要先制組織切片，而且此法耗時長，操作繁 瑣，不適合在基層使用，斑點雜交需要把待測核酸固定于雜交膜上再行雜交、 顯影，適合于批量樣品操作，但僅雜交后的顯影檢測需15小時左右，耗時長。
近年來發(fā)展起來的環(huán)介導等溫擴增法(LAMP， loop-mediated isothermal amplification),該方法可以髙靈敏地非常有選擇性地髙效擴增靶序列(Notomi et al.， 2000),最終的LAMP產物是是一系列反向重復的靶序列構成的莖環(huán)結 構和多環(huán)花椰菜樣結構的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯現不同大小區(qū) 帶組成的階梯式圖譜。LAMP是一種全新的恒溫核酸擴增方法，和其它核酸擴 增技術相比，其反應原理、引物設計更加復雜。但是它具有等溫擴增只需要 一個恒溫裝置就可以；髙效靈敏模板僅需要10個拷貝或更少；擴增特異性 強應用包含了六個區(qū)段的四條引物按嚴格順序進行擴增；檢測時間短擴增 可以在90min完成，比普通PCR反應還要省時間；產物可以通過直接在反應 管中加SYBRGreenI染色(由橙色轉為綠色)或用瓊脂糖凝膠電泳檢測。因 此LAMP在核酸的科學研究、疾病的診斷和預防、動物胚胎的性別鑒定和轉 基因食品檢測等領域得到了日益廣泛的應用。2004年Tomoya Koiio將WSSV 從kuruma shrimp中純化出來，再提取WSSV的核酸，利用LAMP技術對此 核酸進行擴增，結果證實LAMP可用于WSSV相應序列的擴增；但是該方法 對中提純步驟復雜而且對設備要求髙，設備昂貴，適用性不普遍，另外，LAMP 技術應用到實際檢測中，還需要解決的問題包括引物的設計和實驗條件的優(yōu) 化。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種檢測蝦wssv的試劑盒及檢測方法，簡化檢測步
驟，縮短檢測耗時，同時提髙檢測的靈敏度和特異性。
為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是 一種環(huán)介導等溫擴增檢測蝦 白斑綜合癥病毒病(WSSV)的引物，由一對外引物和一對內引物組成，其中
前內引物FIP-234包含F1C，一個TTTT連接子和F2-234,其序列如下 所示
5'-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGA TTT TTT GAT-3，；
后內引物BIP-234包含B1C, —個連接子和B2-234,其序列如下所示
5'墨GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGT TTA CGA CAA-3';
前外引物F3-234的序列如下所示5，-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3';后外引物B3-234的序列如下所示
5,-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3,;
上述引物是根據WSSV DNA基因組序列，選取WSSV ORF 234 (其 GenBank登錄號為No.EF524224),經BLAST分析確定其保守區(qū)域且與 GenBank公布的其它核酸序列無同源，同時根據引物設計原則分別設計的，
上述引物具體涉及的6個位點如下所示
_^_
481 ATACCTTTCG GGGAAAAGGA ACGTTTTGTT GTTAGCACAG ATTTTTTGAT TGGTCTCGGT TATGGAAAGC CCCTTTTCCT TGCAAAACAA CAATCGTGTC TAAAAAACTA ACCAGAGCCA
F2C Fl
541 TTTAGTGCTG ATGATGTCAT GGAAAAATTA ATAGCGATAG AGGGAAATAT GCGGAAAAGT AAATCACGAC TACTACAGTA CCTTTTTAAT TATCGCTATC TCCCTTTATA CGCCTTTTCA
601 GGTCTGAAAT ATACATGGGT GCCTGTGGCC GAAGTGTGCC ATCTCAAAAA ATACAAGGGT jCAGACTTTA TATGTACCCA CGGACACCGG CTTCACACGG TAGAGTTTTT TATGTTCCCA Bl B2C
661 GATATTGTCG TAAACCCCAT TTTCAAGAGT TATCATTCCC ATTGCCTAGT TATTCCACTG CTATAACAGC ATTTGGGGTA AAAGT ATAGTAAGGGTAACGGATCA ATAAGGTGAC為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是一種環(huán)介導等溫擴增檢測蝦 WSSA的試劑盒，由一套引物、DNA提取緩沖液、DNA聚合酶、環(huán)介導等溫 擴增反應液、陽性對照、陰性對照、甜菜堿和dNTP組成；所述的一套引物是 由一對外引物和一對內引物組成， 一對內引物由前內引物FIP-234和后內引物 BIP-234組成， 一對外引物由前外引物F3-234和后外引物B3-234組成；
所述提取緩沖液的組成包括10mM三(羥甲基)氨基甲垸鹽酸鹽 (Tris-HCl), 0.05mM乙二胺四乙酸(EDTA)， 5mM硫酸銨((NH4)2S04)， 0.1%質量百分濃度曲拉通X-100 (Triton X-100);溶液pH為7.8;
所述DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶；所述環(huán)介導等溫 擴增反應緩沖液為與Bst DNA聚合酶配套的，并且配套出售提供的環(huán)介導等 溫擴增反應液，通常配套提供的為10倍環(huán)介導等溫擴增反應液(10XLAMP 反應液)；
所述陽性對照為WSSV質粒片段，選自WSSV ORF 234 (其GenBank登 錄號為No. EF524224)質粒片段；
所述陰性對照為健康蝦的DNA提取物，即沒有受到WSSV感染的健康的 懷，SF的種類與帶檢測的奸保持一致，例如當待檢測的蟲下為克氏螯好時，陰 性對照即為健康的克氏螯蝦的DNA提取物；當待檢測的4下為羅氏沼蝦時，陰 性對照即為健康的羅氏沼蝦的DNA提取物。以健康蝦的DNA提取物為陰性 對照而不選用二次蒸餾水為陰性對照的目的是保證檢測的真實有效性，因為如 果以二次蒸餾水為陰性對照，以WSSV質粒片段為陽性對照時，即使待檢測 的蝦最后的檢測結果呈陽性，那么也可能是由于蝦的DNA導致的；而如果以 健康的同一種類的蝦的DNA提取物為陰性對照，以WSSV質粒片段為陽性對 照時就不會出現這樣的情況；所述蝦的種類包括中國對蝦、南美白對蝦、克 氏螯酐、羅氏沼蝦、斑節(jié)對蝦等。
所述dNTP為含有四種dNTP的等量混合物。
使用上述試劑盒檢測蟲下WSSV的方法，包括以下步驟
(l)提取待檢測蝦的總DNA:取待檢測蝦的組織于沸水中煮6 20min,離 心去水分后加入DNA提取緩沖液，充分磨碎后加酚搖勻10 30min,離心后 將上清轉移到新管中再加酚/氯仿搖勻5 15min，離心后取其上清，作為供擴增的目的模板；
所述酚/氯仿溶液的配比為酚和氯仿的體積比為1:"
(2) 配置擴增體系在每25U l擴增體系中，包含10XLAMP反應液2.5pL， 終濃度各為0.8nmol/L的內引物FIP-234和BIP-234,終濃度各為0.2nmol/L 的外引物F3-234和B3-234,終濃度為0.4jimol/L的dNTP，終濃度為lmol/L 的甜菜堿，步驟(l)所得的模板4pL;補加滅菌的超純水至24pL;
(3) 將反應混合物混勻后加熱變性，冷卻后加入lfiL的8U/^iL的BstDNA 聚合酶，混勻后于60 63'C孵育60 90min，結束反應；
(4) 檢測LAMP反應產物。
上述技術方案中，檢測LAMP反應產物的方法為現有技術，例如可以通 過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測LAMP反應產物，有擴增條帶出現的為檢測結 果陽性；或者向LAMP反應產物中加入100倍稀釋的SYBR Green I染料ljiL 后，顏色由橙色變?yōu)榫G色，提示檢測結果為陽性。
優(yōu)選的技術方案中，步驟(l)提取待檢測蝦的總DNA的方法如下
取待檢測蝦的組織于沸水中煮10min，離心去水分后加入DNA提取緩沖 液，充分磨碎后加酚搖勻15min,離心后將上清轉移到新管中再加酚/氯仿搖 勻10min,離心后取其上清，作為供擴增的目的模板。
由于上述技術方案運用，本發(fā)明與現有技術相比具有下列優(yōu)點
(1) 本發(fā)明實現了對患WSSV病蝦的快速診斷，整個檢測時間可以在4小時 左右完成，比最快的PCR的檢測還要短，比用核酸雜交法檢測時間省10小時 以上。
(2) 本發(fā)明基于檢測是否存在WSSV基因組，對WSSV核酸相關片段進行 特異性擴增，通過檢測是否有擴增產物來實驗對患WSSV病蝦的WSSV檢測， 但LAMP不再需要PCR儀這樣的專業(yè)儀器，代替PCR儀的只是一個恒溫裝 置，例如控溫精度髙的水浴鍋。
(3) 與PCR擴增檢測相比，LAMP的檢測靈敏度要比PCR髙出千倍以上。
(4) 特異性增強，PCR擴增是針對了靶序列的二個區(qū)段用2個(一對)引物 進行匹配實現擴增，而LAMP需要設計4個(二對)引物覆蓋了靶序列的6 個區(qū)段，因而其特異性有很大提髙。(5) 基于對DNA提取方法的改進，改進后的提取方法與通常DNA提取方法 相比，時間要節(jié)約一半以上，而且操作更為方便。
(6) 與基于病原直接診斷、免疫學診斷來檢測蝦WSSV相比，本發(fā)明的檢測 周期更短，操作簡便，而且適合批量檢測，所需費用也低。
具體實施方式
下面實施例對本發(fā)明作進一步描述 實施例一自然感染WSSV克氏螯蝦的診斷
一種檢測好WSSV的方法，該方法采用的試劑盒由一套引物、DNA提取 緩沖液、DNA聚合酶、環(huán)介導等溫擴增反應液、陽性對照、陰性對照、甜菜 堿和dNTP組成；所述的一套引物是由一對外引物和一對內引物組成，其中一 對外引物由前外引物F3-234和后外引物B3-234組成； 一對內引物由前內引物 FIP-234和后后內引物BIP-234組成；
所述提取緩沖液的組成包括10mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCl)， 0.05mM乙二胺四乙酸(EDTA)， 5mM硫酸銨((NH4)2S04), 0.1%質量百分濃度曲拉通X-100 (Triton X-100);溶液pH為7.8:
所述DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶；所述環(huán)介導等溫 擴增反應緩沖液為與Bst DNA聚合酶配套的10倍環(huán)介導等溫擴增反應液(10 XLAMP反應液)；
所述陽性對照為WSSV質粒片段，選自WSSV ORF234 (其GenBank登 錄號為No. EF524223)質粒片段；取pET-28a(+)隱WSSV ORF234( 1 OD/500nl) 0.5ftl，其它成分同檢測組，用雙蒸水補足到總體積24^1:
所述陰性對照為健康蝦的DNA提取物，含有克氏螯蝦蝦DNA (1 OD/200fd) 0.5fd，其它成分同檢測組，用雙蒸水補足到總體積24^1;
所述dNTP為含有四種dNTP的等量混合物。
技術操作過程如下
l.模板DNA的提取取環(huán)境中懷疑被自然感染WSSV的克氏螯蝦新鮮組 織0.2g，于沸水中煮10min，離心棄盡水后充分研磨，按1/3(W/V)比例加 入DNA抽提緩沖液(10 mM Tris-HCl, 0.05 mM EDTA， 5mM(NH4)2S04， 0.1%Triton X-100，pH7.8 ),再加入500 fil飽和酚，顛倒混合15min后4'C ， 12,000 rpm,離心10min。上清轉入新的離心管，加入等體積的酚/氯仿，顛倒混合， 4'C， 12，000 rpm，上清即可作為下一步擴增的模板用；耗時約50分鐘。 2丄AMP擴增LAMP的反應為25 體系，其中包含10Xbuffer 2.5 針對WSSV ORF 234的FIP( 5，-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGA TTT TTT GAT- 3')、 BIP (5，-GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGT TTA CGA CAA-3，)終濃度各為0.8 拜ol/L; F3 (5'隱GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3，)、 B3 (5，-GCAATG GGA ATG ATA ACT CTT -3，)終濃度各為0.2 nmol/L; dNTP終濃度為0.4 pmol/L;甜菜堿終濃度為1 mol/L;模板4 jiL,補加滅菌的超純水至24 pL。 將反應混合物混勻后，于95 min變性5 min，迅速至冰上冷卻5 min后加入8 U (lpL)的BstDNA聚合酶，混勻后于60'C孵育60 min， 90'C 2 min結 束反應。
3.LAMP反應產物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示有擴增條 帶出現，表明結果為陽性。
實施例二人工感染WSSV的克氏螯蝦診斷
1. 模板DNA的提取(采用了普通PCR方法中的DNA提取法，耗時約110 分鐘)取懷疑被自然感染WSSV養(yǎng)殖的克氏螯蝦組織0.2 g,冰上充分研磨后 按1/6 (W/V)比例加入TN緩沖液(50 mM THs-HCI， 0.4 M NaCl， pH7.6), 將含病毒的組織研磨液分至兩個離心管中，每管500 jU。加入等體積的酚，顛 倒混合。4'C， 12,000 rpm,離心10 min。上清轉入新的離心管，加入等體積 的酚/氯仿，顛倒混合，4", 12,000 rpm，離心10 min。上清轉入新的離心管， 加入等體積的氯仿，顛倒混合，4'C, 12,000 rpm，離心10 min。上清再轉入 新的離心管中，加入1/10體積NaAC(3 mol/L)，兩倍體積的預冷無水乙醇， 顛倒混勻后4'C， 12,000 rpm，離心10min。吸去上清，倒置兩分鐘后。加入 500 70%乙醇于沉淀中洗鹽后，4'C， 12,000 rpm離心5 min。棄上清，室 溫或37'C晾干后溶于50fiLTE緩沖液中，并作101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109倍系列稀釋，作為下一步擴增用模板。
2. 靶序列LAMP擴增，取步驟1中所制備的樣品各2jiL作為模板，分別進行LAMP擴增，擴增條件為60TC 90min，其余同實施實例一 中步驟2 。
3.LAMP擴增產物的檢測實施實例一中步驟3,結果系列稀釋模板全部得 到有效擴增，全部顯示陽性，以同樣模板進行PCR擴增(pl-234: 5，-CCGAATTCACCATGGAGTATATAGGGG-3，，p2-234:5，-CGAAGCTTGAT ACAGTGACCGTCCCTG-3，)并將擴增片段克隆測序證實為WSSV的核酸片 段，結果只能在模板濃度為10" 10-5之間能觀察到擴增結果，當模板濃度為 10-6 10一之間時已經觀察不到了，結果證明LAMP陽性結論正確，而且LAMP 的靈敏度比PCR的靈敏度髙了上千倍。
實施例三自然感染WSSV羅氏沼蝦的診斷 技術操作過程如下
1. 模板DNA的提取將待檢測養(yǎng)殖的羅氏沼蝦，按實施實例三步驟1提 取模板DNA，但模板不作稀釋。
2. 靶序列擴增同實施例一中步驟2。
3. 擴增產物檢測同實施例一中步驟3。結果顯示WSSV陽性，并且得到電 鏡觀察結果的支持。
權利要求
1. 一種環(huán)介導等溫擴增檢測蝦白斑綜合癥病毒病的引物，由一對外引物和一對內引物組成，其特征在于一對內引物由前內引物FIP-234和后內引物BIP-234組成；一對外引物由前外引物F3-234和后外引物B3-234組成；所述前內引物FIP-234的序列如下所示5’-CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGATTT TTT GAT-3’；后內引物BIP-234的序列如下所示5’-GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGTTTA CGA CAA-3’；前外引物F3-234的序列如下所示5’-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3’；后外引物B3-234的序列如下所示5’-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT-3’。
2. —種環(huán)介導等溫擴增檢測蝦白斑綜合癥病毒病的試劑盒，其特征在于 由一套引物、DNA提取緩沖液、DNA聚合酶、環(huán)介導等溫擴增反應液、陽性 對照、陰性對照、甜菜堿和dNTP組成；所述一套引物是由一對外引物和一對內引物組成，一對內引物由前內引物 FIP-234和后內引物BIP-234組成， 一對外引物由前外引物F3-234和后外引 物B3-234組成；所述前內引物FIP-234的序列如下所示、5，國CGC ATA TTT CCC TCT ATC GCT ATT ATT TTT TAG CAC AGA TTT TTT GAT- 3，；后內引物BIP-234的序列如下所示、5，-GGT CTG AAA TAT ACA TGG GTG CCT TTT TGA AAA TGG GGT TTA CGA CAA-3，；前外引物F3-234的序列為5，-GGT AAA GGA ACG TTT TGT TG-3，； 后外引物B3-234的序列為5，-GCA ATG GGA ATG ATA ACT CTT -3，； 所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶；所述陽性對照為WSSV質粒片段，選自WSSV ORF 234質粒片段； 所述陰性對照為健康蝦的DNA提取物。
3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述DNA提取緩沖液的 組成包括10mM三(羥甲基)氨基甲垸鹽酸鹽，0.05mM乙二胺四乙酸，5mM 硫酸銨，0.1%質量百分濃度曲拉通X-100;溶液pH為7.8。
4. 使用權利要求2所屬的試劑盒檢測蝦白斑綜合癥病毒病的方法，其特 征在于包括以下步驟(1) 提取待檢測蝦的總DNA:取待檢測蝦的組織于沸水中煮6 20min，離 心去水分后加入DNA提取緩沖液，充分磨碎后加酚搖勻10 30min，離心后 將上清轉移到新管中再加酚/氯仿搖勻5 15min，離心后取其上清，作為供擴 增的目的模板；(2) 配置擴增體系:在每251M擴增體系中，包含IO倍環(huán)介導等溫擴增反 應液2.5pL，終濃度各為0.8pmol/L的內引物FIP-234和BIP-234，終濃度各 為0.2拜ol/L的夕卜弓l物F3-234和B3-234,終濃度為0.4pmol/L的dNTP，終 濃度為lmol/L的甜菜堿，步驟(l)所得的模板4pL;補加滅菌的超純水至2—L;(3) 將反應混合物混勻后加熱變性，冷卻后加入lpL的8U/pL的BstDNA 聚合酶，混勻后于60 63'C孵育60~90min,結束反應；(4) 檢測環(huán)介導等溫擴增反應體系，如檢測到環(huán)介導等溫擴增反應產物，則 待測蝦患有白斑綜合癥病毒病。
5. 根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于步驟(l)提取待檢測蝦 的總DNA的方法如下取待檢測蝦的組織于沸水中煮10min，離心去水分后加入DNA提取緩沖 液，充分磨碎后加酚搖勻15min,離心后將上清轉移到新管中再加酚/氯仿搖 勻10min，離心后取其上清，作為供擴增的目的模板。
全文摘要
一種蝦白斑綜合癥病毒病檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒由一套引物、DNA提取緩沖液、DNA聚合酶、環(huán)介導等溫擴增反應液、陽性對照、陰性對照、甜菜堿和dNTP組成；采用本發(fā)明可以檢測出待檢測蝦是否感染蝦白斑綜合癥病毒；本發(fā)明利用Bst DNA酶的鏈置換特性，設計4條引物，識別靶序列的6個區(qū)域，在等溫條件下生成大量的莖環(huán)樣結構，在定性檢測時不需任何特殊設備。因此具有特異性、靈敏度高和檢測時間比普通PCR短的特點。
文檔編號C12Q1/70GK101418351SQ200810243139
公開日2009年4月29日 申請日期2008年12月9日 優(yōu)先權日2008年12月9日
發(fā)明者張偉明, 曹廣力, 賀 楊, 沈衛(wèi)德, 薛仁宇, 貢成良, 顧金壽, 魏育紅 申請人:蘇州大學