專利名稱：：靶向fak和egfr的rna干擾質(zhì)粒-脂質(zhì)體抗腫瘤復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于腫瘤基因治療領(lǐng)域，具體涉及靶向FAK和EGFR的RNA干擾載體一脂質(zhì)體抗腫瘤復(fù)合物。
背景技術(shù)：
：目前腫瘤的基因治療獲得了蓬勃快速的發(fā)展，但是至今為止，仍然存在許多需要解決的問(wèn)題。而其中急需解決的問(wèn)題是目前用于腫瘤基因治療的基因太少，能抑制腫瘤生長(zhǎng)的基因?yàn)閿?shù)不多，急需提供更多可供利用的基因；另外，由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過(guò)程是一個(gè)多基因參與、涉及多條信號(hào)通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，因此單個(gè)基因治療或單一治療方法往往療效有限。因此，未來(lái)基因治療發(fā)展的重點(diǎn)將在于挖掘并鑒定在臨床上有治療價(jià)值的基因，探索多個(gè)具有不同抗腫瘤作用機(jī)理的基因聯(lián)合治療以及將腫瘤基因治療與化療、放療合用Focal-adhesionkinase(FAK)基因是一個(gè)整合素家族成員基因，是一種定位于黏著斑的非受體型酪氨酸激酶，參與調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與增殖等，它可促進(jìn)細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)附著，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后過(guò)程中扮演重要功能。FAK基因可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞迀移，從而導(dǎo)致腫瘤擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移，同時(shí)也影響腫瘤治療的預(yù)后效果。大量研究發(fā)現(xiàn)FAK基因在多種腫瘤組織中較正常組織表達(dá)明顯增高，在發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后差的病人組織中檢測(cè)到FAK基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，如FAK基因在100。/。的結(jié)腸癌和88。/。的乳腺癌患者組織中表達(dá)上調(diào)，另外在肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、口腔上皮癌、頭頸部鱗狀上皮癌、黑色素瘤、急性髓細(xì)胞樣白血病、甲狀腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)增加，而且FAK基因表達(dá)水平上調(diào)直接與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)，因此，F(xiàn)AK基因是腫瘤治療潛在的理想靶標(biāo)。表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermalgrowthfactorrec印tor，EGFR)EGFR是一種跨膜蛋白質(zhì)，屬于ErbB家族的一員，由細(xì)胞外的結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及主要由酪氨酸激酶組成的胞內(nèi)區(qū)組成。當(dāng)EGF以及其他生長(zhǎng)因子與EGFR的胞外區(qū)相結(jié)合時(shí)，受體的酪氨酸激酶就會(huì)被活化，繼而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)一連串的信號(hào)傳導(dǎo)通路。大量研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)或異?；罨?，從而使腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，在非小細(xì)胞肺癌中，EGFR基因異常高表達(dá)，而且活性增高，EGFR已成為目前肺癌治療的重要靶分子。目前，RNA干擾已經(jīng)廣泛用于腫瘤治療研究，但大多數(shù)是利用化學(xué)合成的siRNA對(duì)腫瘤進(jìn)行治療，而化學(xué)合成的siRNA治療存在以下缺點(diǎn)化學(xué)合成的siRNA用量大，使用成本高，產(chǎn)業(yè)化難度大；化學(xué)合成的siRNA在體內(nèi)作用的穩(wěn)定性差，時(shí)間短，每次使用時(shí)對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高；多次輸注對(duì)患者的生活質(zhì)量也有不好的影響。同時(shí)從文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)來(lái)看，單個(gè)基因的RNA干擾效果往往不是十分理想，因?yàn)槟[瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲等是一個(gè)涉及多基因、多步驟復(fù)雜的過(guò)程，可能涉及的是多個(gè)基因、多條信號(hào)通路，所以針對(duì)多個(gè)耙點(diǎn)基因進(jìn)行RNA干擾治療可能是一個(gè)更好的選擇，效果也有可能更好，同時(shí)將雙基因甚至多基因的RNA干擾治療與化療、放療合用在臨床腫瘤治療方面可能更有前景，但目前未見相關(guān)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種能靶向FAK和EGFR雙基因的RNA干擾表達(dá)載體。該RNA干擾表達(dá)載體能在體內(nèi)表達(dá)FAK基因的RNA干擾序列5-'AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3'(SEQIDNO.1)禾nEGFR基因的RNA干擾序列5'-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3'(SEQIDNO.2)。其中，上述的表達(dá)載體為質(zhì)粒。其中，上述質(zhì)粒的骨架為pGensil-2，含有人的U6和H1啟動(dòng)子，分別用于啟動(dòng)FAK基因RNA干擾表達(dá)框架和EGFR基因RNA干擾表達(dá)框架。其中，表達(dá)FAK基因的RNA干擾序列的表達(dá)框架序列為SEQIDNO.7所示。其中，表達(dá)EGFR基因的RNA干擾序列的表達(dá)框架序列為SEQIDNO.8所示。進(jìn)一步的，上述RNA干擾表達(dá)載體具有SEQIDN0.9所示的序列。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述的RNA干擾表達(dá)載體的脂質(zhì)體復(fù)合物。其中，上述的脂質(zhì)體為陽(yáng)離子脂質(zhì)體。其中，上述陽(yáng)離子脂質(zhì)體是由摩爾比為1:1的D0TAP和膽固醇(Choi)組成。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述RNA干擾表達(dá)載體或上述的脂質(zhì)體復(fù)合物在制備抗腫瘤藥物組合物或抗腫瘤輔助藥物組合物中的用途。本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗腫瘤藥物組合物或抗腫瘤輔助藥物組合物，是由上述的RNA干擾表達(dá)載體或上述的脂質(zhì)體復(fù)合物作為主要活性成分添加藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的。其中，上述抗腫瘤藥物組合物還含有腫瘤化療藥物作為活性成分。進(jìn)一步的，上述腫瘤化療藥物為順鉑。本發(fā)明所要解決的第五個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備上述RNA干擾表達(dá)載體的方法，該方法包括以下步驟a、分別設(shè)計(jì)并合成能表達(dá)FAK基因的RNA干擾序列5」AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3'(SEQIDNO.1)和EGFR基因的RNA干擾序列5'-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3'(SEQIDNO.2)的表達(dá)框架序列；b、將a步驟所得表達(dá)框架序列轉(zhuǎn)入目標(biāo)表達(dá)載體，使表達(dá)框架序列能由啟動(dòng)子操作表達(dá)，擴(kuò)增篩選即得。本發(fā)明所要解決的第六個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種制備上述脂質(zhì)體復(fù)合物的方法，該方法包括以下步驟a、將DOTAP與膽固醇Chol按l:l的摩爾比進(jìn)行混合，制成DOTAP/Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體混懸液；b、將RNA干擾表達(dá)載體包裹到DOTAP/Cho1陽(yáng)離子脂質(zhì)體中形成表達(dá)載體-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，將該復(fù)合物稀釋在葡萄糖溶液中，并調(diào)整使得葡萄糖濃度最終為5%并混合均勻，即得。需要說(shuō)明的是，以上生產(chǎn)和操作本發(fā)明公開的基因、重組載體和脂質(zhì)體復(fù)合物的具體常規(guī)技術(shù)方法和設(shè)備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可按照已描述的技術(shù)方案根據(jù)相應(yīng)的操作手冊(cè)完成。本發(fā)明具有的有益效果在于本發(fā)明靶向FAK和EGFR的雙基因RNA干擾載體可以大大降低生產(chǎn)成本，具有更持久的體內(nèi)作用時(shí)間；本發(fā)明靶向FAK和EGFR的雙基因RNA干擾載體的脂質(zhì)體復(fù)合物，可以更穩(wěn)定地將shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入到體內(nèi)，對(duì)shRNA載體起到了保護(hù)和緩釋作用，使其在體內(nèi)的作用時(shí)間更持久，效果更好。并且本發(fā)明靶向FAK和EGFR的雙基因RNA干擾載體的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物具有被動(dòng)耙向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，而腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要來(lái)源，這樣能使抗腫瘤作用更為顯著，同時(shí)試驗(yàn)也表明其具有明顯的肺內(nèi)耙向作用，對(duì)肺部腫瘤的治療更具優(yōu)勢(shì)。另外，現(xiàn)有的腫瘤生物治療產(chǎn)品均需要采用腫瘤內(nèi)、腹腔內(nèi)等給藥方式，而本發(fā)明靶向FAK和EGFR的雙基因RNA干擾載體及其脂質(zhì)體復(fù)合物均能采用的靜脈注射方式，并有顯著的療效，更適合進(jìn)行臨床使用，尤其難能可貴的是對(duì)非實(shí)體腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤是會(huì)有較好的療效，為本領(lǐng)域當(dāng)前的這一難題的解決提供了一種新的解決途徑。同時(shí)，本發(fā)明FAK+EGFR雙基因RNA干擾載體的陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物和化療藥物——順鉑、放射治療共同作為抗腫瘤綜合治療比各自單獨(dú)使用明顯具有更優(yōu)的效果，能降低兩者的使用量。本發(fā)明產(chǎn)品功效明顯，毒副作用小，制備方法簡(jiǎn)單，能克服化療藥物、放射治療毒副作用大、療效難持久等缺陷，能大大減少給藥量、減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)并提高患者的生活質(zhì)量，具有很好的市場(chǎng)前景。以下結(jié)合附圖通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作各種變型或改進(jìn)，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。圖l為pGenesi1-2的結(jié)構(gòu)圖；圖2為PG6-1載體的結(jié)構(gòu)圖；圖3為PG6-4-hHl載體的結(jié)構(gòu)圖；圖4為PG6-l-F質(zhì)粒用EcoR頂每切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中1表示DL2000Marker從右至左依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;2表示PG6-1-F的EcoR頂每切結(jié)果；圖5為PG6-4-hHl-E質(zhì)粒用Sal頂每切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中1表示DL2000Marker從左至右依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;2表示質(zhì)粒pG6-4-hHl-E;3表示PG6-4-hHl-E的Sal頂每切結(jié)果；圖6為PGen-FAK+EGFR質(zhì)粒用BamH頂每切鑒定鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中l(wèi)表示DL2000Marker從左至右依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;2表示PGen-FAK+EGFR質(zhì)粒用BamH頂每切的結(jié)果；圖7為腫瘤生長(zhǎng)曲線圖；圖8為各組腫瘤重量稱量結(jié)果圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例一耙向FAK和EGFR雙基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建初步篩選得到具有明顯抑制FAK基因表達(dá)功能的siRNA序列5'-AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3'(SEQIDNO.1)(humanFAK:GenBankaccessionno:NM—153831)和明顯抑制EGFR基因表達(dá)功能的siRNA序列5'-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3'(SEQIDNO.2)(humanEGFR:GenBankaccessionno:x00588)。表達(dá)雙基因RNA干擾序列的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程如下1、按如下結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并合成RNA干擾表達(dá)框架表達(dá)框架結(jié)構(gòu)|BamHl|+Sense+L。。i3+Antisense~^^bfi"^+Ec。Rl/SalI^HindIIl|(其中的LOOP指連接序列)。(1)、FAK基因的RNA干擾耙序列(SEQIDNO.1)5'-AACCACCTGGGCCAGTATTAT-3'合成以下FAK基因的RNA干擾表達(dá)框架Sensestrand(SEQIDNO.3):5'如TCCbcCACCTGGGCCAGTATTmTCAAGACGATAATACTGGCCCAGGTGGTTTTTTGAATTC0-3'(設(shè)計(jì)有^^。yf/酶切位點(diǎn))Anti-sensestrand(SEQIDNO.4):5'-AGCTTGAATTCAAAAAACCACCTGGGCCAGTATTATCGTCTT((2)、EGFR基因的RNA干擾耙序列(SEQIDNO.2):5'-CACAGTGGAGCGAATTCCT-3'合成以下EGFR基因的RNA干擾表達(dá)框架Sensestrand(SEQIDNO.5):5'-3ATCCACAGTGGAGCGAATTCCTTTCAAGACGAGGMTTCGCTCCACTCTGTTTTTTg7g&3C0_3'(設(shè)計(jì)有W/酶切位點(diǎn))Anti-sensestrand(SEQIDNO.6):2、用上述合成的序列構(gòu)建PGen-FAK+EGFR載體1)單鏈目的基因片段的退火連接分別取上述合成的FAK和EGFR基因的單鏈RNA干擾表達(dá)框架目的片段進(jìn)行退火連接分別得到雙鏈的FAK和EGFR的RNA干擾表達(dá)框架。2)將與質(zhì)粒pGenesil-2(其結(jié)構(gòu)見圖l)基本骨架相同的PG6-1(其結(jié)構(gòu)見圖2)和PG6-4-hHl(其結(jié)構(gòu)見圖3)分別進(jìn)行BamHI+HindIII雙酶切，并凝膠回收大片段(PG6-1和PG6-4-hHl質(zhì)粒除多克隆位點(diǎn)不同外，其余序列完全相同)。3)將雙鏈的FAK干擾引物序列片段與線性化的PG6-1連接，得到PG6-1-F質(zhì)粒；雙鏈的EGFR干擾引物序列片段與線性化的PG6-4-hHl連接，得到PG6-1-hHl-E質(zhì)粒。4)將PG6-l-F質(zhì)粒和PG6-l-hHl-E質(zhì)粒分別用EcoRI和SalI進(jìn)行酶切鑒定，酶切圖分別見圖4和圖5，結(jié)果表明連接成功。5)將PG6-1-F質(zhì)粒和PG6-1-hHl-E質(zhì)粒都用SalI+Pstl進(jìn)行雙酶切，分別回收大片段和小片段。6)將質(zhì)粒PG6-1-F經(jīng)SalI+Pstl雙酶切所回收的大片段與PG6-4-hHl-E經(jīng)SalI+Pstl雙酶切所回收的小片段進(jìn)行連接，得到PG6-hU6-F+hHl-E質(zhì)粒(簡(jiǎn)稱為PGen-FAK+EGFR)7)利用BamH頂每切鑒定PGen-FAK+EGFR質(zhì)粒，見圖6，并測(cè)序，與預(yù)期序列一致，表明構(gòu)建成功。所構(gòu)建的PGen-FAK+EGFR載體全長(zhǎng)4115bp，全序列如SEQIDNO.9所示。其中所插入的siRNA表達(dá)框架為第一個(gè)表達(dá)框架為FAK基因的siRNA表達(dá)框架(SEQIDNO.7):第二個(gè)表達(dá)框架為EGFR基因的siRNA表達(dá)框架(SEQIDNO.8):(標(biāo)記為灰色的分別為FAK基因和EGFR基因RNA干擾耙序列，)實(shí)施例二、質(zhì)粒DNA/D0TAP-Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的制備1、DOTAP-Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備將陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTAP與中性脂質(zhì)體膽固醇(Choi)按l:l的摩爾比進(jìn)行混合，并將混合物用HPLC級(jí)的氯仿進(jìn)行溶解，并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上3(TC下旋蒸45min后成膜，成膜后真空干燥過(guò)夜。所成的膜取出后溶解于5%的葡萄糖溶液中，然后在5(TC水浴條件下震蕩45min和35i:水浴條件下震蕩10min，混合物在3(TC下經(jīng)400w超聲破碎5min，將混合物轉(zhuǎn)到一個(gè)試管中，并在5(TC下加熱10min，最后依次經(jīng)450nm、220nm、100nm聚碳酸酯膜擠壓，最后將混合物溶解在適量的5%的葡萄糖溶液中，得到5mg/ml的DOTAP-Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體混懸液。2、制備pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒DNA利用50L的細(xì)菌高密度發(fā)酵罐和質(zhì)粒DNA大規(guī)模純化的儀器-AKTAPliot(美國(guó)通用電器公司)，用堿裂解法制備并純化符合國(guó)家GMP標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過(guò)檢測(cè)所純化的質(zhì)粒能夠符合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的要求。3、質(zhì)粒DNA/陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的制備將質(zhì)粒pGen-(FAK+EGFR)按一定比例稀釋，再按脂質(zhì)體DNA=3:1(W/W)的比例將脂質(zhì)體溶液加入到pGen-(FAK+EGFR)溶液中，之后立刻渦流振蕩2min，再在4攝氏度下孵化lh，即得本發(fā)明陽(yáng)離子脂質(zhì)體一質(zhì)粒DNA復(fù)合物。試驗(yàn)例一本發(fā)明pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒的體外實(shí)驗(yàn)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)1、pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞的凋亡。本試驗(yàn)使用的人肺癌細(xì)胞株A549和SPC-A1，以下是A549細(xì)胞株的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SPC-A1也得到趨勢(shì)相同的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)按如下分組進(jìn)行(6孔板)A)空白對(duì)照B)無(wú)關(guān)序列+Liposome(2ygpGen-NC+5ygLiposome)C)pGen-FAK+Liposome(2ygpGen-FAK+5ygLiposome)D)pGen-EGFR+Liposome(2ygpGen-EGFR+5ygLiposome)E)pGen-(FAK+EGFR)+liposome(2ygpGen-(FAK+EGFR)+5ygLiposome)實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下，在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將A549細(xì)胞接種在6孔板(2X1()5細(xì)胞/L)，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為40-50%，在轉(zhuǎn)染前l(fā)-2小時(shí)將6孔板中的培養(yǎng)基更換為無(wú)血清、無(wú)抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基，按以上分組和各組所加的劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體的操作過(guò)程見質(zhì)粒DNA的操作流程，轉(zhuǎn)染后6小時(shí)將孔中的培養(yǎng)基換成RPMI1640+10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將6孔板置于倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和無(wú)關(guān)序列對(duì)照組A549細(xì)胞生長(zhǎng)良好，pGen-FAK質(zhì)?；騪Gen-EGFR轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有10-15%細(xì)胞死亡，而pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組50-70%的細(xì)胞死亡，表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將各孔培養(yǎng)基輕輕吸掉，每孔加入500yl的Hoechst33342染色液，然后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染能夠明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，Hoechst33342染色可見核固縮的凋亡小體，而pGen-FAK和pGen-EGFR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染有部分細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，故pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒具有最強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。試驗(yàn)例二pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物抗人肺癌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究為了研究pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物在體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng)，在BALB/c裸鼠(6-8周齡，雌性)皮下建立了人肺癌移植瘤模型，簡(jiǎn)言之，將體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞A549用胰酶消化，并定容在無(wú)血清、無(wú)抗生素的1640培養(yǎng)基中，調(diào)整的細(xì)胞濃度為5X107cellS/ml，在每只裸鼠的右側(cè)背腹部皮下接種5X106cells(0.1ml)，細(xì)胞接種7天后可以捫及到腫瘤，開始按以下進(jìn)行隨機(jī)分組治療(每組5只)A)空白對(duì)照組5%的葡萄糖溶液；B)無(wú)關(guān)序列組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-NC復(fù)合物置于5%的葡萄糖溶液中；C)pGen-FAK治療組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-FAK復(fù)合物置于5。/。的葡萄糖溶液中；D)pGen-EGFR治療組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-EGFR復(fù)合物置于5。/。的葡萄糖溶液中；E)pGen-(FAK+EGFR)治療組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-(FAK+EGFR)復(fù)合物置于5%的葡萄糖溶液中。采取尾靜脈注射方式進(jìn)行治療，質(zhì)粒DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物配比如下質(zhì)粒DNA(5yg):陽(yáng)離子脂質(zhì)體(15ug)=3:1(質(zhì)量比)，并將質(zhì)粒DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物稀釋在葡萄糖溶液中，并調(diào)整使得葡萄糖終濃度為5%。每次注射體積為200yl，每隔一天進(jìn)行治療，共治療12次，每3天測(cè)量1次腫瘤體積(結(jié)果見圖7)，腫瘤體積按以下方法計(jì)算體積(mm3)=0.52X長(zhǎng)(length)X寬2(width2)。腫瘤生長(zhǎng)抑制用方差分析，P〈0.05則認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。處死動(dòng)物取腫瘤組織時(shí)將各組腫瘤進(jìn)行稱重，結(jié)果如下。實(shí)驗(yàn)各組都沒(méi)有觀察到明顯的毒副作用，觀察39天將小鼠全部處死。從以上的各組動(dòng)物的腫瘤體積曲線(見圖7)、腫瘤重量(見圖8)情況分析發(fā)現(xiàn)雙基因RNA干擾治療組腫瘤生長(zhǎng)緩慢，而兩個(gè)單基因RNA干擾治療組和對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)較快，故陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-(FAK+EGFR)復(fù)合物表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗腫瘤作用，與對(duì)照組相比抑瘤率達(dá)到86.2%，而陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-FAK和陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-EGFR組也表現(xiàn)出了一定的抗腫瘤作用，抑瘤率分別達(dá)到36.3%和29.9%，由此結(jié)果可以看出，pGen-(FAK+EGFR)/陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物比任何單一基因RNA干擾治療都具有更強(qiáng)的抗人肺癌作用。以上結(jié)果表明，在人肺癌模型中pGen-(FAK+EGFR)/陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而且，我們使用的是一個(gè)很低的治療劑量。這提示我們，在以后的臨床應(yīng)用中，可以大大降低pGen-(FAK+EGFR)/陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物的使用劑量，提高治療效果，同時(shí)降低毒副作用。試驗(yàn)例三本發(fā)明產(chǎn)品pGen-(FAK+EGFR)與順鉑(cisplatin)聯(lián)用抗腫瘤試驗(yàn)為了研究pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒/陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物加化療的抗肺癌效應(yīng)，我們?nèi)缜八鲈贐ALB/c裸鼠(6-8周齡，雌性)皮下建立了人肺癌移植瘤模型，于細(xì)胞接種l周后可以捫及到腫瘤，開始按以下進(jìn)行隨機(jī)分組治療(每組5只)A)空白對(duì)照組5%的葡萄糖溶液；B)無(wú)關(guān)序列對(duì)照組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-NC復(fù)合物置于5。/。的葡萄糖溶液中；C)pGen-(FAK+EGFR)干擾治療組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-(FAK+EGFR)復(fù)合物置于5%的葡萄糖溶液中；D)化療組:0.lmg順鉑(DDP);E)無(wú)關(guān)序列加化療組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-NC復(fù)合物置于5。/。的葡萄糖溶液中，化療藥物順鉑DDP的使用如下所述；F)pGen-(FAK+EGFR)RNA干擾加化療組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-(FAK+EGFR)復(fù)合物置于5%的葡萄糖溶液中，化療藥物順鉑DDP的使用如下所述。陽(yáng)離子脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA復(fù)合物采取尾靜脈注射方式進(jìn)行體內(nèi)給藥，質(zhì)粒DNA(5yg):陽(yáng)離子脂質(zhì)體(15ug)=3:1(質(zhì)量比)，每次注射200yl體積，每隔一天進(jìn)行治療，共治療12次，每3天測(cè)量1次腫瘤體積。DDP采取腹腔給藥方式進(jìn)行治療，在第一次RNA干擾治療后2天開始進(jìn)行化療，每周兩次，連續(xù)2周，注射劑量為5mg/kg體重，每只小鼠每次注射O.1mg的DDP。最后處死動(dòng)物取腫瘤組織，并對(duì)各組腫瘤進(jìn)行稱重。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGen-(FAK+EGFR)/陽(yáng)離子脂質(zhì)體-復(fù)合物加化療藥物——順鉑比這兩種藥物單用具有更強(qiáng)的抗腫瘤效果，總抑瘤率達(dá)到90.2%，而單純的pGen-(FAK+EGFR)治療組(抑瘤率達(dá)到81.7%)和順鉑治療組(抑瘤率達(dá)到46.47%)，由此可見，雙基因的RNA干擾治療可以增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性。試驗(yàn)例四本發(fā)明產(chǎn)品pGen-(FAK+EGFR)與放療聯(lián)用抗腫瘤試驗(yàn)為了研究pGen-(FAK+EGFR)質(zhì)粒/陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物加放射治療的抗肺癌效應(yīng)，我們?nèi)缜八鲈贐ALB/c裸鼠(6-8周齡，雌性)皮下建立了人肺癌移植瘤模型，于細(xì)胞接種l周后可以捫及到腫瘤，開始按以下進(jìn)行隨機(jī)分組治療(每組5只)A)空白對(duì)照組5%的葡萄糖溶液；B)無(wú)關(guān)序列對(duì)照組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-NC復(fù)合物置于5。/。的葡萄糖溶液中；C)pGen-(FAK+EGFR)干擾治療組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-(FAK+EGFR)復(fù)合物置于5%的葡萄糖溶液中；D)放療組:每次5Gy/次;E)無(wú)關(guān)序列加放療組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-NC復(fù)合物置于5。/。的葡萄糖溶液中，放療劑量的使用如下所述；F)pGen-(FAK+EGFR)RNA干擾加放療組陽(yáng)離子脂質(zhì)體/pGen-(FAK+EGFR)復(fù)合物置于5%的葡萄糖溶液中，放療劑量的使用如下所述。陽(yáng)離子脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA復(fù)合物采取尾靜脈注射方式進(jìn)行體內(nèi)給藥，質(zhì)粒DNA(5yg):陽(yáng)離子脂質(zhì)體(15ug)=3:1(質(zhì)量比)，每次注射200yl體積，每隔一天進(jìn)行治療，共治療12次，每3天測(cè)量1次腫瘤體積。在第一次RNA干擾治療2天后開始進(jìn)行放療，每周兩次，每次5Gy，連續(xù)2周，總放射劑量為20Gy。最后處死動(dòng)物取腫瘤組織，并對(duì)各組腫瘤進(jìn)行稱重。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGen-(FAK+EGFR)/陽(yáng)離子脂質(zhì)體-復(fù)合物加放療療比這兩種治療方式單用具有更強(qiáng)的抗腫瘤效果，總抑瘤率達(dá)到92.1%，而單純的pGen-(FAK+EGFR)治療組(抑瘤率達(dá)到82.4%)和放射治療組(抑瘤率達(dá)到56.4%)，由此可見，雙基因的RNA干擾治療可以增強(qiáng)腫瘤對(duì)放療的敏感性。以上的較優(yōu)的具體實(shí)施方式是對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的舉例說(shuō)明，但并非對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作出各種變型或改進(jìn)。比如由本領(lǐng)域常識(shí)可知，本發(fā)明中的表達(dá)框架結(jié)構(gòu)中Loop(連接序列)的長(zhǎng)度和組成可以有一定的變化。而若有不同的要求，本發(fā)明的抗腫瘤藥物組合物和抗腫瘤輔助藥物組合物的用量和使用方式可以在一個(gè)較大范圍內(nèi)變動(dòng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)一些已知的因素，諸如疾病的種類，病情嚴(yán)重程度，病人體重，劑型，所選用藥途徑等很容易地加以確定。只要不脫離本發(fā)明的基本思想，這些變動(dòng)均在本發(fā)明的精神及所附上的權(quán)利要求書定義的范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>四川大學(xué)<120>耙向FAK和EGFR的RNA干擾質(zhì)粒-脂質(zhì)體抗腫瘤復(fù)合物〈130>A080076K<160>9<170>Patentlnversion3.4<210>1<211>21〈212>DNA〈213>artificial<220><223>artificial<400>1aaccacctgggccagtattat21〈210>2〈211>19<212>DNA<213>artificial<220><223>artificial〈400>2cacagtggagcgaattcct19<210>3<211>66<212>DNA<213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>3gatccgccacctgggccagtattatttcaagacgataatactggcccaggtggttttttg60aattca66〈210>4〈211>66〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>4agcttgaattcaaaaaaccacctgggccagtattatcgtcttgaaataatactggcccag60gtggcg66〈210>5〈211>66〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>5gatccgcacagtggagcgaattcctttcaagacgaggaattcgctccactgtgttttttg60tcgaca66〈210>6〈211>66〈212>DNA〈213>artificial〈220>artificial〈400>6agcttgtcgacaaaaaacacagtggagcgaattcctcgtcttgaaaggaattcgctccac60tgtgcg66〈210>7〈211>93〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>7agcttgtcgacaaaaaaccacctgggccagtattatcgtcttgaaataatactggcccag60gtggcg66〈210>8〈211>61〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>8aaaaaacacagtggagcgaattcctcgtcttgaaaggaattcgctccactgtgcg55〈210>9〈211>4115〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>9<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccatt1860ctccgccccatggctgactatttatgcagaggccgaggccgcctcggcct1920ctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgca肌gatc1980gatc肌gag3caggatgaggatcgtttcgcaagatggattgcacgcaggt2040tctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggc2100tgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaag2160accgacctgtccggtgccctgaatgaactgca卿cgaggcagcgcggctatcgtggctg2220gccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgg,gggac2280tggctgctattgggcg肌gtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgcc2340gag肌3gtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacc2400tgcccattcg3CC3CC肌gCg肌3C3tCgCatcgagcgagcacgtactcggatgg肌gcc2460ggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactg2520ttcgccaggctc肌ggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgat2580gcctgcttgccg肌tatcatggtgg肌肌tggccgcttttctggattcatcgactgtggc2640cggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaa2700gagcttggcggcg肌tgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgat2760tcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggt2820tcga肌tgaccgaccaagcg3CgCCC肌CCtgccatcacgagatttcgattccaccgccg2880ccttctatga肌ggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctcc2940agcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccctag3000gg肌gg卿c肌taccgg肌gg肌cccgcgctatgacggc3060cgcacggtgttgggtcgtttgcggggttcggtcccagggctggcactctg3120tcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccac3180CCC3CCCCCC肌gttcgggtg肌ggcccagggctcgcagcc肌cgtcggggcggcaggcc3240ctgccatagcctcaggttactcatatatactttagattgacatttttaat3300ctaggtg肌gatcctttttggacc肌肌tcccttaacgtg3360agttttcgttccactgagcgtcagaccccgca肌ggatcttcttgagatc3420ctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaccaccgctaccagcggtgg3480tttgtttgccggatca卿gctaccaactctttttccgaaggt肌ctggcttcagcagag3540cgcagatacccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttc肌g肌ct3600ctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtg3660gcgataagtcgtgtcttaccgggttggactgttaccggat肌ggcgcagc3720ggtcgggctgtcgtgcacacagcccagcttggagcg肌cgacctacaccg3780cctacagcgtgagctatgag肌3gCgCC3Cgcttcccgaaggg卿肌gg3840cggacaggtatccggtaagcggcagggtcggcgcacgagggagcttccag3900gggga肌cgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtc3960gatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaa肌3CgCC3gCaacgcggcct4020ttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatccc4080ctgattctgtggataaccgtattaccgccatgcat411權(quán)利要求1.一種RNA干擾表達(dá)載體，其特征在于它能在體內(nèi)表達(dá)SEQIDNO.1所示的FAK基因RNA干擾序列和SEQIDNO.2所示的EGFR基因RNA干擾序列。13.一種制備權(quán)利要求15任一項(xiàng)所述的RNA干擾表達(dá)載體的方法，其特征在于包括以下步驟a、分別設(shè)計(jì)并合成能表達(dá)SEQIDNO.1所示的FAK基因的RNA干擾序列的表達(dá)框架序列和SEQIDNO.2所示的EGFR基因的RNA干擾序列的表達(dá)框架序列；b、將a步驟所得表達(dá)框架序列轉(zhuǎn)入目標(biāo)表達(dá)載體，使表達(dá)框架序列能由啟動(dòng)子操作表達(dá)，擴(kuò)增篩選即得。14.一種制備權(quán)利要求8所述脂質(zhì)體復(fù)合物的方法，其特征在于包括以下步驟a、將DOTAP與膽固醇Chol按l:l的摩爾比進(jìn)行混合，制成DOTAP/Chol陽(yáng)離子脂質(zhì)體混懸液；b、將RNA干擾表達(dá)載體包裹到DOTAP/Cho1陽(yáng)離子脂質(zhì)體中形成表達(dá)載體-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，將該復(fù)合物稀釋在葡萄糖溶液中，并調(diào)整使得葡萄糖濃度最終為5%并混合均勻，即得。全文摘要本發(fā)明屬于腫瘤基因治療領(lǐng)域，具體涉及靶向FAK和EGFR的RNA干擾質(zhì)粒-脂質(zhì)體抗腫瘤復(fù)合物。本發(fā)明所制備的FAK和EGFR雙基因RNA干擾載體能有效地抑制人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡；體內(nèi)的抑瘤實(shí)驗(yàn)也表明FAK和EGFR雙基因RNA干擾載體-脂質(zhì)體復(fù)合物能夠顯著抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。本發(fā)明以陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹FAK和EGFR雙基因RNA干擾載體和化療及放療共同作為活性成分的抗腫瘤藥物比各自單獨(dú)使用明顯具有更優(yōu)的抗腫瘤效果，并能降低兩者的使用量。本發(fā)明產(chǎn)品功效明顯，能大大減少給藥量、提高患者的生活質(zhì)量，因此具有很好的市場(chǎng)開發(fā)前景。文檔編號(hào)C12N15/63GK101280317SQ20081030078公開日2008年10月8日申請(qǐng)日期2008年3月28日優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日發(fā)明者鄧洪新,陳俐娟,魏于全申請(qǐng)人:四川大學(xué)