專(zhuān)利名稱：：具有新型脂肪酸組成的脂肪酸組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本說(shuō)明書(shū)基于2007年7月23日申請(qǐng)的日本專(zhuān)利申請(qǐng)第2007-190680號(hào)主張優(yōu)先權(quán)。本發(fā)明涉及脂肪酸組合物，其是培養(yǎng)通過(guò)含有包含本發(fā)明序列號(hào)1的堿基序列或編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸、或與其具有同等功能的突變體的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的脂肪酸組合物，其特征在于，在所述脂肪酸組合物的脂肪酸組成中，以下i)v)i)油酸含量ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率，以及iii)油酸的含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率iv)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率v)n-6系脂肪酸含量中的至少1項(xiàng)以上均比培養(yǎng)未用所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物高。
背景技術(shù)：
：脂肪酸是構(gòu)成磷脂、三?；视偷戎|(zhì)的重要成分。已報(bào)道含有2個(gè)以上不飽和鍵的多不飽和脂肪酸(PUFA):花生四烯酸、二高-Y-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等具有種種生理活性(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。此多不飽和脂肪酸在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用值得期待，為高效獲得該脂肪酸，開(kāi)發(fā)了培養(yǎng)各種微生物以獲得多不飽和脂肪酸的方法，且還嘗試了用植物生產(chǎn)多不飽和脂肪酸。在這種情況下，已知多不飽和脂肪酸，例如作為三?；视偷荣A藏脂質(zhì)的組成成分，在微生物的菌體內(nèi)或植物種子中積累。此三酰基甘油在生物體內(nèi)以甘油3-磷酸為原始物質(zhì)，從溶血磷脂酸開(kāi)始經(jīng)磷脂酸、二酰基甘油而生成。如上所述，已知在溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid:以下在本說(shuō)明書(shū)中，有時(shí)也記為"LPA"或"l-酰基甘油-3-磷酸"。)?；闪字?phosphatidicacid:以下在本說(shuō)明書(shū)中有時(shí)記為"PA"或"1，2_二酰基-sn-甘油3-磷酸")的反應(yīng)中，溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(以下有時(shí)記為"LPAAT")會(huì)參與反應(yīng)。此LPAAT也作為1-?；视?-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(E.C.2.3.1.51)而已知，到目前為止，已在一些生物中報(bào)道了該基因。作為來(lái)自大腸桿菌(Escherichiacoli)的LPAAT基因，plsC基因已被克隆(非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)，真菌中，來(lái)自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的SLC1基因已被克隆(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。且已從動(dòng)物、植物中進(jìn)行了克隆(專(zhuān)利文獻(xiàn)l)。作為脂質(zhì)生產(chǎn)菌高山被孢霉(Mortierellaalpina)[以下有時(shí)也記為"高山被孢霉(M.alpina)"]的LPAAT基因，已報(bào)道了2種同源基因。(專(zhuān)利文獻(xiàn)2及專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。其中，專(zhuān)利文獻(xiàn)2中記載了由來(lái)自高山被孢霉(M.alpina)、CDS的堿基數(shù)為1254個(gè)、用序列號(hào)16表示的堿基序列組成的基因LPAAT同源基因(LPAAT1)進(jìn)行了克隆。且本文獻(xiàn)中報(bào)道了，使此LPAAT1在酵母中與A6去飽和酶及A6鏈延長(zhǎng)酶共表達(dá)，并在添加特定脂肪酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，與未表達(dá)LPAAT1的菌株相比，大量產(chǎn)生了比添加的脂肪酸鏈長(zhǎng)更長(zhǎng)的脂肪酸、不飽和度高的脂肪酸(專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。專(zhuān)利文獻(xiàn)l國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)指南(pamphlet)W02004/076617號(hào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2006/174376號(hào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)第2006/0094090號(hào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)lLipids,39，1147(2004)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2Mol.Gen.Genet.，232，295-303，1992非專(zhuān)利文獻(xiàn)3J.B.C.，268，22156-22163，1993非專(zhuān)利文獻(xiàn)4BiochemicalSocietyTransactions,28，707-709，2000非專(zhuān)利文獻(xiàn)5J.Bacteriology,180，1425-1430，1998非專(zhuān)利文獻(xiàn)6J.Bacteriology,173，2026-20341991
發(fā)明內(nèi)容但是，到目前為止已報(bào)道的LPAAT基因，即使導(dǎo)入宿主細(xì)胞使其表達(dá)，也由于其底物特異性，而使宿主產(chǎn)生的脂肪酸組合物受到局限。因此，希望鑒定出可產(chǎn)生與以往組成不同的脂肪酸組合物的基因。本發(fā)明的目的在于，提供具有用于制造油脂、食品等時(shí)而有用的脂肪酸組成的脂肪酸組合物。本發(fā)明者為解決上述課題進(jìn)行了銳意研究。首先，分離來(lái)自脂質(zhì)生產(chǎn)菌高山被孢霉(Mortierellaalpina)的LPAAT1-long基因，導(dǎo)入酵母等具有高增殖力的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生脂肪酸組合物，成功地生成了與公知的LPAAT不同的脂肪酸組合物，從而完成了本發(fā)明。及本發(fā)明如下所示。(l)脂肪酸組合物，其是培養(yǎng)通過(guò)含有如下核酸，該核酸包含以下(a)(e)中任一項(xiàng)所述的堿基序列(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其由與序列號(hào)1所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列組成，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(d)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(e)堿基序列，其與由編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的脂肪酸組合物，其特征在于，在所述脂肪酸組8合物的脂肪酸組成中，以下i)V)中的至少1項(xiàng)以上均比培養(yǎng)未用所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物高i)油酸含量ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率、以及iii)油酸含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率iv)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率v)n-6系脂肪酸含量，且本發(fā)明的脂肪酸組合物，也可以是培養(yǎng)通過(guò)含有如下核酸，該核酸包含以下(a)(e)中任一項(xiàng)所述的堿基序列(a)堿基序列，其編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交；(c)堿基序列，其由與序列號(hào)1所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列組成；(d)堿基序歹lj，其編碼與由序列號(hào)2所組成的氨基酸序列有90%以上伺一性的氨基酸序列；(e)堿基序列，其與由編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交；的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的脂肪酸組合物。(2)(1)中所述的脂肪酸組合物，其中，上述核酸包含以下(a)(c)中任一項(xiàng)的堿基序列(a)堿基序列，其由序列號(hào)2中所示的氨基酸序列中110個(gè)的氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成、且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)l所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的9核酸在1XSSC、6(TC的條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其編碼與序列號(hào)2所組成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。(3)(1)中所述的脂肪酸組合物，其中，上述核酸含有以下的(a)或(b)中所述的堿基序列(a)堿基序列，其如序列號(hào)l所示；(b)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。(4)(1)中所述的脂肪酸組合物，其中，n-6系脂肪酸選自亞油酸、Y-亞麻酸、二高-Y-亞麻酸(DGLA)及花生四烯酸中的至少l種脂肪酸。(5)所述脂肪酸組合物的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)通過(guò)含有如下核酸，該核酸包含以下(a)(e)中任一項(xiàng)所述的堿基序列(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其由與序列號(hào)1所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列組成，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(d)堿基序列，其編碼與序列號(hào)2所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(e)堿基序列，其與編碼序列號(hào)2中所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主，從所得到的培養(yǎng)物中提取脂肪酸組合物，該脂肪酸組合物的特征在于，以下i)v)中的至少1項(xiàng)以上均比培養(yǎng)未用所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物高10i)油酸含量ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率，以及iii)油酸的含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率iv)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率v)n-6系脂肪酸含量。(6)(5)中所述的制造方法，其中，n-6系脂肪酸選自亞油酸、Y-亞麻酸、二高-Y-亞麻酸及花生四烯酸中的至少l種脂肪酸。(7)(5)或(6)中所述的制造方法，其中，上述核酸包含以下(a)(c)中任一項(xiàng)的堿基序列(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2中所示的氨基酸序列中110個(gè)的氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在1XSSC、60。C的條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活'性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2所組成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。(8)核酸的使用，其為用于制造(1)(4)中任一項(xiàng)所述的脂肪酸組合物的、包含以下(a)(e)中任一項(xiàng)所述的堿基序列的核酸的使用(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其由與序列號(hào)1所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列組成，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(d)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(e)堿基序列，其與由編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。(9)(8)中所述的使用，其中，上述核酸包含以下(a)(c)中任一項(xiàng)的堿基序列(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中110個(gè)的氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在1XSSC、60。C的條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2所組成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)(10)食品，其含有(1)(4)中任一項(xiàng)所述的脂肪酸組合物。本發(fā)明的LPAATl-long與公知的LPAATl的底物特異性不同，可在宿主中產(chǎn)生與公知LPAAT1表達(dá)宿主后所產(chǎn)生的脂肪酸組合物在組成上不同的脂肪酸組合物。由此可提供具有所期望特性、效果的脂質(zhì)，所以，可有效適用于食品、化妝料、醫(yī)藥品、肥皂等。本發(fā)明的LPAAT1-long表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)的花生四烯酸含有率，比本發(fā)明的LPAAT1-long未表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)的花生四烯酸含有率高，所以，可期待從該細(xì)胞的培養(yǎng)物中得到的脂肪酸組合物在營(yíng)養(yǎng)學(xué)上具有更高的效果，因而優(yōu)選。此外，因本發(fā)明的LPAAT可提高脂肪酸、儲(chǔ)存脂質(zhì)的生產(chǎn)能力，所以，可作為提高微生物、植物中多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)能力的酶而優(yōu)選。圖1表示對(duì)本發(fā)明的LPAAT1-long及LPAAT1-short以及LPAAT1的CDS12堿基序列的比較。圖2表示對(duì)本發(fā)明的LPAATl-long及LPAAH-short以及LPAATl的CDS氨基酸序列的比較。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及新型脂肪酸組合物、該脂肪酸組合物的制造方法、含有該脂肪酸組合物的食品。以下，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明是利用以產(chǎn)生上述新型脂肪酸組合物為特征的、來(lái)自被孢霉屬(Mortierella)的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，具體地說(shuō)，利用發(fā)明者分離的序列號(hào)1所示的LPMTl-long的核酸等。且溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶是催化溶血磷脂酸?；闪字岬姆磻?yīng)的酶。且本說(shuō)明書(shū)中，"LPAATl-long""LPAATl-short"，不僅代表菌株、代表基因、代表蛋白質(zhì)，有時(shí)還代表將上述LPAATl-long基因、LPAATl-short基因插入表達(dá)載體，培養(yǎng)將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到適當(dāng)宿主中的轉(zhuǎn)化體而得到的菌體。溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)1的同源物與本發(fā)明的LPAATl-long相關(guān)的序列，可例舉為表示LPAATl-long的0RF區(qū)域的序列的序列號(hào)l、LPAATl-long的氨基酸序列的序列號(hào)2、LPAATl-long的cDNA堿基序列的序列號(hào)3、表示其CDS區(qū)域的序列的序列號(hào)4。其中，序列號(hào)1相當(dāng)于序列號(hào)3的第1151557位的堿基序列。且除LPAATl-long以夕卜，本發(fā)明的發(fā)明者還分離了相當(dāng)于LPAATl-long的基因堿基序列全長(zhǎng)的86.8%及氨基酸序列全長(zhǎng)的86.7%的LPAATl基因(以下有時(shí)也稱為L(zhǎng)PAATl-short)。與LPAATl-short有關(guān)的序列，可例舉為表示LPAATl-short的0RF區(qū)序列的序列號(hào)8、LPAATl-short的氨基酸序列的序列號(hào)10、LPAATl-short的cDNA堿基序列的序列號(hào)9。序列號(hào)9中，第361286位的堿基序列相當(dāng)于序列號(hào)8所示的0RF。LPAATl-long與LPAATl-short的關(guān)系如以下表l所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>即本發(fā)明的LPAATl-long的ORF堿基序列中，5'末端缺失的堿基序列相當(dāng)于LPAATl-short。詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明的LPAATl-long的0RF堿基序列(序列號(hào)1)的1443個(gè)堿基中，相當(dāng)于全體的86.8%的第193第1443位堿基區(qū)的堿基相當(dāng)于LPAATl-short的0RF堿基序列(序列號(hào)8)。也就是說(shuō)，LPAATl-long是與LPAATl-short相比在5'區(qū)域長(zhǎng)192個(gè)堿基的序列。且對(duì)于氨基酸序列，本發(fā)明的LPAATl-long的氨基酸序列(序列號(hào)2)的481個(gè)殘基中，相當(dāng)于全體的86.7%的第65481位區(qū)域的殘基，相當(dāng)于LPAATl-short的氨基酸序列(序列號(hào)8)。也就是說(shuō)，LPAATl-long是與LPAATl-short相比在N末端長(zhǎng)64個(gè)氨基酸殘基(序列號(hào)中的氨基酸殘基164)的序列。且作為來(lái)自高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT，有上述專(zhuān)利文獻(xiàn)2中公開(kāi)的公知的LPAAT(以下為L(zhǎng)PAAT1)。此LPAATl的0RF堿基數(shù)為1251個(gè)堿基，與LPAATl-short的0RF堿基數(shù)一致，0RF間堿基序列的同一性也高為89%，所以認(rèn)為L(zhǎng)PAATl-short是與LPAATl同種的等位基因。此LPAATl-long、LPAATl-short及LPAATl的堿基序列的比對(duì)如圖1所示，氨基酸序列的比對(duì)如圖2所示(圖1及圖2)。因此，發(fā)明者在探討本發(fā)明的LPAAH-long的活性時(shí)，作為比較例，將LPAATl-short作為公知的LPAATl的模型使用。具體地說(shuō)，使LPAATl-long及LPAATl-short在酵母中表達(dá)，比較其脂肪酸組合物的脂肪酸組成。其結(jié)果，如以下詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的LPAATl-long基因表達(dá)的宿主所產(chǎn)生的脂肪酸組合物的脂肪酸的組成，與LPAAT1-short表達(dá)的宿主所產(chǎn)生的脂肪酸組合物的脂肪酸的組成完全不同。也就是說(shuō)，說(shuō)明本發(fā)明的LPAATl-long可產(chǎn)生與公知的LPAAT1所產(chǎn)生的脂肪酸組合物的脂肪酸組成完全不同的脂肪酸組合物。具體地說(shuō)，本發(fā)明的脂肪酸組合物的特征之一，可為花生四烯酸含有率高。花生四烯酸是用化學(xué)式C2。H3202表示、分子量為304.47的物質(zhì)，是由含有4個(gè)雙鍵的20個(gè)碳原子的碳鏈組成的羧酸(〔20:4(n-6)))，被分類(lèi)為(n-6)系。花生四烯酸作為動(dòng)物細(xì)胞膜中重要的磷脂質(zhì)(特別是磷脂酰乙醇胺'磷脂酰膽堿-磷脂酰肌醇)存在，大量存在于腦中。且花生四烯酸為通過(guò)花生四烯酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)生成的前列腺素"血栓素'白三烯等一系列的類(lèi)花生酸的起始物質(zhì)，在細(xì)胞間的信號(hào)傳遞中作為第二信使也很重要。另一方面，花生四烯酸是動(dòng)物以亞油酸為原料在體內(nèi)合成的。但是，由于動(dòng)物的種或年齡等不同、或者因此功能不充分而不能生產(chǎn)必需的量、或者完全沒(méi)有生產(chǎn)功能，所以，必須從食物中攝取花生四烯酸，可以說(shuō)花生四烯酸是必須脂肪酸。本發(fā)明的脂肪酸組合物中的花生四烯酸含有率，例如可如下測(cè)定。即將本發(fā)明的LPAAT1-long的質(zhì)粒，例如通過(guò)實(shí)施例8及9中所述的方法插入到pDuraSC、pDura5MCS等的載體中，轉(zhuǎn)化到高山被孢霉(M.alpina)株，使得到的轉(zhuǎn)化體表達(dá)，使用根據(jù)實(shí)施例10中所述的培養(yǎng)方法等得到的培養(yǎng)菌體，測(cè)定菌體內(nèi)的脂肪酸組成、花生四烯酸含量等的方法?；ㄉ南┧岷康鹊姆治龇椒ǎ?，是將所得到的培養(yǎng)菌體的脂肪酸通過(guò)鹽酸甲醇法衍生為脂肪酸甲酯后，用己垸提取，蒸餾除去己垸后，用氣相色譜法進(jìn)行分析的方法。由此表明，使本發(fā)明的LPAAT1-long轉(zhuǎn)化到高山被孢霉(M.alpina)后，菌體內(nèi)脂肪酸中的花生四烯酸含有率高。如此，因花生四烯酸含有率高的本發(fā)明的脂肪酸組合物可有助于高效攝取花生四烯酸，所以優(yōu)選。因此，本發(fā)明的LPAAT1-long具有與公知的LPAAT1完全不同的活性。之所以能得到此種新型活性，其根據(jù)之一可例舉為本發(fā)明的LPAATl-long與公知的LPAAT1的基因/蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同。因此，具有與本發(fā)明的LPAATl-long極為接近的堿基序列/氨基酸序列、且具有同樣功能的突變體也包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，包含以下內(nèi)容i)與本發(fā)明的特定的LPAATl-long堿基序列/氨基酸序列有90%左右(堿基數(shù)為144個(gè)左右，氨基酸殘基數(shù)為48個(gè)左右；也包含這些堿基/殘基發(fā)生缺失、取代或附加的突變體)同一性的范圍內(nèi)的堿基序列/氨基酸序列；及ii)與本發(fā)明的LPAAT1-long的堿基序列/氨基酸序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的堿基序列/氨基酸序列。詳細(xì)內(nèi)容如以下"編碼本發(fā)明的溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶的核酸"的項(xiàng)目中所記載。編碼本發(fā)明的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)的核酸本發(fā)明涉及具有新型脂肪酸組成的脂肪酸組合物、其制造方法等，該脂肪酸組合物為培養(yǎng)通過(guò)含有包含序列號(hào)1(LPAATl-long)等的堿基序列的核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到。因此，首先對(duì)用于制造上述脂肪酸組合物的核酸加以說(shuō)明。如上所述，本發(fā)明的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)中包含LPAATl-long。與本發(fā)明的LPAAT1-long有關(guān)的序列在"溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)1的同源物"的項(xiàng)目中已加以說(shuō)明，可例舉為表示LPAAT1-long的0RF區(qū)域序列的序列號(hào)1、表示LPAATl-long的氨基酸序列的序列號(hào)2、表示LPAATl-long的cDNA堿基序列的序列號(hào)3、表示其CDS區(qū)域的序列的序列號(hào)4。本發(fā)明的核酸，除單鏈及雙鏈的DNA外，還包含其RNA互補(bǔ)體，可來(lái)自天然，也可人工制備。DNA中，例如可例舉為基因組DNA、與上述基因組DNA對(duì)應(yīng)的cDNA、化學(xué)合成的DNA、通過(guò)PCR擴(kuò)增的DNA及這些的組合、DNA和RNA的雜交體，但不限于此。本發(fā)明的核酸的優(yōu)選方式，可例舉為(a)序列號(hào)1所示的堿基序列，(b)，編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的堿基序列等。為獲得上述堿基序列，也可從具有LPAAT活性的生物的EST、基因組DNA的堿基序列數(shù)據(jù)中檢索到編碼與已知的具有LPAAT活性的蛋白質(zhì)同一性高的蛋白質(zhì)的堿基序列。具有LPAAT活性的生物，優(yōu)選脂質(zhì)生產(chǎn)菌，脂質(zhì)生產(chǎn)菌可為16高山被孢霉(M.alpina)，但不限于此。進(jìn)行EST分析時(shí)，首先構(gòu)建cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，可參照《MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded.》[ColdSpringHarborPress(2001)]。且可使用市售的cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。適用于本發(fā)明的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建方法，例如可例舉為如下方法。即將脂質(zhì)生產(chǎn)菌高山被孢霉(M.alpina)的適合的菌株接種于適合的培養(yǎng)基中，進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)。適于此預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，例如、培養(yǎng)基組成可例舉為1.8%葡萄糖、1%酵母膏、pH6.0，培養(yǎng)時(shí)間為3天，培養(yǎng)溫度為28'C的條件。而后，將預(yù)培養(yǎng)物用適合的條件進(jìn)行本培養(yǎng)。適于本培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成，例如可例舉為1.8%葡萄糖、1%大豆粉、0.1%橄欖油、0.01%Adecanol、0.3%KH2P04、0.l%Na2S04、0.05%CaCl"2H20、0.05%MgCl2.6H20、pH6.0。適于本培養(yǎng)的培養(yǎng)條件，例如可例舉為300rpm、lvvm、26'C下通氣攪拌培養(yǎng)8天的條件。培養(yǎng)期間可添加適量的葡萄糖。本培養(yǎng)中適時(shí)采集培養(yǎng)物，從中回收菌體，制備總RNA。總RNA的制備中，可使用鹽酸胍/CsCl法等公知的方法?？蓮乃玫降目俁NA中使用市售的試劑盒純化poly(A)+RNA。且還可使用市售的試劑盒構(gòu)建cDNA文庫(kù)。而后，將構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的任意克隆的堿基序列，使用為可確定載體上插入部分的堿基序列而設(shè)計(jì)的引物來(lái)確定，可得到EST。例如，用ZAP-cDNAGigapackIIIGoldCloningKit(STRATAGENE)構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)，可進(jìn)行定向克隆。本發(fā)明還包括如下核酸，其與包含上述序列號(hào)1所示的堿基序列(有時(shí)記為"本發(fā)明的堿基序列")、以及編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列(有時(shí)記為"本發(fā)明的氨基酸序列")組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸具有同等功能。"具有同等功能"，是指本發(fā)明的堿基序列編碼的蛋白質(zhì)及由本發(fā)明的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有LPAAT活性之意。此外，不僅具有此LPAAT活性，還包括具有如下活性的蛋白質(zhì)(以下，有時(shí)也記為"具有可形成本發(fā)明的LPAAT脂肪酸組成活性的蛋白質(zhì)")，該活性為可形成在本發(fā)明的堿基序列編碼的蛋白質(zhì)、或由本發(fā)明的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主的脂肪酸組成中，以下的i)油酸含量ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率，以及iii)油酸的含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率iv〉硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率v)n-6系脂肪酸含量中的至少l項(xiàng)以上與未表達(dá)上述蛋白質(zhì)的宿主的脂肪酸組成相比呈現(xiàn)高值的脂肪酸組成的活性。具體地說(shuō)，為包含編碼具有如下活性的蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸，該活十生為可形成以下數(shù)值的脂肪酸組成的活性將上述本發(fā)明的堿基序列等插入表達(dá)載體pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)，用其以酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EH13-15株(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體后回收的菌體，用以下實(shí)施例6中所述的方法進(jìn)行脂肪酸分析時(shí)，上述本發(fā)明的LPAAT的脂肪酸組成的數(shù)值具體為i)油酸含量為47%以上；ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率為6.7以上，及/或iii)油酸的含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率為10以上iv)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率為1.1以上。進(jìn)一步優(yōu)選，包含本發(fā)明的堿基序列等是編碼具有LPAAT活性及可形成上述本發(fā)明的LPAAT脂肪酸組成的活性的蛋白質(zhì)的堿基序列的禾亥對(duì)于本發(fā)明的LPAATl-long與LPAATl-short，用實(shí)施例6中所述的方法進(jìn)行脂肪酸分析時(shí)的結(jié)果，如以下表3所示，本發(fā)明的LPAATl-long的油酸含量為54%左右，比為42%左右的LPAATl-short高。此外，本發(fā)明的棕櫚酸含量為7.6%左右，與對(duì)照等同，比為13.5%左右的LPAATl-short低。且得到了如下結(jié)果，本發(fā)明的LPAATl-long的油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率比LPAATl-short高1.8倍2.5倍，且本發(fā)明的LPAATl-long的油酸含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率比LPAATl-short高1.5倍1.8倍左右。且在上述中，還包含具有如下活性的蛋白質(zhì)(以下有時(shí)與上述同樣記為"具有可形成本發(fā)明的LPAAT脂肪酸組成的活性的蛋白質(zhì)")，該活性為可形成在本發(fā)明的1E基序列編碼的蛋白質(zhì)、或由本發(fā)明的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主的脂肪酸組成中，n-6系脂肪酸含量與未表達(dá)上述蛋白質(zhì)的宿主的脂肪酸組成相比呈現(xiàn)高值的脂肪酸組成的活性。n-6系脂肪酸，可例舉為亞油酸、Y-亞麻酸、二高-Y-亞麻酸、花生四烯酸、7，10，13，16-二十二碳四烯酸及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸，但不限于此。例如，為高山被孢霉(M.alpina)時(shí)，優(yōu)選為亞油酸、Y-亞麻酸、二高-Y-亞麻酸及花生四烯酸。具體地說(shuō)，為包含編碼如下蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸，該蛋白質(zhì)為將上述本發(fā)明的堿基序列等插入表達(dá)載體pYE22m等，將其產(chǎn)物以為了能生產(chǎn)花生四烯酸而育種的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、被孢霉屬(Mo:rtierella)等可生產(chǎn)花生四烯酸的酵母、絲狀菌等的真菌為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將培養(yǎng)所得到的轉(zhuǎn)化體然后再回收的菌體用以下實(shí)施例710中所述的方法進(jìn)行脂肪酸分析時(shí)，上述本發(fā)明的LPAAT1-long的n-6系脂肪酸如以下表5所示為高含量的蛋白質(zhì)。使本發(fā)明的LPAAT1-long和LPAAT1-short在為了能生產(chǎn)花生四烯酸而育種的酵母中表達(dá)時(shí)，用實(shí)施例7中所述的方法進(jìn)行脂肪酸分析的結(jié)果如以下表4所示。即本發(fā)明的LPAAT1-long的亞油酸含量比對(duì)照、LPAAT1-short高。且本發(fā)明的LPAAT1-long的Y-亞麻酸含量也比對(duì)照、LPAAT1-short高。并且本發(fā)明的LPAAT1-long的DGLA含量也比對(duì)照高，與LPAAT1-short為同等程度。而且，本發(fā)明的LPAATl-long的花生四烯酸含量也比對(duì)照、LPAAT1-short高。此外，使本發(fā)明的LPAATl-long和LPAAT1-short在高山被孢霉(M.alpina)中表達(dá)時(shí)，用實(shí)施例810中所述的方法進(jìn)行脂肪酸分析的結(jié)果如以下表5戶萬(wàn)示。即本發(fā)明的LPAAT1-long的花生四烯酸、DGLA的含量也比對(duì)照、LPAAT1-short高。因此，本發(fā)明的LPAAT1-long如以下說(shuō)明，可在宿主中產(chǎn)生與其他LPAAT表達(dá)的宿主所產(chǎn)生的脂肪酸組合物的組成完全不同的脂肪酸組合物，具有以往技術(shù)所不可預(yù)期的全新功能。19此種與本發(fā)明的核酸具有同等功能的核酸，可例舉為包含以下(a)(e)中任一項(xiàng)所述的堿基序列的核酸[以下，有時(shí)也記為"(具有同等功能)的本發(fā)明的突變體"]。且以下所例舉的堿基序列的記載中，"本發(fā)明的上述活性"，是指上述的"LPAAT活性及/或可形成上述本發(fā)明的LPAAT的脂肪酸組成的、活性"。(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的核酸中所包含的堿基序列，是包含編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中l(wèi)個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。具體地說(shuō)，如"溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)1的同源物"的項(xiàng)目中戶萬(wàn)說(shuō)明的，(i)序列號(hào)2所示的氨基酸序列中，1個(gè)或多個(gè)[優(yōu)選1個(gè)或多個(gè)(例如l48個(gè)、132個(gè)、124個(gè)、120個(gè)、116個(gè)、112個(gè)、110個(gè)、18個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選14個(gè))]氨基酸發(fā)生缺失的氨基酸序列，(ii)序列號(hào)2所示的氨基酸序列中，l個(gè)或多個(gè)[優(yōu)選l個(gè)或數(shù)個(gè)(例如148個(gè)、132個(gè)、124個(gè)、120個(gè)、116個(gè)、112個(gè)、110個(gè)、l8個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選14個(gè))]氨基酸用其他氨基酸取代后的氨基酸序列，(iii)序列號(hào)2所示的氨基酸序列中，附加了1個(gè)或多個(gè)[優(yōu)選1個(gè)或數(shù)個(gè)(例如148個(gè)、132個(gè)、124個(gè)、120個(gè)、116個(gè)、112個(gè)、l10個(gè)、18個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選14個(gè))]其他氨基酸后的氨基酸序列，或(iv)編碼由組合上述(i)(iii)的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，且具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。上述中，取代優(yōu)選為保守性取代。保守性取代，是指將特定的氨基酸殘基用具有類(lèi)似的物理化學(xué)特征的殘基取代，但只要不實(shí)質(zhì)性改變與原本序列的結(jié)構(gòu)有關(guān)的特征，可為任何取代，例如，只要取代氨基酸不破壞原本序列中存在的螺旋結(jié)構(gòu)，或不破壞賦予原本序列特征的其他種類(lèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可為任何取代。保守性取代，一般可用生物學(xué)體系合成、化學(xué)肽合成導(dǎo)入，但優(yōu)選通過(guò)化學(xué)肽合成來(lái)進(jìn)行。此時(shí)，取代基中可包含非天然的氨基酸殘基，也可包含肽模仿物、氨基酸序列中未被取代的區(qū)域發(fā)生倒位的倒位型或同區(qū)域發(fā)生反轉(zhuǎn)的反轉(zhuǎn)型。以下，將氨基酸殘基按可取代的殘基分類(lèi)舉例，但可取代的氨基酸殘基不限于以下記載的殘基A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸及環(huán)己基丙氨B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸、2-氨基己二酸及2-氨基辛二酸；C組天冬酰胺及谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2，4-二氨基丁酸及2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸及4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸及高絲氨酸；G組苯丙氨酸及酪氨酸。為非保守性取代時(shí)，上述種類(lèi)中的某一種成分可與其他種類(lèi)的成分互換，此時(shí)，為保持本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，優(yōu)選參考氨基酸的親水指數(shù)(親水性氨基酸指數(shù))[Kyte等，J.Mol.Biol.，157:105-131(1982)]。此外，為非保守性取代時(shí)，可根據(jù)親水性進(jìn)行氨基酸的取代。本說(shuō)明書(shū)及附圖中，堿基、氨基酸及其縮寫(xiě)，可根據(jù)IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature、或例如Immunology—ASynthesis[第2版，E.S.Golub及D.R.Gren監(jiān)修，SinauerAssociates，Sunderland,Massachusetts(1991)]等中記載的本領(lǐng)域慣用的縮寫(xiě)。此外，氨基酸有光學(xué)異構(gòu)體時(shí)，在無(wú)特別說(shuō)明的情況下，均表示L體。D-氨基酸等上述氨基酸的立體異構(gòu)體、a，a-二取代氨基酸等的非天然氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非慣用氨基酸，也可作為構(gòu)成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的要素。且本說(shuō)明書(shū)中使用的蛋白質(zhì)的標(biāo)記法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用法及本領(lǐng)域中常用的*示記法，左方向?yàn)榘被┒朔较?，右方向?yàn)轸然┒朔较?。同樣，在一般情況下不特別提及時(shí)，單鏈多核苷酸序列的左端為5'端，雙鏈多核苷酸序列的左方向?yàn)?'方向。只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，即可設(shè)計(jì)、制備本i兌明書(shū)中所述的蛋白質(zhì)的適當(dāng)?shù)耐蛔凅w。例如，通過(guò)將對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性并不太重要的區(qū)域作為靶區(qū)，可鑒定不損壞本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活十生而使其結(jié)構(gòu)改變的蛋白質(zhì)分子中適當(dāng)?shù)膮^(qū)域。且也可鑒定在類(lèi)似的蛋白質(zhì)間保守的分子的殘基及區(qū)域。并且，在認(rèn)為對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性或結(jié)構(gòu)重要的區(qū)域中，在不損壞其生物學(xué)活性且不給予蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)以不良影響的情況下，也可導(dǎo)入保守性氨基酸取代。特別是本發(fā)明中，在本發(fā)明的LPAAT氨基酸序列中的第208213殘基中存在保守基序"HXXXXD(HX4D)"。本基序是甘油磷脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶(Glycerolipidacyltransferase)中必須的基序(J.Bacteriology,180，1425-1430，1998)，對(duì)于本發(fā)明的LPAAT也是重要的基序。因此，本發(fā)明的突變體只要保留上述保守基序，且不損傷本發(fā)明的上述、活性，可以是任何突變體。且在上述保守基序中，X可以是任何氨基酸殘基。只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，均可鑒定對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性或結(jié)構(gòu)重要、與該蛋白質(zhì)的肽類(lèi)似的肽的殘基，比較此2種肽的氨基酸殘基，預(yù)測(cè)出與本發(fā)明蛋白質(zhì)類(lèi)似的蛋白質(zhì)的哪個(gè)殘基是與對(duì)生物學(xué)活性或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，即可進(jìn)行所謂的結(jié)構(gòu)-功能研究。并且，通過(guò)選擇與上述預(yù)測(cè)的氨基酸殘基的化學(xué)性質(zhì)類(lèi)似的氨基酸取代，可選擇保持了本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的突變體。且如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，即可對(duì)本蛋白質(zhì)突變體的三級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸序列進(jìn)行分析。進(jìn)而從所得到的分析結(jié)果來(lái)看，也可預(yù)測(cè)與蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)的氨基酸殘基的比對(duì)。預(yù)測(cè)為蛋白質(zhì)表面上存在的氨基酸殘基，具有參與和其它分子的重要的相互作用的可能性，因此，如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，即可基于上述分析結(jié)果，制備不使預(yù)測(cè)為在此種蛋白質(zhì)表面上存在的氨基酸殘基發(fā)生改變的突變體。進(jìn)而如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，即可制備構(gòu)成本發(fā)明蛋白質(zhì)的各個(gè)氨基酸殘基中，只有一個(gè)氨基酸殘基發(fā)生取代的突變體。通過(guò)公知的檢測(cè)方法篩選此種突變體，即可各個(gè)收集突變體的信息。由此，通過(guò)對(duì)某種特定的氨基酸殘基發(fā)生取代的突變體的生物學(xué)活性與本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性相比降低時(shí)、不表現(xiàn)此種生物學(xué)活性時(shí)、或產(chǎn)生抑制本蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的不適當(dāng)活性時(shí)進(jìn)行比較，可評(píng)價(jià)構(gòu)成本發(fā)明蛋白質(zhì)的種種氨基酸殘基的有用性。此外，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，可根據(jù)此種從日常實(shí)驗(yàn)中收集的信息，單獨(dú)或與其他突變組合，從而容易地分析作為本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體的不期望的氨基酸取代。如上所述，由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，可通過(guò)《MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded.》[ColdSpringHarborPress(2001)]、《CurrentProtocolsinMolecularBiology》[JohnWiley&Sons(1987-1997)、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488—92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85:2763-6]等中所述的定點(diǎn)誘變法制備。發(fā)生了此種氨基酸的缺失、取代或附加等突變的突變體的制備，例如可通過(guò)Kunkel法、Gappedduplex法等公知手法，使用利用了定點(diǎn)誘變法的突變引入用試劑盒、例如QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene公司制)、GeneTailorSite-DirectedMutagenesisSystem(Invitrogen公司制)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm等-TAKARABI0公司制)等進(jìn)行。且作為在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，既保持了其活性同時(shí)又引入1個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、或附加的方法，可例舉為除上述定點(diǎn)誘變以外，還可為用誘變劑處理基因的方法、及使基因選擇性斷裂將選擇的核苷酸除去、取代或附加后進(jìn)行連接的方法。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選由序列號(hào)2中110個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明蛋白質(zhì)中的氨基酸突變或修飾的數(shù)量、或突變或修飾的位點(diǎn)，只要保持LPAAT活性、或本發(fā)明的可形成LPAAT的脂肪酸組成的活性，無(wú)限制。本發(fā)明的LPAAT活性、或本發(fā)明的可形成LPAAT的脂肪酸組成的活性，可使用公知的方法測(cè)定。例如，可參照以下的文獻(xiàn)J.B.C.，265，17215-17221，1990。例如，本發(fā)明的"LPAAT活性"可如下測(cè)定。從使本發(fā)明的LPAAT表達(dá)的酵母中，通過(guò)J.Bacteriology,173，2026-2034(1991)中所述的方法等制備微粒體組分。而后可在反應(yīng)液的0.44mMLPA、0.36mM?；?CoA、0.5mMDTT、lmg/mlBSA、2mMMgCl2、50raMTris-HCl(pH7.5)中添加上述微粒體組分，使其在28。C下反應(yīng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，添加氯仿甲醇使反應(yīng)停止后，進(jìn)行脂質(zhì)的提取，將所得到的脂質(zhì)通過(guò)薄層色譜法等分離，從而對(duì)生成的PA量進(jìn)行定量。此外，本發(fā)明的"可形成LPAAT的脂肪酸組成的活性"例如可如下測(cè)定。在通過(guò)本發(fā)明的脂肪酸組合物的制造方法得到的冷凍干燥的菌體中，添加以適當(dāng)比率調(diào)整的氯仿甲醇并攪拌后，加熱處理適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。進(jìn)一步通過(guò)離心分離分離菌體，回收溶劑，多次重復(fù)此操作。然后使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ怪|(zhì)干固后，添加氯仿等溶劑使脂質(zhì)溶解。適量分取此樣品，通過(guò)鹽酸甲醇法將菌體的脂肪酸衍生為甲酯后，用己烷提取，蒸餾除去己烷后，用氣相色譜法進(jìn)行分析。(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)。.本發(fā)明的核酸中所含有的堿基序列，如"溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)l的同源物"的項(xiàng)目中所說(shuō)明，包含與由序列號(hào)l所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。序列號(hào)1及有關(guān)本發(fā)明的上述活性如上所述。上述堿基序列，用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，使用適當(dāng)?shù)钠沃苽涮綘渴?，使用此探針通過(guò)菌落雜交法、噬菌斑雜交、Southern印跡法等公知的雜交去，可從cDNA文庫(kù)及基因組文庫(kù)等中獲得。對(duì)于雜交法的詳細(xì)步驟，可參照《MolecularCloning，ALaboratoryManual3rded.》[ColdSpringHarborPress(2001);特別是Section6-7]、《CurrentProtocolsinMolecularBiology》[JohnWiley&Sons(1987-1997);特另U是Section6.3—6.4]、《DNACloning1:CoreTechniques,APracticalApproach242nded.》[OxfordUniversity(1995);雜交條件特別參照Section2.IO]等。雜交條件的強(qiáng)度，主要取決于雜交條件、更優(yōu)選雜交條件及洗滌條件。高嚴(yán)謹(jǐn)條件(高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件)，例如，雜交條件可例舉為0.1XSSC2XSSC、55T:65。C的條件，更優(yōu)選0.1XSSC1XSSC、6(TC65'C的條件，最優(yōu)選0.2XSSC、63。C的條件。雜交溶液中，例如含有約50%甲酰胺時(shí)，采用比上述溫度低515。C的溫度。洗滌條件，可為O.2XSSC2XSSC、5(TC68'C，更優(yōu)選0.2XSSC、6065。C。雜交及洗滌時(shí)，一般可加入0.05%0.2%，優(yōu)選約0.1%SDS。本發(fā)明中所含有的堿基序列，優(yōu)選為與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在1XSSC、60'C的條件下雜交，且編碼具有LPAAT活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。此外，也可使用探針中未使用放射性物質(zhì)的市售的雜交試劑盒。具體地說(shuō)，可例舉為使用DIG核酸檢測(cè)試劑盒(RocheDiagnostics公司)、ECLdirectlabeling&detectionsystem(A匿sham公司制)進(jìn)行的雜交等。(c)堿基序列，其由與序列號(hào)1所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列組成，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的核酸中所含有的堿基序列，如"溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)1的同源物"的項(xiàng)目所說(shuō)明，包含由與序列號(hào)1中所示的核酸序列有至少90%以上的堿基序列組成，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。本發(fā)明中為包含具有與序列號(hào)1所示的核酸序列有至少90%以上、優(yōu)選93%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%(例如95%、更優(yōu)選96%、進(jìn)一步為97%、98%或99%)以上同一性的堿基序列的核酸，且可為編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。2個(gè)核酸序列的同一性％，可通過(guò)視覺(jué)檢査、數(shù)學(xué)計(jì)算來(lái)確定，但優(yōu)選使用計(jì)算機(jī)程序、通過(guò)比較2組核酸的序列信息來(lái)確定。序列比較計(jì)算機(jī)程序，例如可利用美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館的網(wǎng)站http:〃雨，ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html的BLASTN程序(Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10):2.2.7版或WU-BLAST2.0算法等。關(guān)于而-BLAST2.0的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)的設(shè)定，可使用以下網(wǎng)站http:〃blast.wustl.edu中所記載的內(nèi)容。(d)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的核酸中所含有的堿基序列，如"溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)1的同源物"的項(xiàng)目中所說(shuō)明，包含編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。本發(fā)明具體地說(shuō)，可例舉編碼與序列號(hào)2所示的氨基酸序列有至少90%以上、優(yōu)選93%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%(例如95%、更優(yōu)選96%、進(jìn)一步為97%、98%或99%)以上同一性的氨基酸序列等，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。本發(fā)明的核酸中所含有的堿基序列，優(yōu)選為編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。進(jìn)一步優(yōu)選為編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。2段氨基酸序列的同一性的百分率，可通過(guò)視覺(jué)檢查、數(shù)學(xué)計(jì)算確定。it匕夕卜，也可使用計(jì)算機(jī)程序來(lái)確定同一性百分率。此種計(jì)算機(jī)程序，例如可例舉為BLAST、FASTA[Altschul等、J.Mol.Biol.，215:403-410(1990)]、及ClustalW等。特別是通過(guò)BLAST程序的同一性檢索的各種條件(參數(shù))，如Altschul等(Nucl.Acids,Res.，25，p.3389-3402，1997)中所記載，可從美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)、日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)的網(wǎng)站上公開(kāi)獲得(BLAST指南、Altschul等NCB/NLM/NIHBethesda,MD20894;Altschul等)。且可使用遺傳信息處理軟件GENETYXVer.7(GENETYX)、DINASISPro(日立軟件)、VectorNTI(Infoniax)等的程序來(lái)確定。使多個(gè)氨基酸序列并列的特定的比對(duì)圖，也可顯示序列中特定的短的區(qū)域的匹配，所以，即使使用的序列的全長(zhǎng)序列間無(wú)顯著相關(guān)時(shí)，也可在此種區(qū)域中檢測(cè)出特定的序列同--性非常高的區(qū)域。且BLAST算法可使用BL0SUM62氨基酸打分矩陣，作為選擇參數(shù)可使用如下所示的內(nèi)容(A)包括將具有低組成復(fù)雜性的查詢序列的片段[由Wootton及Federhen的SEG程序(C。卿utersandChemistry,1993)確定；也希望參照Wootton及Federhen，1996《序列數(shù)據(jù)庫(kù)中組成偏向性區(qū)域的分析》(Analysisofcompositionallybiasedregionsinsequencedatabases)MethodsEnzymol.,266:544-71]、或由短周期性的內(nèi)咅口重復(fù)組成的片段[由Claverie及States(ComputersandChemistry,1993)的XNU程序確定)]用于屏蔽的過(guò)濾，及(B)根據(jù)用于報(bào)告對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)序列的一致性的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性閾值、或根據(jù)E-score(Karlin及Altschul，1990)的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，僅偶然發(fā)現(xiàn)的一致性的期望概率；源于某種一致性的統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異比E-score閾值大時(shí)，不報(bào)告此一致性。(e)堿基序列，其與由編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的核酸中所含有的堿基序列，如"溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)l的同源物"的項(xiàng)目中所說(shuō)明，包含與由編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。由序列號(hào)2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)及雜交條件如土所述。本發(fā)明的核酸中所含有的堿基序列，可例舉為與由編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。本發(fā)明的核酸中還包含如下核酸，其包含由序列號(hào)1所組成的堿基序列中1個(gè)或多^"堿基發(fā)生缺失、取代或附加的堿基序列組成，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。具體地說(shuō)，也可使用包含如下堿基序列，且編碼具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸(i)序列號(hào)1所示的堿基序列中1個(gè)或多個(gè)[優(yōu)選1個(gè)或多個(gè)(例如1144個(gè)、196個(gè)、172個(gè)、148個(gè)、130個(gè)、124個(gè)、120個(gè)、115個(gè)、110個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選15個(gè))]堿基發(fā)生缺失的堿基序列，(ii)序列號(hào)1所示的堿基序列中1個(gè)或多個(gè)[優(yōu)選1個(gè)或多個(gè)(例如l144個(gè)、196個(gè)、172個(gè)、148個(gè)、130個(gè)、124個(gè)、120個(gè)、l15個(gè)、110個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選15個(gè))]堿基被其他堿基取代的堿基序列，(iii)序列號(hào)1所示的堿基序列中附加1個(gè)或多個(gè)[優(yōu)選1個(gè)或多個(gè)(例如1144個(gè)、196個(gè)、172個(gè)、148個(gè)、130個(gè)、124個(gè)、120個(gè)、115個(gè)、110個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選15個(gè))]其他堿基的堿基序列，或(iv)組合了上述(i)(iii)的堿基序列。本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選由序列號(hào)1中1數(shù)十個(gè)、更優(yōu)選110個(gè)的堿基發(fā)生缺失、取代或附加的堿基序列組成，且是具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)本發(fā)明的LPMTl-long,包含由序列號(hào)2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)及與上述蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)，可來(lái)自天然，也可人工制備。對(duì)于由序列號(hào)2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，如上所述。"具有同等功能的蛋白質(zhì)"，指如上述"編碼本發(fā)明的溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶的核酸"的項(xiàng)目中說(shuō)明的具有"本發(fā)明的上述活性"的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，與由序列號(hào)2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)，可為以下(a)(e)中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)且具有本發(fā)明的上述活性的蛋百質(zhì)。即(a)蛋白質(zhì)，其由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中l(wèi)個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性；(b)蛋白質(zhì)，其由如下堿基序列編碼，該堿基序列與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(c)蛋白質(zhì)，其由如下堿基序列編碼，該堿基序列由與序列號(hào)1所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列組成，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(d)蛋白質(zhì)，其由與序列號(hào)2所組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列組成、且具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性；及28(e)蛋白質(zhì)，其由如下堿基序列編碼，該堿基序列與由編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。上述中，對(duì)于序列號(hào)2中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列、或與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，如上述"編碼本發(fā)明的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶的核酸"的項(xiàng)目中的說(shuō)明。且上述"具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)"，還包括由包含序列號(hào)1的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)的突變體、或序列號(hào)2所示的氨基酸序列中通過(guò)1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生取代、缺失或附加等的多種修飾而產(chǎn)生突變的蛋白質(zhì)、或氨基酸側(cè)鏈等被修飾的修飾蛋白質(zhì)、與其他蛋白質(zhì)融合的蛋白質(zhì)，且是具有LPAAT活性的蛋白質(zhì)及/或具有可形成本發(fā)明的LPMT脂肪酸組成活性的蛋白質(zhì)。且與由序列號(hào)2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選為與由序列號(hào)2所組成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，且是具有本發(fā)明的上述活性的蛋白質(zhì)。另外，本發(fā)明的LPAAT1-long也可人工制備，此時(shí)可通過(guò)Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化學(xué)合成法制造。也可利用AdvancedChemTech公司制、珀金埃爾默(PerkinElmer)公司制、Pharmacia公司制、ProteinTechnologyInstruments公司制'、Synthecell-Vega'公司制.、PerS印tive公司制、島津制作所制等的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。LPAAT的核酸的克隆本發(fā)明的具有LPAAT1-long的特定序列的核酸及其突變體，例如可通過(guò)使用適合的探針從cDNA文庫(kù)中篩選來(lái)進(jìn)行克隆。且可使用適合的引物通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增，通過(guò)與適合的載體連接來(lái)進(jìn)行克隆。并且也可亞克隆到其他載體中。以下，以使用LPAATl-long的核酸為例進(jìn)行說(shuō)明。例如也可使用pBlue-ScriptTMSK(+)(Stratagene)、pGEM-T(Promega)、pAmp(TM:Gibco-BRL)、p-Direct(Clontech)、pCR2.1-T0P0(Invitrogene)等市售的質(zhì)粒載體。且用PCR反應(yīng)擴(kuò)增時(shí)，引物可使用上述序列號(hào)1所示的堿基序列的任何部分，例如對(duì)于序列號(hào)l，可使用上游側(cè)引物，引物955-1:GGACGTGTCAAGGAAAAGGA(序列號(hào)6)、下游側(cè)引物，引物955-2:TCCTTCAGATGAGCCTCCTG(序列號(hào)7)等。且在從高山被孢霉(M.alpina)菌體中制備的cDNA中，使上述引物及耐熱性DNA聚合酶等起作用而進(jìn)行PCR反應(yīng)。上述方法根據(jù)《MolecularCloning,ALaboratoryManual3rded.》[ColdSpringHarborPress(2001)]等，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員均可容易地進(jìn)行，作為本發(fā)明的PCR反應(yīng)條件，例如可例舉為以下條件變性溫度9095°C退火溫度4060°C延伸溫度6075°C循環(huán)數(shù)IO次以上所得到的PCR產(chǎn)物的純化可使用公知的方法。例如使用GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquickPCRpurificationKits(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GEHealthcareBio-Sciences)等試劑盒的方法、使用DEAE-纖維素濾紙的方法、使用透析管的方法等。使用瓊脂糖凝膠時(shí)，可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，S每堿基序列片段從瓊脂糖凝膠切出，通過(guò)GENECLE緒(Funakoshi)、QIAquickGelextractionKits(QIAGEN)、Freeze&Squeeze法等純化?？寺『蟮暮怂岬膲A基序列，可使用堿基序列測(cè)序儀來(lái)確定。LPAAT表達(dá)用載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化體的制備含有編碼本發(fā)明的LPAAT1-long的核酸及其突變體的重組載體及通過(guò)上述重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體，可如下獲得。以下以使用LPAAT1-long的核酸為例進(jìn)行說(shuō)明。即將具有編碼本發(fā)明的LPAATl-long的核酸的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶酶切。使用的限制性內(nèi)切酶，例如可例舉為EcoRI、Kpnl、BamHI及SalI等，但不限于此。且也可通過(guò)T4聚合酶處理將末端平滑化。將酶切后的堿基序列片段通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化。將此堿基序列片段通過(guò)使用公知的方法整合進(jìn)表達(dá)用載體，可得到LPAATl-long表達(dá)用載體。將此表達(dá)載體導(dǎo)入宿主制備轉(zhuǎn)化體，用于目的蛋白質(zhì)的表達(dá)。此時(shí)，表達(dá)載體及宿主只要可表達(dá)目的蛋白質(zhì)，無(wú)特別限定，例如宿主可例舉真菌、細(xì)菌、植物、動(dòng)物或它們的細(xì)胞等。真菌，可例舉為脂質(zhì)生產(chǎn)菌高山被孢霉(M.alpina)等的絲狀菌、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的酵母等。且細(xì)菌，可例舉大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等。而植物可例舉菜籽、大豆、棉花、紅花、亞麻等的油料植物。脂質(zhì)生產(chǎn)菌例如可使用MYC0TAX0N，Vol.XLIV，No.2，卯.257-265(1992)中記載的菌株，具體地說(shuō)，可例舉為屬于被孢霉屬(Mortierella)的微生物，例如長(zhǎng)孢被孢霉(Mortierellaelongata)IF08570、微小被孢霉(Mortierellaexigua)IF08571、MortierellahygrophilaIFQ5941、高山被包霉(Mortiere11aalpina)IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等屬于被孢霉亞屬(subgenusMortierella)的微生物，或深黃被孢霉(Mortierellaisabellina)CBS194.28、IF06336、IF07824、IF07873、IF07874、IF08286、IF08308、IF07884、Mortiere11ananaIF08190、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)IF05426、IF08186、CBS112.08、CBS212.72、IF07825、IF08184、IF08185、IF08287、葡酒色被孢霉(Mortierellavinacea)CBS236.82等的屬于Micromucor亞屬(subgenusMicromucor)的微生物等。尤其優(yōu)選高山被抱霉(Mortierellaalpina)。以真菌類(lèi)為宿主使用時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明的核酸在宿主中可自主復(fù)制、或者是可插入該菌的染色體上的結(jié)構(gòu)。與此同時(shí)，優(yōu)選是含有啟動(dòng)子、終止子的組成。使用高山被孢霉(M.alpina)為宿主時(shí)，表達(dá)載體，例如可例舉pD4、pDuraSC、pDura5等。啟動(dòng)子，只要可在宿主中表達(dá)，可使用任何啟動(dòng)子，例如可使用histonH4.1基因啟動(dòng)子、GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因啟動(dòng)子、TEF翻譯延伸因子(Translationelongationfactor)基因啟動(dòng)子的來(lái)自高山被包霉(M.alpina)的啟動(dòng)子。向高山被孢霉(M.alpina)等絲狀菌內(nèi)導(dǎo)入重組載體的方法，例如可例舉為電穿孔法、原生質(zhì)球法、基因槍轟擊法及向核內(nèi)DNA直接顯微注射法等。使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型的宿主株時(shí)，通過(guò)選擇在缺少其營(yíng)養(yǎng)素的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁31殖的菌株，可獲得轉(zhuǎn)化株。此外，轉(zhuǎn)化使用抗藥性標(biāo)記基因時(shí)，在包含其藥劑的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可得到具有抗藥性的細(xì)胞菌落。以酵母為宿主使用時(shí)，作為表達(dá)載體，例如可例舉pYE22m等。且也可4吏用pYES(Irwitrogen)、pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表達(dá)用載體。另外，適用于本發(fā)明的宿主可例舉釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EH13-15株(trpl，MATa)等，但不限于此。作為啟動(dòng)子，例如可使用GAPDH啟動(dòng)子、gall啟動(dòng)子、gallO啟動(dòng)子等來(lái)自酵母等的啟動(dòng)子。向酵母內(nèi)導(dǎo)入重組載體的方法，例如可例舉醋酸鋰法、電穿孔法、原生質(zhì)球法、葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體中的多核苷酸(單數(shù)或多數(shù))的包裹、及向核內(nèi)直接顯微注射DNA等。以大腸桿菌等的細(xì)菌為宿主使用時(shí)，作為表達(dá)載體,例如可例舉Pharmacia公司的pGEX、pUC18等。啟動(dòng)子，例如可使用trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子等來(lái)自大腸桿菌、噬菌體等的啟動(dòng)子。向細(xì)菌內(nèi)導(dǎo)入重組載體的方法，例如可使用電穿孔法、氯化鈣法。本發(fā)明的脂肪酸組合物本發(fā)明提供培養(yǎng)通過(guò)含有上述LPAAH-long等的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而f尋到的脂肪酸組合物。具體地說(shuō)，本發(fā)明的脂肪酸組合物，是培養(yǎng)通過(guò)含有編碼本發(fā)明的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶的核酸(即，包含序列號(hào)1的堿基序列或編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸、或與其具有同等功能的突變體)的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的脂肪酸組合物，其特征在于，在所述脂肪酸組合物的脂肪酸組成中，以下i)v)ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率，以及iii)油酸含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率iv)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率v)n-6系脂肪酸含量中的至少1項(xiàng)以上比培養(yǎng)未用本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物32高。在此，"未用本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主"，是指例如用未整合本說(shuō)明書(shū)中的"編碼本發(fā)明的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶的核酸"的項(xiàng)目中所述的核酸的載體(空載體)轉(zhuǎn)化的宿主。本發(fā)明中所含有的脂肪酸，可以是游離脂肪酸，也可以是甘油三酯、磷脂質(zhì)等。本發(fā)明脂肪酸組合物中含有的脂肪酸，是指長(zhǎng)鏈烴的鏈狀或分支狀的單羧酸，例如可例舉肉豆蔻酸(myristicacid)(十四烷酸)(14:0)、肉豆蔻烯酸(myristoleicacid)(十四碳烯酸)(14:1)、棕櫚酸(十六烷酸)(16:0)、棕櫚油酸(9-十六碳烯酸)(16:1)、硬脂酸(十八烷酸)(18:0)、油酸(順式-9-十八碳烯酸)(18:1(9))、異油酸(11-十八碳烯酸)(18:1(11))、亞油酸(順式，順式-9，12十八碳二烯酸)(18:2(9，12))、a-亞麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18:3(9，12，15))、Y-亞麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)(18:3(6，9，12))、亞麻油酸(Stearidonicacid)(6，9，12，15-十八碳四烯酸)(18:4(6，9，12,15))、花生酸(二十烷酸)(20:0)、(8，11-二十碳二烯酸)(20:2(8，ll))、Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20:3(5，8，ll))、二高Y-亞麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(20:3(8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)(20:4(5，8，11，14))、二十碳四烯酸(5，11，14，17-二十碳四烯酸)(20:4(5，11，14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20:5(5，8，11，14，17))、山崳酸(二十二烷酸)(22:0)、(7，10，13，16-二十二碳四烯酸)(22:4(7，10，13，16))、(4，7，13，16，19—二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，13，16，19))、(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，10，13，16))、(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)(22:6(4，7，10，13，16，19))、木質(zhì)素酸(二十四'烷酸)(24:0)、神經(jīng)酸(順式-15-二十四碳單烯酸)(24:1)、蠟酸(二十六烷酸)(26:0)等，但并不限于這些。此外，上述物質(zhì)名稱是采用IUPAC生物化學(xué)命名法定義的通用名稱，括號(hào)內(nèi)記載了系統(tǒng)名稱以及表示碳原子數(shù)量和雙鍵位置的數(shù)值。獲得此種本發(fā)明的脂肪酸組合物，也就是說(shuō)，本發(fā)明的LPAATl-long表達(dá)的確認(rèn)，可使用公知的一般的方法進(jìn)行。例如，在酵母中使LPAATl-long表達(dá)時(shí)，可確認(rèn)脂肪酸組成的變化。即在通過(guò)上述本發(fā)明的脂肪酸組合物的制造方法獲得的冷凍干燥菌體中，添加以適當(dāng)比率調(diào)整的氯仿甲醇并攪拌后，加熱處理適當(dāng)時(shí)間。進(jìn)一步通過(guò)離心分離分離菌體，回收溶劑，重復(fù)數(shù)次此操作。然后使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ怪|(zhì)干固后，添加氯仿等溶劑使脂質(zhì)溶解。適量分取ll:匕樣品，通過(guò)鹽酸甲醇法將菌體的脂肪酸衍生為甲酯后，用己烷提取，蒸餾除去己烷后，用氣相色譜法進(jìn)行分析。其結(jié)果，得到具有上述脂肪酸組成的脂肪酸組合物時(shí)，即可判斷為得到了本發(fā)明的脂肪酸組合物。且本發(fā)明的LPAATl-long如上所述，與公知LPAATl的脂肪酸組合物的脂肪酸組成不同。即對(duì)本發(fā)明的LPAATl-long與作為公知LPAATl的模型使用的LPAATl-short進(jìn)行脂肪酸分析時(shí)，本發(fā)明的LPAATl-long的油酸含量為54%左右，比為42%左右的LPAATl-short高，本發(fā)明LPAATl-long的油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率也比LPAATl-short高1.8倍2.5倍，本發(fā)明LPAATl-long的硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率也比LPAATl-short高1.8倍2.3倍左右。此外，同樣對(duì)于n-6系脂肪酸，LPAATl-long與LPAATl-short相比為高含量，具體地說(shuō)，LPAATl-long與IPAATl-short相比，亞油酸含量、Y-亞麻酸含量及花生四烯酸含量均高。由此可表明，本發(fā)明的LPAATl-long與公知LPAAT的底物特異性不同。且本發(fā)明還提供如下脂肪酸組合物，其為培養(yǎng)通過(guò)含有以下核酸或與其具有同等功能的突變體的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主，該核酸為上述"編碼本發(fā)明的、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶的核酸"的項(xiàng)目中所述的、包含本發(fā)明序列號(hào)1的堿基序列、或編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸，所得到的培養(yǎng)物與培養(yǎng)未用上述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物相比，為長(zhǎng)鏈的月旨肪酸的含有比率、n-6系脂肪酸含量均高的脂肪酸組合物。長(zhǎng)鏈，是指構(gòu)成月旨肪酸的碳數(shù)的長(zhǎng)度長(zhǎng)。例如，與碳數(shù)為16的棕櫚酸、棕櫚油酸相比，碳數(shù)為18的硬脂酸、油酸為長(zhǎng)鏈。對(duì)于n-6系脂肪酸，如上述"編碼本發(fā)明的溶血磷月旨酸?；D(zhuǎn)移酶的核酸"中的說(shuō)明。本發(fā)明的脂肪酸組合物，與培養(yǎng)未用含有編碼LPAATl-long的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物相比，油酸含量、袖酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率均高，可以說(shuō)是長(zhǎng)鏈脂肪酸的含有比率高的脂肪酸組合物或n-6系脂肪酸含量高的脂肪酸組合物。而且，也可進(jìn)一步通過(guò)制造本發(fā)明脂肪酸組合物的方法中選擇的宿主，制造為長(zhǎng)鏈的脂肪酸的含有比率高的脂肪酸組合物、n-6系脂肪酸含量高的脂肪酸組合物。此種宿主，可例舉真菌、植物、動(dòng)物或它們的細(xì)胞等。作為真菌，可例舉為脂質(zhì)生產(chǎn)菌的高山被孢霉(M.alpina)等的絲狀菌、釀造酵母(Saccharomycescerevisiae)等的酵母等。進(jìn)而作為植物，可例舉油菜子、大豆、棉花、紅花、亞麻等油料植物。此時(shí)，與培養(yǎng)未用含有本發(fā)明核酸的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物中的脂肪酸相比含有率高的長(zhǎng)鏈脂肪酸，可例舉油酸、亞油酸、Y-亞麻酸、DGLA、a-亞麻酸、十八碳四烯酸、二高-Y-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸，但不限于此。n-6系脂肪酸，可例舉亞油酸、Y-亞麻酸、DGLA及花生四烯酸，但不限于此。因此種含有鏈長(zhǎng)更長(zhǎng)的月旨肪酸的比率高的脂肪酸組合物，非常適合用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品、保健食品、功能性食品、幼兒用食品、嬰兒用配方乳、早產(chǎn)兒用配方乳、老人用食品等，所以優(yōu)選。本發(fā)明的脂肪酸組合物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供制造上述脂肪酸組合物的方法。本發(fā)明的制造方法以利用上述LPAAT1-long為特征。具體地說(shuō)，涉及該脂肪酸組合物的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)通過(guò)含有包含本發(fā)明的序列號(hào)1的堿基序列或編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸、或與其具有同等功能的突變體的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主，從所得到的培養(yǎng)物中提取脂肪酸組合物，該脂肪酸組合物的特征在于，以下i)v)i)油酸含量ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率，以及iii)油酸的含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率iv)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率v)n-6系脂肪酸含量。中的至少1項(xiàng)以上均比培養(yǎng)未用上述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物高。*用于使LPAAT1-long表達(dá)的生物的培養(yǎng)的培養(yǎng)基，只要是具有適合的pH及滲透壓，含有各宿主增殖所必需的營(yíng)養(yǎng)素、微量成分、血清、抗生素等的生物材半斗的培養(yǎng)液(培養(yǎng)基)，可使用任何培養(yǎng)液。例如，轉(zhuǎn)化酵母使LPAATl-long表達(dá)時(shí)，可使用SC-Trp培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、YPD5培養(yǎng)基等，但不限于此。具體的培養(yǎng)基的組成，以SC-Trp培養(yǎng)基為例侮1L中，無(wú)氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFC0)為6.7g、葡萄糖為20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、組氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、賴氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、絲氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、纈氨酸4.5g、蘇氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)為1.3g)。培養(yǎng)條件，只要是適合宿主增殖、且適于使生成的酶保持穩(wěn)定的條件，可以為任意的條件，具體地說(shuō)，可調(diào)節(jié)厭氧度、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、濕度、靜置i咅養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)等各種條件。培養(yǎng)方法，可以為同一條件下的培養(yǎng)(l段培養(yǎng))，也可以為使用2個(gè)以上不同培養(yǎng)條件即2段培養(yǎng)或3段培養(yǎng)，但進(jìn)行大量培養(yǎng)時(shí)，優(yōu)選培養(yǎng)效率良好的2段培養(yǎng)等。以下，作為本發(fā)明的脂肪酸組合物的具體制造方法，以使用酵母作為宿主迸行2段培養(yǎng)為例進(jìn)行說(shuō)明。即作為預(yù)培養(yǎng)，將上述獲得的菌落例如接種到上述SC-Trp培養(yǎng)基等中，在3(TC下振蕩培養(yǎng)2天。而后，作為本培養(yǎng)，在YPD5(2%酵母膏、1%多聚蛋白胨、5%葡萄糖)培養(yǎng)基10ml內(nèi)添加預(yù)培養(yǎng)液500u1，在3(TC下振蕩培養(yǎng)2天。本發(fā)明的核酸的使用本發(fā)明還進(jìn)一步提供LPAAT1-long用于制造上述本發(fā)明的脂肪酸組合物的使用。具體地說(shuō)，提供用于制造本發(fā)明的脂肪酸組合物的、編碼本發(fā)明的LPAAT的核酸的使用。使用上述核酸時(shí)，不只用于制造本發(fā)明的脂肪酸組合物，還可制造以下"含有本發(fā)明脂肪酸組合物的食品"的項(xiàng)目中說(shuō)明的、實(shí)現(xiàn)預(yù)定目的、含有該脂肪36酸組合物的食品等，所以優(yōu)選。含有本發(fā)明的脂肪酸組合物的食品等本發(fā)明還進(jìn)一步提供含有上述脂肪酸組合物的食品。本發(fā)明的脂肪酸組合物，根據(jù)通常方法，例如可用于含有油脂的食品、工業(yè)原料[化妝料、醫(yī)藥(例如皮膚外用藥)、肥皂等的原料]的制造等用途中。作為化妝料(組合物)或醫(yī)藥(組合物)的劑型，可例舉溶液狀、糊狀、凝膠狀、固體狀、粉末狀等任意的劑型，但并不限于這些。此外，作為食品的形態(tài)，可例舉膠囊等醫(yī)藥制劑的形態(tài)，或在蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂肪、微量元素、維生素類(lèi)、乳化劑、香料等中配合了本發(fā)明的脂肪酸組合物的自然流食、半消化狀態(tài)營(yíng)養(yǎng)食品、以及成分營(yíng)養(yǎng)食品、保健飲料、經(jīng)腸營(yíng)養(yǎng)劑等加工形態(tài)。進(jìn)而，作為本發(fā)明的食品例，可例舉營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品、保健食品、功能性食品、幼兒用食品、嬰兒用配方乳、早產(chǎn)兒用配方乳、老人用食品等，但不限于這些。在本說(shuō)明書(shū)中，食品是固體、流體及液體以及這些的混合物且可攝取食用的食物的總稱。營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品是指強(qiáng)化了特定營(yíng)養(yǎng)成分的食品。保健食品是指用于保健的或?qū)】涤幸娴氖称?，包括營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品、天然食品、減肥食品等。功能性食品是指用來(lái)補(bǔ)充可發(fā)揮身體調(diào)節(jié)功能的營(yíng)養(yǎng)成分的食品，與特定保健用途的食品含義相同。幼)L用食品是指供給約6歲以下兒童的食品。老人用食品是指與未加處理的食品相比，處理成易消化及吸收的食品。嬰兒用配方乳是指供給約l歲以下兒童的配方乳。早產(chǎn)兒用配方乳是指供給早產(chǎn)兒出生后到約6個(gè)月為止所用的配方乳。作為這些食品，可例舉肉、魚(yú)、果仁等天然食品(用油脂處理過(guò)的食品)；中華料理、拉面、湯等制作時(shí)加入油脂的食品；天麩羅、油炸食品、油炸豆腐、炒飯、炸面圈、油炸糖點(diǎn)心等用油脂作熱介質(zhì)的食品；黃油、人造黃油、沙拉醬、調(diào)味汁、巧克力、方便面、奶糖、餅干、曲奇、蛋糕、冰淇淋等油脂食品或加工時(shí)加入油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬餅干、豆沙面包等加工完成時(shí)用油脂噴霧或涂布的食品等。但是，本發(fā)明的食品并不限于含油脂的食品，例如可例舉面包、面條類(lèi)、米飯、點(diǎn)心類(lèi)(糖果、口香糖、橡皮糖、壓片糖、37日式點(diǎn)心)、豆腐及其加工品等農(nóng)產(chǎn)食品；清酒、藥用酒、甜料酒、食用醋、醬油、黃醬等發(fā)酵食品；酸奶、火腿、培根、香腸等畜產(chǎn)食品；魚(yú)糕、炸魚(yú)糕、魚(yú)肉山芋餅等水產(chǎn)食品；果汁飲料、清涼飲料、運(yùn)動(dòng)飲料、酒精飲料、茶等。使用本發(fā)明涉及的核酸或蛋白質(zhì)的菌株的評(píng)價(jià)，選擇方法本發(fā)明還提供使用本發(fā)明涉及的核酸或蛋白質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)、選擇脂質(zhì)生產(chǎn)菌的方法。具體如下所示。(l)評(píng)價(jià)方法作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，可例舉使用編碼本發(fā)明的LPAATl-long的核酸或LPAATl-long蛋白質(zhì)，進(jìn)行脂質(zhì)生產(chǎn)菌評(píng)價(jià)的方法。本發(fā)明的上述評(píng)價(jià)方法，首先可例舉使用基于本發(fā)明的堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，對(duì)被測(cè)菌株月旨質(zhì)生產(chǎn)菌株的本發(fā)明的上述活性進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。此種評(píng)價(jià)方法的通常方法為公知，例如在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)指南W001/040514號(hào)、日本特開(kāi)平8-205900號(hào)公報(bào)等中均有記載。以下對(duì)該評(píng)價(jià)方法進(jìn)行簡(jiǎn)單說(shuō)明。首先制備被測(cè)菌株的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等任何公矢口的方法[例如參照MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,pi30(1990)]。基于本發(fā)明的堿基序列、優(yōu)選基于序列號(hào)1設(shè)計(jì)引物或探針。上述引物或探針可使用本發(fā)明堿基序列的任意部分，且其設(shè)計(jì)可使用公知方法進(jìn)行。作為引物使用的多核苷酸的堿基數(shù)，通常為10個(gè)堿基以上，優(yōu)選為1525個(gè)堿基。此外，夾在兩引物間的堿基數(shù)通常以3002000堿基為宜。使用上述制備的引物或探針，檢測(cè)上述被測(cè)菌體的基因組中是否存在本發(fā)明堿基序列的特異性序列。本發(fā)明堿基序列的特異性序列的檢測(cè)可采用公知方法進(jìn)行。例如，將含有本發(fā)明堿基序列的特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸作為一個(gè)引物使用，另一個(gè)引物使用含有該序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸、或含有上述堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸，例如通過(guò)PCR法等擴(kuò)增被測(cè)菌株的核酸，可測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)、擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小等。適合本發(fā)明方法的PCR法的反應(yīng)條件，無(wú)特別限定，例如可例舉以下條l牛，變性溫度9095°C退火溫度4060°C延伸溫度6075°C循環(huán)數(shù)IO次以上等條件。將獲得的反應(yīng)生成物通過(guò)使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等進(jìn)行分離，可測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。因此通過(guò)確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量是否是含有相當(dāng)于本發(fā)明堿基序列的特異性區(qū)域的核酸分子的大小，可預(yù)測(cè)或評(píng)價(jià)被測(cè)菌株的本發(fā)明的上述活性。而且通過(guò)用上述方法等分析上述擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列，還可進(jìn)一步更正確地預(yù)測(cè)或評(píng)價(jià)本發(fā)明的上述活性。另外，本發(fā)明的上述活性的評(píng)^(介方法如上所述。作為本發(fā)明的上述評(píng)價(jià)方法，通過(guò)培養(yǎng)被測(cè)菌株，測(cè)定序列號(hào)l等本發(fā)明的堿基序列編碼的LPAATl-long的表達(dá)量，可評(píng)價(jià)被測(cè)菌株的本發(fā)明的上述活性。且LPAAH-long的表達(dá)量，可通過(guò)在適當(dāng)條件下培養(yǎng)被測(cè)菌株，對(duì)LPAATl-long的mRNA或蛋白質(zhì)定量來(lái)測(cè)定。mRNA或蛋白質(zhì)的定量，可使用公知的方法進(jìn)行。mRNA的定量，例如可通過(guò)Northern雜交法、定量RT-PCR進(jìn)行，蛋白質(zhì)的定量例如可通過(guò)Western印跡法進(jìn)行(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons1994-2003)。此外，作為上述活'牲的評(píng)價(jià)方法，也可例舉測(cè)定本發(fā)明LPAAT1-long產(chǎn)生的脂肪酸組合物的組成的方法。脂肪酸組合物的組成的測(cè)定方法如上所述。(2)選擇方法作為本發(fā)明的其他實(shí)施方式，可例舉使用編碼本發(fā)明的LPMT1-long的核酸或LPAAT1-long蛋白質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)生產(chǎn)菌選擇的方法。作為本發(fā)明的上述選擇方法，通過(guò)培養(yǎng)被測(cè)菌株，測(cè)定序列號(hào)1等本發(fā)明的堿基序列編碼的LPAAT卜long的表達(dá)量，選擇目的表達(dá)量的菌株，可選擇出具有期望活性的菌株。此外，設(shè)定作為標(biāo)準(zhǔn)的菌株，分別培養(yǎng)該標(biāo)準(zhǔn)菌株和被測(cè)菌株，測(cè)定各菌株的上述表達(dá)量，比較標(biāo)準(zhǔn)菌株和被測(cè)菌株的表達(dá)量，也可選擇出所期望的菌株。具體地說(shuō)，例如可在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌株和被測(cè)菌株，測(cè)定各菌株的表達(dá)量，通過(guò)選擇與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比被測(cè)菌株為高表達(dá)、或低表達(dá)的被測(cè)菌株，來(lái)選擇具有期望活性的菌株。對(duì)于所期望的活性，如上所述，可例舉測(cè)定LPAATl-long的表達(dá)量及LPAAT1-long產(chǎn)生的脂肪酸組合物的組成的方法。且作為本發(fā)明的上述選擇方法，通過(guò)培養(yǎng)被測(cè)菌株，選擇本發(fā)明的上述活性高或低的菌株，也可選擇出具有期望活性的被測(cè)菌株。對(duì)于所期望的活性，如上所述，可例舉測(cè)定LPAAT1-long的表達(dá)量及LPAATl-long產(chǎn)生的脂肪酸組合物的組成的方法。作為被測(cè)菌株或標(biāo)準(zhǔn)菌株，例如可使用上述導(dǎo)入本發(fā)明的載體的菌株、上述本發(fā)明的核酸表達(dá)受到抑制的菌株、進(jìn)行誘變處理的菌株、自發(fā)突變的菌株等，但并不限于此。且本發(fā)明的LPAATl-long活性及可形成LPAAT1-long的脂肪酸組合物的活性，例如可通過(guò)本說(shuō)明書(shū)中的"編碼本發(fā)明的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶的核酸"、"本發(fā)明的脂肪酸組合物"項(xiàng)目中記載的方法進(jìn)行測(cè)定。誘變處理，例如可例舉紫外線照射、放射線照射等物理方法，EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亞硝基胍等藥劑處理的化學(xué)方法等(如參照大嶋泰治編著、生物《七學(xué)實(shí)驗(yàn)法39酵母分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)法、p67-75、學(xué)會(huì)出版中心等)(日語(yǔ)原名大嶋泰治編著、生物化學(xué)実験法39酵母分子遺伝學(xué)実験法、p67-75、學(xué)會(huì)出版七>夕一)。但不限于此。此外，作為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)菌株、被測(cè)菌株使用的菌株，可例舉上述脂質(zhì)生產(chǎn)菌或酵母等，但并不限于這些。具體地說(shuō)，標(biāo)準(zhǔn)菌株、被測(cè)菌株，可將屬于不同屬、種的任意菌株組合使用，被測(cè)菌株也可同時(shí)使用l種或l種以上的菌株。實(shí)施例以下根據(jù)實(shí)施例更加具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1(l)EST分析將高山被孢霉(M.alpina)1S-4株接種到lOOml的培養(yǎng)基(1.8%葡萄糖、1%酵母膏、pH6.0)中，在28匸預(yù)培養(yǎng)3天。在10L培養(yǎng)槽(AbleCo.，東京)中加入5L培養(yǎng)基[1.8%葡萄糖、1%大豆粉、0.1%橄欖油、O.O濕decanol、0.3%KH2P04、0.1%Na2S04、0.05%CaCl2'2H20、0.05%MgCl2'6H20、p朋.0]，接種全部預(yù)培養(yǎng)物，在300rpm、lvvm、26"C的條件下通氣攪拌培養(yǎng)8天。在培養(yǎng)的第l、2、及3天分別添加相當(dāng)于2%、2%、及1.5%的葡萄糖。在培養(yǎng)的第l、2、3、6、及8天的各階段回收菌體，用鹽酸胍/氯化銫法制備總RNA。使用Oligotex—dT30〈Super〉mRNAPurificationKit(TaKaRaBio)，從總RNA中純化poly(a)+RNA。使用ZAP-cDNAGigapackIIIGoldCloningKit(STRATAGENE)，構(gòu)建各階段的cDNA文庫(kù)，進(jìn)行cDNA的5'端一步法測(cè)序分析(8000克隆X5步)。將獲得的序列進(jìn)行聚類(lèi)。其結(jié)果，獲得約5000序列。(2)LPMT基因同源基因的檢索將通過(guò)EST分析獲得的堿基序列，相對(duì)于在GENEBANK注冊(cè)的氨基酸序列使用同源性檢索程序BLASTX進(jìn)行檢索，提取出LPAAT基因的同源基因，發(fā)現(xiàn)了LPAAT同源基因的序列(序列號(hào)5)。序列號(hào)5與來(lái)自粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)的1-酰基-sn-甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶樣推定蛋白質(zhì)(GBaccessionNo.EAA28956)的同一性最高。將上述得到的序列與專(zhuān)利文獻(xiàn)2的說(shuō)明書(shū)中所記載的高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT同源基因(LPAAT1)的序列進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)序列號(hào)5為L(zhǎng)PAAT1的同種等位基因的部分序列。対子上述的序列，來(lái)源文庫(kù)和其EST分析如表2所示，且表2中還表示了是來(lái)自培養(yǎng)第幾天所得到的cDNA文庫(kù)的克隆。表2來(lái)源文庫(kù)培養(yǎng)天數(shù)12368克隆的個(gè)數(shù)113實(shí)施例2(1)LPAAT同源物的克隆因序列號(hào)5中不存在被認(rèn)為是編碼LPAAT同源物的CDS，所以，為了克隆編碼這些基因全長(zhǎng)的cDNA，基于各自的序列，制備如下引物41基于序列號(hào)5設(shè)計(jì)的引物引物955-1:GGACGTGTCAAGGAAAAGGA(序列號(hào)6)引物955-2:TCCTTCAGATGAGCCTCCTG(序列號(hào)7)使用這些引物，以包含構(gòu)成序列號(hào)5的EST的c咖A文庫(kù)為模板，使用ExTaq(TaKaRaBio)進(jìn)行PCR反應(yīng)。將所得到的DNA片段使用T0P0-TAcloningKit(INVITROGENCORPORATION)進(jìn)行TA-克隆，以確定插入部分的堿基序列。其結(jié)果，證實(shí)包含序列號(hào)5的第20位518位的DNA片段進(jìn)行了克隆，將此質(zhì)粒作為pCR-955-P。而后，以此質(zhì)粒為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)中雖然使用了ExTaq(TaKaRaBio)，但用PCR標(biāo)記用混合物(RocheDiagnostics公司)代替附帶的dNTP混合物，將擴(kuò)增的DNA用地高辛(DIG)標(biāo)記，制備用于篩選cDNA文庫(kù)的探針。使用此探針，對(duì)通過(guò)EST分析得到的構(gòu)成上述序列的EST的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選。雜交條件如下所示。緩沖液5XSSC、1%SDS、50mMTris-HC1(pH7.5)、50%甲酰胺；溫度:42。C(一夜)；洗滌條件在O.2XSSC、0.19()SDS溶液中(65。C)，20分鐘X3次；檢測(cè)，使用DIG核酸檢測(cè)試劑盒(RocheDiagnostics公司)進(jìn)行。從經(jīng)過(guò)篩選獲得的噬菌體克隆中，通過(guò)體內(nèi)切割，切—出質(zhì)粒，獲得質(zhì)粒卵A。篩選含有序列號(hào)5的cDNA、所得到的插入片段最長(zhǎng)的克隆的插入片段的堿基序列如序列號(hào)3所示。序列號(hào)3中，包含由第116位第1557位的1443bp組成的編碼區(qū)域，所以認(rèn)為得到了編碼LPAAT同源物全長(zhǎng)的序列。由此基因編碼的蛋白質(zhì)的推定氨基酸序列如序列號(hào)2所示。篩選含有序列號(hào)5的cDNA，獲得比上述序列號(hào)3短的插入片段的克隆。所得到的克隆的插入片段的堿基序列如序列號(hào)9所示。序列號(hào)9中，含有由第36位第1286位的1251bp組成的ORF,并可知此序列與上述序列號(hào)1所示的堿基序列中，5'末端的第1931443堿基的序列同一。也就是說(shuō)，序列號(hào)9所示的堿基序列，與序列號(hào)l所示的堿基序列相比，是5，區(qū)短192個(gè)堿基的堿基序列。由此基因編碼的蛋白質(zhì)的推定氨基酸序列如序列號(hào)io所示。將含有序列號(hào)3的質(zhì)粒作為pB-LPAATl-long,含有序列號(hào)9的質(zhì)粒作為pB-LPAAT1-short。且將序列號(hào)3所涉及的基因作為L(zhǎng)PAATl-long基因，將序列號(hào)9所涉及的基因作為L(zhǎng)PAATl-short基因。(2)序列分析將上述獲得的來(lái)自高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT同源物的cDNA序列，相對(duì)于在GENEBANK注冊(cè)的氨基酸序列，使用BLASTX進(jìn)行同源性分析。其結(jié)果，相對(duì)于各序列E-value最低，即同一性高的氨基酸序列如下所示。將各序列的ORF和同一性最高的序列相關(guān)的堿基序列的同一性、及氨基酸序列的同一性用clustalW求出，以下一同記載。序列號(hào)3，僅比較相當(dāng)于來(lái)自構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)的1—?；籹n—甘油一3—磷酸?；D(zhuǎn)移酶樣推定蛋白質(zhì)(GBaccessionNo.EAA60126)部分時(shí)，堿基序列為51%、氨基酸序列為32.1%。序列號(hào)9，僅比較相當(dāng)于來(lái)自構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)的1—?；籹n—甘油一3—磷酸?；D(zhuǎn)移酶樣推定蛋白質(zhì)(GBaccessionNo.EAA60126)部分時(shí)，堿基序列為51%、氨基酸序列為32.1°/。。此外，對(duì)于序列號(hào)3和序列號(hào)9，用各個(gè)來(lái)自高山被孢霉(M.alpina)的已知LPAAT同源基因的LPAATl基因(專(zhuān)利文獻(xiàn)2)及其編碼的推定氨基酸序歹U進(jìn)行比較。將上述文獻(xiàn)中公開(kāi)的序列和從高山被孢霉(1.alpina)1S-4株尋到的序列在各自相當(dāng)?shù)膮^(qū)域比較時(shí)，確認(rèn)出LPAATl-long及LPAATl-short均具有堿基序列為89%、氨基酸序列為91%的同一性。實(shí)施例3酵母表達(dá)載體的構(gòu)建為使LPAATl-long、LPAATl-short在酵母中表達(dá)，如下構(gòu)建酵母表達(dá)用載體。將質(zhì)粒pB-LPAAH-long用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Kpnl酶切后所得到的纟勺1.7kb的DNA片段插入酵母用表達(dá)載體pYE22m(Biosci.Biotech,Biochem.，59，1221-1228，1995)的EcoRI-Kpnl位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pYE-MALPAAl-long。為使LPAATl-short在酵母中表達(dá)，如下構(gòu)建酵母表達(dá)載體。即以質(zhì)米立43pB-LPAAT1-short為模板，使用以下的引物L(fēng)PAAT1-6F(序列號(hào)11)和LPAAT1-R1(序列號(hào)12)，通過(guò)ExTaq(TAKARABIO)進(jìn)行PCR反應(yīng)。LPAAT1-6F:TCTGAGATGGATGAATCCACCACCACCAC(序列號(hào)11)LPAATl-Rl:GTCGACTCAACCAGACGATACTTGCTGCAGAG(序列號(hào)12)對(duì)于獲得的纖片段，使用T0P0-TAcloningKit(INVITROGEN)，進(jìn)行TA-克隆，確認(rèn)插入部分的堿基序列，將具有正確的堿基序列的質(zhì)粒作為pCR-LPAATl-short。將該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sail酶切后獲得的約1.3kb的DNA片段，插入酵母表達(dá)用載體pYE22m的EcoRI-Sail位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pYE-亂PAATl-short。實(shí)施例4酵母的轉(zhuǎn)化使用質(zhì)粒pYE22m、pYE-MALPAAl-long或pYE-MALPAAT1-short,通過(guò)醋酸鋰法轉(zhuǎn)化到釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EH13-15株(trpl，MATa)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)中。轉(zhuǎn)化株選擇在SC-Trp[每1升中，無(wú)氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFCO)為6.7g、葡萄糖為20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、組氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、賴氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、絲氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、纈氨酸4.5g、蘇氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)為1.3g]瓊脂培養(yǎng)基(2y。瓊脂)上生長(zhǎng)繁殖的菌株。實(shí)施例5酵母的培養(yǎng)選擇使用各個(gè)載體的轉(zhuǎn)化株中的任意2株(c-l株、c-2株、LPAATl-long-l株、LPAATl-long-2株、LPAATl-short-l株、LPAATl-short-2株)，用以下條件培養(yǎng)。即作為預(yù)培養(yǎng)，從平板上取1白金耳酵母接種到SC-Trp培養(yǎng)基10ml中，在30。C下振蕩培養(yǎng)2天。本培養(yǎng)是在YPD5(酵母膏2%、多聚蛋白胨1%、葡萄糖5%)培養(yǎng)基10ml中添加預(yù)培養(yǎng)液500u1，3(TC下振蕩培養(yǎng)2天。實(shí)施例6酵母的脂肪酸分析通過(guò)離心分離酵母培養(yǎng)液，回收菌體。用10ml滅菌水洗滌，再通過(guò)離心分離回收菌體，進(jìn)行冷凍干燥。在冷凍干燥菌體中添加氯仿甲醇(2:l)4ml，劇烈攪拌后，7(TC下處理1小時(shí)。通過(guò)離心分離分離菌體，回收溶劑。在殘留的菌體中再次添加氯仿甲醇(2:l)4ml，同樣回收溶劑。在離心濃縮儀中使脂質(zhì)干燥固化后，添加2ml氯仿溶解脂質(zhì)。從該試樣中分取200ul，通過(guò)鹽酸甲醇法使菌體的脂肪酸衍生為甲酯后，用己烷提取，蒸餾除去己烷，通過(guò)氣相色譜法進(jìn)行分析。其結(jié)果如表3所示。表3表3轉(zhuǎn)化株的脂肪酸組成(宿主EH13-15)12345(本發(fā)明)6(本發(fā)明)樣品名pYE22m-1pYE22m-2LPAAT1(shortHLPAAT1(shortWLPAAT1(long)-1LPAAT1(long)-216:0(棕櫚酸)B.幼6.5812.1714.767.6B7.4916:1(棕櫚油酸)39.5242,4034.6934.4433.0032.5418:0(硬脂酸)5.28■4.62"35.103.733.6918:1(油酸)44.0743.7445.8842.405404其他脂肪酸2.532朋2.533.311.582.37合計(jì)100.00100加100.00100加100加100加16:1/16:04.596.452朋2.334.314.3418:1/18:08.359.489.718.3218:1+16:1/18:0+16:06.027.704.773.877-.-T3-18:0/16:00.610.700.390.350.490.4918:1/16:11.121.031.321.231.641.6618:0+18:1/18:0+16:11.03O.的1加0.971,4418:1/16:05,126.653.772.87.',乂19比較導(dǎo)入來(lái)自高山被孢霉(M.alpina)的2個(gè)LPAAT同源基因的酵母和對(duì)照酵母的脂肪酸組成。導(dǎo)入LPAATl-short的酵母的脂肪酸組成，其棕櫚酸的比例與對(duì)照株相比上升，而另一方面，棕櫚油酸含量的比例降低。因此，棕櫚油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率與對(duì)照株相比降低了。硬脂酸及油酸的含量與對(duì)照株為同等程度。與此相對(duì)，導(dǎo)入了LPAATl-long的酵母中，油酸的比例與對(duì)照株相比上升了10%以上，另一方面，棕櫚油酸、硬脂酸的比例降低了。因此，油酸含量相45對(duì)于棕櫚酸含量的比率、以及油酸含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率與比對(duì)照株相比升高了。且硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率與對(duì)照株相比也升高了。以上結(jié)果表明，來(lái)自高山被孢霉(M.alpina)的2個(gè)LPAAT同源物，因其底物?；奶禺愋圆煌?，所以導(dǎo)入這些基因的酵母中各同源物的脂肪酸組成也完全不同。并且表明，通過(guò)將上述同源物適時(shí)分開(kāi)使用，可對(duì)目的脂肪酸組成的生物進(jìn)行育種。實(shí)施例7(1)花生四烯酸生產(chǎn)酵母的育種為進(jìn)行花生四烯酸生產(chǎn)酵母釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的育種，構(gòu)建以下質(zhì)粒。首先，以從高山被孢霉(M.alpina)1S-4株中制備的cDNA為模板，用△12-f和△12-r、△6-f和△6-r、GLEL0-f和GLEL0-r或A5-f和△5-r的引物的組合，使用ExTaq進(jìn)行PCR，擴(kuò)增高山被孢霉(M.alpina)1S-4株的A12脂肪酸去飽和酶基因、A6脂肪酸去飽和酶基因、GLELO脂肪酸鏈延長(zhǎng)酶基因以及A5脂肪酸去飽和基因。A12-f:TCTAGAatggcacctcccaacactattg(序列號(hào)13)△12-r:MGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC(序列號(hào)14)△6-f:TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag(序列號(hào)15)A6-r:MGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(序列號(hào)16)GLEL0-f:TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc(序列號(hào)17)GLEL0-r:GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(序列號(hào)18)△5-f:TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc(序列號(hào)19)A5-r:MGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(序列號(hào)20)將這些通過(guò)T0P0-TA-cloningKit克隆。確認(rèn)堿基序歹l」，將含有序列號(hào)2124的堿基序列的克隆分別作為質(zhì)粒pCR-MAA12DS(含有序列號(hào)21的堿基序列)、pCR-MAA6DS(含有序列號(hào)22的堿基序列)、pCR-MAGLEL0(含有序列號(hào)23的堿基序列)、pCR-MAA5DS(含有序列號(hào)24的堿基序列)。而后，將用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切質(zhì)粒pCR-MAA12DS且進(jìn)行末端平滑化后用限制性內(nèi)切酶Xbal酶切而獲得的約1.2kbp的DNA片段，與用限制性內(nèi)切酶Sacl酶切載體pESC-URA(STRATAGENE)且進(jìn)行末端平滑化后用限制性內(nèi)切酶Spel酶切后的約6.6kbp的DNA片段連接，得到質(zhì)粒pESC-U-△12。將用限制性內(nèi)切酶Xbal酶切質(zhì)粒pCR-MAA6DS且進(jìn)行末端平滑化后用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切而獲得的約1.6kbp的DNA片段，與用限制性內(nèi)切酶Sail酶切質(zhì)粒pESC-U-A12且進(jìn)行末端平滑化后用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切后的約8kbp的DNA片段連接，獲得質(zhì)粒pESC-U-A12:A6。將其用限制性內(nèi)切酶PvuII部分酶切獲得的約4.2kb的片段插入pUC-URA3的Smal位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒pUC-猶-A12:A6。此外，將用限制性內(nèi)切酶Xbal和Sacl酶切質(zhì)粒pCR-MAGLEL0后獲得的約0.95kbp的DNA片段，與用限制性內(nèi)切酶Xbal和Sacl酶切載體pESC-LEU(STRATAGENE)后獲得的約7.7kbp的DNA片段連接，獲得質(zhì)粒pESC-L-GLELO。將用限制性內(nèi)切酶Xbal酶切質(zhì)粒pCR-MAA5DS且進(jìn)行末端平滑化后用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切而獲得的約1.3kbp的DNA片段，與用限制性內(nèi)切酶Apal酶切質(zhì)粒pESC-L-GLELO且進(jìn)行末端平滑化后用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切后而獲得的約8.7kbp的DNA片段連接，獲得質(zhì)粒pESC-L-GLELO:A5。將其用限制性內(nèi)切酶pvun酶切后獲得節(jié)約3.2kb片段插入pUC-LEU2的Smal位點(diǎn)，獲得質(zhì)粒pUC-LEU-GLELO:A5。將釀酒酵母(S.cerevisiae)YPH499株(STRATAGENE)用質(zhì)茅立pUC-URA-A12:A6和質(zhì)粒pUC-LEU-GLEL0:A5進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化株選擇在SC-Leu，Ura[每1升中，無(wú)氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFCO)為6.7g、葡萄糖為20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、組氨酸0.6g、賴氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、絲氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、纈氨酸4.5g、蘇氨酸6g、色氨酸1,2g的混合物)為1.3g]瓊脂培養(yǎng)基(2y。瓊脂)上生長(zhǎng)繁殖的菌株。將如此獲得的菌株中的任意一株作為ARA3-1株。(2)花生四烯酸生產(chǎn)酵母的轉(zhuǎn)化株的獲得與分析將ARA3-1株用質(zhì)粒pYE22m、pYE-MALPAAT卜long、PYE-MALPAAT1-short分別轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化株選擇在SC-Trp、Leu、Ura[每1升中，無(wú)氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFC0)為6.7g、葡萄糖為20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、組氨酸0.6g、賴氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、絲氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、纈氨酸4.5g、蘇氨酸6g的混合物)為1.3g]瓊脂培養(yǎng)基(2。/。瓊脂)上生長(zhǎng)繁殖的菌株。從導(dǎo)入各質(zhì)粒的菌株中，分別選擇任意4株。將這些菌株在上述SC-Trp、Leu、Ura液體培養(yǎng)基10ml中30°C、培養(yǎng)1天，取其中iml在SG-Trp、Leu、Ura[每1升中，無(wú)氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasew/oaminoacids)(DIFCO)為6.7g、半乳糖為20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸鹽1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、組氨酸0.6g、賴氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、絲氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、結(jié)^氨酸4.5g、蘇氨酸6g的混合物)為1.3g]液體培養(yǎng)基10ml中15°C、培養(yǎng)7天，進(jìn)行菌體的脂肪酸分析。菌體的脂肪酸組成如表4所示。表4表4總脂肪酸中n-6系PUFA的比率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>如此，在為了可生產(chǎn)花生四烯酸而育種的酵母中使LPAATl-long高表達(dá)曰寸，與只導(dǎo)入載體的對(duì)照株相比，總脂肪酸中n-6系PUFA的比率升高。且與4吏LPAAT1-short高表達(dá)時(shí)相比，亞油酸、Y-亞麻酸、花生四烯酸的比率也升高了。實(shí)施例8高山被孢霉(M.ah)ina)表達(dá)用載體的構(gòu)建作為高山被孢霉(M.alpina)表達(dá)用載體，使用由GAPDH啟動(dòng)子使目的基因表達(dá)的pDuraSC。為使LPAATl-long和LPAAT1-short在高山被孢霉(M.alpina)中表達(dá)，如下構(gòu)建載體。即將質(zhì)粒pB-LPAATl-long用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Sail酶切后所得到的DNA片段中約1.5kb的片段切出，插入載體pDuraSC的多克隆位點(diǎn)的EcoRI位點(diǎn)、Xhol位點(diǎn)，作為質(zhì)粒pDuraSC-LPAAT1-long。且將質(zhì)粒pGR-LPAATl-short用EcoRI和Sail酶切后所得到的DNA片段中約1.3kb切出，插入載體pDuraSC的多克隆位點(diǎn)的EcoRI位點(diǎn)、Xhol位點(diǎn)，作為pDura5SC-LPAAT1-short。實(shí)施例9高山被孢霉(M.alpina)轉(zhuǎn)化株的獲得使用這些質(zhì)粒，從高山被孢霉(M.alpina)中，以根據(jù)專(zhuān)利文獻(xiàn)(W02005/019437"脂質(zhì)生產(chǎn)菌的育種方法")中記載的方法誘導(dǎo)的尿嘧啶缺陷型株Aura-3為宿主，用粒子轟擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。選擇轉(zhuǎn)化株時(shí)，使用SC瓊脂培養(yǎng)基[無(wú)氨基酸禾口硫酸銨酵母氮源(YeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate)(Difco)0.5%、硫酸銨0.17%、葡萄糖2%、腺嘌呤0.002%、酪氨酸0.003%、蛋氨酸0.0001%、精氨酸0.0002%、組氨酸Q.0002%、賴氨酸0.0004%、色氨酸0.0004%、蘇氨酸0.0005%、異亮氨酸0.0006%、亮氨酸0.0006%、苯丙氨酸0.0006。/。、瓊脂2%]。實(shí)施例10轉(zhuǎn)化高山被孢霉(M.alpina)的評(píng)價(jià)將獲得的轉(zhuǎn)化株，接種到0￥培養(yǎng)基(葡萄糖2%、酵母膏iy。)4ml中，28°C振蕩培養(yǎng)3天或4天。通過(guò)過(guò)濾回收菌體，使用RNeasyplantkit(QIAGEN)提取腿。通過(guò)SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR(Invitrogen)合成cDNA。為了確認(rèn)導(dǎo)入的構(gòu)建物中的各基因的表達(dá)、總的各基因的表達(dá)，用以下引物的組合進(jìn)行RT-PCR。用于導(dǎo)入構(gòu)建物中的表達(dá)確認(rèn)的引物MaGAPDHpfw:CACACCACACATTCAACATC(序列號(hào)25)LPAAT1-r:GCCTTCGTCCTTGGTACACCTTGAC(序列號(hào)26)用于總的LPAAT1表達(dá)確認(rèn)的引物L(fēng)PAAT1-2F:TCGGCTCGGTCCCAAGATGAAC(序列號(hào)27)引物L(fēng)PAAT1-2R:GCGTCTGTCATGTGCCCAGTCA(序列號(hào)28)根據(jù)上述RT-PCR的結(jié)果，作為各基因在導(dǎo)入構(gòu)建物中的表達(dá)及總表達(dá)高的菌株，從質(zhì)粒pDuraSC-LPAATl-long導(dǎo)入株中篩選出Gp-LPAATl-long-5株，從質(zhì)粒pDura5C-LPAAT1-short導(dǎo)入株中篩選出Gp-LPAATl-short-6株。將這些菌株在GY培養(yǎng)基4ml中接種，28'C下125rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)第6天通過(guò)過(guò)濾回收全部菌體，冷凍干燥。取出一部分(約1020mg左右)干燥菌體，通過(guò)鹽酸甲醇法使菌體的脂肪酸衍生為甲酯后，用己烷提取，蒸餾除去己烷，通過(guò)氣相色譜法進(jìn)行分析。菌體內(nèi)的脂肪酸組成如表5所示。表5表5總脂肪酸中DGLA和花生四烯酸的比率(％)Gp-LPAAT卜long~5Gp-LPAAT卜short-61S-4DGLA4.15±0.064.09±0.093.99±0.18花生四烯酸43.31±1.4440.28±1,8739.71±1.05這樣，在高山被孢霉(M.alpina)中使LPAAT1-long或LPAAT1-short高表達(dá)的轉(zhuǎn)化株中，與野生株1S-4株相比，DGLA及花生四烯酸的比率高。且將使LPAATl-long高表達(dá)的菌株和使LPAATl-short高表達(dá)的菌株相比較時(shí)，前者的此趨勢(shì)更為明顯。50權(quán)利要求1.脂肪酸組合物，其是培養(yǎng)通過(guò)含有如下核酸，該核酸包含以下(a)～(e)中任一項(xiàng)所述的堿基序列(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其由與序列號(hào)1所組成的堿基序列有90％以上同一性的堿基序列組成，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(d)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(e)堿基序列，其與由編碼序列號(hào)2中所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的脂肪酸組合物，其特征在于，在所述脂肪酸組合物的脂肪酸組成中，以下i)～v)中的至少1項(xiàng)以上均比培養(yǎng)未用所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物高i)油酸含量ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率，以及iii)油酸的含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率iv)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率v)n-6系脂肪酸含量。2.權(quán)利要求l中所述的脂肪酸組合物，其中，所述核酸包含以下(a)(c)中任一項(xiàng)的堿基序列(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2中所示的氨基酸序列中110個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)l所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在1XSSC、6(TC的條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。3.權(quán)利要求1中所述的脂肪酸組合物，其中，所述核酸包含以下(a)或(b)中所述的堿基序列(a)堿基序列，其如序列號(hào)l所示；(b)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。4.權(quán)利要求1中所述的脂肪酸組合物，其中，n-6系脂肪酸選自亞油酸、Y-亞麻酸、二高-Y-亞麻酸(DGLA)及花生四烯酸中的至少l種脂肪酸。5.所述脂肪酸組合物的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)通過(guò)含有如下核酸，該核酸包含以下(a)(e)中任一項(xiàng)所述的堿基序列(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其由與序列號(hào)1所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列組成，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；'(d)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(e)堿基序列，其與由編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷月旨酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主，從所得到的培養(yǎng)物中提取脂肪酸組合物，該脂肪酸鄉(xiāng)且合物的特征在于，以下i)V)中的至少1項(xiàng)以上均比培養(yǎng)未用所述重組載體轉(zhuǎn)l七的宿主而得到的培養(yǎng)物高i)油酸含量ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率，以及iii)油酸的含量相對(duì)于硬脂酸含量的比率iv)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率v)n-6系脂肪酸含量。6.權(quán)利要求5中所述的制造方法，其中，n-6系脂肪酸選自亞油酸、Y-亞麻酸、二高-Y-亞麻酸及花生四烯酸中的至少l種脂肪酸。7.權(quán)利要求5或6中所述的制造方法，其中，所述核酸包含以下(a)(c)中任一項(xiàng)的堿基序列(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中110個(gè)的氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶、活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在1XSSC、6(TC的條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活'性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。8.核酸的使用，其為用于制造權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的脂肪酸組合物的、包含以下(a)(e)中任一項(xiàng)所述的堿基序列的核酸的使用(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶、活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(C)堿基序列，其由與序列號(hào)1所組成的堿基序列有90%以上同一性的堿基序列組成，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(d)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(e)堿基序列，其與編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列所組成的蛋白質(zhì)的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。9.權(quán)利要求8中所述的使用，其中，所述核酸包含以下(a)(c)中任一項(xiàng)的堿基序列(a)堿基序列，其編碼由序列號(hào)2所示的氨基酸序列中110個(gè)的氨基酸發(fā)生缺失、取代或附加的氨基酸序列組成，且具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；(b)堿基序列，其與由序列號(hào)1所組成的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的核酸在1XSSC、60°C的條件下雜交，且編碼具有溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶活'性的蛋白質(zhì)；(c)堿基序列，其編碼與由序列號(hào)2組成的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且編碼具有溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)10.食品，其含有權(quán)利要求14中任一項(xiàng)所述的脂肪酸組合物。全文摘要本發(fā)明的目的是提供與以往脂肪酸組成不同的脂肪酸組合物。上述課題通過(guò)所述脂肪酸組合物解決，其中，脂肪酸組合物是培養(yǎng)通過(guò)含有包含本發(fā)明的序列號(hào)1的堿基序列或編碼序列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸、或與其具有同等功能的突變體的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的脂肪酸組合物，其特征在于，在所述脂肪酸組合物的脂肪酸組成中，以下i)～v)i)油酸含量ii)油酸含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率，以及iii)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量的比率iv)硬脂酸及油酸的合計(jì)含量相對(duì)于棕櫚酸含量及棕櫚油酸的合計(jì)含量的比率v)n-6系脂肪酸含量中的至少1項(xiàng)以上均比培養(yǎng)未用所述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主而得到的培養(yǎng)物高。文檔編號(hào)C12N15/09GK101578372SQ200880000798公開(kāi)日2009年11月11日申請(qǐng)日期2008年7月23日優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日發(fā)明者落合美佐申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社