專利名稱：微流體和納米流體裝置、系統(tǒng)和應(yīng)用的制作方法
微流體和納米流體裝置、系統(tǒng)和應(yīng)用 交叉參考 本申請要求2007年2月5日提交的美國臨時申請?zhí)?0/899， 630 "微流體 禾口纟內(nèi)米流體裝置、系統(tǒng)禾口應(yīng)用(Microfluidic and nanofluidic devices, systems, anda卯lications)"的優(yōu)先權(quán)，通過引用將該申請全文納入本文。
有關(guān)聯(lián)邦資助的研究的聲明 本發(fā)明在以下 一 項或多項政府資助下完成國防部授予的計劃號 W911SR-04-P-0047、 NIH授予的資助號5R01HG003583、 HSARPA授予的合同號NBCHC050133、 HSARPA授予的命令號TTA-1-0014(協(xié)議號W81XWH-04-9-0012)。政府享有本發(fā)明的某些權(quán) 利。
背景技術(shù)：
過去，已經(jīng)開發(fā)了設(shè)計不同的各種微流體裝置，其目的常常是降低生物分析方法 中對樣品體積的要求、將多個步驟整合成自動化的過程、整合樣品制備和分析、以及將樣品 的整個體積和各個步驟聯(lián)系起來。 在沒有按標(biāo)準(zhǔn)控制外形尺寸形狀因素，上游和下游外部接口的特性，以及內(nèi)部微 流體通路的長度、橫截面形狀和直徑的情況下，這類微流體裝置常?；ゲ幌嗳荩⑶遗c現(xiàn)有 的上游純化和下游分析裝置不相容。 盡管顯微制造技術(shù)取得的進(jìn)展使得可能在微升，甚至納升或皮升水平進(jìn)行分析， 但首先獲得的許多生物和環(huán)境樣品的體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有微流體分析裝置的分析水平。
模塊化微流體技術(shù)可以將移動的樣品結(jié)合到微芯片上。雖然微流體領(lǐng)域的焦點(diǎn) 是將多種功能整合到單個裝置，但已通過另一種在多個裝置上模塊化地整合多種功能的 方法達(dá)到該目的。這種模塊化的理念基于以下技術(shù)，即簡單地將兩個連接器插接在一起 以連接毛細(xì)管陣列(美國專利號6，551，839 ;美國專利申請?zhí)?1/229,065 ;美國專利號 6， 190， 616 ;美國專利號6， 423， 536 ;美國專利申請?zhí)?9/770， 412 ;美國專利號6， 870， 185 ; 美國專利申請?zhí)?0/125,045 ;美國專利申請?zhí)?0/540,658 ;美國專利申請?zhí)?0/750， 533 ; 美國專利申請11/138， 018 ;通過引用將它們?nèi)募{入本文)。除產(chǎn)生連接器外，陣列間的接
口也產(chǎn)生真正的死容積為零的閥和路由選擇器。本申請?zhí)峁┤绾芜B接和斷開含流體線路的 微芯片與其他毛細(xì)管微芯片或陣列的指南，開發(fā)包含兩個、三個或多個微芯片的新型微芯
片設(shè)計，提供新功能，包括組分收集、新應(yīng)用和設(shè)備設(shè)計。這種新技術(shù)稱為模塊化納米流體 (nanofluidic)技術(shù)，在模塊化納米流體技術(shù)中使用微芯片則稱為"模塊化微流體微芯片" 或"模塊化微芯片"。 模塊化微流體微芯片在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)中具有許多應(yīng)用。模塊化微芯片產(chǎn)生的裝 置可進(jìn)行單項功能或局部聚集的群組功能。通過?？績蓚€微型裝置和轉(zhuǎn)移經(jīng)加工的樣品產(chǎn) 生更復(fù)雜的過程。例如， 一個微型裝置可進(jìn)行PCR擴(kuò)增并清除一系列靶DNA，第二微型裝置 可進(jìn)行循環(huán)測序反應(yīng)，并可連接于進(jìn)行DNA序列分析的第三裝置。相似地，在蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng) 用中，一個裝置可進(jìn)行第一維度的分離，第二裝置進(jìn)行第二正交分離。以"即插即用"方式 連接裝置的能力允許以不同速率、循環(huán)次數(shù)或通量獨(dú)立進(jìn)行這些過程?？蓽?zhǔn)備多組模塊化微芯片并在酒店中培育(incubated in hotels)。當(dāng)樣品制備過程中的一個步驟完成時，可 將下一步驟的模塊化微芯片停靠、加載和(如果需要)移動到酒店，以便進(jìn)行下一個步驟。 當(dāng)樣品制備完成后，模塊化微芯片可與高通量CAE微芯片、質(zhì)譜儀、流式細(xì)胞儀或其他分析
設(shè)備接口相連。 模塊化方法能夠讓大規(guī)模裝置如自動化裝置和機(jī)器人與納米級樣品制備和分析 一同工作?，F(xiàn)有機(jī)器人系統(tǒng)能夠滿足模塊化操作的精確定位需求，這種精度需求遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 微電子工業(yè)的需求。目前，分級(stage)和步進(jìn)電動機(jī)目前的定位精度能夠達(dá)到小于lym， 大于5 i！ m的定位精度是相當(dāng)常見的。模塊化微芯片可影響廣泛自動化能力，直接加速納米 裝置的發(fā)展和使用。 模塊化微流體方法可將基于微芯片的技術(shù)與自動化系統(tǒng)組合起來，產(chǎn)生完全自動 化納米樣品制備方法并將其與許多類型的分析聯(lián)系起來的技術(shù)平臺。在本發(fā)明中，提供如 何將本發(fā)明應(yīng)用于開發(fā)DNA序列樣品制備和分析、AFLP分析、PCR分析、MLVA分析、循環(huán)測 序、用于基因分型的DNA片段分析和DNA測序的片段分析的例子。 在本發(fā)明中，提供如何連接微量級和納米級裝置以及如何在微芯片上進(jìn)行樣品制 備和分析的指南。我們也教導(dǎo)如何連接行使專門化功能的不同微芯片，這些功能包括微芯 片閥、反應(yīng)器、流體移動、混合、進(jìn)行不同的生化反應(yīng)和分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
—方面，本發(fā)明提供包含以下組件的微流體裝置微流體層、致動層和夾在它們中 間的彈性體層，其中所述微流體層包括至少三個微流體通道，它們在連接點(diǎn)(nexus)處匯 合，并且被中斷所述至少三個微流體通道中流體流動的間斷面分隔開；致動層包括至少一 個開口于閥室的致動通道，所述閥室位于所述連接點(diǎn)的反面；其中移動所述彈性膜能調(diào)節(jié) 經(jīng)過所述至少三個微流體通道的流體流動，從而形成隔膜閥。在一個實施方式中，所述彈性 膜同時調(diào)節(jié)經(jīng)過所述至少三個微流體通道的流體流動。在另一實施方式中，所述彈性膜防 止經(jīng)過所述至少三個微流體通道的流體流動。在另一實施方式中，所述彈性膜不完全抑制 經(jīng)過所述至少三個微流體通道的流體流動。在另一實施方式中，隔膜閥還包括通路層(vias layer)。在另一實施方式中，向所述至少一個致動通道施加壓力或真空造成彈性膜調(diào)節(jié)經(jīng) 過所述間斷面的流體流動，從而形成至少一個三通道閥。在另一實施方式中，該膜天然地關(guān) 閉該閥，向該膜施加真空使該膜偏離閥座，從而打開該閥。在另一實施方式中，所述微流體 層包括朝向該膜的表面，所述表面具有溝槽，按壓該膜時，溝槽形成微流體通道。在另一實 施方式中，所述微流體層包括內(nèi)部微流體通道，這些通道與開口于連接點(diǎn)上的層中的孔相 交。在另一實施方式中，所述致動層包括朝向該膜的表面，所述表面具有溝槽，按壓該膜時， 溝槽形成致動通道。在另一實施方式中，所述致動層包括開口于閥室上的內(nèi)部致動通道。在 另一實施方式中，至少三個微流體通道以Y形匯合在連接點(diǎn)上。在另一實施方式中，多個所 述隔膜閥由 一個致動通道致動。 另一方面，本發(fā)明提供包含以下組件的微流體裝置微流體層、致動層和夾在它們 中間的彈性體層，其中所述微流體層包括第一和第二微流體通道，它們在連接點(diǎn)處匯合， 并且被中斷所述第一和第二微流體通道之間但不沿所述第二通道的流體流動的間斷面分 隔開；致動層包括至少一個開口于閥室的致動通道，所述閥室位于所述連接點(diǎn)的反面；其中移動所述彈性膜能調(diào)節(jié)橫跨所述至少三個微流體通道的流體流動，從而形成隔膜閥。在 一個實施方式中，所述第二微流體通道中的流體流動不受所述彈性膜的調(diào)節(jié)。在另一實施 方式中，彈性膜防止橫跨至少一個微流體通道的流體流動。在另一實施方式中，彈性膜不完 全抑制橫跨至少一個微流體通道的流體流動。在另一實施方式中，所述隔膜閥還包括閥層。 在另一實施方式中，向所述至少一個致動通道施加壓力或真空造成所述彈性膜調(diào)節(jié)橫跨至 少一個間斷面的流體流動。在另一實施方式中，至少兩個微流體通道以T形匯合在連接點(diǎn) 上。在另一實施方式中，多個隔膜閥由一個致動通道致動。在另一實施方式中，第二通道形 成具有確定容積的環(huán)，并包括預(yù)定容積的容積式泵。在另一實施方式中，通過打開隔膜閥和 用泵進(jìn)行多次沖程將預(yù)定體積的液體泵送到微結(jié)構(gòu)裝置的第一通道中。 另一方面，本發(fā)明提供包含以下組件的微流體裝置微流體層、致動層和夾在它們 中間的彈性膜層，其中所述微流體層包括微流體通道；所述致動層包括至少一個開口于 閥室的致動通道，該閥室沿微流體通道排布；無論是否移動彈性膜，流體都會沿通道流動， 但移動所述彈性膜能調(diào)節(jié)沿所述通道的流體流動，從而形成隔膜閥。在一個實施方式中，通 過增加或減少所述至少一個微通道的橫截面積，該彈性膜能調(diào)節(jié)流體流動。在另一實施方 式中，該隔膜閥還包括通路層。在另一實施方式中，向至少一個致動通道施加壓力或真空造 成所述彈性膜調(diào)節(jié)橫跨至少一個間斷面的流體流動。在另一實施方式中，提供在隔膜閥處 包含產(chǎn)生磁場的磁體的微流體裝置。在另一實施方式中，所述磁體選自永磁體、電磁體或稀 土磁體。在另一實施方式中，在鄰近所述隔膜閥的地方，至少一個微通道的通路形成星形或 嵌套星形。 另一方面，本發(fā)明提供包含第一微流體裝置和第二微流體裝置的系統(tǒng)第一微流 體裝置包含包含入口 、出口 、泵和至少一個第一功能組件的第一微流體線路，所述第一功 能組件選自反應(yīng)器、捕獲區(qū)、溫度循環(huán)區(qū)、熱區(qū)、冷區(qū)、分離通道、分析線路、混合器、珠加工 單元或磁體，其中將泵構(gòu)造成能夠通過所述線路泵送流體； 第二微流體裝置包含多個各自含有入口和出口的第二微流體線路，和至少一個 不同于第一功能組件的功能組件；其中所述第一和第二組件被構(gòu)造成與多個位置配合，其 中在每個位置上第一線路的出口與第二線路之一的入口相匹配，以便使流體從第一線路流 動到匹配的第二線路中。在一個實施方式中，所述第一微流體裝置還包括經(jīng)構(gòu)造能以電學(xué) 方式移動流體、分子、化學(xué)物質(zhì)或顆粒的電極。在另一實施方式中，所述第二微流體裝置還 包括分析區(qū)。在另一實施方式中，所述第二微流體裝置還包括捕獲區(qū)。在另一實施方式中， 與所述第一微流體裝置相比，所述第二微流體裝置是可移動的。在另一實施方式中，所述第 二微流體裝置的流體輸入將流體從所述第一微流體裝置遞送至多個微流體通道。在另一實 施方式中，所述第一微流體裝置的流體輸出將流體從多個微流體通道遞送至所述第二微流 體裝置的所述流體輸入。在另一實施方式中，通過電泳方式將流體、分子、化學(xué)物質(zhì)或顆粒 從所述第一微流體裝置的所述流體輸出移動到所述第二微流體裝置的所述流體輸入。另一 方面，本發(fā)明提供包括以下步驟的方法a)在權(quán)利要求26的第一微流體裝置的微流體線路 中，對第一個樣品進(jìn)行第一項操作；b)配合權(quán)利要求26所述的第一和第二微流體裝置以使 所述第一線路的輸出與所述第二微流體線路的第一個線路的入口相匹配；c)在操作后，將 第一個樣品從第一線路移動到第二線路的第一個線路中；d)在所述第二線路的第一個線 路中對接受的第一個樣品進(jìn)行第二項操作；e)在所述第一微流體線路中對第二樣品進(jìn)行第一項操作；f)配合所述第一和第二微流體裝置以使所述第一線路的輸出與第二微流體 線路的下一個不同線路的入口相匹配；g)在操作后，將第二個樣品從所述第一線路移動到 所述第二線路的下一個線路中；和h)在所述第二線路的第一個線路中對第一反應(yīng)樣品進(jìn) 行第二項操作。在一個實施方式中，提供包括在第一線路中再對至少一個樣品重復(fù)進(jìn)行步 驟e)-h)的方法，其中將各樣品移動到多個第二線路的下一個不同線路中。在另一實施方 式中，第一項操作包括將樣品與試劑混合。在另一實施方式中，在短于第二項操作的時間中 進(jìn)行第一項操作。 另一方面，本發(fā)明提供一種制備微流體裝置的方法，所述方法包括聯(lián)結(jié)多層，形 成多個微通道和隔膜閥；其中所述多層夾在一起；其中所述多層中的至少兩層選自彈性 膜、致動層、微流體層；閥層、散熱器、通路層、界面層和覆蓋層。在一個實施方式中，所述多 層中的至少一層是粘附層。在另一實施方式中，所述多層通過粘附層聯(lián)結(jié)在一起。在另一 實施方式中，所述多層通過至少一個夾具聯(lián)結(jié)在一起。在另一實施方式中，通過降低閥處的 壓力或溫度，將所述多層聯(lián)結(jié)在一起，除了隔膜閥的位置。在另一實施方式中，在閥上選擇 性設(shè)置涂層，將所述多層聯(lián)結(jié)在一起，除了隔膜閥的位置。在另一實施方式中，所述涂層可 去除。 另一方面，本發(fā)明提供包含以下組件的微流體裝置a)微流體通道；b)沿溫度高 于環(huán)境溫度的通道布置的第一溫度區(qū)；C)沿溫度低于環(huán)境溫度的通道布置的第二溫度區(qū)； 和d)沿通道布置并經(jīng)構(gòu)造將液體泵送到第一和第二溫度區(qū)的容積式泵。在一個實施方式 中，提供包含與至少一個溫度區(qū)熱偶合的微流體環(huán)的微流體裝置。在另一實施方式中，在至 少兩個不同的溫度區(qū)之間泵送至少一個微流體通道中的樣品至少兩次。在另一實施方式 中，通過不能混溶的流體從所述至少一個三閥泵中分離樣品。在另一實施方式中，至少一個 隔膜閥安置在溫度區(qū)。 另一方面，本發(fā)明提供分析樣品的方法，所述方法包括在權(quán)利要求41所述的微 流體裝置中加熱或冷卻核酸序列；分析所述核酸序列。在一個實施方式中，所述分析包括測 序、連接或聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、翻譯或偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在另一實施方式中，核酸選 自基因組DNA、線粒體DNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 siRNA。在另一實施方式中，所述分析包括將 至少一個銜接子與所述核酸序列連接。在另一實施方式中，所述銜接子包括獨(dú)特的核酸序 列標(biāo)識物。在另一實施方式中，獨(dú)特的核酸序列標(biāo)識物用作內(nèi)部質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。在另一實施方 式中，所述分析包括連接于珠的單個核酸序列的結(jié)合。在另一實施方式中，提供包括擴(kuò)增核 酸序列的方法。 另一方面，本發(fā)明提供包含以下組件的微流體裝置包含微流體通道的微流體層， 其中所述通道包括至少一個緊彎曲(tight bend)，其包含兩個互相連接并形成銳角的通道 節(jié)段；和在緊彎曲區(qū)域產(chǎn)生磁場的磁場生成裝置，其中流經(jīng)該緊彎曲的順磁性顆粒被磁場 所阻滯。在一個實施方式中，提供包含多個緊彎曲的微流體裝置。 另一方面，本發(fā)明提供包含以下組件的微流體裝置包含微流體通道的微流體層， 其中所述通道依次包括第一、第二和第三區(qū)域，其中所述第二區(qū)域的橫截面面積大于所述 第一和第三區(qū)域；和在所述第二區(qū)域產(chǎn)生磁場的磁場生成裝置，其中流經(jīng)所述第二區(qū)域的 順磁性顆粒被磁場所阻滯。 另一方面，本發(fā)明提供在微流體裝置上進(jìn)行生物分子分析的方法，所述方法包括在微流體裝置上的第一反應(yīng)室中混合生物分子和試劑，以產(chǎn)生第一反應(yīng)混合物；將該反應(yīng) 混合物移動到所述裝置上的反應(yīng)區(qū)并進(jìn)行反應(yīng)，以產(chǎn)生產(chǎn)物混合物；將產(chǎn)物混合物移動到 所述裝置上的某區(qū)域并將產(chǎn)物捕獲到該區(qū)域中的順磁性捕獲顆粒上；將所述顆粒和捕獲產(chǎn) 物移動到所述裝置中施加磁場的捕獲室中，以將捕獲顆粒和產(chǎn)物保留在捕獲室中；在捕獲 室中洗滌顆粒；將所述顆粒和產(chǎn)物移動到所述裝置上的端口中，以便從所述裝置取出產(chǎn)物。 在一個實施方式中，生物分子選自核酸(DNA或RNA)、蛋白質(zhì)、糖、細(xì)胞或脂質(zhì)。在另一實施 方式中，所述反應(yīng)是核酸擴(kuò)增反應(yīng)。在另一實施方式中，所述擴(kuò)增是等溫擴(kuò)增。在另一實施 方式中，所述擴(kuò)增包括對混合物進(jìn)行熱循環(huán)。在另一實施方式中，提供了包括在反應(yīng)混合物 或產(chǎn)物混合物上進(jìn)行第二反應(yīng)的方法。 另一方面，本發(fā)明提供包含以下組件的微流體裝置a)多個微流體反應(yīng)線路，各 線路包括至少兩個經(jīng)構(gòu)造能接受樣品或者可由其取出樣品的端口 ；至少一個經(jīng)構(gòu)造能通 過所述線路泵送流體的泵，至少一個包括進(jìn)行化學(xué)或生化反應(yīng)的裝置的反應(yīng)室；和至少一 個包括捕獲顆粒的裝置的捕獲室；b)至少一個與多個微流體線路流體連通并經(jīng)構(gòu)造能向 各個線路遞送樣品或試劑流的分配端口 ；其中多個線路經(jīng)構(gòu)造能對遞送至每個線路的端口 之一的多種不同材料平行進(jìn)行操作。在一個實施方式中，構(gòu)造反應(yīng)室，以便用熱泵加熱或冷 卻。在另一實施方式中，捕獲室位于磁場中，磁場經(jīng)構(gòu)造能阻滯順磁性顆粒在捕獲室中的移 動。在另一實施方式中，所述泵是容積式泵。
通過引用納入本文。 通過引用將本說明書中提到的所有發(fā)表物和專利申請納入本文，就好像將各篇單 獨(dú)的發(fā)表物或?qū)＠暾執(zhí)貏e和單獨(dú)地通過引用納入本文那樣。


所附權(quán)利要求書中具體說明了本發(fā)明的新特征?？蓞⒖家韵略斒龈玫乩斫獗景l(fā) 明的特征和優(yōu)點(diǎn)，這些詳述包括利用本發(fā)明原理的說明性實施方式和附圖
圖1顯示泵在微芯片上，由輸入?yún)^(qū)域至輸出區(qū)域移動流體的應(yīng)用。
圖2顯示由氣動裝置致動的微量級片內(nèi)閥(MOV)。 圖3中，上圖顯示自吸性MOV泵，中上圖顯示路由選擇器，中下圖顯示混合器，下圖 顯示在通道中捕獲珠。 圖4顯示用五個閥制備流體線路的應(yīng)用，微芯片上的兩個泵共享一個閥。
圖5顯示將微芯片上的兩束流體混合并移動至反應(yīng)器的可編程微流體線路。
圖6顯示將兩束液流混合并將混合的液流移動至邊緣的可編程微流體線路，在邊 緣處該微芯片可與另一過程偶聯(lián)。 圖7顯示由邊緣輸入樣品、隨著液流進(jìn)入微型閥而混合樣品和將它們移動到反應(yīng) 器的可編程微流體線路，所述反應(yīng)器可以是MOV閥。 圖8顯示混合和加載連接于邊緣的反應(yīng)器的可編程微流體線路。 圖9顯示可以由兩室向反應(yīng)器移動樣品，然后將樣品或產(chǎn)物移動到邊緣以便進(jìn)一
步加工或分析的可編程微流體線路。 圖IO顯示由反應(yīng)器向可能進(jìn)行第二工序，如另一生化或化學(xué)反應(yīng)的位置移動樣 品的可編程微流體線路。
圖11顯示在各裝置上進(jìn)行不同功能的兩個裝置。
圖12顯示分析裝置可通過模塊化微流體連接偶聯(lián)于樣品制備微芯片的情況。
圖13顯示使用模塊化微流體連接的微芯片，其中一個或兩個微芯片具有電極。
圖14顯示一個裝置上有捕獲區(qū)，以便在該區(qū)域濃縮、純化或捕獲樣品，并將其傳 遞給第二裝置。 圖15顯示各自具有捕獲區(qū)的兩個通道。 顯示具有捕獲區(qū)的裝置A，所述捕獲區(qū)連接于具有多個分析通道的裝置B。 圖17顯示具有多個電極的裝置，所述電極連接于具有捕獲區(qū)的裝置。 圖18顯示將圖17的裝置連接于具有兩個或多個分離通道的裝置。 圖19中，上圖顯示MBI-026微芯片上8通道線路中的一個線路，其包括基于M0V
的混合、熱循環(huán)反應(yīng)和基于珠的樣品清除；下圖顯示完整的玻璃MBI-026微芯片。 圖20顯示MBI-026微芯片的閱讀長度和信噪比。 圖21顯示自動化微芯片和微量滴定板。 圖22顯示一種裝置，即使用免疫磁性分離(MS)和壓力驅(qū)動液流分配磁珠并將生 物物質(zhì)濃縮和純化到珠上的樣品捕獲和純化模塊(SCPM)。 圖23顯示構(gòu)建稱為'Y-閥'的MOV微型閥的改進(jìn)方法，所述Y-閥具有三相連接。
圖24顯示MOV流通閥，其中兩束或多數(shù)液流可匯集在一起。 圖25比較了微型閥不位于連接點(diǎn)的情況(左圖)和通過如圖24所示的流通閥與 另 一通道連接以消除死容積的實施方式。 圖26顯示使用具有改進(jìn)的順磁性顆粒捕集特征的微流體線路。 圖27顯示改變微流體通道的橫截面面積，以減慢流動并改進(jìn)通過磁力、光學(xué)和其
它方法進(jìn)行的顆粒捕集。 圖28顯示通過打開MOV微型閥改變微流體通道的橫截面面積，以減慢流速和改善 通過磁力、光學(xué)和其它方法進(jìn)行的顆粒捕集。 圖29顯示用MOV Y聯(lián)結(jié)件將儲庫和其它流體來源連接于多個通道。 圖30顯示利用流通閥遞送試劑或樣品，以最大程度減小交叉點(diǎn)的死容積，在需要
時通道在交叉點(diǎn)上可互不連通。 圖31顯示含有微型閥如MOV微型泵的環(huán)。 圖32顯示在緊湊設(shè)計中集成多種功能的可編程微流體線路。 圖33顯示混合型塑料微芯片。 圖34顯示使用星形加工設(shè)計和檢測器的緊湊設(shè)計中集成了多種功能的可編程微 流體線路。 圖35顯示機(jī)械夾緊的微芯片的設(shè)計。 圖36顯示機(jī)械夾緊的微芯片的照片，上圖從上方拍攝，下圖從下方拍攝。
圖37顯示機(jī)械夾緊的微芯片的布局。 圖38顯示使用轉(zhuǎn)移帶或涂有粘合劑的材料的微芯片的組件。 圖39顯示由粘合的層構(gòu)成的微芯片。 圖40顯示閥與粘合的層的局部放大圖。 圖41顯示包含加熱器和散熱器的粘合劑層疊微芯片。
圖42顯示塑料層疊微芯片，其包含可由可編程啟動裝置控制的通常關(guān)閉的閥。
圖43顯示塑料層疊微芯片，其包含可由可編程啟動裝置控制的通常開通的閥。
圖44顯示四層閥。 圖45顯示為珠清除制造的掩模設(shè)計頂視圖和塑料微芯片。 圖46顯示可以用塑料或其它材料制造的微芯片上方的設(shè)計，下圖是丙烯酸微芯 片的照片。 圖47顯示使用MOV泵將樣品在熱區(qū)和冷區(qū)之間移動。 圖48顯示使用MOV泵將樣品在三個溫度區(qū)之間移動。 圖49顯示在不通過泵的情況下，在熱區(qū)和冷區(qū)之間移動樣品。 圖50顯示在多通道熱循環(huán)裝置中的溫度區(qū)之間移動多種樣品以提高通量。 圖51顯示在具有清除通道的多通道熱循環(huán)裝置中的溫度區(qū)之間移動多種樣品以
提高通量。 圖52顯示兩個微型閥中的兩種溫度的循環(huán)。
圖53顯示三個微型閥中的三種溫度的循環(huán)。
圖54顯示微型閥中的三種溫度的往復(fù)。 圖55顯示NBP超級焦磷酸領(lǐng)lj序(NanoBioPr印SuperPyroSequencing)
(NanoBioPr印sPs)過程的工作流和工藝的詳細(xì)描述。 圖56顯示42個連接微芯片的NanoBioPi^pSPS連接模塊。 圖57顯示96通道毛細(xì)管盒。 圖58顯示兩個用于連接的可編程微流體線路。 圖59顯示使用可編程微流體線路的96個連接線路的微芯片。 圖60顯示捕集在星形捕獲區(qū)的磁珠。 圖61顯示emPCR擴(kuò)增的示意圖。 圖62顯示使用循環(huán)水的熱循環(huán)器。 圖63顯示多路閉鎖微型閥裝置。 圖64顯示在emPCR模塊中進(jìn)行的熱循環(huán)。 發(fā)明詳述 —方面，本發(fā)明提供有關(guān)使用可編程微流體線路和裝置加工生化或化學(xué)樣品的指 南。在一些實施方式中，微流體過程與毫升或厘升級的輸入物或樣品相聯(lián)系。公開了其它 化學(xué)或生化過程以及多種過程的集成。在一些實施方式中，教導(dǎo)了有關(guān)不同設(shè)計的微型閥 的顯微制造。 在某些實施方式中，本發(fā)明微流體裝置包括微流體層、致動層和夾在它們中間的 彈性膜。流體層包括經(jīng)調(diào)整能允許液體流動的流體通道。在某些實施方式中，流體通道位 于接觸彈性膜的微流體層的表面。在此實施方式中，可將開通通道、溝或槽蝕刻到該層表面 內(nèi)。在其它實施方式中，通道可以在該層的內(nèi)部，例如是暗道、管道或管線的形式。內(nèi)部通 道可通過表面通向該通道的孔與該層表面連通。在一種制備方法中，兩個或多個亞層可相 互抹除，以便在兩個亞層匹配時至少一個亞層包含形成封閉通道的溝槽。在此實施方式中， 亞層之一包含開口于表面，如端口或連接點(diǎn)的孔，以允許橫跨閥流動。本發(fā)明隔膜閥移動確 定體積的液體。三個一組設(shè)置時，隔膜閥可用作隔膜泵，它用作容積式泵。本發(fā)明的模塊化裝置可包含使模塊相互移動的器件(如步進(jìn)電動機(jī))，以使它們配合和匹配橫跨不同模塊 的流體通道(例如順次設(shè)置的)。通過使快速活性的模塊橫跨較慢活性的模塊移動，以使快 速模塊將樣品遞送至較慢模塊的各線路中，從而協(xié)調(diào)快速活性和較慢活性。第一個單個樣 品可在許多較慢通道之間分配，或者可將許多不同樣品遞送至各個第二線路中。
另一方面，利用微結(jié)構(gòu)在微芯片上移動流體。在一些實施方式中，三個或多個閥可 產(chǎn)生用于移動流體的泵(包括但不限于:4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18U9 或20個閥)。在一個實施方式中，所述閥是隔膜閥。隔膜閥可通過致動可形變結(jié)構(gòu)產(chǎn)生。 在一些實施方式中，隔膜閥包括閥座。在一些實施方式中，隔膜閥可允許或阻止通道，如微 通道中的流體流動。在其它實施方式中，產(chǎn)生的隔膜閥無閥座。在一些實施方式中，通過改 變通道的橫截面積，隔膜閥可控制流體通過微通道的流動速度。在另一實施方式中，隔膜閥 不完全抑制流體流動，換言之，該閥在開通和關(guān)閉位置均允許一部分流體流動。圖l顯示在 微芯片A上，泵由輸入?yún)^(qū)域至輸出區(qū)域移動流體的應(yīng)用。 在另一實施方式中，利用微結(jié)構(gòu)移動包含感興趣分析物的流體。在一個實施方式 中，分析物是顆粒。其中，顆粒包括蛋白質(zhì)、肽、朊病毒、毒素、感染性生物體(包括但不限 于細(xì)菌、病毒、真菌)、細(xì)胞(包括但不限于血細(xì)胞、白細(xì)胞、NK細(xì)胞、血小板、皮膚細(xì)胞、 頰(cheek)細(xì)胞、精細(xì)胞、滋養(yǎng)層、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞)、核酸(如DNA和RNA，包 括但不限于mRNA、 rRNA、 tRNA、 siRNA、線粒體DNA、染色體DNA、基因組DNA和質(zhì)粒)、細(xì)胞 成分(包括但不限于核、染色體、核糖體、內(nèi)體、線粒體、液泡、葉綠體和其他胞質(zhì)片段)、糖
(包括但不限于多糖、纖維素或殼多糖)和脂質(zhì)(包括但不限于膽固醇、甘油三酯)。在 另一實施方式中，利用微結(jié)構(gòu)移動包含感興趣分析物的流體，所述感興趣分析物包括例如
分子或化學(xué)物質(zhì)(包括但不限于二氧芑、PCB、重金屬、有機(jī)磷酸酯、雌激素模擬物、rBST、
藥物代謝物、致癌物或致畸物)。 另一方面，將微結(jié)構(gòu)用于樣品捕獲和純化，例如顯微分離、微型閥、微型泵和微型 路由選擇器，納米流體控制和納米級生化。在一個實施方式中，利用微結(jié)構(gòu)使復(fù)雜工作流 小型化和自動化(圖2)。在一個實施方式中，微量級片內(nèi)閥(MOV)閥、泵和路由選擇器以 及操作它們的設(shè)備包括納米生物處理器(NanoBioProcesso. r)平臺。在另一實施方式中， 所述微芯片包括具有一個或多個功能組件的微結(jié)構(gòu)，所述組件包括但不限于反應(yīng)器、捕獲 區(qū)、溫度循環(huán)區(qū)、熱區(qū)、冷區(qū)、分離通道、分析線路、混合器、珠加工單元、散熱器、珀耳帖裝置 (peltier device)和磁體。在一些實施方式中，捕獲區(qū)可包括連接于基材的結(jié)合部分，包 括但不限于抗體、Fc片段、Fab片段、凝集素、多糖、受體配體、DNA序列、PNA序列、siRNA 序列或RNA序列。在另一實施方式中，微結(jié)構(gòu)的一個或多個區(qū)域可包括珠，例如磁力反應(yīng)性 珠。在一些實施方式中，所述珠可包括結(jié)合部分，包括但不限于抗體、Fc片段、Fab片段、凝 集素、多糖、受體配體、DNA序列、PNA序列、siRNA序列或RNA序列。在一些實施方式中，磁 力反應(yīng)性珠的尺寸小于600nm，如590nm、580nm、570nm、560nm、550nm、540nm、530nm、520nm、 510nm、500nm、490nm、480nm、470nm、460nm、450nm、440nm、430nm、420nm、410nm、400nm、 390nm、380nm、370nm、360nm、350nm、340nm、330nm、320nm、310nm、300nm、290nm、280nm、 270nm、260nm、250nm、240nm、230nm、220nm、210nm、200nm、190nm、180nm、170nm、160nm、 150nm、140nm、130nm、120nm、110nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm或 10nm。在一些實施方式中，磁力反應(yīng)性珠包含鐵化合物。在一個實施方式中，磁力反應(yīng)性珠是鐵氧體珠。 在一些實施方式中，磁珠的直徑為10-1000nm、20-800nm、30-600nm、40-400nm或 50-200nm。在一些實施方式中，磁珠的直徑大于10nm、50nm、 100nm、200nm、500nm、 lOOOnm或 5000nm。磁珠可以是干燥的或懸浮于液體中?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方式將流體樣品與 含磁珠的第二液體介質(zhì)混合，這些方式包括2005年9月15日提交的題為"流體遞送的方法 和系統(tǒng)(Methods and Systems for Fluid Delivery)"的美國序列號[未指定]所述的方 式。 在一些實施方式中，當(dāng)樣品中的分析物(如感興趣或不感興趣的分析物)是鐵磁 體或具有磁性時，可利用磁場將這類分析物與一種或多種其它分析物(如感興趣或不感興 趣的分析物)或不含分析物的樣品分隔或分離開。例如，將第一分析物偶聯(lián)于特異性結(jié)合 第一分析物的抗體，其中所述抗體也偶聯(lián)于磁珠。當(dāng)含有第一分析物-磁珠復(fù)合物和第二 分析物的分析物混合物進(jìn)入磁場時，捕獲第一分析物_磁珠復(fù)合物，而其它細(xì)胞繼續(xù)遷移 通過該磁場。然后，可通過移除磁場釋放第一分析物。 磁場可位于本文所述微結(jié)構(gòu)的外部或內(nèi)部。外部磁場是來源位于本文所述裝置 (如微芯片、隔膜閥、通道、阻擋物)以外的磁場。內(nèi)部磁場是來源位于本文所述裝置內(nèi)部 的磁場。在一些實施方式中，通過電磁體或永磁體，如稀土磁體產(chǎn)生磁場。在一些實施方式 中，磁體是可移動的，并且可相對于微結(jié)構(gòu)移動。 在一些實施方式中，當(dāng)需要分離的分析物(如感興趣或不感興趣的分析物)不是 鐵磁體或不具有磁性時，可將磁珠偶聯(lián)于選擇性結(jié)合這類分析物的結(jié)合部分。結(jié)合部分的 例子包括但不限于凝集素、多肽、抗體、核酸等。在優(yōu)選實施方式中，結(jié)合部分是選擇性結(jié) 合感興趣分析物(如紅細(xì)胞、癌細(xì)胞、精細(xì)胞、細(xì)胞核、染色體、白細(xì)胞、上皮細(xì)胞、細(xì)菌、病 毒或真菌)的抗體或抗體片段(如Fab、Fc、sfv)。因此，在一些實施方式中，磁珠可用抗體 (優(yōu)選單克隆抗體)修飾。 可在接觸樣品之前將磁性顆粒偶聯(lián)于本文所述的任何一種或多種微結(jié)構(gòu)，或可在 將樣品遞送至裝置前將磁珠與樣品混合。 在一些實施方式中，本文所述系統(tǒng)包括含有能夠改變捕獲或未捕獲的分析物的磁 性的試劑(如磁珠)的儲庫。該儲庫優(yōu)選流體偶聯(lián)于本文所述的一種或多種微結(jié)構(gòu)。例如， 在一些實施方式中，磁性儲庫偶聯(lián)于大小_微通道，在其它實施方式中，磁性儲庫偶聯(lián)于捕 獲區(qū)。 試劑的確切性質(zhì)取決于分析物的性質(zhì)。示范性試劑包括氧化或還原過度金屬的物 質(zhì)，氧化或還原血紅蛋白的試劑，能夠結(jié)合分析物的磁珠或能夠螯合、氧化或結(jié)合鐵或其它 磁性材料或顆粒的試劑。所述試劑可用于改變分析物的磁性，以賦予或提高其磁場吸引性、 賦予或提高其磁場排斥性、或消除磁性以使分析物不受磁場影響。 對磁場作出反應(yīng)的磁珠可用于本發(fā)明的裝置和方法。所需顆粒是可通過化學(xué)反
應(yīng)、物理吸附、纏結(jié)或靜電作用對其表面化學(xué)進(jìn)行化學(xué)或物理修飾的顆粒。 在一些實施方式中，可通過本領(lǐng)域已知的任何方式將捕獲部分結(jié)合于磁珠。例子
包括化學(xué)反應(yīng)、物理吸附、纏結(jié)或靜電作用。結(jié)合于磁珠的捕獲部分取決于目標(biāo)分析物的性
質(zhì)。捕獲部分的例子包括但不限于蛋白質(zhì)(如抗體、親和素和細(xì)胞表面受體)、帶電或不
帶電的聚合物(如多肽、核酸和合成聚合物)、疏水或親水性聚合物、小分子(如生物素、受體配體和螯合劑)、糖和離子。可使用這類捕獲部分特異性結(jié)合細(xì)胞(如，細(xì)菌、病原體、胎 兒細(xì)胞、胎兒血細(xì)胞、精細(xì)胞、癌細(xì)胞和血細(xì)胞)、細(xì)胞器(如細(xì)胞核)、病毒、肽、蛋白質(zhì)、糖、 聚合物、核酸、超分子復(fù)合物、其它生物分子(如有機(jī)或無機(jī)分子)、小分子、離子，或它們的 組合(嵌合物)或片段。 —旦改變分析物的磁性后，可用其相對于樣品其它組分分離或富集分離物。分離 或富集可包括利用磁場將所需分析物吸引至磁場而進(jìn)行正選擇、或可通過將不感興趣的分 析物吸引至磁場而進(jìn)行負(fù)選擇。在兩種情況下，可收集含有所需分析物的分析物群體以便 進(jìn)行分析或進(jìn)一步加工。 在一些實施方式中，將微結(jié)構(gòu)用于分析至少一種分子、顆粒或化學(xué)物質(zhì)的分析方 法。在一個例子中，分析核酸。分析包括但不限于連接或聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、翻譯、 偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在另一個例子中，標(biāo)記的結(jié)合部分結(jié)合于目標(biāo)分析物(如細(xì)胞、蛋白 質(zhì)、細(xì)胞片段或核酸)。其中，結(jié)合部分包括但不限于抗體、抗體片段、受體、受體配體、凝 集素、多糖或核酸。其中，標(biāo)記包括但不限于熒光標(biāo)記(包括但不限于FITC、PE、德克薩斯 紅(TexasRED)、賽博綠(Cyber Green) 、J0E、FAM、HEX、TAMRA、R0X、阿萊克薩(Alexa)488、阿 萊克薩532、阿萊克薩546、阿萊克薩405或其他熒光團(tuán))、放射性標(biāo)記(包括但不限于P32、 4或(:14)、熒光蛋白(包括但不限于GFP、 RFP或YFP)、量子點(diǎn)、金顆粒、銀顆粒、生物素、珠 (包括但不限于磁珠或聚苯乙烯珠)。 在一些實施方式中，公開了轉(zhuǎn)運(yùn)、加工和分析樣品的MOV泵、閥和路由選擇器。外 部致動的氣動型片內(nèi)閥、泵和路由選擇器可在10nL至10i! L的操作體積下控制流體流動， 所述操作體積包括但不限于10nl、 1 lnl、 12nl、 13nl、 14nl、 15nl、 16nl、 17nl、 18nl、 19nl、 20nl、21nl、22nl、23nl、24nl、25nl、26nl、27nl、28nl、29nl、30nl、35nl、40nl、45nl、50nl、 55nl、60nl、65nl、70nl、75nl、80nl、85nl、90nl、95nl、100nl、110nl、120nl、130nl、140nl、 150nl、160nl、170nl、180nl、190nl、200nl、250nl、300nl、350nl、400nl、450nl、500nl、 550nl、600nl、650nl、700nl、750nl、800nl、850nl、900nl、950nl、1000n1、1. 1 ii 1、1. 2ii 1、 1. 3ii 1、1. 4ii 1、1. 5ii 1、1. 6ii 1、1. 7ii 1、1. 8ii 1、1. 9ii 1、2. Oii 1、2. 5ii 1、3. Oii 1、3. 5ii 1、 4. Oii 1、4. 5ii 1、5. Oii 1、5. 5ii 1、6. Oii 1、6. 5ii 1、7. Oii 1、7. 5ii 1、8. Oii 1、8. 5ii 1、9. Oii 1、 9.5ii 1、10.0ii l(參見Grover，W.H.等，2003. Sensors and Actuators B89 :315-323 ;美國 專利申請?zhí)?0/750， 533 ;美國專利申請?zhí)?0/540， 658 ;通過引用將其全文納入本文)。
在一個實施方式中，MOV閥和泵將兩個玻璃微流體層與與聚二甲基硅氧烷(P匿S) 可形變膜層和氣動層合并起來，聚二甲基硅氧烷(P匿S)可形變膜層能打開或關(guān)閉閥，氣動 層能使膜發(fā)生形變并致動閥(圖2)。蝕刻在玻璃流體晶片上方的微流體通道是不連續(xù)的， 通過"通路晶片"和微流體通道通向通常是關(guān)閉的閥座(圖2，上圖)。通過常規(guī)級真空和 壓力源將真空施加于氣動移動室時，通常關(guān)閉的PDMS膜從閥座抬起以打開該閥(圖2，中 圖)。圖2的下圖顯示閥的頂視圖，比例尺與上方二圖相同。在另一實施方式中，自吸性MOV泵(圖3，上圖)通過協(xié)調(diào)三個或多個閥的操作產(chǎn) 生，并可產(chǎn)生雙向的流動。在另一實施方式中，路由選擇器由三個或多個MOV閥制成(圖3， 中上圖)。在另一實施方式中，MOV混合器(圖3，中下圖)能快速混合樣品和試劑。在另 一實施方式中，MOV裝置精巧地與磁珠一起工作，以泵送或捕集珠組(圖3，下圖)。
通常關(guān)閉的MOV閥、泵和路由選擇器持久耐用、容易制造、成本低、可用于密集陣列且具有較低的死容積。在微芯片，如納米生物處理器微芯片上不難制造MOV閥、泵和路由 選擇器的陣列。在一個實施方式中，微芯片上的所有MOV閥、泵和路由選擇器均可在利用單 個膜的簡單生產(chǎn)工藝中同時產(chǎn)生，所述膜包括例如如特氟龍、硅酮彈性體、聚二甲基硅氧烷 (P匿S)、聚酰亞胺、邁拉、膠乳、氟化橡膠、聚碳酸酯、丙烯酸、傘塔橡膠(sant即rene)、聚氨 酯或丁鈉橡膠的片層。這種技術(shù)能夠在微芯片上產(chǎn)生復(fù)雜的微型和納米流體線路。
在制造方法的一方面，公開了微流體結(jié)構(gòu)。在一個實施方式中，將多層材料夾在一 起形成完整的微流體結(jié)構(gòu)以制造該結(jié)構(gòu)。在一個實施方式中，使用粘合劑將這些層結(jié)合在 一起(圖38-41)。在另一實施方式中，通過至少一個夾具，包括但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45或50個夾具將這些層結(jié)合在一起(圖 35和36)。在另一實施方式中，通過粘合劑和夾具或銷的組合將這些層結(jié)合在一起。在一個 實施方式中，所述夾在一起的多層材料包括選自下組的至少三層頂層、微流體層、通路層、 界面層、膜層、氣動層、底層、散熱器層、加熱器層、致動層和閥層。在另一實施方式中，所述 層由一個以上的基板組成。例如，可用于產(chǎn)生微型閥的基板包括但不限于石英、玻璃(如 硼硅玻璃，包括但不限于派熱克斯玻璃、硼浮玻璃(borofloat)、康寧(Corning) 1737)、 硅和塑料(包括但不限于丙烯酸、聚碳酸酯、液晶聚合物、聚甲氧基丙烯酸甲酯(PMMA)、 Zeonor、聚烯烴、聚丙烯和聚硫醇)。在另一例子中，可用作膜的基材包括但不限于特氟 龍、硅酮彈性體、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰亞胺、邁拉、膠乳、氟化橡膠、聚碳酸酯、丙烯 酸、傘塔橡膠、聚氨酯和丁鈉橡膠。在另一例子中，可用作粘合劑的基材包括但不限于轉(zhuǎn)移 帶、涂有粘合劑的帶，如硅酮基、丙烯酸或其他材料的薄片或薄膜。 在一些實施方式中，所述微結(jié)構(gòu)包括多個微通道。在一些實施方式中，所述微通道 具有相同的寬度和深度。在其它實施方式中，所述微通道具有不同的寬度和深度。在一個 實施方式中，微通道的特征是通道寬度大于遞送至微結(jié)構(gòu)的樣品中感興趣分析物的平均大 小。在另一實施方式中，微通道的寬度等于或大于由樣品分離的最大的分析物(如最大的 細(xì)胞)。例如，在一些實施方式中，微結(jié)構(gòu)中微通道的寬度大于50、60、70、80、90、100、110、 120、130、140、150微米。在一些實施方式中，微通道的寬度小于100、90、80、70、60、50、40、 30或20微米。在一些實施方式中，微結(jié)構(gòu)中的微通道的深度大于50、60、70、80、90、100、 110、120、130、140、150微米。在一些實施方式中，微通道的深度小于100、90、80、70、60、50、 40、30或20微米。在一些實施方式中，微通道的側(cè)壁互相平行。在另一些實施方式中，微通 道的頂面和底面相互平行。在另一些實施方式中，微通道包括具有不同橫截面的區(qū)域。在 一些實施方式中，微通道的橫截面形狀為楔形(cheese wedge)，其中楔形的尖端指向下游。
在一些實施方式中，微通道或微結(jié)構(gòu)作為槽或溝蝕刻到基板中。在一些實施方式 中，可以通過基板鉆、鏜、切或蝕刻出洞。在其它實施方式中，基板中形成的微通道是封閉在 微芯片單層基板內(nèi)的暗道或孔。 在一些實施方式中，用標(biāo)準(zhǔn)照相平版技術(shù)形成微結(jié)構(gòu)。例如，可利用照相平版技術(shù) 在絕緣體上的硅(SOI)晶片上產(chǎn)生有凸起的光刻膠圖案。S0I晶片由500iim厚的Si(100) 晶片上1 y m厚的Si02層之上的100 ii m厚的Si (100)層構(gòu)成。為了優(yōu)化光刻膠粘附，可在 涂布光刻膠之前使SOI晶片接觸六甲基二硅氮烷的高溫蒸汽。UV敏感型光刻膠旋涂在晶片 上，9(TC烘烤30分鐘，通過鉻接觸掩模接觸UV光300秒，在顯影器中顯影5分鐘，再于90°C 烘烤30分鐘?？筛鶕?jù)光刻膠的特性和厚度改變工藝參數(shù)。鉻接觸掩模的圖案轉(zhuǎn)印到光刻膠上，并決定了微結(jié)構(gòu)的幾何形狀。 形成與微結(jié)構(gòu)相同的光刻膠圖案后，開始蝕刻。Si(^可用作蝕刻過程的終止劑。也 可控制蝕刻在給定深度時停止，而不用終止劑層。在等離子體蝕刻機(jī)中，將光刻膠圖案轉(zhuǎn)移 到100iim厚的Si層上?？衫枚嘀厣钗g刻實現(xiàn)一致的微結(jié)構(gòu)。例如，使該基板接觸富氟 的等離子體流SF615秒，然后將該系統(tǒng)切換到富含碳氟化合物的等離子體流C4F810秒，以便 在所有表面上涂上一層保護(hù)膜。在隨后的蝕刻循環(huán)中，接觸離子轟擊優(yōu)選清除水平表面上 的聚合物，重復(fù)該循環(huán)多次，直到(例如)達(dá)到Si02層。 為了將結(jié)合部分與凸起表面偶聯(lián)，可以使該基板接觸氧等離子體，然后進(jìn)行表面 修飾產(chǎn)生二氧化硅層，將結(jié)合部分與其連接。然后，用蒸餾的去離子水沖洗該基板兩次，空 氣干燥。將樣品浸沒在新鮮制備的2% v/v 3-[(2-氨基乙基)氨基]丙基三甲氧基硅烷的 水溶液中30秒，以便將硅烷固定在暴露的玻璃上，然后再用蒸餾的去離子水洗滌。在氮?dú)?中干燥該基板并烘烤。接下來，將該基板浸入磷酸緩沖鹽水配制的2. 5% v/v戊二醛溶液 中，室溫下靜置1小時。然后，再次沖洗該基板，并浸入蒸餾的去離子水配制的0. 5mg/mL結(jié) 合部分，如抗-CD71的溶液中，室溫下靜置15分鐘，以便將結(jié)合物質(zhì)偶聯(lián)于凸起。然后，用 蒸餾的去離子水沖洗該基板，在70%乙醇中浸沒過夜以滅菌。 除上述方法以外，還可利用多種技術(shù)將結(jié)合部分固定在微結(jié)構(gòu)的區(qū)域和裝置表面 上。出于簡便和成本的考慮，可選擇簡單的物理吸附在表面上。另一種方法可使用以各種 結(jié)合部分官能化的自身組裝的單層(如金上的硫醇)。根據(jù)所結(jié)合的結(jié)合部分和用于制造 該裝置的材料，可采用其它方法。本領(lǐng)域已知表面修飾方法。此外，某些細(xì)胞可能優(yōu)選結(jié)合 未改變的材料表面。例如，一些細(xì)胞可以優(yōu)選結(jié)合帶正電、帶負(fù)電或疏水性表面或某些聚合 物中存在的化學(xué)基團(tuán)。 微結(jié)構(gòu)裝置可由不同材料構(gòu)成，包括但不限于派熱克斯玻璃、硼浮玻璃、康寧 1737、硅丙烯酸(silicon acrylic)、聚碳酸酯、液晶聚合物、聚甲氧基丙烯酸甲酯(PMMA)、 Zeonor、聚烯烴、聚苯乙烯、聚丙烯和聚硫醇。根據(jù)材料的選擇，可采用不同的制造技術(shù)。該 裝置可利用熱模凹凸印刷技術(shù)由塑料，如聚苯乙烯制成。凸起和必需的其它結(jié)構(gòu)凹凸印刷 到塑料中，以產(chǎn)生底面。然后，可將頂層粘結(jié)于底層。注模是可用于產(chǎn)生這類裝置的另一種 方法。也可利用軟印刷術(shù)由塑料產(chǎn)生整個室，或者可產(chǎn)生部分微結(jié)構(gòu)，然后粘結(jié)成到玻璃基 材上產(chǎn)生封閉的室。另一種方法包括使用環(huán)氧化物鑄造技術(shù)，通過使用UV或溫度可固化的 環(huán)氧化物在具有所需結(jié)構(gòu)的陰刻拷貝的主板上產(chǎn)生凸起。也可利用激光或其它類型的顯微 機(jī)械加工方法產(chǎn)生流動室?？捎糜谥圃煸撗b置的其他合適的聚合物是聚碳酸酯、聚乙烯和 聚(甲基丙烯酸甲酯)。此外，可利用諸如鋼和鎳等金屬，通過(例如)傳統(tǒng)金屬機(jī)械加工 方法制造本發(fā)明裝置?？衫萌S制造技術(shù)(如立體印刷術(shù))制造單件形式的裝置。本領(lǐng) 域已知其他制造方法。
混合流體 _ 公開了在微芯片和毛細(xì)管上混合流體的能力。圖4顯示用五個閥制備流體線路的 應(yīng)用，一個閥為微芯片上的兩個泵所共享。術(shù)語流體的含義包括但不限于只有一種組分的 簡單流體，混合物，含有珠、顆粒、凝膠和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他材料的液體，氣體和其 他基質(zhì)。線路可由兩個輸入?yún)^(qū)域移動流體，混合它們并將混合物遞送到微芯片A的輸出區(qū)域?？赏ㄟ^包含兩個或多個閥(包括MOV閥或其他閥)的泵移動單束液流。液流可含有樣 品、試劑、緩沖劑和其他組分。閥可以對可形變結(jié)構(gòu)產(chǎn)生致動作用，改變溫度和壓力。可利 用MOV和其他微型閥將兩束(圖3，中下圖)或更多束液流(圖3，中上圖)合并。在一個 實施方式中，M0V閥為自吸性并且在電腦控制下，它們可能在兩個方向上驅(qū)動，可通過簡單 地運(yùn)行這兩個共同連接的泵將樣品從標(biāo)記為輸出的區(qū)域移動到標(biāo)記為輸入的兩個區(qū)域，利 用同一線路將樣品分成兩束液流。 圖5顯示在微芯片上混合兩束液流和移動至反應(yīng)器。在一些實施方式中，反應(yīng)器 可位于M0V閥內(nèi)，以改善用于檢測的光學(xué)距離、面積體積比、熱控制和其他優(yōu)點(diǎn)。在以下例 子中，公開了用具有微型閥，如M0V閥、泵和路由選擇器的微芯片進(jìn)行反應(yīng)的其它方法。
圖6說明兩束液流的混合，以及混合的液流流動至邊緣，并在邊緣與另一過程偶 聯(lián)。可利用MOV閥完成混合。 圖7說明由邊緣輸入樣品，隨著液流在微型閥中混合而混合樣品，將它們移動 到可以是偏轉(zhuǎn)膜產(chǎn)生的MOV閥或室的反應(yīng)器，膜可以是，例如彈性膜，如聚二甲基硅氧烷 (PDMS)。 也可用M0V閥混合三束或多束液流(圖3，中上圖)，并移動到反應(yīng)器中(圖8)。 液流可含有液體、顆粒、磁珠、納米顆粒、膠體、氣體和其他材料。MOV閥能夠容易地操作磁性
和其它性質(zhì)的珠和顆粒，以及流體。
微芯片上的反應(yīng) _ —方面，可將樣品移動至反應(yīng)室(圖8)，它由蝕刻通道、微型閥、小瓶、流動室、毛 細(xì)管、儲庫或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它結(jié)構(gòu)構(gòu)成?？衫肕OV閥產(chǎn)生包括兩束或多數(shù)液 流以進(jìn)行不同生化反應(yīng)的微芯片。然后，可在反應(yīng)器中詢問樣品。這可包括但不限于光學(xué) 傳感，如LIF、吸光度、化學(xué)發(fā)光、表面等離振子共振。 圖9說明使用兩個聯(lián)接的泵將樣品移動至反應(yīng)器，然后將樣品或產(chǎn)物移動至邊 緣，以便進(jìn)行下述的進(jìn)一步加工或分析。術(shù)語樣品包括但不限于含有感興趣分析物的流 體，由單個化合物或元素組成的材料，復(fù)雜樣品如體液，氣溶膠，混合物，生物或化學(xué)物質(zhì)， 包括DNA、 RNA、微小RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、細(xì)胞壁、小分子和生物樣品的所有其它生物組 分，含有微珠或顆粒的流體。另外，可將樣品與一種或多種試劑混合，然后遞送至微結(jié)構(gòu)。
圖10說明將兩個樣品從邊緣移動至反應(yīng)器，然后移動至可進(jìn)行第二項過程，如另 一生化或化學(xué)反應(yīng)的位置。也可利用該位置輸出樣品，利用微流體裝置將樣品移動至進(jìn)行 吸取或其它動作的機(jī)器人。需要時，可利用珠，包括磁珠移動樣品。
兩種或多種過程的集成 _ 在另一方面，模塊化微流體?？亢鸵瞥鲅由熘潦褂脙煞N或多種過程，其中一種或 多種微芯片包含MOV閥、泵和路由選擇器。圖ll顯示裝置A制備樣品，然后由裝置B分析 的實施方式。在一個實施方式中，該裝置可以是采用管線、管道或其它裝置制備樣品的微芯 片或全尺寸裝置。在另一優(yōu)選實施方式中，裝置B可以是毛細(xì)管、包含毛細(xì)管電泳系統(tǒng)或微 芯片毛細(xì)管電泳的單獨(dú)設(shè)備；多維凝膠和毛細(xì)管電泳；質(zhì)譜，具有HPLC的多維質(zhì)譜，ICP，拉 曼光譜，顆粒，納米顆粒和基于珠的檢測，成像，包括熒光、IR、光學(xué)或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何其它分析系統(tǒng)。如圖6所示，在裝置A上加工前，液流或流體可位于儲庫中，或如圖11所示來自邊緣或其它地方。以此方式，可利用具有樣品制備功能如反應(yīng)、路由選擇、樣品清除的微芯片，微芯片A，通過許多方式制備樣品，這些方式包括PCR、循環(huán)測序、夾心試驗、等溫核酸擴(kuò)增、等速電泳、等電聚焦、雜交、親和捕獲或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法。然后，可將樣品移動到裝置B，裝置B可以是可分析制備樣品的微芯片、質(zhì)譜儀、分析裝置或包含分離裝置的其它檢測器。 圖12顯示分析裝置可通過模塊化微流體連接偶聯(lián)于樣品制備微芯片的情況。然后，可通過M0V泵、外壓泵、電滲流、磁性分離或其它方法將樣品從裝置A移動到裝置B。
在一個實施方式中，可整合電極，以通過電位移動樣品，如電泳。圖13顯示了一種構(gòu)型。在一個實施方式中，以第一方向移動感興趣的分析物。在另一實施方式中，以第二方向移動不感興趣的分析物。在一些實施方式中，可使用多個電極。在一個例子中，可以在反應(yīng)器中加工樣品，然后泵入某區(qū)域，在該區(qū)域通過電位將樣品從裝置A移動到分析裝置B中。當(dāng)兩個裝置被移動到相近位置時，可包括直接物理接觸、通過小缺口緊密接觸或通過連接器或接口實現(xiàn)的遠(yuǎn)距離接觸，可實現(xiàn)上述操作。可在裝置B上使用一個或多個電極以完成該線路，從而產(chǎn)生電場，將樣品或樣品組分移動到裝置B中。在另一實施方式中，連接于裝置B的下游裝置中存在其它電極。在另一實施方式中，連接于裝置B的儲庫中存在一個或多個電極(圖13)。 在另一實施方式中，還可利用MOV微型泵或其它裝置將樣品移動到可能連接有捕獲部分或結(jié)合部分的捕獲區(qū)。在一些實施方式中，捕獲區(qū)可用于諸如雜交、親和捕獲或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。在另一實施方式中，捕獲區(qū)可包括非特異性捕獲手段，如疏水或親水性質(zhì)，固相提取、金屬結(jié)合、吸附、非共價相互作用、共價作用、光誘導(dǎo)的結(jié)合或其它手段，以捕獲感興趣或不感興趣的分析物(圖14)。在一個實施方式中，微芯片A和裝置B可作為模塊化微流體裝置一起移動。在一個實施方式中，捕獲區(qū)可用作注射到分析裝置，例如毛細(xì)管電泳(CE)設(shè)備、具有CE的微芯片、毛細(xì)管陣列電泳(CAE)的區(qū)域。然后，微芯片A可移動到微芯片B附近，微芯片B可具有以下功能，包括但不限于毛細(xì)管陣列電泳(CAE)、質(zhì)譜、HPLC、PCR、等溫核酸擴(kuò)增、等速電泳、等電聚焦、雜交、親和捕獲。在另一實施方式中，捕獲區(qū)可用于濃縮樣品或純化樣品，然后移動到第二裝置，第二裝置可進(jìn)行其它樣品制備或分析。 在一個例子中，兩個裝置，如微芯片相互接觸或接近。圖15顯示各自具有捕獲區(qū)的兩個通道。然后，通道可將樣品移動到裝置B附近。接著可施加電位，以將樣品從注射區(qū)移動到裝置B中。在足夠電壓下，樣品可'跳過'缺口。如果需要，樣品可定量地注射到裝置B上?？烧{(diào)整通道數(shù)量，以使裝置A所具有的通道數(shù)量遠(yuǎn)大于裝置B并進(jìn)行重復(fù)注射，或者裝置A的通道數(shù)量可少于裝置B。在優(yōu)選實施方式中，裝置B是包含CAE分離通道的微芯片。在一個實施方式中，裝置B可包含分離毛細(xì)管，在一個實施方式中，分離毛細(xì)管可通過模塊化微流體接口聯(lián)接。在2D分離中，當(dāng)?shù)谝痪S是裝置A中的等電聚焦時，可重復(fù)去除裝置B，可將微芯片A中的一部分樣品注射到微芯片B上的多個微通道中。圖16說明具有捕獲區(qū)的裝置A，捕獲區(qū)連接于具有多個微通道的裝置B，該裝置可用于分析物的分析，如CAE、質(zhì)譜、HPLC。 在一個實施方式中，將樣品注射到微芯片中使用"雙T"注射器。雖然隨著樣品移動通過雙T，雙T確定了雙T之間的小塞子，但隨著樣品從儲庫到廢液的電泳，可發(fā)生分離。(Liu S，Ren H，Gao Q，Roach DJ，Loder RT Jr，Armstrong TM，Mao Q，Blaga I，Barker DL，Jovanovich SB.在多通道微芯片上進(jìn)行的自動化平行DNA測序(Automated parallel DNAsequencing on multiplechannel microchips). Proc Natl Acad Sci USA. 2000年5月9日；97(10) :5369-74)。 在另一實施方式中，在一個裝置中構(gòu)造分離通道，而在第二個裝置上構(gòu)造注射器。在一些實施方式中，可?？亢鸵瞥鲞@兩個裝置。 在一個實施方式中，在單獨(dú)的毛細(xì)管、微芯片或其它裝置上將樣品移動到捕獲區(qū)。圖17顯示的裝置可能是右側(cè)具有捕獲區(qū)的微芯片。首先，可通過M0V閥泵送移動樣品，然后，施以電場以移動未捕獲的分析物和純化樣品。在一個實施方式中，隨后，將具有捕獲區(qū)的微芯片移動到分離裝置，如圖18所示，解吸后，可注射全部樣品?？赏ㄟ^改變溫度、化學(xué)手段、光學(xué)解吸或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方法進(jìn)行解吸。
在微芯片上集成用于樣品制備和清除的工藝 _ —方面，可將MOV技術(shù)應(yīng)用于許多領(lǐng)域如DNA測序、生物防御、法醫(yī)學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)，進(jìn)行基于微芯片的樣品制備和分析。在一個實施方式中，可利用MOVE技術(shù)進(jìn)行自動化的循環(huán)核酸測序和清除，例如桑格測序法(Sanger sequencing)。圖19中，上圖顯示MBI-026微芯片上8通道線路中的一個線路，其包括基于MOV的混合、熱循環(huán)反應(yīng)和基于珠的樣品清除；下圖顯示完整的玻璃微芯片。已經(jīng)利用MBI-026在改良的MegaBACE DNA分析設(shè)備上證明Phred 15數(shù)據(jù)的1， 000個堿基上的閱讀長度(圖20)，其中利用片內(nèi)集成的循環(huán)測序和清除，以制備Ready-to-Inject 測序樣品。通過在MBI-026微芯片上進(jìn)行PowerPlex 16 STR反應(yīng)，MBI能進(jìn)行用于法醫(yī)學(xué)的16-plex STRPCR擴(kuò)增。MBI-026微芯片的許多元件，即MOV混合器、泵和閥均可用于各種應(yīng)用。 —方面，采用納米生物處理器技術(shù)的MBI-026微芯片的操作可使用一個或多個機(jī)器人實現(xiàn)自動化(圖21)。在一個實施方式中，在軟件控制下的機(jī)器人用固定的尖端或探針將樣品從微量滴定板移動到接口裝置中所含的微芯片(如MBI-026)上。在一個實施方式中，微芯片與可具有加熱或冷卻微芯片的功能的裝置接口相連。加熱裝置可包括連接于微芯片的電阻加熱器，如圖19所示。在其它實施方式中，用位于微芯片以外的電阻加熱器、使用不同溫度的空氣或氣體、使用紅外加熱、珀耳帖/熱電加熱、與不同溫度的流體相接觸或通過其它方式加熱微芯片。在一些實施方式中，用空氣或其他氣體(如制冷劑)、珀耳帖裝置、與液體(如制冷劑)接觸或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方式冷卻微芯片。
與大體積樣品接口 _ —方面，微流體裝置，如微芯片直接或間接連接于為微流體裝置制備樣品的裝置。樣品可以是濃縮和/或純化的。 在一個實施方式中，用流體技術(shù)加工環(huán)境氣溶膠，以制備樣品進(jìn)行進(jìn)一步的微芯片樣品制備和分析。圖22顯示一種裝置，即使用免疫磁性分離(IMS)和壓力驅(qū)動液流分配磁珠并將生物物質(zhì)濃縮和純化到珠上的樣品捕獲和純化模塊(SCPM)。在一個實施方式中，從珠上洗脫制備的樣品，將洗脫液移動到下游裝置如微芯片中，或者將珠移動到下游裝置中。在一個實施方式中，可將珠引入微芯片以便進(jìn)行小型化的實時PCR和/或微量級毛細(xì) 管陣列電泳(yCAE)。在一些實施方式中，可振蕩混合樣品、試劑和珠的振蕩混合器可用于 微芯片(圖22)。在另一實施方式中，通過致動作用移動磁體，以便在微結(jié)構(gòu)中捕集和釋放 磁珠(如順磁性珠)。 在一個實施方式中，硬件可由軟件，如MBI的DevLinkTM軟件或嵌入軟件操作。 DevLink限定了一組標(biāo)準(zhǔn)化自動架構(gòu)的通信和命令協(xié)議，與其它軟件開發(fā)方法相比，它更簡 單、更有彈性且更快捷。 DevLink執(zhí)行框架基于橫跨多種操作系統(tǒng)、開發(fā)語言和通信協(xié)議的核心技術(shù)。軟件 驅(qū)動器將該系統(tǒng)的單個智能組件打包，大大縮短了從頭開發(fā)系統(tǒng)軟件一般所需的時間。集 成基于COM或.NET的多系統(tǒng)模塊(泵、閥、溫度控制器、1/0控制器等)的操作是直接的。 DevLink提供了通過產(chǎn)品發(fā)布和維護(hù)進(jìn)行原型制作的專業(yè)質(zhì)量軟件開發(fā)系統(tǒng)。
Y-閥 _ 在另一方面，可利用MOV技術(shù)產(chǎn)生可導(dǎo)向三個或更多個微通道的流體的閥。在一 個實施方式中，路由選擇器可使用具有或不具有閥座的微型閥。圖23顯示構(gòu)建稱為'Y-閥' 的MOV微型閥的方法，所述Y-閥具有三相連接。圖23中，黑色代表流體，白色代表閥座。可 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法制造閥座，這些方法包括照相平版、凹凸印刷、注模和 其它顯微制造方法。當(dāng)Y-閥出于關(guān)閉位置時，閥座將該閥內(nèi)相交的三個通道分離開。開放 式，該圖中的三個通道互相連通。閥開放時閥室的體積增加，關(guān)閉時閥室的體積縮小。這種 體積改變引起液體移動，有助于混合一起進(jìn)入該閥的液體。在圖23所示的實施方式中，可 以存在兩個流入液體的入口通道和一個出口通道，或者一個入口和兩個出口。
流通閥 _ 另一方面，可將如圖2所示的MOV閥調(diào)整成兩束或多束液體匯合的流通閥。圖24 所示的流通閥稱為'T-閥'，在該例子中，關(guān)閉時(如左圖所示)，允許液體由上至下流過垂 直通道，而與水平通道隔離開。如圖24的右圖所示，該閥開放時，流體可從垂直通道移動到 水平通道中或從水平通道移動到垂直通道中。 圖25說明連接三個通道的流體連接之間的差異。左側(cè)，標(biāo)準(zhǔn)MOV閥位于三路連接 的左邊。右側(cè)顯示流通閥。常規(guī)MOV閥和流通閥均可用于調(diào)節(jié)流動或作為泵的一部分，但 流通閥中死容積被消除，而常規(guī)MOV閥中，閥至通道交叉點(diǎn)的區(qū)域是死容積。
此種類型的閥中，通道數(shù)量也可能變化。圖24所示的例子中顯示，一個通道通過 該閥， 一個通道終止于該閥。在另一實施方式中，可設(shè)計包含多個使流體通過該閥的通道和 /或多個終止于封閉閥的通道的微結(jié)構(gòu)。
在微芯片和其它流體裝置上操作磁珠
星形和嵌套星形捕獲裝置 _ 另一方面，隨著磁珠通過通道結(jié)構(gòu)，將它們捕獲。在一個實施方式中，在磁場邊緣 捕獲磁珠最有效。在一個實施方式中，設(shè)計微通道結(jié)構(gòu)，使通道多次通過磁場邊緣，從而利 用該特點(diǎn)。在圖26中，粗線條代表通道結(jié)構(gòu)，細(xì)線條代表磁體。在此實施方式中，該系統(tǒng)的捕獲效率取決于多種因素，包括但不限于流過通道的流體施加在珠上的剪切力和磁體施 加的力。在一個實施方式中，流速較高時，在與磁體相交的每個通道區(qū)段中只能捕獲一定數(shù) 量的珠。通道中捕獲珠后，它們占據(jù)固定體積的空間，顯著減小了通道的橫截面面積，從而 提高流體速度和剪切力。達(dá)到或超過這種平衡時，其它珠沿著通道被推至下一個磁場邊界。 與具有單個磁場邊界交叉的設(shè)計相比，具有多個磁場邊界交叉的微通道設(shè)計能在通道中捕
獲更多的珠。 在一些實施方式中，磁體可以是電磁體或永磁體，包括但不限于稀土磁體、固定 和可移動的磁體。 在一個實施方式中，具有多個銳角的微通道設(shè)計可用于運(yùn)行熱循環(huán)。在另一實施 方式中，具有多個銳角的結(jié)構(gòu)長度可用于混合。當(dāng)液體一起進(jìn)入微流體系統(tǒng)時，層流可保持 液體的分離。具有多個銳角和許多彎曲的結(jié)構(gòu)使得能夠通過擴(kuò)散實現(xiàn)混合。將圖26的左 圖中的線路壓縮成右圖中所示的嵌套星形或許多其他構(gòu)型。嵌套星形占據(jù)的空間小于完整 星形。 通過改變微型閥的橫截面面積捕獲珠 _ 另一方面，可通過改變捕獲區(qū)的幾何形狀以提高橫截面積，而更有效地捕獲珠，圖 27。豎直線代表通道，黑色圓圈代表磁體。隨著通道流過磁場，可增加通道的寬度或深度。 出于數(shù)種原因，橫截面面積改變后能更有效地捕獲珠。與正常通道截面積的給定流速相比， 橫截面面積增加導(dǎo)致流速下降。流速越慢，意味著將珠退出捕獲區(qū)的力越小。除速度較慢 以外，體積增加給予流體以路徑，以環(huán)繞在此部分捕獲的珠周圍。具體形狀可顯著不同。它 也可與星形和嵌套星形結(jié)構(gòu)聯(lián)合使用。橫截面積增加也可實現(xiàn)許多不同功能，包括反應(yīng)室 或熱循環(huán)室。
在閥中捕獲珠 _ 另一方面，閥中的珠捕獲(圖28)利用與上述實例中通過增加通道橫截面積進(jìn)行 捕獲相同的構(gòu)思。微型閥允許改變其通道橫截面。關(guān)閉時，通道的橫截面保持均一貫穿。閥 開放時，閥處的通道橫截面面積明顯增加，實際上閥的開放在微流體通道中產(chǎn)生空間。隨著 磁性顆?；蝽槾判灶w粒通過開口閥移動，液流減慢，磁體可捕集顆粒。適當(dāng)?shù)仄胶獯帕r， 關(guān)閉該閥可釋放順磁性顆粒?？赏ㄟ^重復(fù)地開放和關(guān)閉該閥去除順磁性顆粒。也可通過 使與珠作用較佳的流體通過以提高曳力，或通過改變團(tuán)塊(bolus)中的空氣和液體實現(xiàn)釋 放。 試劑分布 _ 另一方面，宏觀世界和微流體裝置之間的接口常常是難以解決的問題之一。雖然
微流體裝置在試驗中可使用只有納升或皮升的試劑體積，但一般需要將大得多的體積連接
于測定裝置。在分離裝置中，雖然只注射和加工納升或皮升體積，但該裝置可能需要接觸較
大體積的樣品以加載此種較小體積。也優(yōu)選最大程度降低通道中的試劑總量，以最大程度
減小死容積。 共同試劑儲庫
_ 在另一方面，圖29顯示了一種共同試劑儲庫，其中位于中央的儲庫提供兩條通
道。在這種情況下，剛好充滿儲庫底部所需的最小體積在兩條通道之間共享，因此供應(yīng)兩條
通道所需的總體積小于兩條通道連接于兩個獨(dú)立的儲庫的設(shè)計。在此例中，用y_閥將兩條
供應(yīng)通道各自進(jìn)一步分成兩條通道。該y-閥分離進(jìn)入它的三條通道。該分離幫助降低通道
中可能由蒸發(fā)、毛細(xì)管作用或其他來源引起的不良流動引起的污染。在此實施方式中，覆蓋
孔底所需的單個無法使用的體積在四條通道中共享，從而降低此系統(tǒng)所需的流體總量。從
單個孔中引出的通道數(shù)量和用交叉點(diǎn)或閥將通道分開的倍數(shù)基本上是無限的。該系統(tǒng)可以相反方向使用，以收集廢液。在圖29所示的例子中，如果液流朝向儲
庫，四條通道可將廢液移動到單個儲庫中。優(yōu)點(diǎn)是需要清空的廢液儲庫較少。該儲庫也可
含有電極并將四條通道連接于電位，或含有真空以便通過y閥或其他閥調(diào)節(jié)的四條通道吸
出材料。 試劑遞送系統(tǒng) _ 在另一方面，利用流通閥遞送試劑或樣品，以最大程度減小交叉點(diǎn)的死容積，在需 要時通道在交叉點(diǎn)上可互不連通(圖30)。這種安排的優(yōu)點(diǎn)是用一組共有閥泵送鏈內(nèi)的所 有試劑。使用一組共有的泵送閥能降低改變不同泵送閥時引入的混合試劑比例的變化。
試劑環(huán) _ 在另一方面，微結(jié)構(gòu)包括試劑環(huán)中的三個閥以及第四個閥流通閥，試劑環(huán)中的三 個閥用作微型泵以使流體在環(huán)內(nèi)循環(huán)，而流通閥允許將額外材料移動到該環(huán)內(nèi)或移出該環(huán) 外(圖31)。可使用多個流通閥。使用該環(huán)可連續(xù)循環(huán)最小體積。 該系統(tǒng)也可用于洗脫掉樣品。循環(huán)洗脫溶液以及捕獲材料將為洗脫掉樣品和捕獲 材料周圍的高樣品濃度區(qū)域擴(kuò)散開提供更多時間，使得能夠洗脫較高濃度。
集成設(shè)計 _ 在另一方面，使用包含微結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)和生物反應(yīng)。在一個實施方式中，對 DNA測序、法醫(yī)學(xué)和其他應(yīng)用而言，如圖32所示，在閥和試劑遞送系統(tǒng)中將共用的試劑儲庫 與珠捕獲集成。可將三個樣品加載到樣品儲庫80中。然后，可通過檢修閥IO將來自共用試 劑儲庫70的試劑泵送到流通閥20中?？赏ㄟ^使用，例如閥10、30、40和50或?qū)⑼獠繅毫?用于微型閥IO進(jìn)行泵送，從而調(diào)節(jié)流動。流通閥20打開時，達(dá)到樣品儲庫80的樣品，并可 將樣品泵送到流通液流中，通過微型閥30和微型閥40進(jìn)入反應(yīng)室60。如果進(jìn)行熱循環(huán)，則 可關(guān)閉微型閥40和50以分離反應(yīng)室。圖32顯示的反應(yīng)室為通道；反應(yīng)室也可以在閥中， 或者在閥或通道或其他流體組件之間移動?？墒褂醚b置內(nèi)泵送或裝置外泵送進(jìn)行移動，在 優(yōu)選實施方式中，可對微型閥進(jìn)行變成，以便以所需方式導(dǎo)向流動，以便集成生化反應(yīng)，產(chǎn) 生也可以是測定的反應(yīng)?？梢栽谘b置上測定產(chǎn)物，或者可移動到另一個裝置進(jìn)行測定。
然后，圖32所示裝置可進(jìn)行第二個反應(yīng)。在一個實施方式中，反應(yīng)可以是進(jìn)行生 化或化學(xué)反應(yīng)以進(jìn)一步加工樣品的珠基反應(yīng)。可以在該裝置上詢問該反應(yīng)，或?qū)⑵湟苿拥?另一裝置進(jìn)行測定。
在另一實施方式中，對該裝置變成，以集成用于DNA測序應(yīng)用的多步反應(yīng)。在共有 的試劑儲庫70中裝入循環(huán)測序試劑，與含有DNA的樣品混合后裝入樣品儲庫80中，在一個 實施方式中，樣品是準(zhǔn)備測序的PCR、質(zhì)粒或其他核酸擴(kuò)增產(chǎn)物?？赏ㄟ^可編程流體裝置，用 微型閥將含有樣品和循環(huán)測序試劑的混合物移動到反應(yīng)室60中，在此處用熱循環(huán)進(jìn)行循 環(huán)測序反應(yīng)。然后，可將循環(huán)測序產(chǎn)物移動到產(chǎn)物儲庫90中，以便從裝置中移出進(jìn)行進(jìn)一 步加工，或者在優(yōu)選實施方式中，將循環(huán)測序產(chǎn)物移動到儲庫中，將珠如艾克(Agencourt) SPRI珠加入循環(huán)測序產(chǎn)物中，進(jìn)行合適化學(xué)反應(yīng)以使所需循環(huán)測序產(chǎn)物結(jié)合于珠，以便將 產(chǎn)物與保留在溶液中的鹽和未摻入染料標(biāo)記的終止劑或引物分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員可明顯 看出，與循環(huán)測序產(chǎn)物結(jié)合于珠不同的是，上述過程可反向進(jìn)行，其中循環(huán)測序產(chǎn)物留在溶 液中，鹽和未摻入染料結(jié)合于珠。所用術(shù)語珠包括但不限于顆粒、順磁性顆粒、納米顆粒、凝 膠、具有親和捕獲特性或非特異性特性的凝膠。如果儲庫80中包含珠和循環(huán)測序產(chǎn)物，則 通過微型閥20和30將合并的混合物泵送到可能有開口并且附近具有固定或可移動的磁體 的微型閥40中。隨著液流在開通的微型閥中減慢，捕獲順磁性珠如SPRI珠，在磁場中捕獲 珠?？蓪⒘黧w如乙醇加入儲庫中，然后加工該珠并去除不良雜質(zhì)，如鹽和摻入染料標(biāo)記的反 應(yīng)物。然后，可將珠泵送到產(chǎn)物儲庫90中。在循環(huán)測序中，易于在單獨(dú)裝置如具有分離功能 的CAE或微芯片上分析產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯了解，不同儲庫可具有其他構(gòu)型，可將一 種樣品加入儲庫70中，可將多種試劑加入儲庫80中，以在一種樣品上進(jìn)行三種不同反應(yīng)。
在另一實施方式中，利用該裝置進(jìn)行連接測序或合成測序。珠可保持在采用激光 誘導(dǎo)的熒光、拉曼光譜、等離振子共振或其它方法的檢測器可詢問的構(gòu)型中。在此實施方式 中，珠可保持在反應(yīng)室32中，通過微型泵移動的反應(yīng)物經(jīng)過珠，在此處發(fā)生熒光標(biāo)記反應(yīng)， 并用檢測器讀出讀數(shù)。然后，可通過泵送其它流體以洗滌珠，從而去除反應(yīng)物，例如焦磷酸 測序(pyrosequencing)、合成測序、連接測序或其它測序化學(xué)方法。然后，可利用裝置上的 微型泵去除試劑或利用微型閥調(diào)節(jié)試劑流動，加入下一試劑，以進(jìn)行下一輪測序?？赏ㄟ^磁 力、光學(xué)捕集或其它能量方法或通過物理限制捕集在圍堰結(jié)構(gòu)中，而保持珠。(美國專利號 7，312，611，通過引用全文納入本文)。在一個實施方式中，微結(jié)構(gòu)包括能夠利用一個或多個 圍堰結(jié)構(gòu)在微型化水平有效交換或捕集珠的片內(nèi)包裝反應(yīng)器床設(shè)計。在一個實施方式中， 各珠可進(jìn)行反應(yīng)，或者如目前的焦磷酸測序中所用，一些珠可具有額外反應(yīng)物。
在另一實施方式中，可保持珠，一些珠有意不進(jìn)行反應(yīng)以改進(jìn)檢測。通過物理稀 釋所需信號物理分離具有信號的珠與其它珠，以便光學(xué)分離具有待詢問DNA樣品的珠的信 號，從而獲得改進(jìn)。這將通過控制來自其它珠的信號改進(jìn)反應(yīng)的信噪比，以便操縱通道或室 中的串話。例如，如果每個具有DNA的珠中加入不含待測序的DNA樣品的相同大小的100 個珠，那么每IOO個珠有一個信號，這會改善串話。還可有其它稀釋比例。
在另一實施方式中(圖33)，將共有的試劑儲庫70、樣品儲庫80和產(chǎn)物儲庫90以 及微型閥10、20、30和40的元件重新排列，以使用星形捕獲產(chǎn)生可進(jìn)行反應(yīng)的裝置，然后用 磁珠或其它珠或其它純化方法清除反應(yīng)產(chǎn)物。圖33顯示與圖32不同的也可進(jìn)行DNA測序 的設(shè)計。可將樣品加入儲庫180中，將循環(huán)測序試劑加入儲庫170中，通過微型閥110、115、 120和130混合，移動到室160中進(jìn)行循環(huán)測序或其它反應(yīng)。可利用儲庫185將珠加入反應(yīng) 產(chǎn)物，然后將反應(yīng)產(chǎn)物移動到星形捕獲線路140中進(jìn)行磁力捕獲?？赏ㄟ^加入不同溶液，例 如SPRI化學(xué)溶液或其它珠基化學(xué)溶液進(jìn)行洗滌，將該溶液通過捕集的珠，以去除不良產(chǎn)物如鹽或未摻入的染料。 在另一實施方式中，集成設(shè)計能夠運(yùn)行各種過程。可以將兩種試劑精確地混合在
一起，對混合物進(jìn)行反應(yīng)，并清除該反應(yīng)的產(chǎn)物。由于該系統(tǒng)能在兩個儲庫之間主動泵送流 體，所以可將額外試劑供應(yīng)給該反應(yīng)。這種設(shè)計非常緊湊，并且具有每個線路使用較小空間
的優(yōu)點(diǎn)，能夠包裝到微芯片中，以便切掉一部分以改進(jìn)微芯片產(chǎn)率和性能。 在另一實施方式中，圖32和33說明生化和化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)，如循環(huán)測序和化學(xué)反
應(yīng)所述，如SPRI清除。本領(lǐng)域技術(shù)人員可明顯看出，可使用裝置上的微型閥集成不同的生
化和化學(xué)反應(yīng)。在法醫(yī)應(yīng)用中，可以在包含可編程微型閥的裝置上進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)(STR)
反應(yīng)，使用STR反應(yīng)如PowerPlex 16以擴(kuò)增DNA和珠清除來純化反應(yīng)物。 可以在可編程微流體線路中進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、翻譯反應(yīng)或偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯翻
譯，以分別測定DNA或RNA?？捎闷錅y定加入的額外材料如微小RNA、抑制劑、候選藥物、化
學(xué)物質(zhì)或待測其它材料的影響?？蓪⑵溆糜诤Y選所加材料對轉(zhuǎn)錄、翻譯或偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻
譯翻譯的影響。在一個實施方式中，偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯翻譯產(chǎn)生能量收集產(chǎn)物。在另一實
施方式中，加入檢測器105，以監(jiān)測可編程微流體線路中的反應(yīng)。 用直線設(shè)計顯示圖32和33所示設(shè)計，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，也可采用其 它設(shè)計如放身寸狀設(shè)計。("Roach， D. ， R丄oder， T. Armstrong, D. Harris, S. Jovanovich 禾口 R. Johnston.機(jī)器人微通道生物分析裝置(Roboticmicrocha騰l bioanalytical instrument) 2003年9月30日，美國專利6， 627， 446";"Roach， D. ，R. Loder， T. Armstrong, D. Harris, S. Jovanovich和R. Johnston.機(jī)器人微通道生物分析裝置(Robotic microcha騰l bioanalytical instrument). 2004年7月20日，美國專利6， 764， 648，，， "Roach， D. ， R. Loder， T. Armstrong, D. Harris, S. Jovanovich禾口 R. Johnston.填充禾口清潔 用于生物分析的微芯片中的通道和進(jìn)入端口的設(shè)備和方法(A卯a(chǎn)ratus and Method for Filling and CleaningCha皿els and Inlet Ports in Microchips Used for Biological Analysis) ，2004年9月7日，美國專利6， 787， lll"，將所有文獻(xiàn)全文納入本文)。在一個實 施方式中，微型閥可利用化學(xué)或生化過程進(jìn)行反應(yīng)，以加工材料，由樣品產(chǎn)生產(chǎn)物。該產(chǎn)物 由化學(xué)或生化組合物構(gòu)成，可產(chǎn)生能量、儲存能量或使用儲存圖樣以可控方式轉(zhuǎn)化能量。
公開了如何借助化學(xué)或生化過程的集成在反應(yīng)或加入反應(yīng)的材料中產(chǎn)生產(chǎn)物或 測定組分，以測定一些材料屬性。術(shù)語"材料"的含義包括但不限于物質(zhì)或能量，在一個實 施方式中，產(chǎn)生由熒光、發(fā)光或其它電磁波譜的其它變型組成的光線，以測定該反應(yīng)。在一 個例子中，可編程微流體線路可進(jìn)行由檢測器如激光誘導(dǎo)的熒光檢測器檢測核酸的反應(yīng)， 如實時PCR、質(zhì)譜或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它方式，或?qū)Φ鞍踪|(zhì)而言是可測定反應(yīng)物催化 的化學(xué)或生化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)。在一個實施方式中，該裝置可通過化學(xué)或生化方式將能量儲存 在物料(bulk)或圖樣中，以便以可用方式，如視覺或光學(xué)方式儲存能量。該裝置可以是被 動的或可編程的，以改變其行為?？捎闷涓淖冃盘柈a(chǎn)生，其方式為通過化學(xué)或生化轉(zhuǎn)化改變 光學(xué)特性或其它特性。其可用作條件傳感器，鑒定物理對象、轉(zhuǎn)化物質(zhì)和能量的報道物。
可利用該儲庫將可編程微流體線路連接于其它上游或下游裝置。可使用機(jī)器人吸 取或轉(zhuǎn)移流體，或者模塊化微流體連接可直接連接于其它微流體裝置。
微流體芯片組裝法_熱粘結(jié)的膜 _
在一個方面，微流體芯片(微芯片)由兩層玻璃或塑料熱粘結(jié)在一起形成。 一些 醫(yī)學(xué)試驗片使用粘合劑(一般是帶形)將具有通道的塑料層與分成一個或多個塑料和/或 粘合劑層的其它特征粘結(jié)起來形成。 在一個實施方式中，可編程微流體線路可由芯片上的包含MOV微型閥的特征和相 關(guān)特征制成。(下文中，我們使用"閥"指代任何這種類型的特征。)在圖2所示的實施方 式中，所用堆疊物包含具有蝕刻的微流體通道和鉆孔的兩個粘結(jié)玻璃層、PDMS膜層和其中 蝕刻氣動通道以便為隔膜提供致動壓力的玻璃層。在這種結(jié)構(gòu)中，PDMS適度地自身粘結(jié)于 玻璃，但可在閥中與玻璃局部分離，經(jīng)處理可降低其在閥中的粘性。也可能是三層結(jié)構(gòu)。
在一個實施方式中，氣動致動微型閥用塑料材質(zhì)制造。隨著微流體和氣動層的材 料改變?yōu)樗芰?，PDMS膜不再具有使用與玻璃相同結(jié)構(gòu)時的足夠粘性，必須開發(fā)一種新方法。
在一個實施方式中，用熱和壓力組裝全塑料芯片，以便同時將微流體層、膜和氣動 層熱粘結(jié)在一起。需要小心地控制這一過程，以保證在除閥區(qū)域以外的區(qū)域，層強(qiáng)烈粘結(jié)， 在閥區(qū)域不施加壓力以防止膜與微流體層粘結(jié)-如果時間、溫度和壓力正確。在整個芯片 上獲得均一粘結(jié)且在微型閥中不發(fā)生粘結(jié)可能是一項挑戰(zhàn)。 圖34說明混合塑料微芯片的一個例子。在本發(fā)明的另一實施方式中，用一種或多 種方法使膜熱粘結(jié)于微流體層。各方法通過將閥中的溫度保持在粘結(jié)溫度以下，而加熱其 余區(qū)域并壓在微流體層上，而避免膜閥中粘結(jié)。輔助這種方法的一項因素是膜可以制備得 相當(dāng)薄(如25微米)，而閥的直徑一般為l-3mm。這使得能夠使用將熱施加于去除匹配閥 圖樣的圖案的加熱板的方法。為了從側(cè)邊到達(dá)閥的中心，用于粘結(jié)的熱必須經(jīng)過相當(dāng)于到 達(dá)膜和微流體層界面的距離20倍或更多倍的距離。這使得可能在加熱粘結(jié)區(qū)域的同時保 持閥區(qū)域足夠冷卻，使其不發(fā)生粘結(jié)。不應(yīng)粘結(jié)的閥座的相關(guān)區(qū)域也可以是用涂層，包括照 相平版掩模、消減蝕刻(subtractive etch)、化學(xué)氣相淀積法和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其 它方法修飾的表面。也可通過局部冷卻使不應(yīng)粘結(jié)的閥座的相關(guān)區(qū)域保持不同溫度，或者 加熱微流體和膜層的組件可去除閥區(qū)域，以使各閥的局部區(qū)域接受較少熱量，從而無法達(dá) 到其Tg且無法粘結(jié)。 在一個實施方式中，通過包括以下步驟的方法將膜粘附于微流體層(l)使用切 成所需形狀的加熱板或輥。以使其只在需要粘結(jié)的區(qū)域，一般是除閥區(qū)域以外的任何地方 接觸芯片組件；(2)使用激光選擇性加熱所需區(qū)域。在此方法中，可能需要一層能透過激光 波長，而另一層無法透過激光波長。以此方式，使激光能量被材料之間的界面吸收，這正是 我們最想要的。可使用額外的堅硬透明層向界面施加壓力?；蛘?，可使用"透明焊接"方 法。在該方法中，用特殊化合物涂布界面，所述化合物經(jīng)設(shè)計能吸收容易通過可能是全透明 的新皮層的激光波長；(3)用高能IR光源，并用掩模遮蔽不需要粘結(jié)的區(qū)域。只加熱暴露 的區(qū)域；(4)超聲焊接。根據(jù)所用材料，可通過將準(zhǔn)備粘結(jié)(或不粘結(jié))的表面選擇性暴露 于紫外光和/或等離子體以改變其粘結(jié)溫度，而任選地改進(jìn)這些加熱方法。
在另一實施方式中，可將氣動致動構(gòu)建到使用微芯片的設(shè)備中，在該設(shè)備中微芯 片保持一定位置以便致動閥膜。該方法中如何制備和粘附氣動層的方法有很大彈性。 一些 實施方式是(1)通過轉(zhuǎn)移帶或雙面帶(例如通過激光切割或沖切)切割氣動通道，將帶粘 附于覆蓋膜，然后將此組件粘附在微流體/膜組件上，或者首先將該帶粘附在微流體/膜組 件上，然后加上覆蓋膜；(2)研磨、雕刻或注模形成塑料氣動塊，以使通道不完全一致。使用液體粘合劑將其粘結(jié)于微流體/膜組件；(3)通過帶的粘合劑側(cè)研磨或雕刻氣動圖案。(4) 使用機(jī)械夾緊方法使微流體/膜組件靠在氣動組件上。在這種情況下，氣動組件可能是芯 片的一部分或設(shè)備的一部分，正如所期望的那樣；(5)將氣動塊熱念介導(dǎo)微流體/膜組件 上。需要注意，可為氣動組件選擇低熔點(diǎn)材料，以避免損傷微流體/膜組件。
在一個例子中，提供制備塑料微流體芯片的手段?？蛇x擇材料，以使樣品僅暴露于 一種材料。如果支持板處于冷卻溫度，那么微流體層在粘結(jié)過程中可保持冷卻，從而避免收 縮。有一種產(chǎn)生所需熱的方法可供選擇。氣動層的材料和粘附方法的選擇有很大彈性。它 并不昂貴。它不需要開發(fā)重大新技術(shù)。它保證沿微流體通道的良好粘結(jié)，即使在氣動通道 穿過處。在現(xiàn)有的三層同時粘結(jié)方法中，有可能在這些位置缺少壓力而妨礙良好粘結(jié)，導(dǎo)致 通道泄漏。 機(jī)械夾緊的微芯片 _ 在另一方面，通過機(jī)械粘結(jié)層以便在不結(jié)合的部分產(chǎn)生密封，從而制造微流體芯 片。 在一個實施方式中(圖35)，機(jī)械夾緊的芯片允許使用各種膜層，而無需發(fā)現(xiàn)各種 材料的粘結(jié)技術(shù)。該實例含有具有不同特性需求的層。微流體和氣動層均需要保持小特征 的能力，膜層需要作為MOV閥操作，膜和微流體層必須與化學(xué)或生物測定相容。機(jī)械夾緊使 得可能在不引入額外材料如粘合劑的情況下構(gòu)建這一部分。對準(zhǔn)不同層，并將它們機(jī)械夾 緊在一起。圖36顯示以此方式制備的芯片的照片。
降低對準(zhǔn)需求的夾緊芯片 _ 在此實施方式中(圖37)，下述兩層中含有需要對準(zhǔn)的精細(xì)特征氣動層以及微流 體和閥層。微流體層中的特征可通過許多方法粘結(jié)于密封層，因為它們均可由相同材料制 成。可將特征，如脊和通道安置在微流體和氣動層上，以幫助密封于膜層。氣動層與膜機(jī)械 夾緊到組裝的微流體和閥層上。在此設(shè)計中需要夾緊的區(qū)域縮小降低了容差累積并簡化了 微芯片的制造。 粘合劑層疊微流體芯片 _ 另一方面，公開了層疊微芯片。MOV微流體芯片一般含有隔膜閥和相關(guān)特征，如泵、 路由選擇器和可變?nèi)莘e室(下文中，我們使用"閥"指代任何這種類型的特征)，其中使用玻 璃制造剛性層，使用PDMS制造隔膜層的膜。將玻璃_玻璃界面熱粘結(jié)，膜的固有特性能提 供將其粘結(jié)于玻璃的足夠粘合力，無須使用粘合劑。 在許多應(yīng)用中，可能需要用塑料替代玻璃以降低微流體芯片的成本。迄今為止， PDMS對塑料不具有足以耐受操作閥的壓力的固有粘合力。另外，PDMS對氣體的滲透性可能 使保持關(guān)閉的閥中形成氣泡。這些氣泡可能對芯片的性能有害。 在一些實施方式中，用粘合劑粘結(jié)層，以制備微流體芯片(美國專利號6， 803， 019 和美國專利號6， 176， 962，通過引用將其全文納入本文)。 在一個實施方式中，微流體芯片中的不同層用粘合劑粘結(jié)，在一些實施方式中，在 一些或所有粘合劑層中形成特征，如通道。與粘合劑-層疊微流體結(jié)構(gòu)中其它工作的關(guān)鍵差異是包含閥特征和相關(guān)結(jié)構(gòu)。該構(gòu)思的實施方式的兩個例子見圖38和圖39。在圖38所 示的第一個實施方式中，微流體層、界面層和氣動層由轉(zhuǎn)移帶制成，轉(zhuǎn)移帶具有切通(例如 通過激光切割)的合適的通道和孔。其他層被制成塑料薄片，它們也可具有切通的合適特 征。因此，多個層可由轉(zhuǎn)移帶制成。 在另一實施方式中(圖39)，在玻璃晶片中蝕刻通道，并將其熱粘結(jié)于玻璃通路 層，用兩個粘合劑層以不同順序組裝，從而構(gòu)建微芯片。使用可能是轉(zhuǎn)移帶的多個粘合劑層 實現(xiàn)這種方式安排。微流體層可以是熱粘結(jié)的塑料或用其他材料通過其他成型方法和/或 其他粘結(jié)方法制成。 在另一實施方式中，圖40說明通過粘合劑層疊構(gòu)建的閥的局部放大圖。通過氣動 層中的通道將壓力施加于閥室時，膜變形，直到其壓住兩個通路，密封它們以防止一個微流 體通道中的流體通過該閥流向其他通道。施加于閥室的真空將膜拖離通路開口，使流體從 一個微流體通道流向另 一個。 在另一實施方式中，粘合劑層疊方法能容許設(shè)計中出現(xiàn)較大的彈性。對于可集成 到設(shè)計中的內(nèi)容有少數(shù)限制。例如，圖41說明內(nèi)建加熱器和散熱器的粘合劑層疊芯片。不 同實施方式加入電極、光學(xué)組件、其他溫度控制組件，如熱管或散熱器、傳感器、印刷標(biāo)志。 由于不需要加熱或只需要適度加熱以固化粘合劑，所以這些類型的添加物對其無損傷，但 它們必須耐受或免受用于層疊工藝的壓力。 粘合劑層疊構(gòu)建是一種便宜的產(chǎn)生微流體芯片的方式。材料的選擇有很大彈性。 不難由庫存購得許多種類的膜和轉(zhuǎn)移帶。該芯片可保持相當(dāng)薄，以便于進(jìn)行熱控制。如果 足夠薄，它可能具有足夠彈性以便以巻的形式儲存。各層中的特征可以是激光切割的、噴水 切割的或沖切的，視需要而定。它們都是快速和富有彈性的方法，因此可快速完成原型制作 和少量生產(chǎn)?？梢杂幂^短的研制周期作出設(shè)計改變。存在實施該方法的必需技術(shù)，有多個 供應(yīng)商能夠提供這種組件。可快速實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。容易實施其中一層或多層由不同技術(shù) 生產(chǎn)的混合構(gòu)建。如果需要，界面粘合劑可制備得相對較厚，以形成通常完全開發(fā)的閥。這 種閥不需要真空源?？捎脡毫﹃P(guān)閉它，撤去壓力時該閥開放，膜回到最小應(yīng)力位置(平坦)。 容易加入額外的功能，如加入加熱器、散熱器、光學(xué)組件等。
集成到塑料微流體裝置上的閥陣列 _ 在本發(fā)明的一個方面，三層相同的塑料層疊獲得微流體芯片。 一個實施方式見圖 42。相同塑料的粘結(jié)參數(shù)是溫度和壓力。在正確條件下，除了發(fā)誓上的區(qū)域，膜將永久地粘 結(jié)于上板(微流體)和下板(致動)，當(dāng)壓力條件不同時，如果向閥室施加真空則塑料膜向 下移動，向閥室施加壓力則塑料膜向上移動。壓力條件在閥區(qū)域不同，因為在該區(qū)域它不接 觸底面致動層，由于閥室該區(qū)域在層壓或按壓期間經(jīng)受較小的壓力。當(dāng)恒定的溫度施加于 整個裝置或組件時，對接觸閥的材料施加的壓力較小，在調(diào)節(jié)溫度時這將防止粘結(jié)，因此只 在壓力轉(zhuǎn)移至膜時發(fā)生粘結(jié)。這是通常關(guān)閉的閥。在另一實施方式中，通常開放的閥可通過 在層壓過程中調(diào)節(jié)微流體通道中的壓力高于閥室而制成。如圖43所示，在裝置冷卻后獲得 凹陷的膜。致動此閥只需要壓力。在沒有電能的情況下可獲得壓力，此閥在可攜帶設(shè)備中 可能很有價值。對于這些三層結(jié)構(gòu)，空氣通道不能穿過兩個以上的微流體通道，反之亦然， 因為膜在通道下方不會粘結(jié)(此處無壓力)。這可能妨礙多通道裝置中聯(lián)接閥。
在另一實施方式中，在四層結(jié)構(gòu)中可使用相交的空氣和微流體通道。圖44顯示這 種結(jié)構(gòu)的橫截面。此閥通常是關(guān)閉的，需要壓力和真空來致動。也可產(chǎn)生通常開放的閥，只 需要壓力來致動。 在另一實施方式中，提供可選擇性沉積在閥座上、粘結(jié)完成后去除的可圖案化材 料，例如，與粘結(jié)溫度相容的光刻膠如Shipley 1818、水溶性聚合物的絲網(wǎng)印刷、光敏化合 物如UV活化的聚丙烯酰胺(R印roGel， GE健康護(hù)理公司(GE Healthcare))。另一實施方 式通過改變修飾區(qū)域的熔化溫度，例如通過在需要選擇性粘結(jié)的區(qū)域UV激活塑料如聚碳 酸酯，而修飾一些區(qū)域的表面特性。在另一實施方式中，通過液體如乙腈，優(yōu)選包含聚乙二 醇和丙二醇粘性液體，以破壞膜與閥座的粘結(jié)。
塑料微芯片中用于珠清除的線性閥陣列 _ 在另一方面，為珠清除方案設(shè)計線性閥陣列。例如，圖45的上圖顯示掩模設(shè)計，下 圖顯示此種丙烯酸三層芯片的照片。裝置由兩塊1. 5mm厚的丙烯酸平版和0. 04mm的丙烯 酸薄膜構(gòu)成。在各個1. 5mm平板中銑削微流體通道(藍(lán)色)和致動通道(紅色)(0. 25mm 寬和O. lmm深)。在兩塊丙烯酸平板中鉆出通導(dǎo)孔。將用于交叉點(diǎn)溫度控制的特殊通道切 成一塊平板。對準(zhǔn)丙烯酸夾心結(jié)構(gòu)，放置在平坦化(planarizing)托盤上，蓋上玻璃板，并 用加熱板按壓。在IO(TC和1頓壓力下進(jìn)行層壓。通過連續(xù)泵送檢測該芯片3天。沒有觀 察到泵失效。 在圖46中，提供用于法醫(yī)應(yīng)用的三層丙烯酸芯片的設(shè)計和照片。該芯片將樣品與 珠溶液混合，在大閥內(nèi)使珠樣品濃縮，將清潔樣品與PCR試劑混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和PCR后 清除。芯片尺寸是30mmX30mm。該通道的寬度為0. 25mm，深度為0. 15mm。擴(kuò)增通道可保持 約1. 5 ii L。微芯片的工作過程如下。氣動線211致動微型閥210和220。氣動線212致動 微型閥215。氣動線213致動微型閥250和255。氣動線214致動微型閥276。氣動線216 致動微型閥240。氣動線217致動微型閥230。氣動線219致動微型閥246。將具有粘附 于磁珠的材料的樣品加載到儲庫280中，儲庫280連接于微型閥220。通過微型閥220、230 和245泵送可將樣品移動到微型閥240中，微型閥240是開放的并配有磁場以捕集珠。用 加載到儲庫275中的洗滌緩沖液洗滌珠，這一過程由微型閥276控制，由微型閥276、230和 245泵送，洗液進(jìn)入廢液池247。然后，可用洗脫劑充滿儲庫275，純化樣品由珠洗脫到與下 游過程相容并通過微型閥246泵送的緩沖液中。在微型閥255上，用微型閥210、215和255 由儲庫270加入反應(yīng)混合物，隨著流入反應(yīng)器260，與所述的洗脫樣品混合。如果進(jìn)行熱循 環(huán)過程，如PCR或循環(huán)測序，則可關(guān)閉閥250和255。反應(yīng)后，將樣品泵出到儲庫290中。
根據(jù)各種樣品制備方案，如樣品濃縮、熱循環(huán)(循環(huán)測序或PCR反應(yīng))、等溫反應(yīng)和 樣品純化來設(shè)計這些實例。塑料多層層壓可提供具有閥和泵的低成本的一次性復(fù)雜芯片。 在許多應(yīng)用領(lǐng)域，如法醫(yī)學(xué)和分子診斷領(lǐng)域需要這些一次性芯片。 一次性芯片可使該設(shè)備 更簡單，沒有制備和清潔步驟。使用通常開放的閥不需要真空泵或壓力泵?？赏ㄟ^加壓筒
提供致動壓力，整個設(shè)備的動力要求可能相當(dāng)?shù)汀?
在閥中快速移動流體和反應(yīng) _ 另一方面，微結(jié)構(gòu)在兩個或多個不同空間位置之間快速移動流體。有許多方法進(jìn)行PCR、循環(huán)測序和其它目的的熱循環(huán)反應(yīng)。它們通?？煞譃閮深?。首先，反應(yīng)組分位于溫 度隨時間變化的小室內(nèi)。其次，在兩個或更多個位置上保持溫度恒定，將反應(yīng)組分從一個位 置移動到另一個位置，在各位置上與溫度平衡。我們可以將它們分別稱為"時間"和"空間" 循環(huán)。 迄今為止，在微流體應(yīng)用中進(jìn)行時，使用空間循環(huán)的那些通常提供曲折通過溫度 區(qū)的流體通道，它們通常以恒定速度強(qiáng)迫反應(yīng)流體單向流過該通道。通常通過微流體結(jié)構(gòu) 外部的裝置施加產(chǎn)生的壓力而產(chǎn)生流動。 在一個實施方式中，在單獨(dú)步驟中，通過一個或多個泵在不同溫度的區(qū)域之間移 動反應(yīng)組分以進(jìn)行熱循環(huán)。該泵可以位于外部，但在優(yōu)選實施方式中，該泵位于對反應(yīng)組分 進(jìn)行熱循環(huán)的微流體芯片內(nèi)部。 一個實施方式見圖47。在此方法中，利用我們的MOV泵之 一在熱區(qū)和冷區(qū)之間移動樣品。為了簡明起見，該圖僅說明一個雙溫度系統(tǒng)。但本發(fā)明不 限于此，很容易將該構(gòu)思擴(kuò)展到三個溫度或更多溫度。 例如，圖48顯示實施三溫度循環(huán)的方式。在本文中，用芯片內(nèi)泵通過三個溫度區(qū) 移動樣品。在這種情況下，溫度區(qū)在不同的通道體積上延伸。就恒速泵送而言，樣品暴露于 每種溫度的時間與各區(qū)中通道的體積成正比。相反，就芯片內(nèi)泵送而言，很容易在獨(dú)立動作 中移動樣品。以此方式，可以將溫度區(qū)制備得較小，恰好夠包含樣品即可。然后，僅對該泵致 動較短時間，以將一個區(qū)域的樣品移動到下一個區(qū)域，可通過泵致動動作之間的時間確定 在各溫度的停留時間。這使得溫度循環(huán)概況的調(diào)整富有彈性，而不用重新設(shè)計通道或加熱 器。需要注意，樣品可被不可混溶的流體包圍，以放置其擴(kuò)散開。因此，通過此種可編程微 流體線路激活團(tuán)塊和微乳劑，可用檢測器檢測團(tuán)塊和微乳劑，以進(jìn)行實時反應(yīng)或終點(diǎn)反應(yīng)， 例如在團(tuán)塊和微乳劑中進(jìn)行實時PCR。對于較高通量的系統(tǒng)，可能需要使用如圖50所示的 管線結(jié)構(gòu)。 圖49顯示另一實施方式，其中在不通過泵的情況下在熱區(qū)和冷區(qū)之間移動樣品， 從而消除與泵中材料的相互作用以及死容積引起的樣品損失。再一次，不可混溶的流體可 用于不同大小的樣品，以幫助保持其不發(fā)生擴(kuò)散。不一定具有如本文所示的兩個完整的三室泵。 如果需要再次使用這些特征，可能需要洗滌或沖洗后再次使用，以防止交叉污染。 如圖51所示的反應(yīng)室的一部分，可為這些功能加入額外特征，以清潔室。
在另一實施方式中，如圖52所示的雙溫度循環(huán)的閥和圖53所示的三溫度循環(huán)的 閥，溫度區(qū)位于與閥相同的位置。在此實施方式中，可通過關(guān)閉含有反應(yīng)組分的閥同時打開 目標(biāo)溫度區(qū)中的閥，將反應(yīng)組分一起從一個區(qū)域轉(zhuǎn)移到另一個區(qū)域。 一部分反應(yīng)組分將留 在通道中，因此無法達(dá)到所需的溫度，這是不想要發(fā)生的情況。但通過適當(dāng)調(diào)節(jié)閥和通道的 大小，可將該部分保持得很小。該實施方式的優(yōu)點(diǎn)是樣品不可能移動太多或太少，因此不能 適當(dāng)?shù)匚挥跍囟葏^(qū)。閥中的反應(yīng)可以在三層微型閥中進(jìn)行，其中彈性體或閥膜變形產(chǎn)生空 間，或者在四層微型閥中在通路中進(jìn)行反應(yīng)。 圖54顯示三室循環(huán)的另一實施方式。在這種實施方式中，用圓周旋轉(zhuǎn)(circular rotation)泵送液體。這保證沒有樣品重復(fù)地停留在通道中，但相對于閥容積增加了通道容 積。 在一些實施方式中，對溫度區(qū)中的閥而言不一定需要實際產(chǎn)生密封。只有閥打開和關(guān)閉時的容積改變比較重要。 一個選項是省去閥座，以使該通道允許通過熱循環(huán)區(qū)域進(jìn) 行連續(xù)流動。這在開始充填芯片和反應(yīng)組分移動到熱循環(huán)區(qū)域的過程中有優(yōu)勢。在充填過 程中，除一個閥以外，用必需的最小試劑體積使所有閥保持關(guān)閉。如果閥具有座，那它們應(yīng) 該開放以便充填。如果觀察到反應(yīng)組分到達(dá)循環(huán)區(qū)域的遠(yuǎn)端，則芯片充滿。
在一些實施方式中，需要在具有一項或多項以下特征的裝置中進(jìn)行熱循環(huán)快速 溫度轉(zhuǎn)變；穩(wěn)定、精確的溫度；輕量小包裝；一次性反應(yīng)容器；小反應(yīng)體積；低動力要求；自 動混合樣品和試劑；可編程地控制溫度概況(溫度和時間)；可適應(yīng)一系列樣品大小(納升 和更大)；可適應(yīng)一系列樣品數(shù)量(每個裝置l個樣品至幾百個樣品或更多樣品)；低操作 成本；通過該裝置移動反應(yīng)組分的壓力要求低。 在一個實施方式中，微結(jié)構(gòu)熱循環(huán)是可移動或手持式的。在另一實施方式中，該微 結(jié)構(gòu)熱循環(huán)器不是電池供電的。在一個實施方式中，用固定區(qū)域加熱方法保持動力要求相 當(dāng)?shù)?，并用微型泵在溫度區(qū)之間移動流體。在另一實施方式中，用微型閥控制含有分析物、 顆粒、納米顆粒、乳劑、微乳劑、試劑和其組合的流體。
微芯片中的反應(yīng)和它們在文庫構(gòu)建和分析中的應(yīng)用 _ 傳統(tǒng)桑格鳥槍測序法包括昂貴、費(fèi)力、費(fèi)時的體內(nèi)克隆、選擇、集落分離和擴(kuò)增步 驟。大的基因組研究中心已經(jīng)用機(jī)器人自動化島將許多這些過程自動化。目前正在開發(fā)或 被一些公司，如ABI、Solexa和454早期應(yīng)用的下一代技術(shù)可通過對小的分子集合體進(jìn)行反 應(yīng)而提供成本明顯較低的測序。同時，這些技術(shù)-以及其他技術(shù)如超級焦磷酸測序和單分 子測序_將大大改變樣品制備的要求和方法。 454公司目前開發(fā)了用皮升反應(yīng)對單個珠進(jìn)行的小型化形式的焦磷酸測序 法，該方法在"皮升滴定板(Picotiter plate)"中進(jìn)行，通過乳液相PCR產(chǎn)生鳥槍 模板(Margulies M，等，在顯微制造的高密度皮升反應(yīng)器中進(jìn)行基因組測序(Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors). Nature,2005年9 月15日；437(7057) :376-80，電子公開2005年7月31日)。每個四小時運(yùn)行在每輪測序 中產(chǎn)生約25M堿基，平均閱讀長度約為108。將支持各輪的樣品制備方法與許多手工步驟聯(lián) 合。通過乳液PCR(emPCR)，將DNA銜接子加入珠上的剪切的DNA文庫、純化的單鏈DNA和由 單個分子擴(kuò)增的DNA中。乳液PCR能夠用常規(guī)熱循環(huán)器在單個管道內(nèi)產(chǎn)生幾百萬至幾十億 單獨(dú)區(qū)室。Dressman等已用乳液PCR產(chǎn)生附連于磁性顆粒的克隆的PCR擴(kuò)增子(Dressman D， Yan H， Traverso G， Kinzler KW， Vogelstein B.將單個DNA分子轉(zhuǎn)化到熒光磁性顆 粒中以檢測禾口列舉遺傳變異(Transforming single DNAmolecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration ofgenetic variations)， Proc Natl Acad Sci USA. 2003年7月22日；100 (15) :8817-22.電子公開于2003年7月11 日)禾口 (Diehl F， Li M， He Y， Kinzler KW， VogelsteinB， Dressman D. BEAMing :在油包水 乳液中的微粒上進(jìn)行單分子PCR(BEAMing :single-molecule PCR on microparticles in water-in-oilemulsions) ，Nat Methods. 2006年7月；3(7) :551-9.)并開發(fā)了擴(kuò)增復(fù)雜文 庫的方法(Williams R， Peisajovich SG， Miller 0J， Magdassi S， Tawfik DS， Griffiths AD.通過乳液PCR擴(kuò)增復(fù)雜基因文庫(Amplification of complex gene libraries byemulsion PCR) ， Nat Methods. 2006年7月;3(7) :545-5)。在珠上產(chǎn)生克隆文庫的方法大約耗時2天，許多操作用專門設(shè)備進(jìn)行，產(chǎn)生約375bp的珠。樣品制備已成為G20通量的 主要限速步驟。在沒有完全自動化的情況下，每天不可能增加超過IOO倍以上的珠產(chǎn)量來 測序人基因組。為了將454樣品制備擴(kuò)展到從頭測序中，哺乳動物和其他復(fù)雜基因組需要 快速分級克隆策略，并且每天需要加工成百上千個文庫?？蓪⑾嗤臉悠分苽浞椒☉?yīng)用于 通過連接進(jìn)行的SOLiD測序。 在一個方面，利用小型化的樣品制備方法，通過使用顯微制造結(jié)構(gòu)、微流體和磁性 分離以及改進(jìn)的emPCR使文庫加工成珠文庫的過程自動化?？蓸?gòu)建需要激活自動化分級測 序法的大致平行的珠文庫。例如，用攜帶足夠DNA模板進(jìn)行焦磷酸測序的每個克隆微球， 每45分鐘可產(chǎn)生4， 032個單個文庫。在一些實施方式中，利用一個通道至能夠加工多達(dá) 一百萬單個序列的成百上千個微通道構(gòu)建裝置。 雖然實例描述DNA焦磷酸測序，但DNA分析法可以是其它反應(yīng)，例如合成測序，如 通過Solexa、Helicos、連接反應(yīng)如艾克/應(yīng)用生物系統(tǒng)(AppliedBiosystems)連接反應(yīng)測 序，以及其它DNA分析法。 除產(chǎn)生DNA測序文庫以外，可進(jìn)行相同方法以制備DNA文庫或樣品，用于其它DNA 分析、RNA分析、蛋白質(zhì)分析、糖分析、脂質(zhì)分析和其他生物分子的分析。這些樣品包括通過 對體外DNA-RNA-蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行編程產(chǎn)生的樣品，如偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄_翻譯系統(tǒng)、對生物分子 進(jìn)行修飾的系統(tǒng)和這些系統(tǒng)的產(chǎn)物。相似地，該方法可擴(kuò)展至化學(xué)文庫和合成的生物分子 文庫。 也可利用該方法在裝置如微芯片上進(jìn)行分子生物學(xué)反應(yīng)。 在以下實施例中，將連接用于許多實施例。除連接反應(yīng)外，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難觀 察到，可進(jìn)行所有生化和化學(xué)反應(yīng)，例如，限制性(酶切反應(yīng))、DNA修飾、聚合、DNA-蛋白質(zhì) 結(jié)合和其它生化反應(yīng)，以及加成、裂解、環(huán)化、縮合和其它化學(xué)反應(yīng)。 在用于構(gòu)建微珠基體外乳液相PCR文庫的流體系統(tǒng)中自動化的珠基克隆和擴(kuò)增 _ —方面，珠基克隆和擴(kuò)增方法和實施可以基于自動化設(shè)備，以加速對大量序列的 加工。例如，每天可將128， 000個輸入BAC或其它文庫加工成250， 000， 000個珠，用于對 人大小的基因組進(jìn)行超級焦磷酸測序(SPS)。圖55是對工作流和工藝的高水平描述。用 術(shù)語"超級焦磷酸測序"描述NBpSPs(NanoBioPr印sPs)中產(chǎn)生的珠的讀數(shù)，其中珠所含的 DNA文庫由單個模板拷貝制成。在其它實施方式中，可將不同的化學(xué)反應(yīng)施加于額外的工 作流，以便在團(tuán)塊、乳液和微乳液中進(jìn)行實時PCR。也可能進(jìn)行本發(fā)明所述的其它生化反 應(yīng)。NanoBioPr印SPS'平臺是合并制備DNA測序應(yīng)用樣品的珠基化學(xué)反應(yīng)的一個例子。 在一些實施方式中，可使基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)和其它實施方式適應(yīng)珠基反應(yīng)和流體反應(yīng) (美國專利號6， 190,616 ;美國專利號6， 423， 536 ;美國申請?zhí)?9/770,412 ;美國專利號 6， 870， 185 ;美國申請?zhí)?0/125， 045 ;美國申請?zhí)?1/229， 065 ;通過引用將其全文納入本 文)。在一些實施方式中，例如，在超級焦磷酸測序?qū)嵗蟹治霾豢苫烊艿牧黧w或微乳液中 的樣品團(tuán)塊。這是教導(dǎo)如何將生化和化學(xué)過程偶聯(lián)和用微流體裝置進(jìn)行多步反應(yīng)的本發(fā)明 的另一個例子。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，模塊化微流體連接能夠移動如本文所述產(chǎn)生的樣品。
在一個實施方式中，NanoBioPr印SPS每45分鐘可輸入4， 023個末端削平的文庫， 在連接模塊中，在42個微芯片上進(jìn)行4， 023個納米級單個連接以連接關(guān)鍵銜接子，每個芯片有96個通道。然后，連接模塊匯集文庫并將單個片段結(jié)合到單個珠上。emPCR模塊使用 乳液相PCR(emPCR)產(chǎn)生珠基DNA文庫，用于超級焦磷酸測序。 在一個實施方式中，單通道微芯片可進(jìn)行連接，已開始開發(fā)規(guī)模可調(diào)的硬件微芯 片和軟件，以便將連接模塊的微芯片部分完全自動化。如下所述的'珠風(fēng)暴(BeadStorm)' 裝置可重懸、混合、加工、結(jié)合和移動磁性和非磁性珠。在emPCR過程中，公開了用于單個 emPCR通道的容納至多和超過100mL emPCR反應(yīng)和其它工作流部分的硬件；其它實施方式 可采用額外通道，它們也屬于本發(fā)明范圍?？墒褂脧?qiáng)大的全尺寸步驟來產(chǎn)生高質(zhì)量的珠文 庫。 在一個實施方式中，NanoBioPr印超級焦磷酸測序(NanoBioPr印SPS)過程(圖 55)將文庫加工自動化，以連接銜接子、構(gòu)建單鏈DNA文庫和進(jìn)行乳液相PCR(emPCR)，從而 產(chǎn)生具有DNA片段的克隆群體的珠、塑料、聚苯乙烯、玻璃或其他珠，所述DNA片段衍生自細(xì) 菌人工染色體(BAC) 、 BAC-等效文庫、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、單個樣品、全基因組擴(kuò)增、匯集樣品如環(huán) 境樣品，包括用于監(jiān)測的氣溶膠收集器，包括生物防御應(yīng)用(統(tǒng)稱為文庫)。最終產(chǎn)物DNA 珠文庫能提供超級焦磷酸測序讀出設(shè)備，以便在一天內(nèi)完整地從頭進(jìn)行哺乳動物量級的基 因組測序。 在本實施例中，NanoBioPr印SPS過程每輪、每45分鐘從1072 384孔微量滴定板輸 入4， 032個單個文庫，這些文庫被預(yù)剪切至1， 000堿基對左右的群體，進(jìn)行末端削平和磷酸 化。因此，NanoBioPr印SPS每天加工128，000個文庫，產(chǎn)生至多250，000，000個珠。產(chǎn)生的 珠數(shù)量可調(diào)。各珠將攜帶至多1， 000bp的擴(kuò)增子，每天足以產(chǎn)生60B堿基的序列數(shù)據(jù)_相 當(dāng)于每天覆蓋10倍人類量級的基因組。NanoBioPr印SPS設(shè)備例教導(dǎo)了前端樣品制備的有 效和高效裝置，它能產(chǎn)生用于超級焦磷酸測序的鳥槍文庫，用于從頭和再測序方案以及可 與本發(fā)明所述的生化和化學(xué)過程結(jié)合的其它微珠和微乳劑過程。 在另一實施方式中，NanoBioPr印SPS設(shè)備集成兩個模塊，如圖55所示。連接模
塊輸入片段化、大小分級和末端削平的文庫，(1)將獨(dú)特銜接子結(jié)合于片段末端，(2)修復(fù) 連接反應(yīng)產(chǎn)生的3'缺口，和(3)變性以產(chǎn)生單鏈(SS)DNA文庫，以便輸入第二模塊即乳液 PCR(emPCR)模塊。emPCR模塊(1)在使單個DNA分子結(jié)合于單個珠的條件下用結(jié)合的捕獲 探針將SS文庫退火到珠上，(2)進(jìn)行emPCR以在珠上擴(kuò)增DNA， (3)將雙鏈DNA變性產(chǎn)生覆 蓋有SS擴(kuò)增文庫片段的玻璃珠，和(4)使用退火引物，通過另一磁珠捕獲由空珠中富集含 有DNA的珠。將最終SS珠文庫送入超級焦磷酸測序設(shè)備中，以便進(jìn)行測序和分析。
NanoBioPi^pSPS連接模塊 _ 在一個方面，提供包括基本平行的基于微芯片的設(shè)備的裝置，所述設(shè)備利用MOV 閥、泵和路由選擇器將每輪4， 032對不同的銜接子單獨(dú)連接到4， 032個不同的削平片段的 文庫的過程自動化，后續(xù)一起進(jìn)行缺口修復(fù)和變性，產(chǎn)生鑰匙編碼的(key-coded)單鏈文 庫。NanoBioPr印SPS連接模塊可由42個微芯片組成，各微芯片具有96條通道(圖56)。 通過在每個片段上連接兩個銜接子，微芯片的各個通道具有單個片段文庫。描述了一種 NanoBioPr印SPS微芯片，它能同時為96個文庫添加銜接子。
將文庫加載到微芯片上 _
在一個實施方式中，可使用間隔9mm的毛細(xì)轉(zhuǎn)移管陣列，將微量滴定板，如384孔 板中的文庫轉(zhuǎn)移到微芯片上，一次96個樣品(圖57)，所述毛細(xì)轉(zhuǎn)移管陣列稱為毛細(xì)管盒。 可采用較低和較高量的毛細(xì)管。圖58顯示用于反應(yīng)的96通道毛細(xì)管盒的照片。在這個 NanoBioPr印SPS例子中，毛細(xì)管的長度可剛好浸入微量滴定板孔中，其寬度剛好被毛細(xì)管 作用充滿。由微量滴定板充滿后，通過機(jī)器人將轉(zhuǎn)移毛細(xì)管盒轉(zhuǎn)移到微芯片的96個輸入孔 中，其具有8X 12形式的96個連接線路，間隔9mm。將毛細(xì)管盒簡單清潔后，再用于充滿下 一個微芯片。我們以前已建立毛細(xì)管盒和清潔臺。
銜接子連接反應(yīng) _ 在一個實施方式中，微芯片或其他裝置可利用壓力或真空，或電力驅(qū)動的離心或 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他力從毛細(xì)管陣列移動樣品。例如，連接于輸入孔的96各芯片內(nèi) MOV泵可將文庫泵送到微芯片中，如圖59和60所示。在含有96種單獨(dú)的連接混合物的M0V 混合器中混合樣品，并將樣品泵送到納米連接反應(yīng)室中(圖58)，在其中培育，例如5分鐘。 這能產(chǎn)生連接于輸入剪切的文庫樣品DNA的銜接子混合物。圖58顯示兩個連接反應(yīng)線路， 而圖59顯示96通道NanoBioPr印SPS的掩模設(shè)計。 在一個實施方式中，各銜接子可具有鑰匙(key)，如用于在測序后鑒定文庫的六個 堿基(條件是4， 032個文庫中的每組單獨(dú)用超級焦磷酸測序分析法進(jìn)行分析，可通過簡單 地分開反應(yīng)器進(jìn)行)。銜接子含有巢式PCR和測序引物位點(diǎn)、3'鈍端和5'突出端海對中 的一個銜接子的5'端具有生物素。由于6個堿基長度的序列產(chǎn)生4， 096個單獨(dú)的鑰匙，并 且42個具有96個通道的微芯片裝置需要4， 032個單獨(dú)的鑰匙，所以其余可用的64個鑰匙 在每個NanoBioPr印SPS運(yùn)行中合并進(jìn)行質(zhì)量控制，以監(jiān)測最優(yōu)性能。連接后，各連接片段 的一端含有PCR引發(fā)位點(diǎn)、測序引物位點(diǎn)和六個核苷酸長度的鑰匙序列，另一端具有PCR和 測序引發(fā)位點(diǎn)以及鑰匙序列，連接片段中還含有削平的插入物基因組文庫DNA。
在一個實施方式中，連接后，首先由一個微芯片收集96個獨(dú)特編碼的文庫，然后 收集所有42個微芯片，加入20個質(zhì)量控制鑰匙序列，一組是"正常"測序難度的十種對照 序列，還有難度增加的五種對照序列，以及五種具有挑戰(zhàn)性的對照序列，其中包括所有四個 均聚物運(yùn)行輪次。 在一個實施方式中，可使用諸如800nL的反應(yīng)室，進(jìn)行其他體積如400-200nL的反 應(yīng)。384通道微芯片將形成用42個微芯片每天可加工(例如)512，000個文庫的連接模塊， 與額外的微芯片或設(shè)備成線性比例。 在一個實施方式中，一個銜接子通過，例如生物素-鏈霉親和素連接與磁珠預(yù)結(jié) 合將產(chǎn)生每個末端具有不同銜接子的珠結(jié)合片段，以便在連接后用磁力操縱4， 032個反 應(yīng)。在微芯片中，MOV微型泵通常與珠一起使用，用磁體將珠捕獲在通道中(圖61)。
缺口修復(fù) _ —個方面，連接后，可匯集裝置中來自所有微芯片的珠(或文庫)，如果在珠上，則 由磁場捕集在5mL修復(fù)反應(yīng)器中。用于樣品捕獲和制備模塊(為生物防御應(yīng)用開發(fā))的珠 渦旋和磁珠致動裝置產(chǎn)生稱為珠風(fēng)暴裝置的裝置，該裝置在溫度控制室中分配、混合和捕 集磁珠懸浮液。所有連接的銜接子末端的缺口將由Bst DNA聚合酶修復(fù)。缺口修復(fù)后，如果DNA尚未連接于珠，則加入預(yù)先洗滌和平衡的鏈霉親和素珠，修復(fù)的DNA通過結(jié)合于一組 銜接子的生物素連接。洗滌珠，以去除未連接的片段和銜接子，加入堿變性的另一組8個有 鑰匙的單鏈Q(jìng)C序列。將釋放的單鏈移動到emPCR模塊中，棄去磁性微球。修復(fù)反應(yīng)和變性 步驟應(yīng)花費(fèi)約40分鐘的時間，每輪以單一批次完成。上游連接模塊微芯片被再生，在修復(fù) 反應(yīng)正在進(jìn)行的過程中即可開始另一輪反應(yīng)。 在 一 個實施方式中，可利用安捷倫(Agilent) 2100或類似裝置或者在 NanoBioPr印SPS設(shè)備中評估文庫的質(zhì)量。自動化可產(chǎn)生均一文庫，導(dǎo)致可省去此點(diǎn)上的質(zhì) 量檢查。如果必要，可將單通道CE組件加入連接模塊中。
NanoBioPi^pSPS emPCR模塊 _ 在一個方面，NanoBioPr印SPS emPCR模塊將DNA結(jié)合于光學(xué)透明的捕獲珠，以便 檢測下游測序反應(yīng)，在至多l(xiāng)OOmL的體積內(nèi)制備熱循環(huán)乳液PCR(emPCR)，使得到的擴(kuò)增子 變性，分離含有DNA的珠，如圖61所示。
結(jié)合于DNA捕獲珠 _ 在一個方面，連接模塊中制備的連接有引物和鑰匙序列的SS DNA將退火至含有互 補(bǔ)DNA捕獲引物的聚苯乙烯或其他珠。珠的制備獨(dú)立于該裝置。在25mL MBI珠風(fēng)暴處理 器中將溶液加熱至8(TC，然后以IO度為單位逐步降低溫度，從而使模板退火。逐步降溫和 保持時間可單獨(dú)優(yōu)化。在此步驟中可加入另外8個有鑰匙的單鏈Q(jìng)C序列。
乳液相PCR擴(kuò)增 _ —個方面，emPCR反應(yīng)是熱循環(huán)反應(yīng)，乳液被破壞，具有擴(kuò)增的雙鏈產(chǎn)物的珠被純 化?？梢杂眉s30mL PCR反應(yīng)混合物按比例擴(kuò)大至42個微芯片，每輪總體積為100mL。因 為emPCR步驟的總時間約為6小時，這包括8個45分鐘的運(yùn)行輪次，所以需要9個平行的 emPCR反應(yīng)器，各自能夠加工lOOmLemPCR反應(yīng)以滿足本實施例中的通量要求。
4， 032個文庫的各emPCR運(yùn)行輪次的樣品將流入lOOmL試管中，通過emPCR反應(yīng)器 運(yùn)行；或者，也可在兩個平板之間進(jìn)行emPCR。 一旦在預(yù)處理室中將聚合酶熱激活，則將樣 品移動到共同反應(yīng)室中，其將同時循環(huán)至多9個大體積的PCR反應(yīng)。在此步驟中加入最終 12個有鑰匙的QC序列珠。 在一個實施方式中，emPCR最初可以在常規(guī)的96孔微量滴定板中進(jìn)行，而設(shè)計了 8個平行的emPCR反應(yīng)器。在大體積熱循環(huán)中，在一個實施方式中，三個具有選擇閥的循環(huán) 水浴可產(chǎn)生能夠加工大體積且具有優(yōu)秀的溫度調(diào)節(jié)功能的熱循環(huán)設(shè)備。以前已建立該設(shè)備 (圖62)，它能夠快速進(jìn)行熱循環(huán)_因為水的優(yōu)異的傳熱性能_以便良好地適用于循環(huán)測序 和PCR。軟件可控制所述三個循環(huán)水浴，并操作選擇循環(huán)的水和溫度的全尺寸閥。乳液化學(xué) 可產(chǎn)生足夠體積的但分散乳液，每種微乳液產(chǎn)生1， 000個堿基長度的片段。除使用三種循 環(huán)水源外，可通過循環(huán)不同溫度的空氣或液體改變溫度。在簡單的實施方式中，主要可使用 設(shè)置為三種不同溫度的三個吹風(fēng)機(jī)快速改變樣品的溫度。熱空氣可重復(fù)循環(huán)，通過運(yùn)行恒 定溫度的加熱器或吹風(fēng)機(jī)保持固定溫度。
富集單鏈DNA珠
_ 在一個方面，可收集具有單鏈DNA的珠，然后用磁力拖拉(pull-up)富集，例如通過Margulies等所述的方法，該方法包括(1)用我們的定制裝置替代MPC-S， (2)用沉降或過濾替代離心步驟，以改變緩沖液和洗滌珠，和(3)根據(jù)光學(xué)珠，而非瓊脂糖珠的密度調(diào)節(jié)步驟。為了由乳液收集emPCR珠，可向PCR擴(kuò)增的emPCR溶液中異丙醇，混合該溶液，用注射泵強(qiáng)迫該溶液通過篩分濾器。洗滌該濾器，移動到珠風(fēng)暴中，其中加入含有O. 1%吐溫的退火緩沖液并對擴(kuò)增的DNA進(jìn)行堿變性。培育后，可通過沉降濃縮含有單鏈DNA的珠，去除上清液，加入退火緩沖液。洗滌后，加入磁力捕獲珠，通過拉下操作(pull-down)純化具有單鏈DNA的珠，去除上清液和未結(jié)合的珠，加入解鏈溶液以破壞雜交。捕集磁珠，同時去除包含具有單鏈模板DNA的富集珠的上清液。然后，NanoBioPr印SPS可輸出匯集和有鑰匙的純化文庫，該文庫可立即用于超級焦磷酸測序。
42個微芯片的連接裝置和emPCR模塊和集成 _ 在一個方面，連接模塊可由l個擴(kuò)展至42個微芯片和自鎖閥，自鎖閥如下所述，用于設(shè)計42個微芯片的裝置。在非集成工作流中，可使用單個微芯片連接模塊和單個通道emPCR模塊的工作流來處理人衍生的癌細(xì)胞系文庫。單個連接模塊微芯片和下游過程可與單通道流通的lOOmL emPCR熱循環(huán)器集成，以制備每輪運(yùn)行能夠加工96個文庫的自動化的集成原型。 在一個實施方式中，為了完成NanoBioPr印SPS，可將42個微芯片的連接模塊與9通道emPCR模塊整合，如本發(fā)明所公開。微芯片連接模塊可以通過物理途徑或軟件，在實驗線路板上與單通道emPCR模塊整合。完整的42微芯片連接模塊可與9通道emPCR模塊建造和整合在一起?？蓛?yōu)化完全集成的NanoBioPr印SPS，并在超級焦磷酸測序裝置上分析樣品，以便通過(例如)焦磷酸測序、合成測序、連接測序或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法進(jìn)行DNA測序，以獲得能夠在一天內(nèi)完成人從頭測序的系統(tǒng)。 在一個實施方式中，連接模塊可由l個微芯片擴(kuò)展至42個微芯片?？墒褂米枣i閥控制42個微芯片，并開始設(shè)計完整的系統(tǒng)硬件。在一個實施方式中，使用以芯片內(nèi)氣動多路分配器獨(dú)立控制的自鎖微流體閥結(jié)構(gòu)(圖63)。這些結(jié)構(gòu)基于氣動MOV閥并取決于其通常關(guān)閉的性質(zhì)。短至120ms的真空或壓力脈沖足以將這些自鎖閥保持開放或關(guān)閉狀態(tài)數(shù)分鐘。此外，芯片內(nèi)多路分配器只需要n個氣動輸入來控制2(n-l)個獨(dú)立的自鎖閥。已示范由三閥和四閥線路組成的自鎖閥(W. H. Grover， R. H. C. Ivester， E. C. Jensen和R. A. Mathies. 2006 ，用微流體邏輯結(jié)構(gòu)對自鎖氣動閥進(jìn)行開發(fā)和多路控制(Deve 1 opmentandmultiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidiclogicalstructures)，芯片實驗室(Lab-on-a-chip).電子公開)。該技術(shù)將成排螺線管(banksof solenoid)有效移動到微芯片上，并降低成本和復(fù)雜性。 在一個實施方式中，可用自鎖閥建立氣動控制的NanoBioPr印微芯片，例如用于42個微芯片。毛細(xì)管盒轉(zhuǎn)移機(jī)制將機(jī)器人系統(tǒng)與毛細(xì)管盒接口相連，以便用2， 500個閥加載4個微芯片的裝置。 在一個實施方式中，例如，emPCR模塊可在一個通道中處理100mL?？山⒕哂腥齻€不同獨(dú)立熱循環(huán)區(qū)域的高容量循環(huán)熱循環(huán)器(如圖64所示)。需要9個單獨(dú)的100mLemPCR反應(yīng)器來共享主循環(huán)熱循環(huán)器，它們將連續(xù)進(jìn)行相同的循環(huán)方案。預(yù)處理室可適應(yīng)與聚苯乙烯或其它珠的結(jié)合并制備乳液，然后調(diào)節(jié)溫度以適應(yīng)快速氣動需要。后處理室能夠滿足后處理要求，例如破壞乳液和提取物。所有三個熱循環(huán)室可共享大量循環(huán)水；加入4t:和其它所需溫度的水；這只是另一個循環(huán)水浴和三個全尺寸COTS閥和螺線管。工程計算、研究和實驗可確定循環(huán)均一性要求所容忍的反應(yīng)的表面體積比和深度(mm)的影響，以確定反應(yīng)器的最優(yōu)形狀，即長粗管狀、卵形管狀或平行板狀，并用確定性能的科學(xué)實驗加以驗證?？梢栽谥轱L(fēng)暴模塊中分離攜帶擴(kuò)增子的珠和空珠，作為超級焦磷酸測序或其它分析方法之前的最終步驟?？梢栽谲浖刂葡抡蠈嵤┭b置的硬件。 例如，在非集成工作流中，可使用單個微芯片連接模塊和單個通道emPCR模塊加工人細(xì)胞系文庫。可以用GS20試劑和步驟手工進(jìn)行對照處理。 在另一實施方式中，可按比例增加NanoBioPr印SPS，完全整合連接模塊和emPCR模塊?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知方式建立完整的42個微芯片的連接模塊。例如，(l)可制造塔以保持微芯片，(2)建立能操作自鎖的MOV閥、泵和路由選擇器的微芯片控制器，(3)可顯微制造和測試NanoBioPr印機(jī)器人平臺和第一組42個微芯片，和(4)可整合和測試42個微芯片的連接模塊。平行地，可改進(jìn)珠風(fēng)暴設(shè)計以加工匯集的樣品。可擴(kuò)展emPCR模塊，以便由連接模塊保持9個運(yùn)行輪次?？衫?54GS20和超級焦磷酸測序優(yōu)化emPCR的性能。42微芯片連接模塊可連接于完全擴(kuò)展的emPCR模塊，并根據(jù)已經(jīng)開發(fā)的單微芯片-單通道裝置優(yōu)化過程。利用所述的NanoBioPr印SPS，可完成10%的完整人基因組或完整的人從頭測序。 雖然本文介紹和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可明顯看出，這些實施方式僅以實例的方式提出。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的情況下可以作出多種改變、變化和取代。應(yīng)理解，本文所述的本發(fā)明實施方式的各種替代形式可用于實施本發(fā)明。所附權(quán)利要求書確定本發(fā)明范圍，這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)以及其等同形式均為本發(fā)明所覆蓋。
權(quán)利要求
一種微流體裝置，其包括微流體層、致動層和夾在它們中間的彈性體層，其中微流體層包括至少三個微流體通道，它們在連接點(diǎn)處匯合，并且被中斷所述至少三個微流體通道中流體流動的間斷面分隔開；致動層包括至少一個開口于閥室的致動通道，所述閥室位于所述連接點(diǎn)的反面；和其中移動所述彈性膜能調(diào)節(jié)經(jīng)過所述至少三個微流體通道的流體流動，從而形成隔膜閥。
2. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，所述彈性膜同時調(diào)節(jié)經(jīng)過所述至少 三個微流體通道的流體流動。
3. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，所述彈性膜防止經(jīng)過所述至少三個 微流體通道的流體流動。
4. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，所述彈性膜不完全抑制經(jīng)過所述至 少三個微流體通道的流體流動。
5. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，所述隔膜閥還包括通路層。
6. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，向所述至少一個致動通道施加壓力 或真空造成所述彈性膜調(diào)節(jié)經(jīng)過所述間斷面的流體流動，從而形成至少一個三通道閥。
7. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，所述膜天然地關(guān)閉該閥，向所述膜施 加真空使所述膜偏離閥座，從而打開該閥。
8. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，所述微流體層包括朝向所述膜的表 面，所述表面具有溝槽，按壓所述膜時，溝槽形成所述微流體通道。
9. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，所述微流體層包括內(nèi)部微流體通道， 這些通道與開口于連接點(diǎn)上的層中的孔相交。
10. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，所述致動層包括朝向所述膜的表 面，所述表面具有溝槽，按壓所述膜時，溝槽形成所述致動通道。
11. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其特征在于，所述致動層包括開口于閥室上的內(nèi) 部致動通道。
12. 如權(quán)利要求6所述的微流體裝置，其特征在于，所述至少三個微流體通道以Y形匯 合在連接點(diǎn)上。
13. 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，包括由單個致動通道致動的多個所述隔膜閥。
14. 一種微流體裝置，其包括微流體層、致動層和夾在它們中間的彈性體層，其中所述微流體層包括第一和第二微流體通道，它們在連接點(diǎn)處匯合，并且被中斷所述第 一和第二微流體通道之間但不沿所述第二通道的流體流動的間斷面分隔開；所述致動層包括至少一個開口于閥室的致動通道，所述閥室位于所述連接點(diǎn)的反面；和其中移動所述彈性膜能調(diào)節(jié)經(jīng)過所述至少三個微流體通道的流體流動，從而形成隔膜閥。
15. 如權(quán)利要求14所述的微流體裝置，其特征在于，所述第二微流體通道中的流體流 動不受所述彈性膜調(diào)節(jié)。
16. 如權(quán)利要求14所述的微流體裝置，其特征在于，所述彈性膜防止經(jīng)過所述至少一 個微流體通道的流體流動。
17. 如權(quán)利要求14所述的微流體裝置，其特征在于，所述彈性膜不完全抑制經(jīng)過所述 至少一個微流體通道的流體流動。
18. 如權(quán)利要求14所述的微流體裝置，其特征在于，所述隔膜閥還包括閥層。
19. 如權(quán)利要求18所述的微流體裝置，其特征在于，向所述至少一個致動通道施加壓 力或真空造成所述彈性膜調(diào)節(jié)經(jīng)過至少一個間斷面的流體流動。
20. 如權(quán)利要求18所述的微流體裝置，其特征在于，所述至少兩個微流體通道以T形匯 合在連接點(diǎn)上。
21. 如權(quán)利要求14所述的微流體裝置，包括由單個致動通道致動的多個所述隔膜閥。
22. 如權(quán)利要求14所述的微流體裝置，其特征在于，所述第二通道形成具有確定容積 的環(huán)，并包括預(yù)定容積的容積式泵。
23. —種方法，包括通過打開所述隔膜閥和用泵進(jìn)行多次沖程將預(yù)定體積的液體泵送 到權(quán)利要求22所述裝置的第一通道中。
24. —種微流體裝置，其包括微流體層、致動層和夾在它們中間的彈性體層，其中 所述微流體層包括微流體通道；致動層包括至少一個開口于閥室的致動通道，所述閥室沿所述微流體通道布置；禾口 無論是否移動彈性膜，流體都會沿通道流動，但移動所述彈性膜能調(diào)節(jié)沿所述通道的 流體流動，從而形成隔膜閥。
25. 如權(quán)利要求24所述的微流體裝置，其特征在于，所述彈性膜通過增加或減少所述 至少一個微通道的橫截面積來調(diào)節(jié)流體流動。
26. 如權(quán)利要求24所述的微流體裝置，其特征在于，所述隔膜閥還包括通路層。
27. 如權(quán)利要求24所述的微流體裝置，其特征在于，向所述至少一個致動通道施加壓 力或真空造成所述彈性膜調(diào)節(jié)經(jīng)過至少一個間斷面的流體流動。
28. 如權(quán)利要求24所述的微流體裝置，還包括在隔膜閥產(chǎn)生磁場的磁體。
29. 如權(quán)利要求28所述的磁體，其特征在于，所述磁體選自永磁體、電磁體或稀土磁體。
30. 如權(quán)利要求24所述的微流體裝置，其特征在于，在鄰近所述隔膜閥的地方，至少一 個微通道的通路形成星形或嵌套星形。
31. —種系統(tǒng)，其包括 第一微流體裝置，其包含第一微流體線路，包括入口 、出口 、泵和至少一個第一功能組件，第一功能組件選自反 應(yīng)器、捕獲區(qū)、溫度循環(huán)區(qū)、熱區(qū)、冷區(qū)、分離通道、分析線路、混合器、珠加工單元或磁體，其 中構(gòu)造所述泵以便通過所述線路泵送流體；禾口第二微流體裝置，其包含多個第二微流體線路，各線路包含入口 、出口和至少一個不同于第一功能組件的功能 組件；構(gòu)造所述第一和第二組件以配合多個位置，其中在各位置上，第一線路的出口與第二線路之一的入口相配合，以允許流體從所述第一線路流入所述配合的第二線路中。
32. 如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述第一微流體裝置還包括經(jīng)構(gòu)造能以 電學(xué)方式移動流體、分子、化學(xué)物質(zhì)或顆粒的電極。
33. 如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述第二微流體裝置還包括分析區(qū)。
34. 如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述第二微流體裝置還包括捕獲區(qū)。
35. 如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其特征在于，與所述第一微流體裝置相比，所述第二微 流體裝置是可移動的。
36. 如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述第二微流體裝置的所述流體輸入將 流體從所述第一微流體裝置遞送至多個微流體通道中。
37. 如權(quán)利要求31所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述第一微流體裝置的所述流體輸出將 流體從多個微流體通道遞送到所述第二微流體裝置的所述流體輸入中。
38. 如權(quán)利要求32所述的系統(tǒng)，其特征在于，通過電泳方式將所述流體、分子、化學(xué)物質(zhì)或顆粒從所述第一微流體裝置的所述流體輸出移動到所述第二微流體裝置的所述流體 輸入中。
39. —種方法，其包括a) 在權(quán)利要求26所述的第一微流體裝置的第一微流體線路中，對第一樣品進(jìn)行第一 操作；b) 使配合權(quán)利要求31所述的第一和第二微流體裝置，以使所述第一線路的輸出與所 述第二微流體線路的入口相配；c) 在所述操作后，將所述第一樣品從所述第一線路移動到所述第二線路的第一個線路中；d) 在所述第二線路的第一個線路中對所接受的第一樣品進(jìn)行第二操作；e) 在所述第一微流體線路中對第二樣品進(jìn)行第一操作；f) 使配合所述第一和第二微流體裝置，以使所述第一線路的輸出與所述第二微流體線 路的下一個不同線路的入口相配；g) 在所述操作后，將第二樣品從所述第一線路移動到所述第二線路的下一個線路中；和h) 在所述第二線路的第一個線路中對第一反應(yīng)樣品進(jìn)行第二操作；
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，還包括在第一線路中再對至少一個樣品重復(fù)進(jìn)行步驟 e)-h)，其中將各樣品移動到多個第二線路的下一個不同線路中。
41. 如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述第一操作包括將樣品與試劑混合。
42. 如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，進(jìn)行所述第一操作消耗的時間短于所述 第二操作。
43. —種制備微流體裝置的方法，所述方法包括 聯(lián)結(jié)多層，形成多個微通道和隔膜閥； 其中所述多層夾在一起；其中所述多層中的至少兩層選自彈性膜、致動層、微流體層、閥層、散熱器、通路層、界面層和覆蓋層。
44. 如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述多層中的至少一層是粘合劑層。
45. 如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述多層通過粘合劑層聯(lián)結(jié)在一起。
46. 如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述多層通過至少一個夾具聯(lián)結(jié)在一起。
47. 如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，通過降低閥處的壓力或溫度，將所述多層 聯(lián)結(jié)在一起，除了隔膜閥的位置。
48. 如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，通過在所述閥上選擇性設(shè)置涂層，將所述 多層聯(lián)結(jié)在一起，除了隔膜閥的位置。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述涂層是可去除的。
50. —種微流體裝置，其包括a) 微流體通道；b) 沿溫度高于環(huán)境溫度的通道布置的第一溫度區(qū)；c) 沿溫度低于環(huán)境溫度的通道布置的第二溫度區(qū)；禾口d) 沿通道布置并經(jīng)構(gòu)造將液體泵送到第一和第二溫度區(qū)的容積式泵。
51. 如權(quán)利要求50所述的微流體裝置，還包括與至少一個溫度區(qū)熱偶合的微流體環(huán)。
52. 如權(quán)利要求50所述的微流體裝置，其特征在于，在至少兩個不同的溫度區(qū)之間泵 送至少一個微流體通道中的樣品至少兩次。
53. 如權(quán)利要求50所述的微流體裝置，其特征在于，用不可混溶的流體由所述至少一 個三閥泵分離所述樣品。
54. 如權(quán)利要求50所述的微流體裝置，其特征在于，至少一個隔膜閥位于溫度區(qū)中。
55. —種分析樣品的方法，其包括在權(quán)利要求41所述的微流體裝置中加熱或冷卻核酸序列；禾口 分析所述核酸序列。
56. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述分析包括測序、連接或聚合酶鏈反應(yīng) 擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、翻譯或偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
57. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述核酸選自基因組DNA、線粒體DNA、 mRNA、 tRNA、 rRNA、 siRNA。
58. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述分析包括將至少一個銜接子連接于 所述核酸序列。
59. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述銜接子包括獨(dú)特的核酸序列標(biāo)識物。
60. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述獨(dú)特的核酸序列標(biāo)識物用作內(nèi)部質(zhì) 控標(biāo)準(zhǔn)。
61. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述分析包括連接于珠的單個核酸序列 的結(jié)合。
62. 如權(quán)利要求61所述的方法，還包括擴(kuò)增所述核酸序列。
63. —種微流體裝置，其包括包含微流體通道的微流體層，其中所述通道包括至少一個緊彎曲，其包含兩個互相連 接并形成銳角的通道節(jié)段；禾口在所述緊彎曲區(qū)域產(chǎn)生磁場的磁場生成裝置， 其中流經(jīng)所述緊彎曲的順磁性顆粒被磁場所阻滯。
64. 如權(quán)利要求63所述的微流體裝置，包括多個緊彎曲。
65. —種微流體裝置，其包括包含微流體通道的微流體層，其中所述通道依次包括第一、第二和第三區(qū)域，其中所述 第二區(qū)域的橫截面面積大于所述第一和第三區(qū)域；禾口 在所述第二區(qū)域產(chǎn)生磁場的磁場生成裝置，禾口 其中流經(jīng)所述第二區(qū)域的順磁性顆粒被磁場所阻滯。
66. —種在微流體裝置上進(jìn)行生物分子分析的方法，所述方法包括 在微流體裝置上的第一反應(yīng)室中混合生物分子和試劑，以產(chǎn)生第一反應(yīng)混合物； 將所述反應(yīng)混合物移動到所述裝置上的反應(yīng)區(qū)并進(jìn)行反應(yīng)，以產(chǎn)生產(chǎn)物混合物； 將所述產(chǎn)物混合物移動到所述裝置上的某區(qū)域并將產(chǎn)物捕獲到該區(qū)域中的順磁性捕獲顆粒上；將所述顆粒和捕獲產(chǎn)物移動到處于磁場內(nèi)的裝置的捕獲室中，以將捕獲顆粒和產(chǎn)物保 留在所述捕獲室中；在所述捕獲室中洗滌顆粒；將所述顆粒和產(chǎn)物移動到所述裝置上的端口中，以便從所述裝置取出產(chǎn)物。
67. 如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述生物分子選自核酸、蛋白質(zhì)、糖、細(xì)胞 或脂質(zhì)。
68. 如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)是核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
69. 如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增是等溫擴(kuò)增。
70. 如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增包括對所述混合物進(jìn)行熱循環(huán)。
71. 如權(quán)利要求66所述的方法，還包括對所述反應(yīng)混合物或產(chǎn)物混合物進(jìn)行第二反應(yīng)。
72. —種微流體裝置，其包括a) 多個微流體反應(yīng)線路，各線路包括i) 至少兩個經(jīng)構(gòu)造能接受樣品或者可由其取出樣品的端口 ；ii) 至少一個經(jīng)構(gòu)造能通過所述線路泵送流體的泵，iii) 至少一個包括進(jìn)行化學(xué)或生化反應(yīng)的裝置的反應(yīng)室；禾口iv) 至少一個包括捕獲顆粒的裝置的捕獲室；b) 至少一個與多個微流體線路流體連通并經(jīng)構(gòu)造能向各個線路遞送樣品或試劑流的 分配端口 ；其中多個線路經(jīng)構(gòu)造能對遞送至每個線路的端口之一的多種不同材料平行進(jìn)行操作。
73. 如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，構(gòu)造所述反應(yīng)室，以便用熱泵加熱或冷卻。
74. 如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述捕獲室位于磁場中，磁場經(jīng)構(gòu)造能阻 滯順磁性顆粒在捕獲室中的移動。
75. 如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述泵是容積式泵。
全文摘要
本發(fā)明公開了集成的可編程微流體線路，以實現(xiàn)加工生化和化學(xué)反應(yīng)物體物以及整合這些反應(yīng)物的實際應(yīng)用。在一些實施方式中，合并了生化反應(yīng)工作流或化學(xué)工作流。公開了微型閥如具有Y閥和流通閥的可編程微流體線路。在一些實施方式中，本發(fā)明微型閥用于混合流體，這可能是整合過程的一部分。這些過程包括混合樣品和將反應(yīng)物移動到模塊化微流體設(shè)備的邊緣或儲庫中，使用捕獲區(qū)，和注入單獨(dú)裝置上的分析裝置中。在一些實施方式中，使用星形和嵌套星形設(shè)計，或通過改變微型閥中通道的橫截面面積捕獲珠。還公開用固定溫度在溫度區(qū)之間移動樣品，以及通過微型泵移動樣品。
文檔編號C12M3/02GK101715483SQ200880003896
公開日2010年5月26日 申請日期2008年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月5日
發(fā)明者A·R·保倫凱, I·I·布拉加, J·霍恩, M·萬格博, M·范恩古延, S·喬瓦諾維齊, W·D·尼爾森 申請人:微芯片生物工藝學(xué)股份有限公司