專利名稱：：HbA1c測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及HbAlc測定中使用的含血紅蛋白試樣的制備方法及HbAlc測定方法。
背景技術(shù)：
：作為指示生物體狀態(tài)的指標(biāo)，常對各種蛋白質(zhì)的糖化率進(jìn)行測定。其中血細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白(Hb)的4唐化率，尤其是HbAlc能夠反映生物體內(nèi)血糖值的過往的歷史，因此祐j見為糖尿病診斷及治療等中重要的指標(biāo)。HbAlc為葡萄糖結(jié)合于HbA(a2p2)的卩鏈N末端氨基酸(纈氨酸)上的形態(tài)，其值用HbAlc量與總Hb量之比(比例，％)表示。HbAlc例如可通過高效液相色譜(HPLC)法、免疫法、酶法、電泳法等進(jìn)行測定，近年來，就確立利用酶法的簡便的測定方法進(jìn)行了研究。所述利用酶法的HbAlc測定方法例如為以下的方法。首先，使蛋白酶作用于Hb,切出含P鏈N末端纈氨酸的片段。隨后再使果糖胺氧化酶(以下稱"FAOD")作用于上述片段的糖化部分(即(3鏈N末端纈氨酸的糖化部分)，產(chǎn)生過氧化氫。該過氧化氫量對應(yīng)于上述Hb的(3鏈N末端纈氨酸的糖化量。再向該反應(yīng)液中添加過氧化物酶(以下稱"POD")以及通過氧化而顯色的顯色底物，POD能催化過氧化氪與顯色底物間的顯色程度。在該方法中，吸光度的大小與顯色的顯色底物的量相應(yīng)，上述顯色的顯色底物的量與生成的過氧化氫的量相應(yīng)，過氧化氬的量如前所述與糖化量相應(yīng)。即通過測定顯色程度，借助這樣的氧化還原反應(yīng)，可間接地測定糖化量。隨后，利用該糖化量以及總Hb量可計(jì)算出HbAlc(%)。這種HbAlc(%)的測定通常由檢測機(jī)構(gòu)來進(jìn)行，特別是，在健康檢查等中，從患者采集的含Hb試樣(例如全血試樣、從全血回收到的血細(xì)胞試樣、從全血中回收到的Hb試樣等)，采集后并非立即供于測定。通常，這些含Hb試樣在例如常溫、冷藏或冷凍狀態(tài)下保存后供測定。
發(fā)明內(nèi)容然而，本發(fā)明人等在對上述酶法進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)以下現(xiàn)象。即，將上述這種含Hb試樣保存后再進(jìn)行HbAlc檢測時(shí)，將得到比使用剛采集的含Hb試樣的測定值低的值。因此對于保存后測定的含Hb試樣，很難維持與使用剛采集的含Hb試樣的情況同等的測定精度。特別是，如上所述，由于HbAlc反映著生物體內(nèi)血糖值的過往的歷史，在糖尿病的治療和預(yù)防中，與每次的測定值相比，了解經(jīng)時(shí)變化非常重要。因此，對于引起測定值變動(dòng)的主要因素，希望統(tǒng)一條件。但若要將含Hb試樣從采集到測定的條件(例如，時(shí)間、溫度等)保持為恒定，從效率上來說難以實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種HbAlc的測定方法，即使對保存后的含Hb試樣，也可維持與剛采集后同等的測定精度。本發(fā)明的含Hb試樣的制備方法，其特征在于，其為測定HbAlc的方法中使用的含Hb試樣的制備方法，包含下述(Al)或(A2)的工序。(Al)在抑制二氧化碳產(chǎn)生的狀態(tài)下，保存Hb含有物的工序，(A2)從保存后的Hb含有物中，減少與Hb結(jié)合著的二氧化碳的工序。本發(fā)明的HbAlc測定方法，其特4i在于，其為測定HbAlc的方法，包含下述(A)~(D)的工序。(A)通過本發(fā)明的制備方法，準(zhǔn)備保存后的含Hb試樣的工序，(B)對保存后的上述含Hb試樣進(jìn)行蛋白酶處理，切斷上述含Hb試才羊中的血紅蛋白的工序，(C)使果糖胺氧化酶作用于通過上述(B)工序得到的血紅蛋白片段的糖化部分的工序，(D)通過測定上述糖化部分與果糖胺氧化酶的氧化還原反應(yīng)來確定HbAlc的量的工序。本發(fā)明人等研究了由保存引起的含Hb試樣中HbAlc變動(dòng)的原因，結(jié)果表明，其原因在于含Hb試樣保存時(shí)產(chǎn)生二氧化碳、以及產(chǎn)生的二氧化碳所導(dǎo)致的Hb結(jié)構(gòu)變化。已知一般情況下，即使是從體內(nèi)采集的試樣，例如，含有血細(xì)胞時(shí)，因血細(xì)胞其自身仍存活，由于糖酵解系統(tǒng)的作用，葡萄糖被消耗而產(chǎn)生二氧化碳。剛采集的健康者全血中的氧分壓通常約為80~lOOmmHg,二氧化碳分壓通常約為35~45mmHg。另夕卜，在全血中，還以碳酸氫根離子(HCOs一)形式存在，上述碳酸氫根離子的濃度約為22~26mmo1(例如24mmo1)。但將全血例如在室溫下放置15天的話，由于糖酵解系統(tǒng)的影響，氧分壓降至約0mmHg左右、二氧化碳分壓變?yōu)?50mmHg以上，另夕卜，碳酸氬根離子的濃度亦增加至約8~34mmo1。該碳酸氫根離子的濃度為相當(dāng)于例如剛采血后的全血中葡萄糖濃度的2倍的值。即，由于保存，全血中的氧濃度與二氧化碳濃度的比率發(fā)生逆轉(zhuǎn)。像這樣，二氧化碳所占比率增加的話，則會(huì)導(dǎo)致Hb的立體結(jié)構(gòu)由氧合型變?yōu)槊撗跣?。這種轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣偷淖兓⒉粌H發(fā)生在全血中，例如，從全血中回收的血細(xì)胞試樣或乂人全血中回收的Hb試樣保存在存在二氧化碳的條件下、或保存在產(chǎn)生二氧化碳的狀態(tài)下，同樣會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象。對此進(jìn)一步反復(fù)研究，結(jié)果表明，脫氧型Hb變成了如下的立體結(jié)構(gòu)通過酶法測定HbAlc時(shí)十分重要的P《連N末端朝向Hb內(nèi)部。即，采取以往的方法時(shí)，由于保存時(shí)產(chǎn)生二氧化碳，導(dǎo)致Hb的立體結(jié)構(gòu)變?yōu)榈鞍酌负茈y作用在P鏈N末端的脫氧型，因難以將所有Hb保持在氧合型，所以導(dǎo)致HbAlc測定值隨著保存而降低的結(jié)果。此外，關(guān)于Hb的立體結(jié)構(gòu)，雖已有報(bào)告存在氧合型與脫氧型，但脫氧型Hb為卩鏈N末端朝向內(nèi)部的構(gòu)象，因此導(dǎo)致難以用蛋白酶切出(3鏈N末端的纈氨酸或含該氨基酸的多肽則是由本發(fā)明人等首次闡明的。于是，本發(fā)明人等的第l手段為通過抑制Hb含有物保存時(shí)產(chǎn)生二氧化碳，來實(shí)現(xiàn)對保存所導(dǎo)致的HbA1c變動(dòng)的抑制。另外，本發(fā)明人等的第2手段為即使Hb含有物保存中產(chǎn)生二氧化碳、Hb變?yōu)槊撗跣?，也可通過減少與Hb結(jié)合的二氧化碳，使Hb重新變?yōu)檠鹾闲?，從而抑制保存所?dǎo)致的HbAlc變動(dòng)。如上所述，使用本發(fā)明，即使在保存Hb含有物的情況下，也可抑制HbAlc測定值的變動(dòng)，因此對于保存后的含Hb試樣，也可以以與剛采集的含Hb試樣同樣的精度測定HbA1c。由于這樣可以抑制保存對HbAlc測定值的影響，因此，如上所述，對于在與試樣采集地點(diǎn)不同的地點(diǎn)測定HbAlc的情況下、或收集一定數(shù)量的試樣后集中進(jìn)行HbA1c測定這樣的必須保存試樣的情況來說，可稱為是相當(dāng)有用的方法。此外，上述機(jī)理僅為推測，對本發(fā)明無任何限制。具體實(shí)施方式<含Hb試樣的制備方法>本發(fā)明的制備方法，如上所述，其特征在于，其為測定HbAlc的方法中使用的含Hb試樣的制備方法，包含下述(Al)或(A2)的工序(Al)在抑制二氧化碳產(chǎn)生的狀態(tài)下，保存Hb含有物的工序，(A2)從保存后的Hb含有物中，減少與Hb結(jié)合著的二氧化碳的工序。這樣通過(Al)在抑制二氧化碳產(chǎn)生的狀態(tài)下保存Hb含有物、或通過(A2)從保存后的Hb含有物中減少與Hb結(jié)合著的二氧化-友，可獲得抑制了HbAlc測定值變動(dòng)的含Hb試樣。在本發(fā)明中，只要例如對Hb含有物抑制保存時(shí)二氧化碳的產(chǎn)生、或可減少保存時(shí)產(chǎn)生并與Hb結(jié)合的二氧化碳即可，對抑制二氧化碳產(chǎn)生的方法或使已產(chǎn)生的二氧化碳減少的方法沒有任何限制。并且，只要是利用這樣的方法制備出的保存后的含Hb試樣，則在HbAlc測定時(shí)，例如可以以與剛采集后相同的精度測定HbA1c。予以說明，對使用通過本發(fā)明制得的含Hb試樣的HbA1c的測定方法，沒有任何限制。作為具體例子，例如，除了后述的酶法，還可采用免疫法、HPLC法等目前已知的方法。予以說明，關(guān)于本發(fā)明的含Hb試樣的制備方法，將在本發(fā)明的HbAlc測定方法中詳述。在本發(fā)明中，保存的Hb含有物只需含有Hb即可。上述Hb含有物可舉出例如全血、血細(xì)胞等。上述全血可舉出例如采集(采血)后未經(jīng)處理的全血、稀釋的全血、溶血的全血等。另外，上述血細(xì)胞可舉出例如從全血回收的血細(xì)胞、稀釋的血細(xì)胞、溶血的血細(xì)胞等。血細(xì)胞例如可由全血通過沉降或離心分離等進(jìn)行回收，但也可以殘留有血漿等。另外，也可為從采血在例如保存含血細(xì)胞的Hb含有物、例如可舉出未處理全血、稀釋全血、血細(xì)胞等。上述(A2)工序優(yōu)選應(yīng)用于例如未處理全血、稀釋全血、溶血的全血、血細(xì)胞、精制Hb等Hb含有物的保存中。另外，Hb含有物可以是干燥的(干燥物)也可以是濕潤的(液體)?！碒bAlc測定方法〉本發(fā)明的HbAlc測定方法，其特征在于，其為測定HbAlc的方法，包含下述(A)~(D)的工序。(A)通過本發(fā)明的制備方法，準(zhǔn)備保存后的含Hb試樣的工序，(B)對保存后的上述含Hb試樣進(jìn)行蛋白酶處理，切斷上述含Hb試樣中的血紅蛋白的工序，(C)使果糖胺氧化酶作用于通過上述(B)工序得到的血紅蛋白片段的糖化部分的工序，(D)通過測定上述糖化部分與果糖胺氧化酶的氧化還原反應(yīng)來確定HbAlc的量的工序。在本發(fā)明的測定方法中，上述(A)工序中，既可以如上所述地在抑制二氧化碳產(chǎn)生的狀態(tài)下保存Hb含有物，由此制備保存后的含Hb試樣(Al),也可以如上所述地從保存后的Hb含有物中減少與Hb結(jié)合的二氧化碳，由此制備保存后的含Hb試樣(A2)。下面，第l種HbAlc測定方法為前者的具體例，第2種HbAlc測定方法為后者的具體例。此外，本發(fā)明不受這些具體例的限制。第l種HbAlc測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的第l種HbAlc測定方法包含以下(Al，)~(D)的工序。(Al，)在糖酵解抑制劑存在下，保存Hb含有物的工序(制備保存后的含Hb試樣)，(B)對保存后的含Hb試樣進(jìn)行蛋白酶處理，切斷上述含Hb試樣中的血紅蛋白的工序，(C)使果糖胺氧化酶作用于通過上述(B)工序得到的血紅蛋白片段的糖化部分的工序，(D)通過測定上述糖化部分與果斗唐胺氧化酶的氧化還原反應(yīng)來確定HbAlc的量的工序。才艮據(jù)本發(fā)明的第l種HbAlc測定方法，例如，在含血細(xì)胞的Hb含有物的情況下，由于保存時(shí)血細(xì)胞的糖酵解系統(tǒng)被抑制，所以能抑制二氧化碳的產(chǎn)生。其結(jié)果，能防止血紅蛋白立體結(jié)構(gòu)變?yōu)槊撗跣虷b。因此，即使是保存后的含Hb試樣，Hb的立體結(jié)構(gòu)也能保持采血時(shí)那樣的、(3鏈N末端易于被蛋白酶作用的氧合型，從而能防止HbAlc測定值的變動(dòng)。上述(A1，)的工序優(yōu)選應(yīng)用于保存例如含血細(xì)胞的Hb含有物，可舉出例如未處理全血、稀釋全血、血細(xì)月包等。第l種HbAlc測定方法，只要是例如在上述(Al，)的工序中，在上述糖酵解抑制劑存在下保存Hb含有物即可，而對其它工序中的條件等無任何限制。另外，上述(B)工序和(C)工序，例如可以在同一反應(yīng)液中同時(shí)進(jìn)4亍。上述(D)工序可在上述(C)工序之后進(jìn)行，亦可與上述(C)工序(以及上述(B)工序)同時(shí)進(jìn)行。上述糖酵解抑制劑可舉出例如氟化鈉、氟化鉀等，其中優(yōu)選氟化鈉。另外，糖酵解抑制劑可使用任意一種，亦可將二種以上同時(shí)使用。明的第l種HbAlc測定方法進(jìn)行說明。此外，本發(fā)明不受此例的限制，例如，對于稀釋全血或血細(xì)胞等Hb含有物也同樣適用。(全血的保存)從待測者采集全血，在上述糖酵解抑制劑存在下保存至HbAlc測定時(shí)。此夕卜，雖然在HbAlc測定中，保存全血并非必需步驟，但本發(fā)明的目的是為了抑制保存所導(dǎo)致的HbAlc值的變動(dòng)，因此優(yōu)選在需要進(jìn)行全血保存的情況下應(yīng)用本發(fā)明。上述糖酵解抑制劑，例如，可在從待測者釆集全血后立即添加，亦可事先添加在采血用具(例如，釆血管)中。具體例的含氟化鈉的采血管，可以使用市售的商品名為《乂-工夕卜II真空采血管(terumocorporation生產(chǎn))或商品名為夕Vb-七—文(七《74公司生產(chǎn))等。另外、使用市售采血管時(shí)，可含有肝素等抗凝劑。通過同時(shí)存在肝素等抗凝劑，能確保充分的抗凝作用。本發(fā)明中，含上述糖酵解抑制劑的試劑可作為全血保存用試劑使用。上述(Al，)工序中，上述糖酵解抑制劑相對全血的添加比例無特別限制，例如，每lml全血中為O.l~100mol/L，優(yōu)選為0.2~10mol/L。上述(B)的工序中的蛋白酶處理反應(yīng)液中，上述糖酵解抑制劑(例如，NaF)的濃度為O.Ol~10mol/L，優(yōu)選為O.Ol~3mol/L。上述添加了糖酵解抑制劑的全血的保存時(shí)間無特別限制，例如，從采血當(dāng)日起可保存約10天左右。采集自患者的全血送到檢測機(jī)構(gòu)的情況下，通常在采血之日起2天以內(nèi)供于分析。根據(jù)以往的方法，從采血之日起經(jīng)過4天的時(shí)間段內(nèi)，對HbAlc測定值的影響很顯著。從而，使用本發(fā)明的方法保存采血試樣的情況下，可充分預(yù)防HbAlc。/。的變動(dòng)，能夠進(jìn)行可靠性較高的HbAlc測定。上述添加糖酵解抑制劑的全血的保存溫度無特別限制，通常為135。C,優(yōu)選為225。C,更優(yōu)選為210。C。另外，除上述未處理的全血外，在保存例如稀釋全血或回收的血細(xì)胞時(shí)也可同樣地進(jìn)行處理。糖酵解抑制劑的添加比例無特別限制，將稀釋全血或血細(xì)胞換算成全血的量，再按上述的范圍進(jìn)4亍添加。以下的工序也相同。(溶血處理)對保存后的全血試樣進(jìn)行溶血處理。全血試樣的溶血方法無特別限制，例如可使用利用滲透壓差的方法、利用超聲波的方法等。利用滲透壓差時(shí)，可相對于全血(或血細(xì)胞)添加2~IOO倍體積量的純水進(jìn)行溶血。另外，也可在試樣中添加表面活性劑進(jìn)行溶血。(蛋白酶處理)使蛋白酶作用于進(jìn)行了溶血的保存后全血試樣。通過該處理，切出上述試樣中的Hb的(3鏈N末端纈氨酸或含上述N末端纈氨酸的多肽((3鏈N末端多肽)，由此，使下述的FAOD能更高效地作用于Hb的糖化部分(卩4連N末端纈氨酸)。上述蛋白酶可使用例如金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、絲氨酸羧肽酶、蛋白酶K、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、豬胰腺來源的胰蛋白酶、枯草芽孢桿菌(5ac〃/i^si^"/")來源的蛋白酶、米曲霉(^i7erg77/worvz"e)來源的蛋白酶等，優(yōu)選內(nèi)切蛋白酶。市售品例如可舉出金屬蛋白酶(商品名、7—夕k4公司生產(chǎn))、蛋白酶A"7t乂，，G(商品名、天野工>if4厶公司生產(chǎn))、蛋白酶M"7T乂"G(商品名、天野工歹f4厶公司生產(chǎn))、蛋白酶S"77乂，，G(商品名、天野工7if4厶公司生產(chǎn))、肽酶R(商品名、天野工7f4厶公司生產(chǎn))、木瓜蛋白酶M-40(商品名、天野工7f>f厶公司生產(chǎn))、蛋白酶N(商品名、7A力公司生產(chǎn))、蛋白酶N"7T乂"(商品名、天野制藥公司生產(chǎn))、芽孢桿菌屬(Bacillus)來源的金屬蛋白酶(商品名、卜3f—厶東14洋紡公司生產(chǎn))等。其中特別優(yōu)選能與I3鏈N末端特異性作用、催化N末端多肽斷裂反應(yīng)的蛋白酵(例^口，曰本凈爭開2000-300294號7>才艮、曰本特開2004-344052號公報(bào)等)。另外，催化(3鏈N末端纈氨酸斷裂反應(yīng)的蛋白酶可舉出例如國際公開第2000/50579號小冊子(日本特許3668801)、國際公開第2000/61732號小冊子、日本特開2002-315600號公報(bào)等公開的蛋白酶。i^反應(yīng)液中蛋白酵的添力口比例例^口在0.001~300，000KU/L的范圍，優(yōu)選為O.Ol~30,000KU/L，特別優(yōu)選為0.1~1000KU/L。上述反應(yīng)液中的Hb濃度為0.005mM時(shí)，蛋白酶的添加比例例如在O.Ol~300，000KU/L的范圍，優(yōu)選為0.05~30,000KU/L，特別優(yōu)選為O.l~10，000KU/L。蛋白酶的活性單位"U，，為以每分鐘內(nèi)能增加相當(dāng)于l微摩爾酪氨酸在275nm的吸光度的酶量作為1U。上述蛋白酶處理優(yōu)選例如在緩沖液中進(jìn)行，可使用Tris-鹽酸緩沖液、EPPSi爰沖液、PIPES緩沖液、磷酸》爰沖液、ADA緩沖液，檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液等。另外，蛋白酶反應(yīng)液的pH例如在4~IO的范圍，優(yōu)選為6~9。蛋白酶處理的條件無特別限制，處理溫度例如在IO~40°C的范圍，優(yōu)選為2537。C。處理時(shí)間例如在l~IOO分鐘左右，優(yōu)選為1~IO分鐘。另外，該蛋白酶處理例如可在以下所示的促進(jìn)化合物存在下進(jìn)行。若在這些促進(jìn)化合物存在下對Hb進(jìn)行蛋白酶處理，可實(shí)現(xiàn)蛋白酶處理的高效率和縮短。另外，由于可高效地進(jìn)行蛋白酶處理，例如，也不需要增加處理中使用的蛋白酶的量。上述促進(jìn)化合物可舉出下述式(I)所示的化合物。R—X(I)上述式(I)中，R為碳原子數(shù)9以上的烷基、取代烷基、酰基或取代?；＞唧w例子可舉出碳原子數(shù)9~16的直鏈烷基或直鏈?；Ｌ荚訑?shù)10~40且主鏈碳原子數(shù)9~16的支鏈烷基或支鏈?；⒒虮画h(huán)烷基取代的直鏈烷基(例如，環(huán)烷基的碳原子數(shù)為3~8,除環(huán)烷基外的直鏈的碳原子數(shù)為413)等。上述環(huán)烷基可舉出例如環(huán)己基、環(huán)戊基、環(huán)丁基等。上述式(I)中，X為糖殘基，優(yōu)選為例如單糖或二糖的殘基。上述單糖可舉出例如甘露糖苷、葡萄糖苷、硫代葡萄糖苷等。二糖可舉出麥芽糖苷、吡喃果糖-吡喃葡萄糖苷、硫代麥芽糖苷等。這些糖的構(gòu)象可為a、(3、'D、L的任意一種。另外、鍵合在糖的環(huán)結(jié)構(gòu)上的氫以及OH基的氫可^皮例如Na、K、卣素等取代。此外，本發(fā)明中，將介于R與糖殘基的環(huán)結(jié)構(gòu)的鍵間的原子(例如，-O-、-S-等)看作糖殘基的組成部分。上述式(I)促進(jìn)化合物的具體例子可舉出，例如，正十二烷基-J3-D-麥芽糖苷(正十二烷基-p-D-麥芽吡喃糖苷)、6-環(huán)己基己基-(3-D-麥芽糖苷、蔗糖單月桂酸酯(p-D-吡喃果糖基-a-D-吡喃葡萄糖苷單十二酸酯)、正癸基-卩-D-麥芽糖苷(正癸基-卩-D-麥芽吡喃糖苷)、正壬基-卩-D-硫代麥芽糖苷(正壬基-|3-D-硫代麥芽糖苷)、5-環(huán)己基戊基-(3-D-麥芽糖苷、十一烷基-卩-D-麥芽糖苷、正十二烷基-a卩-D-麥芽糖苷、十六烷基-p-D-麥芽糖苷、以及3-氧十三烷基-a-D-甘露糖苷等。其中，優(yōu)選上述式(I)中R(烷基鏈)的碳原子數(shù)為12以上的正十二烷基-|3-D-麥芽糖苷、蔗糖單月桂酸酯、十六烷基-(3-D-麥芽糖苷等。另外，若R的碳原子數(shù)相同時(shí)(例如、碳原子數(shù)相同的烷基與?；?，更優(yōu)選為?；?、如優(yōu)選正十二烷基-(3-D-麥芽糖苷(正十二烷基-(3-D-麥芽吡喃糖苷)。16蛋白酶處理的反應(yīng)液中，上述促進(jìn)化合物的添加比例例如在O.Ol~200mM的范圍，優(yōu)選為0.4~100mM。上述反應(yīng)液中Hb;農(nóng)度為0.005mM時(shí)，上述促進(jìn)4匕合物的添力口比例例3口在0.4~100mM的范圍，優(yōu)選為l100mM。此外、上述促進(jìn)化合物與蛋白酶的添加順序沒有任何限制，可同時(shí)添加，也可以順序不同地添加二者。蛋白酶的處理?xiàng)l件，如上所述無特別限制，同時(shí)存在促進(jìn)化合物時(shí)，其處理時(shí)間無限制，尤其是上限不受限制，例如，可進(jìn)行O.l~60分鐘左右的蛋白酶處理。處理時(shí)間優(yōu)選為O.l~45分鐘，更優(yōu)選為0.2~20分鐘，特別優(yōu)選為0.2~5分鐘。在上述促進(jìn)化合物存在下進(jìn)行蛋白酶處理時(shí)，能更迅速地切出氨基酸或多肽，因此采用上述的處理時(shí)間即可充分進(jìn)行切斷處理。另外，除上述式(I)的化合物外，上述的促進(jìn)化合物例如還可舉出硝基化合物。這些化合物可使用任意一種，也可兩種以上同時(shí)使用。硝基化合物可舉出例如亞硝酸及其鹽。硝基化合物無特別限制，例如可舉出亞硝酸鉀、亞硝酸戊酯、亞硝酸丁酯、硝化甘油、亞硝酸鈉、對硝基氯苯、三硝基甲苯、硝基苯等。進(jìn)行蛋白酶處理的反應(yīng)液中，上述硝基化合物的添加比例無特別限制，例如，上述反應(yīng)液中Hb濃度為0.005mM時(shí)，上述硝基化合物的添加比例例如優(yōu)選為0.005mM以上，更優(yōu)選為0.05~2mM。另外、在進(jìn)行下一工序的FAOD處理工序之前，優(yōu)選向試樣中添加四哇化合物。對于血液試樣這種含有抗壞血酸等還原物質(zhì)的試樣的情況下，例如可通過添加四哇化合物來避免其對測定的影響。這時(shí)，四唑化合物的添加時(shí)4幾，例如選l奪在蛋白酶處理前或蛋白酶處理后均可。另外，進(jìn)行蛋白酶處理時(shí)，若同時(shí)存在四唑化合物，例如可促進(jìn)蛋白酶的消化。上述四唑化17合物無特別限制，例如，可舉出2-(4-石典苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-二氫-四唑鹽、2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-二氫-四唑鹽、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-二氫-四唑鹽、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-二氫-四唑鹽、3，3，-(l，l，-聯(lián)苯基-4,4，-二基)-雙(2，5-二苯基)-二氫-四唑鹽、3,3，-[3,3，-二甲氧基-(1,1，-聯(lián)苯基)-4,4，-二基]-雙[2-(4-硝基苯基)-5_苯基-二氫-四唑鹽]、2，3-二苯基-5-(4-氯苯基)四唑鹽、2,5-二苯基-3-(對二苯基)四唑鹽、2,3-二苯基-5-(對二苯基)四唑鹽、2,5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鹽、2,5-二苯基-3-(間曱苯基)四唑鹽、2，5-二苯基-3-(對甲苯基)四唑鹽、2，3-二苯基-5-(2-p塞吩基)四唑鹽、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-曱氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨曱?；?苯基]-二氫-四唑鹽、2，2，-二苯并噻唑基-5，5，-雙[4-二(2-磺乙基)氨甲?；交鵠-3，3，-(3，3，-二甲氧基-4，4，-亞聯(lián)苯基)二四唑鹽、3-(4,5-二甲基-2-漆峻基)-2，5-二苯基-二氫-四唑鹽、2,3-二苯基-5-氰四唑鹽、2，3-二苯基-5-羧基四唑鹽、2，3-二苯基-5-曱基四唑鹽、2,3-二苯基-5-乙基四唑鹽等，特別優(yōu)選為2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-二氫-四峻鹽。上述四唑化合物的添加量無特別限制，例如，優(yōu)選每l(iL試樣中添加O.OOl~lOOpmol，更優(yōu)選在0.005~10pmol的范圍，特別優(yōu)選在O.Ol~ljimol范圍內(nèi)。(FAOD處理工序)隨后，向上述蛋白酶處理后的反應(yīng)液中添加FAOD。使FAOD作用于Hb片段N末端纈氨酸的糖化部分，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)。通過該FAOD處理，例如，如下所示，4吏結(jié)合于N末端纈氨酸的糖游離出來，生成過氧化氫。上述FAOD無特別限制，優(yōu)選能作用于a-氨基被糖化的氨基酸或多肽，催化過氧化氫與a-酮醛發(fā)生反應(yīng)的酶(以下稱"FAOD-a")。這種催化反應(yīng)，例如可用下述式(1)表示。R1-CO-CH2-NH-R2+H20+02—R^—CO—CHO+NH2—R2+H202...(1)上述式(1)中，W指羥基或來源于糖化反應(yīng)前的糖的殘基(糖殘基)。若反應(yīng)前的糖為醛糖時(shí)，上述糖殘基(R"為醛糖殘基，若反應(yīng)前的糖為酮糖時(shí)，上述糖殘基(R1)為酮糖殘基。例如，反應(yīng)前的糖為葡萄糖時(shí)，雖然可通過阿馬道里重排使反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為果糖結(jié)構(gòu)，但這時(shí)糖殘基(R1)為葡萄糖殘基(醛糖殘基)。此糖殘基(R1)例如可表示為-[CH(OH)]n-CH2OH,其中n為06的整數(shù)。上述式(1)中，R無特別限制，例如，為下述式(2)所示的氨基酸殘基或多肽殘基。-CHR3-CO-R4...(2)上述式(2)中，113表示氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，R"表示羥基、氨基酸殘基或多肽殘基，例如，可用下述式(3)表示。下述式(3)中，n為0以上的整數(shù)，如上所述，113表示氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)，氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)可以全部相同，也可相互不同。-(NH-CHR3-CO)n-OH...(3)這種FAOD-a,例如，可以使用國際公開第2004/029251號小冊子記載的果糖胺氧化酶、日本特開2004-275013號公報(bào)與日本特開2004-275063號公報(bào)記載的果糖胺氧化酶、青霉屬來源的FAOD(日本特開平8-336386號公報(bào))等。使用這些FAOD,例如即使p鏈N末端纈氨酸以外被糖化，也難以作用于纈氨酸糖化部分以外的糖化部分，因此，能以更高的精度進(jìn)行HbAlc觀'J定。FAOD還可具有上述(1)以外的底物特異性。這類FAOD可舉出例如可作用于上述被糖化的a-氨基與^皮糖化的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)雙方的FAOD(以下稱"FAOD-aS")。具體例子可舉出例如商品名FPOX-CE(軒少-一7>7>司生產(chǎn))，商品名FPOX-EE(軒73—T7公司生產(chǎn))，市售的商品名為FOD(旭化成公司生產(chǎn))、赤霉(Gibberella)屬來源的FAOD(日本特開平8-154672號/>才艮)、鐮孢菌(fusarium)屬來源的FAOD(日本特開平7-289253號公報(bào))、曲霉菌(aspergillus)屬來源的FAOD(WO97/20039)等。這些FAOD例如可通過適當(dāng)選擇蛋白酶的種類，并且與能特異切斷j3鏈N末端氨基酸或多肽的蛋白酶進(jìn)行組合，可抑制蛋白酶作用于其他糖化位點(diǎn)。FAOD處理優(yōu)選與上述蛋白酶處理同樣地在緩沖液中進(jìn)行，上述緩沖液無特別限制，可使用與上述蛋白酶處理相同的緩沖液。FAOD處理的條件無特別限制，反應(yīng)液的pH可例如為6~9，處理溫度例如在10-38。C的范圍，優(yōu)選為2537。C。處理時(shí)間也無特別限制，例如為O.l~60分鐘，優(yōu)選為O.l~5分鐘。FAOD處理的反應(yīng)液中，F(xiàn)AOD的添加比例例如在O.Ol~50KU/L的范圍，優(yōu)選為0.5~10KU/L。FAOD的活性"U"定義為以果糖基纈氨酸作為底物，1分鐘內(nèi)催化生成1微摩爾過氧化氫的酶量為1U。(氧化還原反應(yīng)的測定)下面，對上述糖化部分與FAOD的氧化還原反應(yīng)進(jìn)行測定。該測定可舉出例如測定由上述反應(yīng)生成的過氧化氫量、或測定上述反應(yīng)消耗的氧量。上述過氧化氫量的測定例如可如下進(jìn)行使用氧化物酶(POD)、通過氧化而顯色的底物，通過這些與過氧化氫反應(yīng)使上述底物顯色，測定其顯色程度。另外，過氧化氬量除可通過使用POD等的酶法測定外，還可用電學(xué)方法進(jìn)行測定。上述通過氧化而顯色的底物(顯色底物)無特別限制，例如，可舉出N-(羧甲基氨羰基)-4,4，-雙(二曱氨基)二苯胺鈉(商品名D4-64、和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))，10-(羧甲基氨羰基)-3,7-雙(二甲氨基)吩噻嗪或其鹽(例如，商品名DA-67，和光純藥乂>司生產(chǎn))、N，N,N，，N，，N",N"-六(3-磺丙基)-4，4，，4"-三氨基三苯基甲烷六鈉鹽(例如，商品名TPM-PS,同仁化學(xué)公司生產(chǎn))、N-(羧甲基氨曱?；?-4，4，-雙(二甲氨基)二苯胺鈉、鄰苯二胺(OPD)、Trinder試劑與4-氨基安替比林共同組成的底物等。Trinder試劑可舉出，例如苯酚、苯酚書于生物、苯胺4汁生物、萘酚、萘酚彩f生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除4-氨基安替比林外，還可使用氨基安替比林衍生物、香蘭素二胺磺酸、曱基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、石黃4匕甲基苯并p塞唑啉酮月宗(sulphonatedmethylbenzothiazolonehydrazone,SMBTH)等。反應(yīng)液中上述顯色底物的添加比例在0.001~10mM的范圍，優(yōu)選為0.004~2mM。POD反應(yīng)優(yōu)選與上述蛋白酶處理同樣地在緩沖液中進(jìn)行，可使用上述那樣的緩沖液。POD處理的條件無特別限制，反應(yīng)液的pH例如為59。處理溫度例如在1040。C的范圍，優(yōu)選為25~37°C。處理時(shí)間無特別限制，例如為0.15分鐘。POD反應(yīng)液中POD的添加比例在O.Ol~300KU/L的范圍，優(yōu)選為0.5~40KU/L。另夕卜，上述反應(yīng)液中的顯色底物添加比例例如在0.001~10mM的范圍，優(yōu)選為0.004~2mM。POD的活性"U，，定義為l分鐘內(nèi)能氧化l微摩爾愈創(chuàng)木酚的酶量為1U。如上所述，使用顯色底物時(shí)，用例如分光光度計(jì)測定其顯色(例如，反應(yīng)液的吸光度)即可。因過氧化氫量對應(yīng)于Hb的N末端纈氨酸的糖化量(即HbAlc量，也稱HbAlc濃度、糖化濃度)，從而可由測定的吸光度推算出N末端纈氨酸的糖化量。這樣就能測定HbAlc量。隨后如下述式所示，通過計(jì)算Hb的N末端纈氨酸的糖化量(HbAlc量)與試樣中總Hb量(Hb濃度)之比(百分比)，即可得到HbAlc0/。(HbAlc比例)。此外，Hb量可l吏用目前已知的方法或市售的試劑盒進(jìn)行測定。HbAlc%=((3鏈N末端纈氨酸的糖化量/Hb量)xioo從吸光度計(jì)算N末端纈氨酸糖化量，例如可用標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行，上述標(biāo)準(zhǔn)曲線為Hb的N末端纈氨酸的已知糖化量對吸光度作圖而得到。例如，對于N末端纈氨酸糖化量已知的Hb標(biāo)準(zhǔn)液，與上述同樣進(jìn)行吸光度測定，作出顯示該標(biāo)準(zhǔn)液的測定值與已知的糖化量的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在該標(biāo)準(zhǔn)曲線中代入如上測定得到的吸光度，即可算出N末端纈氨酸的糖化量(HbAlc量)。另外，上述顯色底物如上所述，無特別限制，例如，優(yōu)選上述DA-67這樣的、通過與過氧化氫反應(yīng)生成亞甲基藍(lán)的底物。這種顯色底物所生成的亞曱基藍(lán)，因在相對較長的波長側(cè)(約666nm)有極大的吸收，從而，例如即使全血試樣中存在在500nm附近或其以下的波長范圍具有吸收的成分時(shí)，也可避免這些成分引起的吸光度變動(dòng)，從而以更高的可靠性進(jìn)行測定。另外，-使用此類顯色底物時(shí)，優(yōu)選向上述反應(yīng)液中進(jìn)一步添加22后文所述的染料物質(zhì)后，再進(jìn)行吸光度測定。通過同時(shí)存在有這些染料物質(zhì)，能夠在更長的波長側(cè)(660nm以上)對亞甲基藍(lán)進(jìn)4亍一全測，^旦具體才幾理尚不明確。因此，例如即^f吏全血試樣中含有在660nm處有吸收的成分，也可以避免其影響，可以更高的可靠性進(jìn)行測定。此外，上述染料物質(zhì)的添加時(shí)機(jī)只要是在吸光度測定前即可，其他無任何限制。例如，可在亞曱基藍(lán)生成前或生成后添加，亦可與上述顯色底物、氧4匕酶同時(shí)添加。上述染料物質(zhì)可舉出例如5-羥基-1-(4-磺苯基)-4-(4-磺基苯偶氮)-3-吡唑羧酸或其鹽(例如，三鈉鹽)、6-羥基-5-(4-磺基苯偶氮)-2-萘磺酸或其鹽(例如，二鈉鹽)、3-羥基-4-(4-磺基萘偶氮)-2,7-萘二磺酸或其鹽(例如，三鈉鹽)、7-羥基-8-(4-磺基萘偶氮)-1,3-萘二磺酸或其鹽(例如，三鈉鹽)或水合物(例如，11/2水合物)等，這些鹽或水合物可舉出，例如，市售品酒石黃、食用黃5號，食用紅2號，食用紅102號等。此外，還可舉出3，，6，-二羥基-2',4，，5',7，-四碘螺[異苯并呋喃-l(3H),9'-(9H)貼噸]-3-酮或其鹽(例如，二鈉鹽)或水合物(例如，一水合物)、3，，6，-二羥基-2'，4，，5，,7'-四溴-4，5，6,7，-四氯螺[異苯并呋喃-1(3H),9，-[9H]口占噸]-3-酮或其鹽(例如，二鈉鹽)、4，5，6,7-四氯-3，,6，-二羥基-2，,4，，5，，7，-四硪螺[異苯并呋喃-1(3H),9，-[9H]卩占噸]-3-酮或其鹽(例如，二鈉鹽)等，這些鹽或水合物，例如，可使用食用紅3號，食用紅104號，食用紅105號等。另外，也可使用花青素聚合物(例如，市售的可可色素(CacaocolorfromTheobtomacacaoLINNE))與棉色素(JapanesepersimmoncolorfromDipospyroskakiTHUNB.)等。上述染料物質(zhì)的添加比例無特別限制，但相對每摩爾顯色底物，例如，為O.l~1000摩爾，優(yōu)選為1~500摩爾，更加優(yōu)選為2100摩爾，另外，其在反應(yīng)液中的終濃度為，例如，10—6~0.1mol/L,其中優(yōu)選為10_5~0.05mol/L,更加優(yōu)選為0.00005~0.03mol/L。測定HbAlc量與HbAlc。/。時(shí)，各處理工序可分別如上所述進(jìn)行，但也可采用例如以下所示的組合同時(shí)進(jìn)行各處理。另夕卜，蛋白酶、FAOD、POD、顯色底物的添加順序亦無特別限制。1:溶血處理+蛋白酶處理2:-容血處理+蛋白酶處理+FAOD處理3:溶血處理+蛋白酶處理+FAOD處理+POD處理4:蛋白酶處理+FAOD處理5:蛋白酶處理+FAOD處理+POD處理6:FAOD處理+POD處理第l種HbAlc測定方法也可通過以下試劑盒進(jìn)行。上述試劑盒只需能夠?qū)嵤┥鲜霰景l(fā)明的第l種HbAlc測定方法即可，其組成不受限制，例如可舉出第l試劑為含F(xiàn)AOD及氧化酶的試劑，第2試劑為含有蛋白酶及顯色底物的試劑。使用這種試劑盒時(shí)，例如，將含血紅蛋白試樣與第l試劑混合后，再添加第2試劑，蛋白酶處理、FAOD處理、顯色反應(yīng)即可全部開始。上述第l試劑，除含有FAOD及氧化酶(例如，POD)夕卜，例如，還可含有緩沖劑、上述促進(jìn)化合物、上述染料物質(zhì)等。另外，第2試劑，除含蛋白酶及顯色底物外，例如，還可含有緩沖劑與上述染料物質(zhì)。各試劑中各成分的含有比例無特別限制，但優(yōu)選制備成反應(yīng)液中的濃度在上述范圍內(nèi)。第2種HbAlc測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的第2種HbAlc測定方法，含有下述(A2，)~(D)的工序(A2，)向保存后的全血中添加強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的工序，上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的正離子為選自K+、Na+以及Mg"所《且成的組中的至少一種離子，且上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的負(fù)離子為選自C1—、so42—以及NCT所組成的組中的至少一種離子(保存后的全血試樣的制備)(B)對保存后的上述含血紅蛋白試樣進(jìn)行蛋白酶處理，切斷上述含血紅蛋白試樣中的血紅蛋白的工序(C)使果糖胺氧化酶作用于通過上述(B)工序得到的血紅蛋白片段的糖化部分的工序(D)通過測定上述糖化部分與果糖胺氧化酶的氧化還原反應(yīng)來確定HbAlc的量的工序根據(jù)本發(fā)明的第2種HbAlc測定方法時(shí)，即使血紅蛋白含有物由于保存產(chǎn)生二氧化碳、Hb的立體結(jié)構(gòu)成為脫氧型的情況下，也可通過添加上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)，防止保存所導(dǎo)致的HbAlc測定值的變動(dòng)。認(rèn)為這是由于即使由于保存產(chǎn)生二氧化碳、Hb變?yōu)槊撗跣蜁r(shí)，也可以通過強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)4吏與Hb結(jié)合的二氧化碳解離(除去)，由此使Hb的立體結(jié)構(gòu)重新變?yōu)檠鹾闲汀５?種HbAlc測定方法，其特征在于，向保存后的血紅蛋白含有物中添加上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)，其他工序中的條件等不受任何限制。通過向上述保存后的血紅蛋白含有物中添加上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)，由此，通常情況下，上述(B)工序在上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)存在下進(jìn)行蛋白酶處理。另外，上述(B)工序及(C)工序例如可在同一反應(yīng)液中同時(shí)進(jìn);f亍。上述(D)工序例如可與上述(C)工序(及上述(B)工序)同時(shí)進(jìn)行。下文舉一個(gè)以全血作為Hb含有物進(jìn)行保存的例子對本發(fā)明的第2種HbAlc測定方法進(jìn)行說明。但本發(fā)明不受此例限制，例如對于稀釋全血、溶血后的全血、血細(xì)胞、精制Hb等Hb含有物也可同樣進(jìn)行。另外，第2種HbAlc測定方法，除上述(A2，)外，不受任何限制。第2種HbAlc測定方法除特別說明外，與上述第l種HbAlc測定方法同樣進(jìn)行。此外，上述第2種HbAlc測定方法中的(B)~(D)的工序，分別對應(yīng)上述第l種HbAlc測定方法中的(B)~(D)的工序，若無特別說明則二者為同樣的工序。(全血的保存)首先^人待測者采集全血，保存至HbAlc測定時(shí)。此外，在HbAlc測定中，保存全血并非必須步驟，但本發(fā)明的目的是為了抑制保存引起的HbAlc值的變動(dòng)，因此優(yōu)選在需要進(jìn)行全血保存的情況下應(yīng)用本發(fā)明。該實(shí)施方式與上述第l種HbAlc測定方法不同，不需在上述糖酵解抑制劑存在下保存全血。從而，對例如采血管的種類無任何限制，例如可使用不含糖酵解抑制劑的采血管等。(溶血處理)對保存后的全血進(jìn)行溶血處理。溶血處理的條件，例如與上述第l種HbAlc測定方法相同。此外，上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)在溶血處理的之前、之后添加均可。(強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的添加)向上述溶血后的全血中添加上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)。由此，可制備供HbA1c測定的保存后的全血試樣。上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)可舉出例如KC1、K2S04、KNO、NaCl、Na2S04、NaNO、MgCl2、MgS04以及Mg(NO)2。此外也可使用例如Ca(NO)2等。其中優(yōu)選KC1、NaCl、K2S04、MgS04。另外，強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)可以使用任意一種，也可同時(shí)使用兩種以上。同時(shí)使用二種以上強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)時(shí)，其組合不受任何限制。26例如，可舉出KC1與MgS04的組合、NaCl與MgS04的組合、K2S04與MgS04的組合。本發(fā)明中，上述含強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的試劑作為處理試劑，用于減少保存后的全血中與Hb結(jié)合的二氧化破。該處理試劑中例如還可含有蛋白酶。強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)相對于全血的添加比例例如為每lml全血中為53000mo1，優(yōu)選為8~lOOOmol。另夕卜，后一工序中的蛋白酶處理的反應(yīng)液的強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的濃度例如為10~3000mmol/L，<尤選為40~1000mmol/L,凈爭另'J<尤選為40~350mmol/L。上述反應(yīng)液中的Hb的濃度為0.005mM時(shí)，上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的添加比例例如為10~3000mmol/L,優(yōu)選為40~lOOOmmol/L,特另'j優(yōu)選為40~350mmol/L。另外，除上述這種未處理的全血以外，例如對稀釋全血、溶血后的全血、血細(xì)胞、精制Hb等進(jìn)行保存時(shí)，可用強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)同樣進(jìn)行處理。強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的添加比例無特別限制，例如將稀釋全血、溶血后的全血、血細(xì)胞、精制Hb等換算成全血的量，按上述的范圍添加強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)即可。其他工序亦同樣。(蛋白酶處理)在上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)存在下，用蛋白酶對上述溶血后的全血試纟羊進(jìn)4于處理。此外，蛋白酶處理中，上述反應(yīng)液中優(yōu)選含有NaOH和Tris(三羥曱基氨基曱烷)中的至少一種。通過添加這些化合物，能更加有效地抑制凍存全血試樣的情況下的HbA1c變動(dòng)。此外，上述第1種HbAlc測定方法中也同樣。凍存的溫度例如為-15°C~-80°C，通常為-80°C。上述反應(yīng)液中NaOH的添力口比侈'H列^口為5~3000mmol/L，{尤選為30~1000mmol/L,特另'H尤選為40~350mmol/L。另夕卜，Tris的添力口比例例^口為5~3000mmol/:L,4尤選為30~lOOOmmol/L,凈爭另'H尤選為40~350mmol/L。蛋白酶處理后，與上述第l種HbAlc測定方法相同，通過FAOD處理、測定氧化還原反應(yīng)，即可算出HbAlc。如上所述的第2種HbAlc測定方法，例如也可4吏用下述的試劑盒進(jìn)行。上述試劑盒只需能夠執(zhí)行上述本發(fā)明中第2種HbAlc測定方法即可，其具體組成不受限制。例如，可舉出第l試劑為含F(xiàn)AOD、氧化酶以及上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的試劑，第2試劑為含有蛋白酶及顯色底物的試劑。4吏用這類試劑盒時(shí)，例如將全血與第l試劑混合后，再添加第2試劑，由此，蛋白酶處理、FAOD處理、顯色反應(yīng)即可全部開始。上述第l試劑，除FAOD、氧化酶(例如，POD)及上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)外，例如還可含有上述的NaOH、Tris，此外還可含有緩沖劑、上述促進(jìn)化合物、上述染料物質(zhì)等。另外，第2試劑，例如，除蛋白酶及顯色底物外，還可含有緩沖液、染料物質(zhì)。各試劑中，各成分的含有比例無特別限制，但優(yōu)選制備成反應(yīng)液中的濃度在上述范圍內(nèi)。以下舉實(shí)施例來對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明不受限于此。實(shí)施例1將使用各種采血管采集的全血保存后，測定HbAlc。/。，判斷是否存在HbAlc。/。的變動(dòng)。使用下述采血管采集健康人的全血，將上述全血在上述采血管中密封保存。4。C放置上述采血管15天后，對全血的Hb及HbAlc進(jìn)行測定。(采血管)H管肝素鈉采血管(terumocorporation生產(chǎn))DK管EDTA-K采血管(terumocorporation生產(chǎn))FH管氟化鈉+肝素鈉采血管(terumocorporation生產(chǎn))(第l試劑)FPOX-CE1.5KU/LPOD10KU/LPIPES30mmol/L(pH7)正十二烷基-al3-D-麥芽糖苷2.5g/LKN024mmol/L酒石黃*_0.15g/L_*5-羥基-1-(4-磺苯基)-4-(4-磺基苯偶氮)-3-吡唑羧酸三鈉鹽(下同)(第2試劑)金屬蛋白酶(7—夕k4公司生產(chǎn))CaCl2TrisMES十六烷基三曱基氯化銨酒石黃DA-67(和光純藥7>司生產(chǎn))<HbA1c%的測定方法>將放置15日后的全血用純化水稀釋26倍，在該稀釋液6.5(iL中加入6.5nL純化水作為試樣。13[iL該試樣中加入上述第l試劑78pL,混合后37。C下孵育5分鐘。將反應(yīng)液在571nm/751nm波長處測定吸光度(B!),以及在694nm/751nm波長處測定吸光度(Ai)。隨后，再往上述反應(yīng)液中添加上述第2試劑19.5|iL,37°C下孵育5分鐘，再次將上述反應(yīng)液在694nm/751nm波長處測定吸光度(A2)。隨后，如下述式中所示，從第2次的吸光度值(A2)中減去乘以體積變化修正值[(13+78)/(13+78+19.5)]后的第l次的吸光度值(AJ,所得值即為與全血試樣中HbAlc濃度相當(dāng)?shù)奈舛?HbAlc吸光度)。此外，第l次在571nm/751nm波長處測定的吸光度值(Bi)與試樣中的Hb濃度相當(dāng)(Hb吸光度)。測定采用生化自動(dòng)分析裝置(商品名JCA-BM8:日本電子公291謂KU/L5mmol/L70mmoI/L30mmol/L(pH5.5)0.2g/L0.10g/L0.03mmol/L司制)進(jìn)行。另外，作為對照，用剛采集的全血和純化水替代全血，進(jìn)行同樣的吸光度測定。另外，將本操作測得的吸光度代入預(yù)先作成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求出HbAlc。/。。上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的作法為用HbAlc。/。已知的標(biāo)準(zhǔn)試樣進(jìn)行相同的吸光度測定，將上述吸光度值對HbAlc。/。值作圖。本實(shí)-驗(yàn)結(jié)果如下述表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>Alc/Hb=[Alc(mAbs.)-純化水(mAbs.)]/[Hb(mAbs.)-純化水(mAbs.)]如上述表2中所示，使用僅含肝素鈉的采血管與含EDTA-K的采血管采集的全血，經(jīng)放置后可見吸光度降低、結(jié)果導(dǎo)致HbAlc。/。降低。這是由于放置時(shí)全血中產(chǎn)生二氧化碳，使氧合型Hb轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣虷b,乂人而蛋白酶難以作用在Hb的p《連N末端側(cè)。對此，使用含氟化鈉的采血管時(shí)，即使采集后的全血經(jīng)放置15天后，HbAlc%的結(jié)果也基本看不出變動(dòng)。即，在氟化鈉存在下，即使從患者采集的全血經(jīng)過保存，保存后與剛采血后同樣，不會(huì)發(fā)生HbAlc。/。變動(dòng)，從而可實(shí)現(xiàn)更高精度的測定。此外，還通過HPLC法確認(rèn)了保存過程中HbAlc。/。沒有發(fā)生變動(dòng)。即，在與上述同樣的條件下，用上述氟化鈉采血管采集全血后，血液存于上述管中原樣;故置。隨后采用HPLC法測定此全血的HbAlc。/。。測定時(shí)4吏用ADAMS-AleHA-8160(7—夕L4公司生產(chǎn))。結(jié)果表示在下表中。如下表所示，可確認(rèn)HbAlc。/o未因保存而發(fā)生變動(dòng)。HbAlc%剛采血后5.45l天后5.355天后5.617天后5.509天后5.5612天后5.51實(shí)施例2在保存后全血中添加各種添加劑，對HbAlc。/。進(jìn)行測定，觀察HbAlc。/。的變動(dòng)。使用肝素鈉釆血管(H管)釆集健康人全血，此全血于冰箱中保存2周后，對全血的Hb及HbAlc進(jìn)行測定。此外，HbAlc%的測定方法中，除用下述第1-2試劑替換第l試劑外，其余操作均與上述實(shí)施例l相同。下述第1-2試劑中的PIPES/KOH的配制方法為在30mmol6々PIPES中添力口KOH"i周整至pH7,再力口7K至1L。[表3](第1-2試劑)FPOX-CEPODPIPES/KOH正十二烷基-ap-D-麥芽糖苷KN02酒石黃*力口劑1.5KU/L10KU/L30mmol/L(pH7)2.5g/L4mmol/L0.15g/L規(guī)定量另夕卜，以4吏用下述表4中所示的添加劑(No.l~22)的體系作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，然后對用與實(shí)施例l同樣的氟化鈉+肝素鈉的采血管(FH管)采集的全血與實(shí)施例l同樣保存后，對HbAlc0/。進(jìn)行測定。在實(shí)施例l中已經(jīng)證明，使用FH管采集的全血進(jìn)行保存后，能充分抑制HbAlc。/。的降低。因此，使用H管采集全血，并對加入了各種添加劑后的體系進(jìn)行HbAlc測定，其測定值若與使用FH管采集的全血測定值相近似，則說明加入了上述添加劑的體系能防止HbAlc值的降低。實(shí)3全結(jié)果如下述表5及表6所示。32<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>—aoCOCOCO—z絲o望FH管(標(biāo)準(zhǔn))蔬FH管(標(biāo)準(zhǔn))《￡+FH管(標(biāo)準(zhǔn))苗譯新、m>蔬FH管(標(biāo)準(zhǔn))緊頭蔬FH管(標(biāo)準(zhǔn))sFH管(標(biāo)準(zhǔn))紫關(guān)晶嘞輛紫:_________i——FH管(標(biāo)準(zhǔn))純化水嗽FH管(標(biāo)準(zhǔn))純化水sFH管(標(biāo)準(zhǔn))筠甚CO知COCOCOCOCOCOCO<JIOS(S3COhoenNOS3cnAleOnAbs)COCOcnonCOsiCOCO<3>o>COCOSienCOor浮ogon0.03710.0350,037i0,04310-0410.0370,0410.0350.037j0,0530.0490.0530,0550.0350.0370.卿！0.0600.0410.05611A1c/Hb313Mi03COr°213hoCOCOCOCOCO嘗HbAM，6<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>如表所示，與實(shí)施例1中所示的用FH管采集的全血相比，使用未加入KC1等添加劑l的體系中，H管采集的全血的HbAlc%因保存大幅度降低。與此相對，用H管采集全血并保存，測定時(shí)加入了含KC1等的添加劑(添加劑No.222)的體系中，即使是保存后的全血，也可得到與使用FH管時(shí)同等的HbAlc%值，可通過上述添加劑抑制HbAlc。/。的降低。實(shí)施例3用肝素管采集全血后立即置于-80。C保存(60天)。此后在室溫解凍后測定全血的HbAlc。/。，4全測其變動(dòng)。此外，凍存全血后，使用下述表7中的添加劑作為第1-2試劑中的添加劑，且使用PIPES/Tris或PIPES/NaOH代替上述第1-2試劑中作為緩沖液的PIPES/KOH,除此之外均與上述實(shí)施例2相同，進(jìn)行HbA1c%的測定。得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下述表8中所示<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>如上述表8中所示，與實(shí)施例1中所示的用FH管采集的全血相比，使用未加入KC1等的添加劑l的體系因經(jīng)過-80。C凍存，其HbAlc。/o大幅度降低。與此相對，在使用添力。劑23~31的體系中，即使用H管采集的全血經(jīng)過保存后，也可得到與使用FH管時(shí)同等的值，可抑制HbAlc。/o的降低。實(shí)施例4在經(jīng)保存的全血中加入添加劑(K2S04AMgS04)后，進(jìn)行HbAlc。/。的測定，觀察HbAlc。/。的變動(dòng)。上述實(shí)施例3的第1-2試劑中，加入K2SQ4(60mmol/L)及MgS04(40mmol/L)作為添力p劑。并將其作為第1-2試劑。隨后用肝素鈉采血管(H管)或EDTA-2K采血管采集健康人的全血，以裝入上述采血管的狀態(tài)將全血在冰箱中保存規(guī)定時(shí)間(0、1、4、6、ll天)后，測定全血的Hb及HbAlc。HbAlc。/。的測定方法中，除使用上述第l-2試劑代替第1試劑以外，均與上述實(shí)施例1相同。此外，在第1-2試劑中添加純化水代替K2S04及MgS04,使用此第1-2試劑作為對照。所得結(jié)果如下述表9中所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>單位HbAlc%如上述表9中所示，用任一采血管采集的全血，對照的測定值都隨時(shí)間推移而降低。與此相對，實(shí)施例在K2S04及MgS04的存在下進(jìn)行測定，因此觀察不到HbAlc。/。值的變動(dòng)。生產(chǎn)上的利用可能性如上所述，采用本發(fā)明，即使全血試樣經(jīng)過保存的情況下，也可防止HbAlc的測定值的變動(dòng)，因而能夠以與剛采集的全血同樣的精度測定HbAlc。由于這樣能排除保存對HbAlc測定值的影響，因此，在必須進(jìn)行全血保存、例如在與采集全血的地點(diǎn)不同的地點(diǎn)進(jìn)行測定的情況下，可稱為是相當(dāng)有用的方法。權(quán)利要求1.一種制備方法，其特征在于，其為HbA1c的測定方法中使用的含血紅蛋白試樣的制備方法，包含下述(A1)或(A2)的工序(A1)在抑制二氧化碳產(chǎn)生的狀態(tài)下，保存血紅蛋白含有物的工序，(A2)從保存后的血紅蛋白含有物中，減少與血紅蛋白結(jié)合著的二氧化碳的工序。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其中，在所述(A1)工序中，在糖酵解抑制劑的存在下，保存血紅蛋白含有物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其中，所述糖酵解抑制劑為氟化鈉和氟化鉀中的至少一種。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其中，在所述(A2)工序中，向所述保存后的血紅蛋白含有物中添加強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)，所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的正離子為選自K+、Na+以及Mg^所組成的組中的至少一種離子，且所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的負(fù)離子為選自cr、S042—以及NCT所組成的組中的至少一種離子。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其中，所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)為選自KC1、K2S04、KNO、NaCl、Na2S04、NaNO、MgCl2、MgS04以及Mg(NO)2所組成的組中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的制備方法，其中，所述含血紅蛋白試樣為全血試才羊或血細(xì)月包試才羊。7.—種HbAlc測定方法，其特征在于，其為測定HbAlc的方法，包含下述(A)~(D)的工序(A)通過權(quán)利要求l所述的制備方法，準(zhǔn)備保存后的含血紅蛋白試j羊的工序，(B)對保存后的所述含血紅蛋白試樣進(jìn)行蛋白酶處理，切斷所述含血紅蛋白試樣中的血紅蛋白的工序，(C)使果糖胺氧化酶作用于通過所述(B)工序得到的血紅蛋白片段的糖化部分的工序，(D)通過測定所述糖化部分與果糖胺氧化酶的氧化還原反應(yīng)來確定HbAlc的量的工序。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的HbAlc測定方法，其中，所述(A)工序?yàn)槿缦碌墓ば蛟谔墙徒庖种苿┐嬖谙卤４嫜t蛋白含有物，由此準(zhǔn)備保存后的所述含血紅蛋白試樣，在所述(B)工序中，蛋白酶處理的反應(yīng)液中的所述糖酵解抑制劑的濃度為0.01~10mol/L。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的HbAlc測定方法，其中，所述(A)工序?yàn)槿缦碌墓ば蛳虮４婧蟮难t蛋白含有物中添加強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)，由此準(zhǔn)備保存后的所述含血紅蛋白試樣，所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的正離子為選自K+、Na+以及Mg^所組成的組中的至少一種離子，且所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的負(fù)離子為選自cr、S042—以及NCT所組成的組中的至少一種離子，在所述(B)工序中，在所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)存在下進(jìn)行蛋白酶處理。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的HbAlc測定方法，其中，在所述(B)工序中，蛋白酶處理的反應(yīng)液中的所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的濃度為10~3000mmol/L。11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的HbAlc測定方法，其中，在所述(D)工序中，通過測定所述糖化部分與果糖胺氧化酶的氧化還原反應(yīng)，算出所述含血紅蛋白試樣中的血紅蛋白中的HbAlc量，再由所述含血紅蛋白試樣中的血紅蛋白量與所述HbAlc量算出HbAlc的比例。12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的HbAlc測定方法，其中，所述含血紅蛋白試樣為全血試樣或血細(xì)胞試樣。13.—種保存用試劑，其特征在于，其為權(quán)利要求l所述的含血紅蛋白試樣的制備方法中使用的、用于保存血紅蛋白含有物的保存用試劑，所述保存用試劑含有糖酵解抑制劑。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的保存用試劑，其中，所述糖酵解抑制劑為氟化鈉和氟化鉀中的至少一種。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的保存用試劑，其中，所述保存用試劑為用于抑制保存所述血紅蛋白含有物時(shí)二氧化碳的產(chǎn)生的保存用試劑。16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的測定方法，其中，所述含血紅蛋白試樣為全血試樣或血細(xì)胞試樣。17.—種處理用試劑，其特征在于，其為在權(quán)利要求l所述的含血紅蛋白試樣的制備方法中使用的、用于處理保存后的血紅蛋白含有物的處理用試劑，所述處理用試劑含有強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)，所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的正離子為選自K+、Na+以及Mg"所組成的組中的至少一種離子，且所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的負(fù)離子為選自Cr、S04^以及NO—所組成的組中的至少一種離子。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的處理用試劑，其中，所述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)為選自KC1、K2S04、KNO、NaCl、Na2S04、NaNO、MgCl2、MgS04以及Mg(NO)2所組成的組中的至少一種。19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的處理用試劑，其中，還含有蛋白酶。20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的處理用試劑，其中，所述處理用試劑為用于減少所保存的血紅蛋白含有物中的與血紅蛋白結(jié)合的二氧化碳的處理用試劑。21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的處理用試劑，其中，所述含血紅蛋白試樣為全血試才羊或血細(xì)月包試樣。22.—種測定試劑盒，其為在權(quán)利要求7所述的HbAlc測定方法中使用的試劑盒，所述測定試劑盒包含含有果糖胺氧化酶及強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)的第1試劑、以及含有蛋白酶的第2試劑。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定試劑盒，其中，所述第l試劑還含有氧化酶，所述第2試劑還含有通過氧化而顯色的底物。全文摘要本發(fā)明提供一種HbA1c的測定方法，即使對于保存后的全血試樣，亦可維持與剛采血后同等的測定精度。在糖酵解抑制劑存在下保存全血，并向保存后的上述全血試樣中添加蛋白酶，以切斷上述全血試樣中的血紅蛋白。再使果糖胺氧化酶作用于所得到的血紅蛋白片段的糖化部分，測定上述糖化部分與果糖胺氧化酶的氧化還原反應(yīng)，由此確定HbA1c糖化率。此外，代替糖酵解抑制劑存在下的全血保存，而可以向保存后的全血中添加KCl、K₂SO₄、KNO、NaCl、Na₂SO₄、NaNO、MgCl₂、MgSO₄、Mg(NO)₂等強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)，在上述強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)存在下進(jìn)行蛋白酶處理。通過這些方法，可以避免因保存全血而引起的HbA1c測定值的變動(dòng)。文檔編號C12Q1/37GK101595230SQ200880003239公開日2009年12月2日申請日期2008年1月30日優(yōu)先權(quán)日2007年1月30日發(fā)明者稻村范郎,米原聰申請人:愛科來株式會(huì)社