專利名稱：一種共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于非水相酶促有機(jī)合成應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地講是屬T一種共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的 酰胺類酶法生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
關(guān)于酰胺類的合成，有化學(xué)合成和生物催化合成兩類方法。其中的化學(xué)合成工藝己經(jīng)非常成熟，目前 仍被大量用于酰胺類有機(jī)物的工業(yè)化生產(chǎn)。但化學(xué)合成工藝存在著某些致命的缺陷。該工藝常常需要采用 濃硫酸或?qū)籽趸交撬嶂惖囊后w強(qiáng)酸做催化劑，且反應(yīng)溫度很高，通常不可避免地伴有副反應(yīng)，對(duì)原 料的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的產(chǎn)率影響很大，分離提純工藝復(fù)雜，對(duì)環(huán)境也有極為嚴(yán)重的污染。
與化學(xué)合成工藝相比，酰胺類的生物催化合成工藝具有非常大的優(yōu)越性，可以避免使用液體強(qiáng)酸，使 反應(yīng)在溫和的條件下進(jìn)行，消除對(duì)環(huán)境的污染，實(shí)現(xiàn)綠色化工、環(huán)境友好生產(chǎn)。同時(shí)，由于兒乎無副反應(yīng) 發(fā)生，因而分離提取工藝可火為簡(jiǎn)化，原料的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品的純度都可以大幅度提高。但是，酸和有機(jī)胺 結(jié)合生成酰胺和水的反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，必須在反應(yīng)過程中連續(xù)不斷地脫除生成的水，才能使平衡不斷
地向酰胺的合成的方向移動(dòng).使反應(yīng)趨T完全，達(dá)到理想的轉(zhuǎn)化率。酰胺類的生物催化合成i:藝迄今沒有 得到大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用，連續(xù)脫水的問題沒有得到妥善解決是關(guān)鍵閃素之一。
為了及時(shí)的連續(xù)不斷的脫除反應(yīng)生成的水，已經(jīng)采取了分于篩吸附、膜分離吸水、負(fù)壓共沸等技術(shù)措 施，但所有這些技術(shù)措施都存在這樣或那樣的缺陷。分子篩吸附法方便易行，效果明顯，在實(shí)驗(yàn)室研究中 常常采用，但由于吸附飽和后的分子篩的再生需要專用的設(shè)備和工藝，投資成本很高，因而無法在大規(guī)模 的工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用。膜分離吸水法理論上可行，但由于存在膜的杜塞、老化及使用壽命等方面問題，因而
實(shí)現(xiàn)起來尚有困難。采用叔戊醇、叔丁醇等即能勾酶相容，保證酶的催化活性，又可Lj生成的水形成共沸
混合物的有機(jī)溶劑做反應(yīng)媒介兼帶水劑，以負(fù)壓共沸蒸餾的方式將水帶走，是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，但遺憾的 是，所形成的共沸混合物冷凝后不分ii，閑而無法實(shí)現(xiàn)水的連續(xù)分離和溶劑的連續(xù)循環(huán)回用，蒸出的含水 溶劑必須經(jīng)過專門的干燥處理才能冋用。含水溶劑的干燥處理成本大大限制了此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。
酰胺類生物催化合成工藝走向大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用必須解決的另一大關(guān)鍵技術(shù)是產(chǎn)品的分離純化技術(shù)。 為了提高原料，尤其是價(jià)格比較昂貴的原料的轉(zhuǎn)化率，往往需要讓另一種反應(yīng)原料過量，因而在反應(yīng)終了 時(shí)得到的往往是一個(gè)由反應(yīng)產(chǎn)物和過量的那個(gè)反應(yīng)原料所組成的混合物。從該混合物中將產(chǎn)品分離出來，
得到純度達(dá)到95%以上的產(chǎn)品，效率極低且需要花費(fèi)相當(dāng)高昂的代價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
本專利涉及一種環(huán)境友好的，以共沸除水型生物催化耦合模擬移動(dòng)床色譜分離的方式進(jìn)行的，相對(duì)廉 價(jià)的，高產(chǎn)率的，普遍適用的酰胺類酶法合成新工藝。更為獨(dú)特的是，它涉及一種經(jīng)過改進(jìn)的工藝，這種 工藝以環(huán)己烷、叔戊醇、叔丁醇、二氯乙垸、甲苯、二甲苯或其他任何能夠在反應(yīng)條件下跟水共沸，或跟 溶劑和水共沸，冷凝成液體后跟水分層，形成互不相溶的兩相，且不會(huì)導(dǎo)致生物催化劑失活的有機(jī)溶劑為 帶水劑兼模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)的洗脫劑，既通過從反應(yīng)混合物中不斷的去除反應(yīng)生成的水，使平衡反 應(yīng)向酰胺的合成的方向移動(dòng)，使反應(yīng)趨于完成，又通過模擬移動(dòng)床連續(xù)色譜分離，使反應(yīng)產(chǎn)物與過量的反 應(yīng)原料連續(xù)的加以分離，為解決非水相酶促有機(jī)合成中的連續(xù)除水問題和產(chǎn)品的分離純化問題提供了一舉 兩得的簡(jiǎn)便易行的解決方案。按照本專利進(jìn)行操作，與此前的傳統(tǒng)方法相比，能夠以經(jīng)濟(jì)可行的方法連續(xù) 除水，連續(xù)分離純化，徹底清除酰胺類的生物催化合成工藝的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的障礙，實(shí)現(xiàn)酰胺類生產(chǎn) 的環(huán)境友好化，并顯著改善產(chǎn)率及產(chǎn)品的純度。以上這些改進(jìn)對(duì)于化工生產(chǎn)的綠色、可持續(xù)與環(huán)境友好化 而言是至關(guān)重要的。
具體來說，首先，我們發(fā)現(xiàn)，叔戊醇、叔丁醇等溶劑中所含有的水分可以通過在酶促反應(yīng)溫度(30 60。C) 下進(jìn)行的減壓共沸蒸餾被環(huán)己烷、二氯乙烷等帶水劑帶走，混合蒸氣在冷凝后自動(dòng)分層，形成帶水劑相和水相。而向叔戊醇或叔丁醇等溶劑中添加少量，最好是不高于35%，的環(huán)己垸、二氯乙垸等帶水劑，不影 響脂肪酶Novozym435、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、豬肝彈性蛋白酶等生物催化劑在這些溶劑中的催化活性。 由此奠定了通過共沸蒸餾連續(xù)脫除所生成的水的酰胺類酶法合成工藝的基礎(chǔ)。
其次，我們發(fā)現(xiàn)，由叔戊醇或叔丁醇等溶劑和環(huán)己烷、二氯乙垸等帶水劑所組成的混合溶劑，跟適當(dāng) 的吸附劑配合組成模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)，可以有效地將反應(yīng)混合物中的酰胺類產(chǎn)物跟酸類或有機(jī)胺類 反應(yīng)原料徹底分離，得到純度極高的反應(yīng)產(chǎn)物，同時(shí)可以將過剩的反應(yīng)原料，不經(jīng)任何處理，直接循環(huán)回 用。由此奠定了共沸除水型生物催化耦合模擬移動(dòng)床色譜分離酰胺類合成生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)。
我們發(fā)現(xiàn)，該工藝對(duì)于酰胺類物質(zhì)的合成具有普遍適用性，適用的酸類可以是碳鏈長(zhǎng)度在C2 C26之間
的脂肪酸，飽和的或不飽和的，直鏈的或支鏈的，也可以是芳香酸、氨基酸、羥基酸，或其他任何有機(jī)酸。 適用的有機(jī)胺類可以是碳鏈長(zhǎng)度在C廣C32之間的胺，飽和的或不飽和的，直鏈的或支鏈的，伯胺或仲胺， 也可以是氨基糖類、氨基糖醇類、氨基酸類或其他任何含有胺基的有機(jī)物。適用的生物催化劑可以是脂肪 酶、酯酶、蛋白酶或其他任何對(duì)酰胺鍵的形成具有催化活性的生物催化劑中的一種或幾種。適用的溶劑可 以是丙酮、2-丁酮、甲基叔丁基醚、叔戊醇、叔丁醇、己烷、戊烷、甲苯或其他任何能夠讓生物催化劑在 其中呈現(xiàn)催化活性的有機(jī)溶劑。適用的帶水劑可以是己烷、戊烷、環(huán)己烷、二氯乙垸、甲苯、二甲苯或其 他任何能夠在反應(yīng)條件，通常為30 6(TC， 0.1~0.001 MPa,下跟水共沸，或跟溶劑和水共沸，冷凝成液體 后跟水分層，形成互不相溶的兩相，且不會(huì)導(dǎo)致生物催化劑失活的有機(jī)溶劑。模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)所 使用的洗脫劑為酶促反應(yīng)體系所使用的溶劑與酶促反應(yīng)體系所使用的帶水劑按一定比例勾兌而成的混合 溶液，勾兌的比例為溶劑帶水劑=0:100~100:0。模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)所使用的吸附劑可以是活性炭、 硅膠、變性硅膠、聚丙烯酰胺或其他任何能夠勾特定洗脫劑配合將酰胺類反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)j相應(yīng)的反應(yīng)原料，酸 類或有機(jī)胺類相分離的吸附材料。模擬移動(dòng)床色譜分離在0 10(TC,最好是30 60。C，的溫度下進(jìn)行。
本發(fā)明中所提及的所有重要參數(shù)全部最優(yōu)化后原料的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品的得率均可提高至理論水平。產(chǎn)品 的純度可提高至99%(色譜純度)以上。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)例將具體說明本發(fā)明的操作方法，但不能作為對(duì)本發(fā)明的限定。 實(shí)例一
90 g(l mol)甲氧基乙酸，121 g (1 mol)外消旋苯乙胺和5gNovozym 435被添加到500 ml無水叔戊醇中 構(gòu)成混合物，隨后在55。C下，在不斷攪拌的條件下，反應(yīng)8hr。隨后加入100ml環(huán)己烷，開啟真空泵，將 反應(yīng)體系的壓強(qiáng)減至0.001~0.005 MPa，以使共沸混合蒸氣蒸出，蒸出的混合蒸氣經(jīng)冷凝后分層，形成環(huán) 己烷相和水相，環(huán)己烷相自動(dòng)回流至反應(yīng)體系中循環(huán)使用。反應(yīng)體系在此狀態(tài)下邊蒸除、冷凝、回流邊繼 續(xù)維持反應(yīng)，直到分水冷凝器中水相的體積不再增加，繼續(xù)維持反應(yīng)4hr。
反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物過濾分離固體酶，然后置以硅膠為吸附劑，以環(huán)己烷叔戊醇=4: 1的混 合溶劑為洗脫劑構(gòu)成的模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)中分離，得到甲氧基乙酸組分和含(S)-苯乙胺與(R)-甲氧乙 酰苯乙胺的混合組分。
含(S)-苯乙胺與(R)-甲氧乙酰苯乙胺的混合組分置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收脫除洗脫劑，然后冷卻至室溫，用 200ml 0.1M鹽酸萃取，重復(fù)操作二次，得到含(S)-苯乙胺鹽酸鹽的水溶液，和含(R)-甲氧乙酰苯乙胺的有 機(jī)相。水溶液調(diào)節(jié)pH至10~10.2，然后用乙醚萃取，蒸發(fā)問收乙醚，得到(S)-苯乙胺54g。有機(jī)相經(jīng)蒸餾 分離，得到(R)-甲氧乙酰苯乙胺77.2g。
甲氧基乙酸組分不經(jīng)處理，直接作為反應(yīng)原料，補(bǔ)充添加其他組分后，進(jìn)入下一個(gè)反應(yīng)循環(huán)使用，得 到同樣的結(jié)果。
實(shí)例二
22g月桂酸，14 g賴氨酸和lg黑曲霉來源脂肪酶被添加到100ml無水叔丁醇中構(gòu)成混合物，隨后在 36°C下，在不斷攪拌的條件下，反應(yīng)12hr。隨后加入10 ml己烷，開啟真空泵，將反應(yīng)體系的壓強(qiáng)減至 0.001-0.005 MPa，以使共沸混合蒸氣蒸出，蒸出的混合蒸氣經(jīng)冷凝后分層，形成己烷相和水相，環(huán)己烷相自動(dòng)回流至反應(yīng)體系中循環(huán)使用。反應(yīng)體系在此狀態(tài)下邊蒸除、冷凝、回流邊繼續(xù)維持反應(yīng)，直到反應(yīng)體 系中賴氨酸固體全部消失，分水冷凝器中水相的體積不再增加，繼續(xù)維持反應(yīng)4hr。
反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物過濾分離固體酶，然后置以硅膠為吸附劑，以己烷叔丁醇=3: 1的混合 溶劑為洗脫劑構(gòu)成的模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)中分離，得到月桂酸組分和月桂酰賴氨酸組分。月桂酰賴氨 酸組分置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收脫除洗脫劑，然后結(jié)晶，得到月桂酰賴氨酸30g。
月桂酰賴氨酸經(jīng)高效液相檢驗(yàn)，產(chǎn)品純度達(dá)到了光譜純。
月桂酸組分不經(jīng)處理，直接作為反應(yīng)原料，補(bǔ)充添加其他組分后，進(jìn)入下一個(gè)反應(yīng)循環(huán)使用，得到同 樣的結(jié)果。
實(shí)例三
135gL-天冬氨酸，117gD-丙氨酸乙酯和lg中性蛋白酶被添加到100ml無水叔丁醇中構(gòu)成混合物， 隨后在36。C下，在不斷攪拌的條件下，反應(yīng)12hr。隨后加入10ml戊烷，開啟真空泵，將反應(yīng)體系的壓強(qiáng) 減至0.01-0.005 MPa，以使共沸混合蒸氣蒸出，蒸出的混合蒸氣經(jīng)冷凝后分層，形成戊烷相和水相，戊烷 相自動(dòng)回流至反應(yīng)體系中循環(huán)使用。反應(yīng)體系在此狀態(tài)下邊蒸除、冷凝、回流邊繼續(xù)維持反應(yīng)，直到反應(yīng) 體系中莽草酸固體全部消失，分水冷凝器中水相的體積不？P曾加，繼續(xù)維持反應(yīng)4hr。
反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)混合物過濾分離固體酶，然后置以硅膠為吸附劑，以戊烷叔丁醇=3: 1的混合 溶劑為洗脫劑構(gòu)成的模擬移動(dòng)床色譜分離系統(tǒng)中分離，得到L-天冬氨酸組分和L-天冬氨酰-D-丙氨酸乙酯 組分。L-天冬氨酰-D-丙氨酸乙酯組分置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收脫除洗脫劑，然后結(jié)晶，得到L-天冬氨酰-D-丙 氨酸乙酯230g。
L-天冬氨酰-D-丙氨酸乙酯經(jīng)高效液相檢驗(yàn)，產(chǎn)品純度達(dá)到了光譜純。
L-天冬氨酸組分不經(jīng)處理，直接作為反應(yīng)原料，補(bǔ)充添加其他組分后，進(jìn)入下一個(gè)反應(yīng)循環(huán)使用，得 到同樣的結(jié)果。
權(quán)利要求
1. 一種共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)工藝。該工藝由下列步驟組成1)制備一個(gè)混合物。該混合物由(i)酸類，(ii)有機(jī)胺類，(iii)生物催化劑，(iv)溶劑和(v)帶水劑組成；2)讓混合物中的酸和有機(jī)胺反應(yīng)生成酰胺和水；3)讓混合物中的溶劑、帶水劑跟反應(yīng)后所生成的水共沸蒸餾，讓水以混合蒸氣的形式連續(xù)蒸出；4)讓混合蒸氣在冷凝器中冷凝、分層，分離除去所生成的水，溶劑和帶水劑返回反應(yīng)器，循環(huán)使用，直到反應(yīng)終止；5)回收生物催化劑，得到由反應(yīng)產(chǎn)物、過剩反應(yīng)物、溶劑和帶水劑組成的混合物；6)以溶劑和帶水劑為洗脫劑，對(duì)混合物進(jìn)行模擬移動(dòng)床色譜分離，將混合物分割為含過剩反應(yīng)物的組分和含酰胺類產(chǎn)品的組分；7)含過剩反應(yīng)物的組分返回反應(yīng)器，循環(huán)使用；8)含酰胺類產(chǎn)品的組分，脫除溶劑，得到酰胺類產(chǎn)品。溶劑回收，循環(huán)使用。
2. 如權(quán)利要求1所述的共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的酸類可以是 碳鏈長(zhǎng)度在C廣C26之間的脂肪酸，飽和的或不飽和的，直鏈的或支鏈的，也可以是芳香酸、氨基酸、 羥基酸，或其他任何有機(jī)酸。
3. 如權(quán)利要求1所述的減壓共沸連續(xù)除水的酰胺類酶法合成工藝，其特征在于所述的有機(jī)胺類可以是碳 鏈長(zhǎng)度在C, C32之間的胺，飽和的或不飽和的，直鏈的或支鏈的，伯胺或仲胺，也可以是氨基糖類、 氨基糖醇類、氨基酸類或其他任何含有胺基的有機(jī)物。
4. 如權(quán)利要求1所述的共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的生物催化劑 可以是脂肪酶、酯酶、蛋白酶或其他任何對(duì)酯鍵的形成具有催化活性的生物催化劑中的一種或兒種。
5. 如權(quán)利要求1所述的共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)l:藝，其特征在于所述的溶劑可以是丙酮、2-r酮、甲基叔丁基醚、叔戊醇、叔r醇、己烷、戊烷、甲苯成其他任何能夠讓生物催化劑在其中M現(xiàn)催化活性的冇機(jī)溶劑。
6. 如權(quán)利要求1所述的共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)l:藝，其特征在于所述的帶水劑可以 是戊烷、己烷、環(huán)己烷、二氯乙烷、甲苯、二甲苯或其他任何能夠在反應(yīng)條件下跟水共沸，成跟溶劑 和水共沸，冷凝成液體后跟水分層，形成互不相溶的兩相，且不會(huì)導(dǎo)致生物催化劑失活的有機(jī)溶劑。
7. 如權(quán)利耍求i所述的共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)丄藝，其特征在:r所述的模擬移動(dòng)床 色譜分離系統(tǒng)所使用的洗脫劑為酶促反應(yīng)體系所使用的溶劑與酶促反應(yīng)體系所使用的帶水劑按一定比例勾兌而成的混合溶液，勾兌的比例為溶劑帶水劑=0:100~100:0。
8. 如權(quán)利要求1所述的共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的模擬移動(dòng)床 色譜分離系統(tǒng)所使用的吸附劑可以是活性炭、硅膠、變性硅膠、聚丙烯酰胺或其他任何能夠與特定洗 脫劑配合將酰胺類反應(yīng)產(chǎn)物與相應(yīng)的反應(yīng)原料，酸類或有機(jī)胺類相分離的吸附材料。
9. 如權(quán)利要求1所述的共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)工藝，其特征在于反應(yīng)在所選用的生 物催化劑的最適溫度，通常為30~60°C，下進(jìn)行。共沸蒸餾在反應(yīng)溫度下通過對(duì)反應(yīng)體系的壓強(qiáng)的調(diào) 節(jié)來實(shí)現(xiàn)，可以是常壓，也可以是低達(dá)0.001-0.005 MPa的低壓。
10. 如權(quán)利要求1所述的共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)工藝，其特征在于模擬移動(dòng)床色譜分 離在0 100。C，最好是30 60。C，的溫度下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明屬非水相酶促有機(jī)合成應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種共沸除水耦合模擬移動(dòng)床的酰胺類酶法生產(chǎn)工藝。本工藝適用于生物催化劑(如中性蛋白酶)催化下的各種酰胺鍵的合成。它提供了一種普遍適用的酰胺類酶法合成新工藝，可在不影響生物催化劑的催化活性的前提下，通過減壓共沸連續(xù)除水，使反應(yīng)平衡向酰胺的合成的方向移動(dòng)，從而能夠大大提高酶促有機(jī)合成的轉(zhuǎn)化率，確保反應(yīng)趨于完成，徹底解決非水相酶促有機(jī)合成中的連續(xù)除水問題；通過酶促反應(yīng)體系與模擬移動(dòng)床色譜分離體系的耦合，確保反應(yīng)產(chǎn)物與過剩反應(yīng)原料的徹底分離，開解決過剩反應(yīng)原料的循環(huán)會(huì)用問題，可使原料的轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)品的收率以及產(chǎn)品純度均提高到接近100％的水平，使生產(chǎn)成本大幅度降低，實(shí)現(xiàn)酰胺類化工產(chǎn)品生產(chǎn)的廢水廢渣零排放，在醫(yī)藥、食品、材料和精細(xì)化工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P13/00GK101418323SQ20081024364
公開日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者戴阿娟, 湯魯宏, 擇 王, 超 鄧, 偉 陳, 黃海波 申請(qǐng)人:江南大學(xué);湯 寧