專利名稱：：具有氨基杯芳烴衍生物和亞胺杯芳烴衍生物單層的修飾玻璃纖維，以及通過將低聚...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種通過將氨基杯芳烴書f生物或亞胺杯芳烴衍生物結(jié)合至玻璃纖維表面形成單層以制備表面修飾的玻璃纖維的方法，一種通過將具有連續(xù)鳥噤呤》成基的低聚DNAs固定在根據(jù)所述方法制備的玻璃纖維上以制備固定了低聚DNAs的玻璃纖維的方法，以及一種使用根據(jù)所述方法制備的固定了各種低聚DNAs的玻璃纖維的快速基因分型試劑盒的制備方法，通過前述方法支持了各種基因的基因分型。
背景技術(shù)：
：自從在人類基因組研究小組和CeleraGenomics竟?fàn)幮蚤_展的人類基因組項目中的人類基因組圖譜于2000年完成后，在世界范圍內(nèi)開展了對基因功能和突變基因檢測的研究，并通過研究結(jié)果制造了低聚DNA芯片，其中結(jié)合和固定了能夠?qū)Ω鞣N有機物進行基因分型的低聚DNA。[5]特別地，由于低聚DNA芯片可以對病毒基因分型，全世界對通過在低聚DNA芯片的基底上固定多種低聚DNAs制備的低聚DNA芯片已開展了眾多研究，該DNA芯片可用于如準確分沖斤病毒感染的途徑，確定該病毒是否有害，以及通過對引起癌癥的病毒組的基因分型預(yù)測癌癥發(fā)生的可能性。最近開發(fā)并受到關(guān)注的用于HPV病毒基因分型的DNA芯片是一種可對數(shù)十種人乳頭瘤病毒(HPV)進行基因分型的DNA芯片。據(jù)報道當(dāng)特定基因型的病毒存在時，未來發(fā)生子宮頸癌的概率高于90%。相應(yīng)地，所述芯片被認為是可以預(yù)測疾病發(fā)生幾率的用于預(yù)防疾病的重要生物芯片，因而韓國食品藥品管理局在世界上首次對其授予了官方許可證。然而，由修飾的玻璃片制備并通過各種物理和/或化學(xué)方法固定了多種DNAs的DNA芯片需要經(jīng)歷用戶操作過程，例如加樣，雜交，洗滌等。在以人手加工多種樣本的過程中，可能會出現(xiàn)如下的問題，這些問題肯定需要進行處理。1)人手可能無法均一地#:作。就此而言，即j吏在洗滌時間或分配溶液進4于洗滌的速度上的孩t小偏差也可能導(dǎo)致較大的誤差。相應(yīng)地，該測試結(jié)果可能由于操作DNA芯片的人的水平而變化。2)在約50。C的高溫下進行的約30分鐘至約2小時的雜交反應(yīng)中，由于溶劑的蒸發(fā)，在該溶液中結(jié)合的凄t量(例如，可參與該9雜交的DNAs的濃度)將急劇上升。在這一情況下，所得的信號可能有數(shù)倍的差異，這使得陽性/陰性的確定變得困難。3)特別地，存在不應(yīng)4企測到熒光的位置具有可見焚光的情況，這將誤導(dǎo)出相應(yīng)DNA存在的結(jié)論；即，存在非特異性DNA表達的情況，這使得精確的基因分型變得困難。4)對于DNA芯片，4至8個樣本可在一個DNA芯片上進4亍實-瞼，且相應(yīng)地，經(jīng)常存在多個涂^隻的解決方案混在一起的情況，這將引起應(yīng)讀取為陰性的樣本被讀取為陽性的嚴重問題。相應(yīng)地，有必要開發(fā)新型基因分型技術(shù)，其中各個樣本可被單獨上樣和分析。5)特別地，基于玻璃片的DNA芯片難以制作為易于使用的形式。相應(yīng)地，有必要開發(fā)通過具有良好可加工性的材料來生產(chǎn)維持了DNA芯片性能并被制成易于使用形式的商品的技術(shù)。6)此夕卜，阻止DNA芯片廣泛使用的最主要的因素之一是為了確定該芯片的最終分析結(jié)果，需要使用昂貴的掃描儀。目前大部分的掃描儀價值數(shù)萬美金，這阻礙了允許對各種病毒進行基因分型的DNA芯片的開發(fā)和使用。為了解決這一問題，有必要開發(fā)可通帶，并開發(fā)生產(chǎn)該條帶所必需的玻璃纖維(即，可固定DNAs并能被簡單地處理的玻璃纖維)的修飾技術(shù)，以及將各種DNAs固定在修飾的玻璃纖維上以允許分析各種基因(即，各種基因的基因分型)的技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容為了解決通過在玻璃片上固定低聚-DNAs的傳統(tǒng)DNA芯片的問題，本發(fā)明采取了如下的方法。本發(fā)明的研究組曾開發(fā)了可自發(fā)固定具有715個連續(xù)鳥噪呤石咸基的^氐聚-DNAs的玻璃片的制備技術(shù)。該種玻璃片可按如下制備將式l的氨基杯芳烴衍生物和式2的亞胺杯芳烴衍生物涂在胺修飾的玻璃片上，乂人而分別形成氨基杯芳烴單層和亞胺杯芳烴單層。在將溶液形式的j氏聚-DNAs涂覆在該玻璃片上時，各類低聚-DNAs可被自發(fā)固定。相應(yīng)地，該玻璃片被用于制備簡易的并具有高度可重復(fù)性的DNA芯片。為了在3皮璃纖維上固定各種DNAs,本發(fā)明利用了玻璃纖維表面與玻璃片表面相同的事實。本發(fā)明參照Z^wgmwV，7996，Ko/72，p/533S-5^Z2所4皮露的已知方法以胺修飾了玻璃纖維的表面。然后，本發(fā)明將式1的氨基杯芳烴書f生物和式2的亞胺杯芳烴f;f生物應(yīng)用于胺修飾的玻璃纖維，以分別形成氨基杯芳烴單層和亞胺杯芳烴單層。然后，以包含DNAs的溶液以與玻璃片相同的方式涂覆玻璃纖維，以制備固定了DNA的玻璃纖維。即，本發(fā)明的目標(biāo)在于創(chuàng)建固定了多種DNAs的玻璃纖維的制備技術(shù)，以及使用該玻璃纖維制備基因分型條帶的方法。特別地，本發(fā)明提供了制備基因分型條帶的技術(shù)，其通過結(jié)合一種或多種基因或產(chǎn)物鑒定基因型，該基因或產(chǎn)物可通過將該溶液在具有通過雜交結(jié)合在玻璃纖維上的揮:針DNA的溶液中進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)后得到。才支術(shù)方案ii[22]本發(fā)明提供了表面修飾的玻璃纖維的制備方法，其中所述的玻璃纖維可按如下制備參照圖1和2的方法將式1的胺基杯芳烴衍生物和式2的亞胺杯芳烴書f生物結(jié)合至胺^f奮飾的玻璃纖維表面以形成單層。[式l]4其中Ri,R2,R3,R4,R5，R6，R7，R8,R、，R'2，R'3,R'4,R'5,R'6,R'7和R'8獨立選自組合-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，-OCH3,-CI,-C6H5，-OH，-OCH2CH3,-Br,-CF3，-OCH2C6H5，-OC6H5,-OC6H4CH3，-OC6H4C(CH3)3,-OC6H4CF3,-OC^Cl,-OCOCH3,-NHCOCH3,-CONHCH3,隱CN,COOH，和-COOR，其中R代表—CH3或—C2H5，且所述Y!，Y2,Y3和Y4獨立選自組合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH,-((^112)111《6114畫((:112)(^和^0-(0:112)1.1匿(:61^隱((:^12)(^，其中，n=215,m=110，c=010,Z為選自-SH,-CHO,《0011和-^2的基團，且-(^6114-和-(:6115被定義為苯基基團。OIYOIY61V，？lr12[30]其中R!，R2，R3和R4獨立選自組合-H,-CH3，-C2H5,-C3H7，-OCH3,畫Cl,-C6H5,-OH，-OCH2CH3,-Br，-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5,—OG6H4CH3,-OG6H4G(GH3)3,-OG6H4CF3,匿OC^H4Cl,-OCOCH3，-NHCOCH3，-CONHCH3,-CN,COOH和-COOR，其中R代表-CH3或畫C2Hs;Yl5Y2，Y3和Y4獨立選自組合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH，-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0，-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH,-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z和誦CO陽(CH2)m.廣C6H4-(CH2)c-Z，其中，n=2~15,m=l~10，c=010,Z為選自-SH，-CHO，-COOH和-NH2的基團，且-(^6114-和-0:6115被定義為苯基基團。該式1的胺基杯芳烴書f生物和式2的亞胺杯芳烴書f生物可參照韓國專利申請10-2005-0096322,10-2005-0103857,10-2005-0105340和10-2005-0110824所4皮露的方法進行制備，這些專利申請在此引用作為參考。'對于在^皮璃纖維上形成單層的方法，如圖3的i兌明所述，玻璃纖維具有約10nm至數(shù)百微米的厚度，且表面富有硅烷醇(-SiOH)功能團的玻璃纖維被通過化學(xué)反應(yīng)修飾為具有胺末端的玻璃纖維(參見Langmuir，1997，Vol13，pp4305-4308;Langmuir,1996，Vol12,pp5338-5342)。然后，具有胺末端的玻璃纖維可被浸入溶液約1至約24小時，該溶液中式1或2的化合物以0.15.0mM的濃度#:溶解于有才幾溶劑(如CHCi3等)。然后，以相同的溶劑洗滌該玻璃纖維，并干燥以得到表面修飾的玻璃纖維，其中形成了胺基杯芳烴或亞胺杯芳烴的單層。通過采用所述方法，本發(fā)明提供了具有自組裝單層的玻璃纖維，其中式1的氨基杯芳烴衍生物或式2的亞胺杯芳烴衍生物通過化學(xué)結(jié)合(例如亞胺結(jié)合，通過還原亞胺結(jié)合得到的胺結(jié)合，^危醇結(jié)合，酯結(jié)合，醚結(jié)合，酰胺結(jié)合等)被連接至玻璃纖維的表面。在圖4和5所示的將DNA固定至修飾的玻璃纖維的方法中，具有連續(xù)鳥嘌呤堿基的低聚-DNAs可被自發(fā)地固定在具有60-600mM的離子的固定溶液中，從而制備固定了DNA的玻璃纖維。如本發(fā)明所述的固定DNA的方法包括將具有連續(xù)鳥噤呤石咸基(例如，9個連續(xù)的鳥嘌呤堿基)的低聚-DNA溶解于BMT調(diào)制14(dispensing)溶液(具有600mM銨離子的溶液)中以制備固定溶液；將所述固定溶液分配至經(jīng)氨基杯芳烴或亞胺杯芳烴單層修飾的所述玻璃纖維；并固定該低聚-DNA。所述方法可選擇性地包括洗滌所述玻璃纖維，并封閉未固定^f氐聚DNA的位點。在所述方法中，該固定步驟優(yōu)選在室溫下進行約1至約4小時。該封閉步驟可包括將洗滌的玻璃纖維置于封閉溶液(lx4xSSC,0.1-5.0%酪蛋白)并處理1030分4f。當(dāng)按照圖9的方法進行比較時，據(jù)觀察固定在按此制備的玻璃纖維上的DNAs的濃度為理論最大固定量的約1/2至1/3,這顯示本發(fā)明實現(xiàn)了能夠以接近理論最大值的量固定DNA的玻璃纖維的制備技術(shù)。圖5和圖6顯示了根據(jù)堿基一致程度所得的各種基因的雜交結(jié)果。在約1.4cm的較窄空間內(nèi)，DNAs被固定在8個直道中，隨后每條道被涂覆以熒光標(biāo)記的基因以進行雜交。玻璃纖維可牢固地固定DNAs，其固定凄t量可4吏得該熒光可在該固定位置通過雜交單獨鑒定，從而在溶液擴展時維持間隔狀態(tài)及其固定位置，如圖5的實驗結(jié)果所示。實施例3顯示了固定DNAs的方法，而實施例4顯示了涂覆熒光標(biāo)記的基因的過程。此外，本發(fā)明提供了能夠鑒定具有特定堿基序列的基因的基因分型的方法，包括-在本發(fā)明所述的玻璃纖維上擴展包含了具有擴增核酸的熒光標(biāo)記基因的溶液；和[44]-通過雜交將具有特定^威基序列(例如，病毒的特定基因型)的基因與固定在該玻璃纖維表面上的互補探針低聚-DNA相結(jié)合。圖6顯示了基因分型的結(jié)果，即，根據(jù)基因一致性所得的雜交結(jié)果。為了獲得該雜交結(jié)果，固定多種不同基因型的基因，并參照實施例5涂覆一種基因型的熒光標(biāo)記基因。圖6顯示了實際的實-驗結(jié)果和結(jié)果的分析。才艮據(jù)該結(jié)果，基因型不匹配的位置顯示了極少的熒光強度，但基因型匹配的位置顯示了高10至40倍的焚光強度。如本發(fā)明所述的該基因分型方法可在約4i:至約2(rc的低溫下，在約20。C至約30。C的室溫下，或在約30。C至約60。C的高溫下進4亍。同時，自乂人K.Kleppe和G,Khorana于1971年在Jowwa/o/Mo/ecw/w5z'o/ogy，vol.56，pp341~361^皮露了聚合酶鏈式反應(yīng)，擴增基因的雜交通常在約40。C至約6(TC的高溫下進行以提高選擇性。然而，如本申i青中在常溫下進^f亍的反應(yīng)的結(jié)果尚未祐y^布。一般而言，實驗室的溫度被維持在約22。C至25。C，且雜交可在包括所述溫度的室溫下進行。對于僅能在高溫下(從約30。C至約60。C)進行的雜交反應(yīng)，僅在使用烘箱提高溫度時才能進行雜交。對于在低溫下進行的雜交反應(yīng)(從約4。C至約20。C)，可在使用降低溫度的4義器(例如，致冷器)時進行雜交?？梢霍迵?jù)反應(yīng)溫度和維持該溫度的儀器對雜交進行分類。在本發(fā)明中，以大分子對玻璃纖維進^^奮飾，從而^吏具有連續(xù)鳥噤呤堿基的探針DNAs可被固定在玻璃纖維上。此外，在本發(fā)明中，該探針低聚-DNAs通過該連續(xù)鳥嘌呤堿基被適當(dāng)?shù)拈g隔開，因而即<吏在室溫或<氐溫下也可能進4亍雜交。與一4殳的預(yù)期不同，固定在該《奮飾J皮璃纖維上的該揮:4十DNA在室溫或^氐溫下進行雜交，并獲得熒光強度，其顯示了與高溫雜交相同或比之更高的雜交率。圖6和圖9顯示了從室溫雜交獲得的熒光數(shù)據(jù)，其可以在各種熒光數(shù)據(jù)中被容易地使用。此外，本發(fā)明提供了能夠鑒定具有特定堿基序列的基因的基因分型的方法，包括-通過本發(fā)明所述的基因分型條帶的樣本入口注射包含了具有擴增核酸的熒光標(biāo)記基因的溶液；-將該溶液在該玻璃纖維上展開；并-通過雜交將具有特定堿基序列的基因與固定在該玻璃纖維表面上的互補探針低聚-DNAs相結(jié)合。17[57]此外，本發(fā)明提供了基因分型方法，其包括以包含具有特定序列的基因(RNA，DNA等)的溶液涂覆玻璃纖維；通過雜交將該種具有特定石咸基序列的基因與固定在該玻璃纖維表面上的具有連續(xù)鳥噤呤堿基的互補低聚-DNAs相結(jié)合；并通過采用焚光或可見光線等的分光法檢測該結(jié)合基因的總量。有益效果綜上，本發(fā)明提供了以大分子修飾的固定了低聚-DNAs的玻璃纖維，其制備方法，以及使用所述固定了低聚-DNAs的玻璃纖維制備基因分型條帶的方法。此外，本發(fā)明實現(xiàn)了制備和使用固定了低聚-DNAs的表面修飾玻璃纖維的技術(shù)。本發(fā)明可以解決傳統(tǒng)DNA芯片因昂貴的掃描4義的4吏用，且測試結(jié)果隨該芯片的使用人而變化，以及該芯片不易于操作而無法廣泛使用的問題。此外，本發(fā)明實現(xiàn)了易于使用且需要很少處理的基因分型條帶的制備4支術(shù)，乂人而可以顯著改善基于常失見玻璃片的DNA芯片且許多用戶遇到的問題。此外，玻璃纖維具有如下特4正溶液可在其上面以特定速度擴展，類似于用于快速試劑盒的NC膜。相應(yīng)地，當(dāng)?shù)途?DNA被固定在玻璃纖維表面時，包含在以特定的速度擴展的溶液中的基因在擴展中通過均勻固定的DNAs被勻速雜交。相應(yīng)地，本發(fā)明可制備成條帶形式的商品，其除了在注射溶液形式的樣本外無需用戶操作。因此，本發(fā)明提供了無需用戶操作便可使用的芯片，從而可以顯著提高測試結(jié)果的重現(xiàn)性并提高便利性。為了實現(xiàn)上述效果，本發(fā)明人開發(fā)了通過固定該低聚-DNA修飾玻璃纖維表面的4支術(shù)。[61]因此，本發(fā)明提供了世界上首項通過改善傳統(tǒng)的修飾玻璃片的技術(shù)制備玻璃纖維的技術(shù)，因而有可能制備以高密度固定了低聚-DNA,使得無需用戶操作便可使用的基因分型條帶。此夕卜，本發(fā)明實現(xiàn)了使用固定了低聚-DNA的玻璃纖維制備基因分型條帶的技術(shù)。參照本發(fā)明制備的該條帶不僅可以解決制備和使用傳統(tǒng)低聚-DNA芯片所遇到的問題(例如測試結(jié)果不可重現(xiàn)，且測試結(jié)果隨使用者而變化)，還可以提供基于玻璃纖維的條帶形式的DNA芯片的制備技術(shù)，從而允許使用不昂貴的分析儀(即，無需使用花費數(shù)萬美元的昂貴分析儀)進行基因分型。本發(fā)明可以解決制備和使用基于傳統(tǒng)玻璃片的DNA芯片時遇到的大多數(shù)問題。按此制備的條帶的測試結(jié)果可通過配備了線性馬達的大約數(shù)百至數(shù)千美金的低價掃描儀獲取。圖5顯示了通過低價掃描儀獲得的實際實驗結(jié)果。本發(fā)明的重要之處在于它可以解決使用傳統(tǒng)DNA芯片中遇到的問題，從而允許使用基因分型進行各種診斷。附圖i兌明圖l和圖2顯示了其表面參照公開于Langmuir,1996,Vol12,pp5338-5342的論文中的方法以胺基修飾的玻璃纖維，并顯示了通過結(jié)合式1或式2的衍生物與胺基修飾的玻璃纖維，制備大分子單層的過程。圖3為實際用于所述制備的玻璃纖維(Fusion5(WhatmanCo.,U.K.))的照片，其放大圖，以及其圖示。用于本發(fā)19明的該^皮璃纖維(包含了來自英國WhatmanCo.，美國WaterCo.和美國MilliporeCo.等公司的產(chǎn)品)可通過乂人玻璃原材料中抽取直徑10nm至數(shù)百jim的細玻璃纖維，然后將其編織為膜，從而獲得。相應(yīng);也，所述纖維可具有如下特4正施加于該纖維一個部分的;容劑通過重力，毛細管作用，微流體或其中至少兩種的組合進行擴展。本發(fā)明使用了所述玻璃纖維的該種特征。圖4顯示了制備玻璃纖維的過程，其中低聚-DNA按如溶液以具有特定寬度的線的形式分配在以大分子單層修飾的玻璃纖維上。圖5顯示了實際實驗的結(jié)果。在該實驗中，當(dāng)包含由聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)獲得的熒光標(biāo)記擴增基因的》容液-波應(yīng)用于以條線形式涂覆了具有連續(xù)鳥噪呤堿基的低聚-DNAs的玻璃纖維上時，作為結(jié)果，當(dāng)多個低聚-DNAs以多條線的形式被固定時，該溶液將自發(fā)擴展，然后與該固定探針低聚-DNAs互補的基因型的基因通過雜交^皮結(jié)合。該試-驗使用了熒光標(biāo)記的基因以通過才企測熒光強度來鑒定結(jié)合的基因。圖6顯示了讓包含熒光標(biāo)記基因的溶液在以條線形式涂覆了多種低聚-DNAs的玻璃纖維上流動以進行固定，并以熒光掃描儀實施分析所得的實際實驗結(jié)果。在基因的堿基序列與待檢測的堿基序列一致的位置可檢測到強烈的熒光，而在堿基序列與待檢測的堿基序列不一致的位置則未檢測到熒光。因此，在該實驗中，僅在堿基序列一致的位置才會檢測到熒光標(biāo)記的基因。圖7顯示了通過將固定了多種低聚-DNAs的玻璃纖維放入條帶然后加蓋制備得到的條帶。當(dāng)包含了通過PCR得到的擴增基因的溶液被注射進入條帶的樣本入口，可得到圖5和6的基因雜交結(jié)果。該結(jié)果主要通過光譜測定法進行分析。圖8顯示了圖7中溶液擴展處理后通過光i普測定法分析所得結(jié)果的過程。圖8顯示了以下過程將以條線形式固定了多種低聚-DNAs的玻璃纖維放入條帶，然后如圖7所示將包含各種基因的溶液注射進入才羊本入口，在一定時間后，以肉眼或4吏用光學(xué)4義器觀察結(jié)合至各個條線的基因的數(shù)量，然后將其以信號量度表示。溶液中基因的基因型可通過觀察該量度的差異進行鑒定。圖6顯示了通過檢測熒光得到的實際試驗結(jié)果。由圖6可以確認僅當(dāng)基因型一致時才可測得4交大水平的熒光。圖9顯示了將可被雜交的理論最大量的熒光標(biāo)記基因被涂覆和干燥時獲得的熒光強度與以實際固定DNAs雜交獲得的熒光強度相比4交的實際試-驗結(jié)果。在此，可^皮雜交的焚光標(biāo)記基因的理論最大量可通過如下計算獲得計算以條線形式固定該DNAs時玻璃纖維表面可固定的具有連續(xù)鳥噤呤石咸基的低聚-DNAs的最大量，然后計算可與它們雜交的熒光標(biāo)記基因的最大量。在此，該計算可基于如下假設(shè)熒光標(biāo)記基因與固定低聚-DNAs以l:l的比例進行雜交(為了確認熒光強度從理論最大量(即，xl)的下降，可使用如xl/3，xl/9等下降濃度的基因檢測熒光強度)。同時，熒光標(biāo)記基因與實際固定DNAs之間的雜交實驗結(jié)果通過5才艮條線的重復(fù)得到確認。從該實-驗獲得的熒光強度約為理論最大熒光強度的l/3倍，這顯示本發(fā)明實現(xiàn)了出色的基因固定和雜交結(jié)果。圖10是顯示了一類圖7和圖8中所用的具有樣本入口的裝配條帶的照片。圖11至圖16顯示了實-驗結(jié)果，其通過如下方式獲^^:將修飾的玻璃纖維(其中固定了不同基因型的探針低聚-DNAs)裝配進入圖10所示的條帶，然后使熒光標(biāo)記的擴增基因在該條帶上擴展，然后力口實施例7所述4吏用焚光掃描4義讀耳又該結(jié)果。圖ll至圖14顯示了在采用與一種探針基因型互補的擴增基因時通過相同方法所得的結(jié)果，而圖15和圖16顯示了在采用與至少兩種探針基因型互補的擴增基因時通過相同方法所得的結(jié)果。所有的結(jié)果顯示使用修飾玻璃纖維的基因分型中，基因被選擇性地雜交，且未出現(xiàn)非特異性雜交。發(fā)明模式本發(fā)明將通過實施例作更為具體的描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不受到特定實施例的限制。[85]實施例l通過在胺基修飾的玻璃纖維上使用溶解了5,11，17，23-四二千氨基杯[4]芳烴-1，3-己醛(TDBACAHA)的溶液形成單層的方法。其中X與代表了具有式1醛末端基團的連接部分的功能基團相同。TDBACAHA將0.15.0mM式l的衍生物中的5，ll，17，23-四二千氨基杯[4]芳烴-l，3-己醛(TDBACAHA)溶解于有機溶劑(如CHCl3等)中，以制備溶液。如圖1和圖2所示，將連接了胺基功能集團的玻璃纖維(例如，胺基玻璃纖維基底)浸入按此制備的溶液中l(wèi)-24小時，然后依次以氯仿，丙酮和水洗滌該玻璃纖維，然后干燥以形成氨基杯芳烴單層。另一種氨基杯芳烴衍生物單層參照相同的方法制備。,一匿o[92]實施例2通過應(yīng)用溶解了5，ll,17，23-四節(jié)基亞胺烷氧基杯[4]芳烴(TBICOCA)的溶液(參照常規(guī)方法制備)修飾胺基修飾的玻璃纖維的方法。TBICOCA將0.1~5.0mM式2的衍生物中的5,ll,17,23-四千基亞胺烷氧基杯[4]芳烴(TBICOCA)溶解于有機溶劑(如CHCl3等)中，以制備溶液。如圖3所示，將連接了胺基功能集團的玻璃纖維(例如，胺基玻璃纖維基底)浸入按此制備的溶液中l(wèi)-24小時，然后依次以氯仿，丙酮和水洗滌該玻璃纖維，然后干燥以形成本發(fā)明的亞胺杯芳烴單層。另一種亞胺杯芳烴衍生物單層參照相同的方法制備。24網(wǎng)實ife例3通過使用修飾的玻璃纖維固定低聚-DNAs以對各種類型的基因進行基因分型的方法將Biodot分配器(型號XYZ3050,美國)用于圖5所示的低聚-DNA固定。為了對各類基因進行基因分型，如圖5所示固定即，訂奪3-30液(具有600mM4妄離子的溶液)中以制備8組固定溶液(具有600mM銨離子的溶液；產(chǎn)品名稱；BMT點樣;容液-9G，由韓國的BiomatrixTechnologyCoy^司生產(chǎn))4吏用分配噴"觜以5-50mm/sec的速率分配所述固定溶液。在〗務(wù)飾的玻璃基底(玻璃纖維)上參照實施例1和2的方法形成圖4所示的胺基杯芳烴衍生物單層或亞胺杯芳烴衍生物單層。然后，將低聚-DNA以寬度為0.5-5mm的條線的形式固定在按此制備的玻璃基底上。在室溫下固定14小時后，洗滌該玻璃纖維，然后浸入250mlBMT封閉溶液(lx4xSSC，0.1-5.0%酪蛋白；產(chǎn)品名BMT封閉溶液-9G,韓國BiomatrixTechnologyCo乂A司)10~30分鐘，以封閉未固定低聚-DNAs的位置。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>為了進行與熒光標(biāo)記的靶標(biāo)DNA的雜交，將5(il表l列舉的熒光標(biāo)記輩巴標(biāo)DNA和75(xlBMThyb-mixA(6xSSC,20%甲酰胺:0.05%tritonX-100;產(chǎn)品名稱BMTHyb-溶液-9G,韓國BiomatrixTechnologyCoy^司)1.5ml》文入管，以制備80jxl的〉、昆合溶液。然后，將由此制備的溶液注射進裝配條帶的樣本入口。然后在室溫下(20土5。C)雜交550分鐘。雜交完成后，注入100300pl的0.1x4xSSC溶液，然后分離該條帶。然后該玻璃纖維連接至玻片，并通過樣t陣列掃描儀(GSILumonics，U.S.A.)或線性掃描儀定量分析該熒光強度。圖5顯示了通過線性掃描儀獲得的實際實驗結(jié)果。這些結(jié)果顯示固定了低聚-DNAs的玻璃纖維已被制備，且當(dāng)在表面修飾的玻璃纖維上采用各類基因，然后將包含熒光標(biāo)記靶標(biāo)DNA的溶液流過該玻璃纖維，溶液中的基因與各種固定低聚-DNA雜交，因此玻璃纖維可鑒定特定類型的基因是否包含在該溶液中。[110]_實施例5通過使用表面修飾的玻璃纖維檢測特定類型基因的實驗在圖6所示的低聚-DNA固定中使用了Biodot分配器(型號XYZ3050，美國)。為了檢測非特異性熒光，參照圖4所示的方法，如圖6所示將表2中列舉的具有完全互補堿基序列的探針低聚-DNAs和具有非互補堿基序列的探針低聚-DNAs進行固定。與實施DNAs的玻璃纖維,表2<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>[114]定在玻璃纖維上的DNA雜交，將上述制備的該玻璃纖維基底組裝進入圖10所示外形的條帶中。為了進行雜交，將5pl的熒光標(biāo)記靶標(biāo)DNA和75fxl的BMThyb-mixA放入1.5ml管中，以制備80pl的混合溶液。然后，將由此制備的溶液注射進裝配條帶的樣本入口。然后在室溫下(20士5。C)雜交550分鐘。雜交完成后，注入100300pl的0.1x4xSSC溶液，然后分離該條帶。然后將該玻璃纖維連接至玻片，并用微陣列掃描儀(GSILumonics,美國)定量分析熒光強度。圖6顯示了實際的試驗結(jié)果。該結(jié)果顯示僅在具有目標(biāo)堿基序列的條線中才會有可見的熒光，且當(dāng)基因通過毛細管作用、微流體或側(cè)流等方式流過玻璃纖維時，可特異性的檢測到具有互補石咸基序列的靶標(biāo)DNA。實施例6與可在玻璃纖維表面上固定的基因的理論最大量的比較實驗為了進行與可在玻璃纖維表面上固定的DNAs的理論最大量的比較實驗，通過與實施例3相同的方法制備具有連續(xù)鳥。票呤堿基和互補石威基序列的探針DNA,并以54艮條線的形式應(yīng)用于修飾的玻璃纖維。為了應(yīng)用熒光標(biāo)記《I物或PCR產(chǎn)物并鑒定其是否與固定在玻璃纖維上的DNA雜交，將上述制備的該玻璃纖維基底組裝進入圖7的圖示或圖10的照片所示外形的條帶中。通過與實施例4相同的方法進行雜交。雜交完成后，將該玻璃纖維脫離該條帶。然后使用孩i陣列掃描儀(GSILumonics，美國)定量分析焚光強度以獲得實驗數(shù)據(jù)。此外，為了將該實驗數(shù)據(jù)與可在該表面上固定的基因的理論最大量進行比較，可制備包含了與可在該表面上固定的DNAs的理i侖最大量等量的濃度為1X的熒光標(biāo)^己基因的溶液。然后，28將所述溶液稀釋為1/3，1/9,1/27,1/81倍。然后，用分配器將該溶液以條線的形式分別應(yīng)用于玻璃纖維上，然后干燥玻璃纖維。使用熒光^r測器讀取該結(jié)果。圖9顯示了實際結(jié)果。實施例7在探針DNAs與擴增基因雜交后通過測量熒光檢測所述修飾玻璃纖維的膜上出現(xiàn)的條線的方法A)以通過標(biāo)準材料進行的PCR獲得的產(chǎn)物鑒定基因類型的實-驗在本實施例中所用的標(biāo)準材料購自ATCC(美國典型菌種保藏中心)，并列舉如下探針畫l(ATCC45150)探針-2(ATCC45151)探針-3(ATCC45152)探針-4(ATCC45113)使用上述的質(zhì)粒DNA作為模板并使用表3中的引物，參照下述方法進4亍PCR。該PCR中所用的引物經(jīng)我們:汀購由BioneerCo.Ltd.公司(韓國)合成。PCR按如下進行將購自BioniaCo.Ltd.公司，包含10iil的PCR緩沖液、1lal的1.5mMMgCl2、250uMdNTP、30mMKC1、10mMTris-HCl(pH9.0)、Taq聚合酶(l單位)和引物(10pmol/pl)、7(al的蒸餾水以及l(fā)nl的模板DNA的反應(yīng)溶液在94。C下處理5分鐘(一次)，然后進行94'C下1分鐘，45。C下45秒，并在72。C下l分鐘的處理(重復(fù)35次)，然后在72。C下處理5分鐘(一次)。然后，將5pl按此制備的反應(yīng)溶液與DNA大小標(biāo)準標(biāo)記應(yīng)用于2%的瓊脂糖凝膠，然后進行電泳。此處，該電泳凝膠以0.00005%的溴化乙錠溶液染色。在凝膠中各條道上出現(xiàn)的條帶是否有效可通過UV確認。表3引物名稱堿基序列(5'-3')正向GATGGTGATATGGTAGATACAGGATTTCy5-反向承Cy5-CCTAGTGGCTCTATGGTAACCTCTGACGC*0丫-5是一種具有熒光活性的化合物的商品名，銷售商為美國的TelechemCo。[134]B)應(yīng)用熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物并將其與固定在玻璃纖維上的探針DNA進行雜交，然后通過觀察熒光進行分析的方法30[137]在圖4所示的探針DNA固定中使用了Biodot分配器(型號XYZ3050,美國)。將7-30pmol/nl的具有9個連續(xù)鳥嘌呤堿基的探針DNAs(包括表4列舉的探針1，探針2,探針3，探針4,HC(雜交對照))溶解于BMT調(diào)制溶液(具有IOOmM銨離子的溶液)中以制備固定溶液。^使用分配噴嘴以20mm/sec(0.7ul/Cm)的速率分配所述固定》容液，并應(yīng)用于BiomatrixTechnologyCo7厶司生產(chǎn)的》務(wù)飾玻璃纖維上。該探針以厚度為0.2-3.0mm的線性帶的形式進行應(yīng)用，并自發(fā)固定。該固定在室溫下進行約124小時。然后，為了封閉未固定低聚-DNAs的位置，洗滌該玻璃纖維，然后浸入250ml的BMT封閉溶液(4xSSC;包含l。/o酪蛋白和0.50/。聚乙二醇)1030分鐘，然后在40-50。C的孵箱中干燥30分鐘至4小時以制備圖10所示的條帶。表4探針名稱堿基序列(5'-3')描述探針-1GGGGGGGGGTCTGTAGCTACTAGTATTTATGTACATACA探針DNA探針-2GGGGGGGGGAGTATATATGTTAACACC探針DNA探針-3GGGGGGGGGGTGTGTATTCTCCCTCT探針DNA探針-4GGGGGGGGGTTCAAATTATTTTCCTACA探針DNAHCGGGGGGGGGTTTACACCTAGTGGCTCTATGGTGTCCTCT雜交對照31同C)應(yīng)用熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物并將其與固定在J皮璃纖維上的4笨針DNA進4于雜交，然后通過熒光分析該材料的方法將熒光標(biāo)記引物或PCT產(chǎn)物與固定在玻璃纖維上的DNA雜交后，為了鑒定特定的基因是否被結(jié)合，可將該玻璃纖維或參照實施例7-B)的方法將實施例2中制備的;皮璃纖維基底上固定揮:針DNAs得到的條帶裝配進入圖10所示形狀的盒子。然后，將該PCR產(chǎn)物在該玻璃纖維上展開以鑒定是否存在特定的基因。為了制備展A》文入1.5ml管中以制備80pl的混合溶液。然后，將4姿此制備的溶液在100。C的水中加熱3分鐘，然后在冰上冷卻3分鐘。然后，將80|il的混合溶液注射進裝配條帶的樣本入口。然后，將該條帶在室溫下(2030。C)放置3-120分鐘，從而使該溶液流動并進行雜交。然后，注入100jil的BMTWa-B-2(4xSSC)溶液，并在5分鐘后分離該條帶。然后將該玻璃纖維(條帶)連接至玻片，并用^f效陣列掃描儀(GSILumonics，美國)定量分4斤熒光強度。實際結(jié)果顯示在圖ll至圖16上方的條帶中。圖11至圖16中間的圖顯示了通過1型BMTHPV條帶讀取器(其用于分析BMT中的條帶)所得的分析結(jié)果。如圖中清晰顯示，對于包含與探針DNAs互補的擴增基因的樣本，在固定了該互補探針DNAs的帶(線)上出現(xiàn)了特異性雜交，在HC區(qū)域也同樣進4亍了雜交，這4吏得鑒定該樣本是否#:分配成為可能。同時，在不同類型探針DNA的位置未出現(xiàn)雜交。即，該圖顯示能夠以高選擇性和低非特異性雜交速率對PCR擴增基因進行基因分型的條帶型芯片已得到開發(fā)和試-驗。[144]本發(fā)明披露了世界上首項修飾玻璃纖維表面，從而可在它上面固定DNA的技術(shù)，所述技術(shù)包括表面修飾玻璃纖維(其表面被式1的氨基杯芳烴衍生物或式2的亞胺杯芳烴衍生物修飾以形成單層)及其制備方法，固定了DNA的修飾玻璃纖維及其制備方法，使用固定了DNA的玻璃纖維制備基因分型條帶的方法等。本發(fā)明在以下方面顯著改善了現(xiàn)有技術(shù)解決了由昂貴掃描儀的使用帶來的成本問題，通過減少復(fù)雜的處理提供了便捷，并通過溶液的均勻擴展實現(xiàn)了重現(xiàn)性。J皮璃纖維具有如下特;f正溶液可在其上面以特定速度擴展，類似于用于快速試劑盒的NC膜。相應(yīng)地，當(dāng)?shù)途?DNA被固定在玻璃纖維的表面上時，包含在以特定的速率移動的溶液中的基因在通過均勻固定的DNAs時以恒速進行雜交，從而能夠制備除加載樣本外無需用戶操作的條帶形式的商品。本發(fā)明可以顯著地提高—測試結(jié)果的重現(xiàn)性，并能提高便捷性。為了實現(xiàn)上述效果，本發(fā)明人開發(fā)了修飾玻璃纖維表面從而可在其上固定DNA的技術(shù)。這樣，本發(fā)明實現(xiàn)了世界上首項通過改善傳統(tǒng)的玻璃片修飾技術(shù)，制備高密度固定了低聚-DNA的玻璃纖維的技術(shù)。此外，本發(fā)明實現(xiàn)了使用該固定了低聚-DNA的玻璃纖維制備基因分型條帶的技術(shù)。參照本發(fā)明制備的該條帶不僅可以解決制備和使用傳統(tǒng)低聚-DNA芯片所遇到的問題(例如測試結(jié)果不可重現(xiàn)，且測試結(jié)果隨使用者而變化)，還可以提供基于玻璃纖維的條帶形式的DNA芯片的制備技術(shù)，從而允許使用不昂貴的分析儀(即，無需使用花費數(shù)萬美元的昂貴分析4義)進行基因分型。即，本發(fā)明的重要之處在于它可以解決使用傳統(tǒng)DNA芯片中遇到的問題，從而允許使用基因分型進行各種診斷。權(quán)利要求1.通過在胺修飾玻璃纖維表面結(jié)合式1的氨基杯芳烴衍生物形成單層進行表面修飾的玻璃纖維[式1]其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R′1，R′2，R′3，R′4，R′5，R′6，R′7和R′8獨立選自組合-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，-OCH3，-Cl，-C6H5，-OH，-OCH2CH3，-Br，-CF3，-OCH2C6H5，-OC6H5，-OC6H4CH3，-OC6H4C(CH3)3，-OC6H4CF3，-OC6H4Cl，-OCOCH3，-NHCOCH3，-CONHCH3，-CN，COOH和-COOR，其中R代表-CH3或-C2H5；Y1，Y2，Y3和Y4獨立選自組合-H，-(CH2)n-CH＝O，-(CH2)n-SH，-(CH2CH2O)m-CH2CH2-CH＝O，-(CH2CH2O)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z和-CO-(CH2)m-1-C6H4-(CH2)c-Z，其中，n＝2～15，m＝1～10，c＝0～10，Z為選自組合-SH，-CHO，-COOH和-NH2的基團，且-C6H4-和C6H5被定義為苯基基團。2.通過在胺《奮飾3皮璃纖維表面結(jié)合式2的亞胺杯芳烴書f生物形成單層進4于表面<奮飾的玻璃纖維[式2]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Rl5R2,R3和R4獨立選自組合-H,-CH3,-C2H5,-C3H7，-OCH3,誦Cl,-C6H5,-OH,-OCH2CH3,-Br,-CF3，-OCH2G6H5，-OG6H5，-OC6H4CH3,-OC6H4C(CH3)3,-OC6H4CF3，-OC6H4Cl，-OCOCH3,-NHCOCH3，-CONHCH3，-CN,COOH和-COOR,其中R代表-CH^-C2H5;Yl5Y2,Y3和Y4獨立選自組合-H,-(CH2)n-CH=0，-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)c畫Z和-CO-(CH2)m隱廣C6H4-(CH2)c-Z，其中，n=2~15,m=l10,c=010,Z為選自纟且合-SH,畫CHO，-COOH和-NKb的基團，且-C6Hr和C6H5被定義為苯基基團。3.修飾玻璃纖維表面的方法，其包括-將連接了胺功能基團的玻璃纖維浸入溶液，該溶液中權(quán)利要求1所述的式1的化合物;故溶解于有才幾溶劑；-以相同的溶劑洗滌該j波璃纖維；并-干燥該玻璃纖維以形成氨基杯芳烴衍生物單層。4.修飾玻璃纖維表面的方法，其包括-將連接了胺功能基團的玻璃纖維浸入溶液，該溶液中權(quán)利要求2所述的式2的化合物^皮溶解于有才幾溶劑；-以相同的、溶劑洗滌該玻璃纖維；并-干燥該玻璃纖維以形成亞胺杯芳經(jīng)書f生物單層。5.如權(quán)利要求l所述的玻璃纖維，其中具有連續(xù)鳥噤呤堿基的低聚DNA^皮固定在氨基杯芳烴衍生物的單層上。6.如權(quán)利要求2所述的玻璃纖維，其中具有連續(xù)鳥"票呤堿基的低聚DNA凈皮固定在亞胺杯芳烴書f生物的單層上。7.制備玻璃纖維的方法，其包括固定溶液；-將該固定溶液分配至以權(quán)利要求l所述的氨基杯芳烴單層表面》務(wù)飾的玻璃纖維；并-將低聚DNA固定在該玻璃纖維表面上。8.制備玻璃纖維的方法，其包括-通過在調(diào)制溶液中溶解具有連續(xù)鳥嘌呤堿基的低聚DNA制備固定溶液；-將該固定溶液分配至以權(quán)利要求2所述的亞胺杯芳烴單層表面修飾的玻璃纖維；并-將低聚DNA固定在該玻璃纖維表面上。9.如4又利要求5所述的玻璃纖維，其中該^f氐聚DNA能夠通過擴展包含了具有擴增核酸的熒光標(biāo)記基因的溶液鑒定具有特定堿基序列的基因。10.如權(quán)利要求6所述的玻璃纖雄，其中該低聚DNA能夠通過擴展包含了具有擴增核酸的熒光標(biāo)記基因的溶液鑒定具有特定石威基序列的基因。11.如權(quán)利要求9所述的玻璃纖維，其中該特定堿基序列為病毒的基因型。12.如權(quán)利要求10所述的玻璃纖維，其中該特定石咸基序列為病毒的基因型。13.能夠鑒定具有特定堿基序列的基因的基因分型方法，其包括-在權(quán)利要求5所述的玻璃纖維上擴展包含了具有擴增核酸的熒光才示"i己基因的溶液；和-通過雜交將具有特定堿基序列的基因與固定在該玻璃纖維表面上的互#卜探針低聚DNA相結(jié)合。14.能夠鑒定具有特定堿基序列的基因的基因分型方法，其包括-在權(quán)利要求6所述的玻璃纖維上擴展包含了具有擴增核酸的焚光標(biāo)記基因的溶液；和-通過雜交將具有特定石威基序列的基因與固定在該玻璃纖維表面上的互外卜探針低聚DNA相結(jié)合。15.如4又利要求13所述的基因分型方法，其中該特定石咸基序列為病毒的基因型。16.如權(quán)利要求14所述的基因分型方法，其中該特定堿基序列為病毒的基因型。17.如4又利要求13所述的基因分型方法，其中該具有特定堿基序列的基因在4。C至60。C的溫度下通過雜交結(jié)合。18.如權(quán)利要求14所述的基因分型方法，其中該具有特定石威基序列的基因在4。C至60。C的溫度下通過雜交結(jié)合。19.用于基因分型的條帶，其包含權(quán)利要求5所述的含有至少一類具有連續(xù)鳥嘌呤堿基的低聚DNA的玻璃纖維，其中在該玻璃纖維上未固定低聚DNA的部分形成樣本入口。20.用于基因分型的條帶，其包含權(quán)利要求6所述的含有至少一類具有連續(xù)鳥嘌呤堿基的低聚DNA的玻璃纖維，其中在該玻璃纖維上未固定低聚DNA的部分形成樣本入口。21.用于基因分型的試劑盒，其包含如權(quán)利要求19所述的快速條帶型的用于基因分型的條帶。22.用于基因分型的試劑盒，其包含如權(quán)利要求20所述的快速條帶型的用于基因分型的條帶。23.能夠鑒定具有特定堿基序列的基因的基因分型方法，其包括-通過如權(quán)利要求19所述的用于基因分型的條帶的樣本入口注射包含了具有擴增核酸的熒光標(biāo)記基因的溶液；畫;)尋該:;容液在該jE皮璃纖維上展開；并-通過雜交將具有特定堿基序列的基因與固定在該玻璃纖維表面上的互4卜探針低聚DNA相結(jié)合。24.能夠鑒定具有特定石咸基序列的基因的基因分型方法，其包括-通過如權(quán)利要求20所述的用于基因分型的條帶的樣本入口注射包含了具有特定堿基序列的熒光標(biāo)記基因的溶液；-將該溶液在該玻璃纖維上展開；并'-通過雜交將具有特定堿基序列的基因與固定在該玻璃纖維表面上的互#卜探針低聚DNA相結(jié)合。25.如權(quán)利要求23所述的基因分型方法，其中該具有特定堿基序列的基因在4。C至60。C的溫度下通過雜交結(jié)合。26.如權(quán)利要求24所述的基因分型方法，其中該具有特定堿基序列的基因在4。C至60。C的溫度下通過雜交結(jié)合。27.如權(quán)利要求13所述的基因分型的方法，其中該方法進一步包括以分光法測量具有特定堿基序列的結(jié)合基因的總量。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過將氨基杯芳烴衍生物或亞胺杯芳烴衍生物結(jié)合至玻璃纖維表面形成單層以制備表面修飾的玻璃纖維的方法，一種通過將具有連續(xù)鳥嘌呤堿基的低聚DNAs固定在根據(jù)所述方法制備的玻璃纖維上以制備固定了低聚DNAs的玻璃纖維的方法，以及一種使用根據(jù)所述方法制備的固定了各種低聚DNAs的玻璃纖維的快速基因型試劑盒的制備方法，通過前述方法支持了各種基因的基因分型。文檔編號C12Q1/00GK101568645SQ200880000302公開日2009年10月28日申請日期2008年3月12日優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日發(fā)明者宋錦秀,金亨燮,金泰善申請人:博美利克斯技術(shù)公司