專利名稱：：編碼用于控制寄生線蟲的截短的蔗糖異構(gòu)酶多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及控制線蟲，尤其是控制大豆胞嚢線蟲。本文公開的是產(chǎn)生具有提高的線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法、包含編碼功能蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)生的種子。
背景技術(shù)：
：線蟲是微觀的蠕蟲樣動(dòng)物，其以多于2,000種蔬菜、水果和觀賞植物的根、葉和莖為食，引起全世界l萬(wàn)億美元的農(nóng)作物損失。線蟲的一種常見類型是根癌線蟲(RKN)，其進(jìn)食在根上產(chǎn)生特有的蟲癭。其它攝取根為食的線蟲是胞嚢類型和損傷類型，其更多為宿主特異性的。線蟲在美國(guó)普遍存在，但它主要是南部和西部溫暖潮濕地區(qū)和沙壤土中的問(wèn)題。大豆胞嚢線蟲(SCN)Z/Wm^feragfy"Vi"首先于1954年在美國(guó)NorthCarolina中發(fā)現(xiàn)。其為大豆植物最嚴(yán)重的害蟲。一些地區(qū)被SCN嚴(yán)重感染，以至于在沒(méi)有控制措施的情況下大豆產(chǎn)量在經(jīng)濟(jì)上不再是可能的。盡管大豆是被SCN攻擊的主要經(jīng)濟(jì)作物，但SCN寄生在總共50種宿主中，其包括農(nóng)作物、蔬菜、觀賞植物和雜草。線蟲損害的標(biāo)志包括葉的發(fā)育障礙和黃化，以及在熱時(shí)期植物的萎蔫。然而，線蟲包括SCN可引起顯著的產(chǎn)量損失，而卻沒(méi)有地上癥狀。此外，感染了SCN的根矮化或短小。線蟲侵襲可減少根上的固氮根瘤的數(shù)量，并可使根對(duì)其它土壤傳播植物病原體的攻擊更為敏感。線蟲生活周期有三個(gè)主要階段卵期、幼蟲期和成蟲期。所述生活周期在線蟲種類之間不同。例如，SCN生活周期通常在最適條件下24到30天內(nèi)完成，而其它種類需要一年或更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)完成其生活周期。當(dāng)溫度和濕度水平在春季變得足夠時(shí)，蠕蟲狀幼蟲在土壤中從卵開始孵化。這些幼蟲是可感染大豆根的線蟲的唯一生活周期。SCN的生活周期已經(jīng)成為許多研究的主題，并因而可用作理解線蟲生活周期的實(shí)例。在滲入大豆根后，SCN幼蟲穿過(guò)根移動(dòng)，直至它們接觸到維管組織，在那里它們停止移動(dòng)并開始攝取食物。線蟲注射分泌物，所述分泌物修飾根的某些細(xì)胞并將它們轉(zhuǎn)變成專門的進(jìn)食位點(diǎn)。根細(xì)胞在形態(tài)上被轉(zhuǎn)變成大的多核合胞體(或在RKN的情況下為巨細(xì)胞)，其用作線蟲的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源?；钴S進(jìn)食的線蟲因此從植物偷取必需營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。線蟲進(jìn)食時(shí)，它們膨脹，并且最終雌性線蟲變得很大，以至于它們突破根組織并暴露于根表面。在成蟲時(shí)不膨脹的雄性SCN線蟲從根中遷移到土壤中并與檸檬狀的成年雌蟲受精。然后雄蟲死亡，而雌蟲仍然附著在根系上并繼續(xù)進(jìn)食。膨脹的雌蟲中的卵首先在體外的塊嚢或卵嚢中開始發(fā)育，稍后在體腔內(nèi)進(jìn)行發(fā)育。最終成年雌蟲的整個(gè)體腔內(nèi)充滿卵，雌線蟲死亡。死亡雌蟲充滿卵的尸體被稱為胞嚢。胞嚢最終離開并在土壤中游離存在。胞嚢的壁變得很粗糙，這為其中包含的大約200到400個(gè)卵提供極好的保護(hù)。SCN卵在胞嚢內(nèi)生存，直至出現(xiàn)合適的孵化條件。盡管許多卵可在第一年內(nèi)進(jìn)行孵化，但許多也將在胞嚢內(nèi)生存若干年。線蟲依靠自己的力量每年只能沿土壤移動(dòng)少許英寸。然而，線蟲侵襲可以多種方式傳播很大距離?？梢砸苿?dòng)被感染的土壤的任何東西均能夠傳播所述感染，包括農(nóng)場(chǎng)機(jī)器、運(yùn)載工具和工具、風(fēng)、水、動(dòng)物和農(nóng)業(yè)工人。種子大小的土壤顆粒經(jīng)常污染所收獲的種子。結(jié)果，當(dāng)將來(lái)自感染田地的污染種子種植于未感染的田地中時(shí)，線蟲感染就可以進(jìn)行傳播。甚至有證據(jù)表明某些線蟲種類通過(guò)鳥類傳播。僅可以預(yù)防這些原因中的一些。用于治理線蟲感染的傳統(tǒng)實(shí)踐包括在線蟲感染的土地中維持適當(dāng)?shù)耐寥罓I(yíng)養(yǎng)和土壤pH水平；控制其它植物疾病，及昆蟲和雜草害蟲；僅在未感染田地工作后使用衛(wèi)生設(shè)施，如耕地、播種和耕作線蟲感染的田地；在感染田地中工作完之后用高壓水或蒸氣徹底清洗設(shè)備；除非已經(jīng)將種子徹底清洗，否則不使用在感染田地中生長(zhǎng)的種子用于種植未感染的田地；用非寄主農(nóng)作物輪種感染田地并更換寄主農(nóng)作物；使用殺線蟲劑；和種植有抵抗力的植物變種。已經(jīng)提議方法用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化，以賦予對(duì)植物寄生線蟲提高的抵抗力。美國(guó)專利號(hào)5,589,622和5,824,876涉及線蟲附著后在進(jìn)食位點(diǎn)或其附近特異性表達(dá)的植物基因的鑒定。WO2004/005504描述了通過(guò)表達(dá)蔗糖異構(gòu)酶基因產(chǎn)生線蟲抗性植物的方法。在某些微生物中產(chǎn)生的蔗糖異構(gòu)酶將蔗糖轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖(palatinose)(參閱，美國(guó)專利號(hào)5,985,668和5,786,140)。發(fā)明簡(jiǎn)述的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)會(huì)賦予線蟲抗性。本發(fā)明提供了多核苷酸、轉(zhuǎn)基因植物和種子，以及克服或至少減輕有價(jià)值的農(nóng)作物如大豆的線蟲感染的方法。因此，本發(fā)明包含分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式，其當(dāng)轉(zhuǎn)化入植物中時(shí)顯示抗線蟲活性，其中所述多肽不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含有效連接多核苷酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體，所述多核苷酸編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式，其當(dāng)轉(zhuǎn)化到植物中時(shí)顯示抗線蟲活性，但不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物，所述表達(dá)載體包含編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式的分離的多核苷酸，其當(dāng)轉(zhuǎn)化到植物中時(shí)顯示抗線蟲活性，但不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性。本本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了對(duì)于分離的多核苷酸為不分離的轉(zhuǎn)基因種子，所述多核苷酸編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式，其當(dāng)轉(zhuǎn)化到植物中時(shí)顯示抗線蟲活性，但不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有提高的線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包括以下步驟將包含有效連接分離的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體導(dǎo)入植物中，并選擇線蟲抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物，所述分離的多核苷酸編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式，其當(dāng)轉(zhuǎn)化到植物中時(shí)顯示抗線蟲活性，但不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性。附圖簡(jiǎn)述圖la-lc顯示了本發(fā)明截短的蔗糖異構(gòu)酶(SEQIDNO:l)與來(lái)自大黃歐文氏菌CEVw/"/flWm/^mftW)的全長(zhǎng)蔗糖異構(gòu)酶(登錄號(hào)AF279281;SEQ11)NO:3)的DNA序列比對(duì)。使用AlignX程序在VNTI中進(jìn)行比對(duì)(逐對(duì)比較，空位開放罰分=15，空位延伸罰分=6.66)。圖2顯示了SEQIDNO:2所描述的截短的大黃歐文氏菌氨基酸序列與SEQII)NO:5所描述的普城沙雷氏菌(SefTfl"V//7(v附"AZoi)的蔗糖異構(gòu)酶的截短氨基酸序列的總體百分比同一性。PID=總體百分比同一性。圖3a-3b顯示了SEQIDNO:2所描述的歐文氏菌截短蔗糖異構(gòu)酶的示例性截短同源物與具有SEQIDNO:5、14、15、16、17、18、19和20的同源物的氨基酸比對(duì)。VectorNTI軟件包(空位開放罰分-15，空位延伸罰分=6.66,空位分隔罰分=8)。圖4顯示了歐文氏菌截短蔗糖異構(gòu)酶的示例性截短同源物的總體百分比同一性矩陣表。優(yōu)選實(shí)施方案詳述可參考本發(fā)明實(shí)施方案的以下詳細(xì)描述和本文中包括的實(shí)施例來(lái)更容易地理解本發(fā)明。除非另有指出，本文中所用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員常規(guī)用法來(lái)理解。在本申請(qǐng)中，參考多種專利和文獻(xiàn)出版物。所有這些出版物的公開內(nèi)容和這些出版物中引用的那些參考特此以其整體引入本申請(qǐng)中作為參考，以更詳盡地描述本發(fā)明所屬的領(lǐng)域現(xiàn)狀。所使用的縮寫和命名法在本領(lǐng)域中被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)，并通常用于如此處引用的那些專業(yè)雜志中。如此處所用及在所附權(quán)利要求中，單數(shù)形式"a"、"an，，和"the，，包括復(fù)數(shù)參考，除非上下文中清楚地另有說(shuō)明。如此處所用，單詞"或"指特定列表中的任何一個(gè)成員，并也包括該列表成員中的任何組合。術(shù)語(yǔ)"大約"此處用于指近似、大致、大約或在一定區(qū)域內(nèi)。當(dāng)所述術(shù)語(yǔ)"大約"與數(shù)字范圍結(jié)合使用時(shí)，其通過(guò)延伸高于和低于所設(shè)數(shù)值的邊界修飾該范圍。通常，術(shù)語(yǔ)"大約"此處用于修飾高于和低于所述值10%(高或低，更高或更低)的數(shù)值。如此處所用，詞語(yǔ)"核酸"、"核苷酸"或"多核苷酸"旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、天然發(fā)生的、突變的、合成的DNA或RNA分子，和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RINA的類似物。其可以是單鏈的或雙鏈的。這種核酸或多核苷酸包括，但不限于結(jié)構(gòu)基因的編碼序列、反義序列和不編碼mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的非編碼調(diào)節(jié)序列。多核苷酸可編碼農(nóng)藝學(xué)上有價(jià)值的性狀或表型性狀。如此處所用，"分離的"多核苷酸當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上沒(méi)有其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上沒(méi)有化學(xué)前體。術(shù)語(yǔ)"基因"廣泛用于指與生物功能相關(guān)的核酸的任何片段。因此，基因包括基因組序列中的內(nèi)含子和外顯子，或僅包括其表達(dá)所需的cDNA和/或調(diào)節(jié)序列中的編碼序列。例如，基因指表達(dá)mRNA或功能RNA，或編碼特定蛋白質(zhì)，并包括調(diào)節(jié)序列的核酸片段。術(shù)語(yǔ)"多肽"和"蛋白質(zhì)"此處互換地使用來(lái)指連續(xù)氨基酸殘基的多聚體。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"有效連接"或"功能連接"指單個(gè)核酸片段上多個(gè)核酸序列的連接，使得一個(gè)核酸的功能受另一核酸的影響。例如，如果兩個(gè)l)NA的位置使得調(diào)節(jié)DNA影響編碼DNA的表達(dá)，那么調(diào)節(jié)DNA稱為"有效連接到"表達(dá)RNA或編碼多肽的DNA上。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"特異性表達(dá)"指被限制在一種或少數(shù)植物組織(空間限制)和/或一個(gè)或幾個(gè)植物發(fā)育階段(時(shí)間限制)的基因產(chǎn)物的表達(dá)。公認(rèn)的是幾乎不存在真正的特異性啟動(dòng)子看起來(lái)優(yōu)選在一些組織中開啟，而在其它組織中沒(méi)有或僅僅具有很少活性。這種現(xiàn)象稱為泄漏表達(dá)。然而，如此處定義的特異性表達(dá)旨在包括在一種或少數(shù)植物組織或植物特定部位中的表達(dá)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"指DNA序列，當(dāng)其連接到目的核苷酸序列上時(shí)能夠控制目的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成mRNA。啟動(dòng)子通常(盡管不是必須的)位于目的核苷酸(其向mRNA的轉(zhuǎn)錄受啟動(dòng)子的控制)5，(例如上游)(例如，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近)，并為RNA聚合酶和用于轉(zhuǎn)錄起始的其它轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合提供位點(diǎn)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，，指能夠調(diào)節(jié)有效連接的多核苦酸轉(zhuǎn)錄的多核苷酸。其包括，但不限于啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、5'UTR和3，m，R。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"載體"指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)連接了另一核酸的核酸分子。載體的一種類型是"質(zhì)粒"，其指可連接額外DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。在本說(shuō)明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。載體可以是雙元載體或包含左邊界和右邊界并可以包括中間目的基因的T-I)NA。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"指能夠在適當(dāng)宿主細(xì)胞中指導(dǎo)特定核苷酸表達(dá)的載體。表達(dá)載體包含有效連接目的核酸的調(diào)節(jié)性核酸元件，其任選地有效連接到終止信號(hào)和/或其它調(diào)節(jié)元件上。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"同源物"指通過(guò)從共同的祖先DNA序列遺傳而與第二個(gè)基因相關(guān)的基因。術(shù)語(yǔ)"同源物"可應(yīng)用于通過(guò)物種形成事件(例如，直向同源物)分離的基因之間的關(guān)系或應(yīng)用于通過(guò)遺傳復(fù)制事件(例如，共生同源物)分離的基因之間的關(guān)系。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"直向同源物"指來(lái)自不同物種，但通過(guò)物種形成從共同的祖先基因進(jìn)化而來(lái)的基因。直向同源物在進(jìn)化過(guò)程中保留了相同的功能。直向同源物編碼具有相同或類似功能的蛋白質(zhì)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"共生同源物"指在基因組內(nèi)通過(guò)復(fù)制而相關(guān)聯(lián)的基因。共生同源物通常具有不同的功能或新的功能，但這些功能可能是相關(guān)的。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"在嚴(yán)格條件下雜交"旨在描述用于雜交和洗滌的條件，在所述條件下彼此之間至少60%相似或同一的核普酸序列通常彼此保持雜交。在另一實(shí)施方案中，條件是使得彼此之間至少約65%、或至少約7()%、或至少約75%或更高相似或同一的序列通常彼此保持雜交的條件。這種嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并如下文描述。嚴(yán)格條件的優(yōu)選的非限制性實(shí)例是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，在約45°C中雜交，隨后是在0.2XSSC、0.1%SDS中于50-65。C一次或更多次洗滌。在兩種核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語(yǔ)"序列同一性，，或"同一性"參考當(dāng)在特定比較窗(如在總體比對(duì)中的完整序列或在局部比對(duì)中的相似區(qū)域)中為最大對(duì)應(yīng)性進(jìn)行比對(duì)時(shí)兩條序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性的百分比用于指蛋白質(zhì)時(shí)，公認(rèn)的是不相同的殘基位置經(jīng)常因保守氨基酸替換而不同，其中氨基酸殘基被具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基替換并因而不改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列在保守替換中不同時(shí)，可向上調(diào)節(jié)百分比序列同一性以校正替換的保守性。通過(guò)這種保守替換而不同的序列被稱為具有"序列相似性"或"相似性"。用于進(jìn)行這些調(diào)整的手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。通常，這包括將保守替換評(píng)定為部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配，由此提高序列相似性的百分比。如此處所用，"序列同一性的百分比"或"序列同一性百分比"指通過(guò)在比較窗內(nèi)總體或局部比較兩條最佳比對(duì)序列來(lái)測(cè)定的值，其中對(duì)兩條序列的最佳比對(duì)而言，比較窗中序列部分可包含空位。原則上，可通過(guò)測(cè)定位置數(shù)目(在所述位置中相同核酸堿基或氨基酸殘基出現(xiàn)在兩條序列中以產(chǎn)生匹配的位置數(shù))，用比較窗中全部位置數(shù)除匹配位置數(shù)，并將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比來(lái)計(jì)算所述百分比。對(duì)蛋白質(zhì)序列而言，可使用相同原理來(lái)計(jì)算"序列相似性的百分比"，其中保守替換計(jì)算為部分錯(cuò)配而非完全錯(cuò)配。因此，例如，給予相同氨基酸分值1，給予非保守替換分值O,給予保守替換0和1之間的分值?？蓮谋绢I(lǐng)域已知的氨基酸矩陣(例如Blosum或PAM矩陣)中獲得保守替換的得分。用于比較的序列比對(duì)方法為本領(lǐng)域所熟知。可使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成兩條序列之間百分比同一性或百分比相似性(對(duì)蛋白質(zhì)而言)的測(cè)定。這些數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選非限制性實(shí)例為，Myers和Miller的算法(Bioinformatics，4(1):11-17，1988)、Needleman-Wunsch總體比對(duì)(JMolBiol.48(3):443-53，1970)、Smith-Waterman局部比對(duì)(JournalofMolecularBiology,147:195-197，1981)、Pearson和Lipman的相似性搜索方法(search畫for-similarity-method)(PNAS,85(8):2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(J.Mol.Biol"215(3):403-410，19卯；PNAS，90:5873-5877,1993)?？衫糜?jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)這些數(shù)學(xué)算法用于序列比較，以測(cè)定序列同一性或鑒定同源物。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"保守區(qū)"或"保守結(jié)構(gòu)域"指異源多核苷酸或多肽序列中的區(qū)域，其中在不同序列之間具有相對(duì)高程度的序列同一性。可例如使用ClustalW算法從多序列比對(duì)來(lái)鑒定"保守區(qū)"。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"或"植物細(xì)胞"指單細(xì)胞，并也包括細(xì)胞群體。群體可以是包含一種細(xì)胞類型的純的群體。同樣，所述群體可包含多于一種細(xì)胞類型。本發(fā)明意義中的植物細(xì)胞可以是分離的(例如，在懸浮培養(yǎng)中)或包含在任何發(fā)育階段的植物組織、植物器官或植物中。關(guān)于植物(或"植物組織")的術(shù)語(yǔ)"組織"指多個(gè)植物細(xì)胞的排列，包括植物的分化組織和未分化組織。植物組織可組成植物器官的部分(例如植物葉的表皮)，但也組成腫塊組織(例如，愈傷組織)和培養(yǎng)中的多種細(xì)胞類型(例如，單細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚、愈傷組織、原胚體狀體等)。植物組織可以在植物中、器官培養(yǎng)中、組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)中。關(guān)于植物(或"植物器官")的術(shù)語(yǔ)"器官"指植物部分，并可包括，但不限于，例如根、果實(shí)、芽、莖、葉、下胚軸、子葉、花藥、萼片、花瓣、花粉、種子等。如此處所用，根據(jù)上下文，術(shù)語(yǔ)"植物"可理解為整林植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物種子和植物后代。詞語(yǔ)"植物"也指任何植物，尤其指種子植物，并可包括，但不限于農(nóng)作物植物。植物部分包括，但不限于莖、根、芽、果實(shí)、胚珠、雄蕊、葉、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、配子體、孢子體、花粉、小孢子、下胚軸、子葉、花藥、萼片、花瓣、花粉、種子等。可用于本發(fā)明方法中的植物種類通常廣泛到易于實(shí)施轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物和低等植物種類，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、棵子植物、蕨類植物、楔葉類(horsetails)、草原植物、莒蘚植物和多細(xì)胞藻類。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"旨在指含有轉(zhuǎn)基因或其基因組已經(jīng)被引入轉(zhuǎn)基因改變或已經(jīng)摻入了外源基因或多核苷酸的細(xì)胞和/或植物?？赏ㄟ^(guò)幾種方法來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織、器官和植物，包括將包含多核苷酸(通常是l)NA)的"轉(zhuǎn)基因"引入至靶細(xì)胞中或通過(guò)人為干涉如通過(guò)此處描述的方法將轉(zhuǎn)基因整合至靶細(xì)胞的染色體中。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"不分離"指對(duì)特定性狀而言多種植物如果其對(duì)該性狀在一定程度上是純合的，當(dāng)不分離變種是自體受精時(shí)，觀察不到后代中顯著量的獨(dú)立性狀分離。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"對(duì)照植物"或"野生型植物"指在轉(zhuǎn)基因植物或遺傳修飾植物中為鑒定增強(qiáng)表型或想要的性狀的目的，用于與轉(zhuǎn)基因植物或遺傳修飾植物相比較的植物細(xì)胞、外植體、種子、植物成分、植物組織、植物器官或整林植物。"對(duì)照植物，，在一些情況下可以是轉(zhuǎn)基因植物株系，其包含空載體或標(biāo)記基因，但不含有所評(píng)估的轉(zhuǎn)基因植物或遺傳修飾植物中存在的目的重組多核苷酸。對(duì)照植物可以是與所檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植物或遺傳修飾植物相同抹系或變種的植物，或其可以是另一林系或變種，如已知具有特定表型、特征或已知基因型的植物。合適的對(duì)照植物將包括用于產(chǎn)生本文轉(zhuǎn)基因植物的親本林系的遺傳未改變植物或非轉(zhuǎn)基因植物。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"對(duì)線蟲感染有抗性"或"具有線蟲抗性的植物"指植物避免被線蟲感染、殺死線蟲或阻礙、減慢或終止線蟲發(fā)育、生長(zhǎng)或增殖的能力。這可以通過(guò)主動(dòng)過(guò)程(例如通過(guò)產(chǎn)生對(duì)線蟲有害的物質(zhì))，或通過(guò)被動(dòng)過(guò)程(像對(duì)線蟲減少營(yíng)養(yǎng)價(jià)值或不發(fā)育通過(guò)線蟲進(jìn)食位點(diǎn)誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)，如合胞體或巨細(xì)胞)來(lái)實(shí)現(xiàn)?？梢远喾N方式，例如通過(guò)計(jì)數(shù)能夠在該植物上建立寄生的線蟲，或測(cè)定線蟲的發(fā)育時(shí)間、雄性和雌性線蟲的比例或所產(chǎn)生胞嚢或線蟲卵的數(shù)量來(lái)測(cè)定植物的線蟲抗性水平。對(duì)線蟲感染抗性提高的植物是相比于另一植物對(duì)線蟲感染更具抵抗力的植物，所述另一植物具有類似的或優(yōu)選相同的基因型，而缺少賦予線蟲提高抗性的基因或多個(gè)基因，例如對(duì)照或野生型植物。術(shù)語(yǔ)"進(jìn)食位點(diǎn)，，或"合胞體位點(diǎn)"可互換地使用并如此處所用指線蟲感染后在植物根中形成的進(jìn)食位點(diǎn)。該位點(diǎn)用作線蟲的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。合胞體是胞嚢線蟲的進(jìn)食位點(diǎn)，巨細(xì)胞是根癌線蟲的進(jìn)食位點(diǎn)。如此處定義，"蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式"指蔗糖異構(gòu)酶多肽，其缺少在相應(yīng)天然蔗糖異構(gòu)酶多肽中發(fā)現(xiàn)的至少約5%、10%、15%、18%、20%、21%、22%、23%、24%或25%的N末端氨基酸。本發(fā)明蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式是具有SEQIDNO:2中闡明的氨基酸序列的多肽的同源物?？蓮娜L(zhǎng)蔗糖異構(gòu)酶多肽的直向同源物和共生同源物中分離蔗糖異構(gòu)酶多肽的額外的N末端截短形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性的蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式的分離多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，任何全長(zhǎng)活性的蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式的多核苷酸。在下文實(shí)施例中公開了確定蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式中蔗糖異構(gòu)酶活性存在或缺失的測(cè)定法。在示例性實(shí)施方案中，所述多核苷酸選自具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸；編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸；與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸有70%序列同一性的多核苷酸；編碼與具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽有70%序列同一性的多肽的多核苷酸；在嚴(yán)格條件下與具有如SEQII)NO:l、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；和在嚴(yán)格條件下與編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。本發(fā)明也具體體現(xiàn)在分離的多核苷酸中，所述分離的多核苷酸與具有如SEQIDNO:l、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苦酸至少約50-60%、或至少約60-70%、或至少約70-80%、80-85%、85-90%、卯-95%、或至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高相同或更相似。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽與具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的任何多肽至少約50-60%、或至少約60-70%、或至少約70-80%、80-85%、85-卯％、卯-95%、或至少約95%、96%、97%、98%、99%或更相同或更相似。本發(fā)明分離多核苷酸中還包括的是不顯示蔗糖異構(gòu)酶活性的全長(zhǎng)蔗糖異構(gòu)酶多肽的等位基因變體。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"等位基因變體"指含有多態(tài)性的多核苷酸，所述多態(tài)性導(dǎo)致所述核苷酸編碼的蛋白質(zhì)氨基*列的改變，并且其存在于自然群體中(例如，植物物種或變種)。這種天然等位基因變異通?？蓪?dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸1-5%變異，或所編碼蛋白質(zhì)中1-5%變異。等位基因變體可通過(guò)對(duì)在大量不同植物中目的核酸進(jìn)行測(cè)序來(lái)鑒定，例如可通過(guò)使用雜交探針鑒定那些植物中相同基因遺傳位點(diǎn)來(lái)容易地進(jìn)行鑒定。多核苷酸中任何及所有這種核酸變異，和所得氨基酸多態(tài)性或因天然等位基因變異并且不改變所編碼蛋白質(zhì)的功能活性的蛋白質(zhì)變異均屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明還具體體現(xiàn)在轉(zhuǎn)化有包含分離多核苷酸的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物中，所述分離的多核苷酸編碼不顯示蔗糖異構(gòu)酶活性的蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式，其中所述多核苷酸的表達(dá)賦予植物提高的線蟲抗性。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物包含具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸。在另一示例性實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物包含編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸。在另一示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物包含多核苷酸，所述多核苷酸與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸至少約50-60%、或至少約60-70%、或至少約70-80%、80-85%、85-90%、卯-95%、或至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性或相似性。在另一示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物包含多核苷酸，所述多核苷酸與具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽有至少約50-60%、或至少約60-70%、或至少約70-80%、80-85%、85-90%、卯-95%、或至少約95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性或相似性。本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因種子和來(lái)自該種子的后代植物，包括雜種和近親截短形式的多核苷酸而言是不分離的。本發(fā)明還提供植物育種的方法，例如以制備雜交可育轉(zhuǎn)基因植物。所述方法包括將包含本發(fā)明特定表達(dá)載體的可育轉(zhuǎn)基因植物與其自身或第二種植物(例如缺少特定表達(dá)載體的植物)雜交，以制備包含特定表達(dá)載體的雜交可育轉(zhuǎn)基因植物的種子。然后種植所述種子以獲得雜交可育轉(zhuǎn)基因植物。植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。所述雜交可育轉(zhuǎn)基因植物可以具有通過(guò)母本或父本遺傳的所述特定表達(dá)載體。所述第二種植物可以是近親交配植物。雜交可育轉(zhuǎn)基因植物可以是雜種。本發(fā)明中還包括的是任何這些雜交可育轉(zhuǎn)基因植物的種子。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及包含有效連接一個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明多核苷酸的一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體，其中所述多核苷酸的表達(dá)賦予轉(zhuǎn)基因植物提高的線蟲抗性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是能夠調(diào)節(jié)有效連接的多核苷酸組成型表達(dá)的啟動(dòng)子。"組成型啟動(dòng)子，，指能夠在植物的所有或幾乎所有發(fā)育階段，所有或幾乎所有植物組織中表達(dá)它控制的可讀框的或調(diào)節(jié)元件啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子包括，但不限于來(lái)自植物病毒的35SCaMV啟動(dòng)子(Franck等，Cell21:285-294，1980)、Nos啟動(dòng)子、泛蛋白啟動(dòng)子(Christense等，PlantMol.Biol.12:619-632,1992和18:581-8，1991)、MAS啟動(dòng)子(Velten等，EMBOJ.3:2723-30，1984)、玉米H3組蛋白啟動(dòng)子(Lepetit等，MolGen.Genet231:276-85，1992)、ALS啟動(dòng)子(W096/30530)、19SCaMV啟動(dòng)子(US5,352,605)、super啟動(dòng)子(US5,955,646)、玄參屬花葉病毒啟動(dòng)子(US6,051,753)、稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(US5,641，876)和核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基啟動(dòng)子(US4,962,028)。在另一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子。"調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子"指不是組成型，而是以時(shí)間和/或空間方式指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子，并包括組織特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。不同的啟動(dòng)子可在不同的組織或細(xì)胞類型中，或在不同的發(fā)育階段，或響應(yīng)不同的環(huán)境條件指導(dǎo)基因或調(diào)節(jié)元件的表達(dá)。"組織特異性啟動(dòng)子"指不在所有植物細(xì)胞中表達(dá)卻僅在特定器官的一種或多種細(xì)胞類型(如葉子和種子)、特定組織(如胚胎或子葉)或特定細(xì)胞類型(如葉薄壁組織或種子儲(chǔ)藏細(xì)胞)中表達(dá)的調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子。這些也包括時(shí)間調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，如在胚胎發(fā)生早期或晚期、發(fā)育種子或果實(shí)的果實(shí)催熟過(guò)程中、在完全分化的葉中或在序列開始時(shí)。合適的啟動(dòng)子包括來(lái)自油菜的油菜籽蛋白基因啟動(dòng)子(US5,608,152)、來(lái)自蠶豆的USP啟動(dòng)子(Bacumlein等，1991MolGenGenet.225(3):459-67)、來(lái)自擬南芥的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(WO98/45461)、來(lái)自菜豆的菜豆蛋白啟動(dòng)子(US5,504,200)、來(lái)自蕓苔的Bce4啟動(dòng)子(WO91/13980)或豆^求蛋白B4啟動(dòng)子(LeB4;Bacumlein等，1992PlantJournal,2(2):233-9),以及在單子葉植物像玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等中賦予種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。應(yīng)注意的合適的啟動(dòng)子是來(lái)自大麥的lpt2或lptl基因啟動(dòng)子(WO95/15389和WO95/23230)或在WO99/168卯中描述的那些啟動(dòng)子(來(lái)自大麥醇溶蛋白基因、稻谷蛋白基因、水稻素基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麥醇溶蛋白基因、小麥谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麥谷蛋白基因、高粱kasirin基因和棵麥醇溶蛋白基因的啟動(dòng)子)。適合于在植物根組織中優(yōu)先表達(dá)的啟動(dòng)子包括，例如來(lái)自玉米nicotianamine合酶基因的啟動(dòng)子(US20030131377)和稻RCC3啟動(dòng)子(US11/075,113)。用于在植物綠色組織中優(yōu)先表達(dá)的合適啟動(dòng)子包括來(lái)自基因如玉米醛縮酶基因FDA的啟動(dòng)子(US20040216189)、來(lái)自酪縮酶和丙酮正磷酸二激酶(PPDK)的啟動(dòng)子(Taniguchi等，PlantCellPhysiol.41(1):42-48，2000)。"誘導(dǎo)型啟動(dòng)子"指那些調(diào)節(jié)性啟動(dòng)子，其在一種或更多種細(xì)胞類型中可通過(guò)外界刺激，例如化學(xué)品、光、激素、脅迫或病原體(如線蟲)而開啟。如果期望基因表達(dá)以時(shí)間特異性方式發(fā)生，那么化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子尤其合適。這種啟動(dòng)子的實(shí)例是水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO95/19443)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Gatz等，1992Plant,J.2:397-404)、來(lái)自核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的光i秀導(dǎo)型啟動(dòng)子和乙醇i秀導(dǎo)型啟動(dòng)子(WO93/21334)。并且，響應(yīng)生物脅迫或非生物脅迫條件的合適啟動(dòng)子是那些如病原體誘導(dǎo)型PRP1基因啟動(dòng)子(Ward等，1993Plant.Mol.Biol.22:361-366)、來(lái)自番癡的熱誘導(dǎo)型hsp80啟動(dòng)子(US5187267)、來(lái)自馬鈴薯的冷誘導(dǎo)型a淀粉酶啟動(dòng)子(WO96/12814)、玉米的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Busk等，Plant,1.11:1285-1295，1997)、來(lái)自馬鈴薯的冷、干旱及高鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Kirch,PlantMol.Biol.33:897-卯9，1997)或來(lái)自擬南芥的RD29A啟動(dòng)子(Yamaguchi-Shinozalei等Mol.Gen.Genet.236:331-340，1993)，許多冷謙導(dǎo)型啟動(dòng)子如來(lái)自擬南芥的corl5a啟動(dòng)子(Genbank登錄號(hào)U01377)、來(lái)自大麥的bltl01和blt4.8(Genbank登錄號(hào)AJ310994和U63993)、來(lái)自小麥的wcsl20(Genbank登錄號(hào)AF03123S)、來(lái)自玉米的mlipl5(Genbank登錄號(hào)D26563)、來(lái)自蕓莒的bnll5(Genbank登錄號(hào)U01377)和創(chuàng)傷誘導(dǎo)型pinll啟動(dòng)子(歐洲專利號(hào)375091)。優(yōu)選的啟動(dòng)子是根特異性、進(jìn)食位點(diǎn)特異性、病原體誘導(dǎo)型或線蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物包含編碼不顯示蔗糖異構(gòu)酶活性的蔗糖異構(gòu)酶多肽N末端截短形式的多核普酸，其中所述方法包括步驟將包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體引入植物中；并選擇線蟲抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物。用于將多核苷酸引入植物基因組中并從植物組織或植物細(xì)胞再生植物的多種方法例如在PlantMolecularBiologyandBiotechnology(CRCPress,BocaRaton,Florida)，笫6/7章，第71-119頁(yè)(1993);WhiteFF(1993)VectorsforGeneTransferinHigherPlants;TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization，編輯Kung和WuR,AcademicPress,15-38;'JenesB等(1993)TechniquesforGeneTransfer;TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,編輯Kung和R.Wu，AcademicPress,第128-143頁(yè)；Potrykus(1991)AnnuRevPlantPhysiolPlantMolecBiol42:205-225;HalfordNG，ShewryPR(2000)BrMedBull56(l):62-73中已知。轉(zhuǎn)化方法可包括直接和間接的轉(zhuǎn)化方法。合適的直接方法包括聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA攝取、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(US4,536,475)、使用基因槍的生物射彈方法(FrommME等(1990)Bio/Technology.8(9):833-9;Gordon-Kamm等(1990)PlantCell2:603)、電穿孔法、干胚在包含DNA的溶液中進(jìn)行溫育和顯微注射法。在這些直接轉(zhuǎn)化方法的情況下，所用質(zhì)粒不需要滿足任何特殊的要求?？墒褂煤?jiǎn)單質(zhì)粒，如pUC系列、pBR322、M13mp系列、pACYC184等的那些質(zhì)粒。如果完整植物待從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生，那么額外的選擇標(biāo)記基因優(yōu)選位于所述質(zhì)粒上。直接轉(zhuǎn)化技術(shù)等同地適用于雙子葉和單子葉植物。也可通過(guò)農(nóng)桿菌的細(xì)菌侵染(例如EP0116718)、病毒載體的病毒感染(El)0067553;US4,407,956;WO95/34668;WO93/03161)或花粉(EP0270356;WO85/01856;US4，684，611)來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化?；谵r(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)(尤其對(duì)雙子葉植物而言)為本領(lǐng)域所熟知。農(nóng)桿菌菌林(例如根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)桿菌)包含在農(nóng)桿菌感染后轉(zhuǎn)化至植物中的質(zhì)粒(Ti或Ri質(zhì)粒)和T-I)NA元件。所述T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)整合到植物細(xì)胞的基因組中。所述T-I)NA可以定位在Ti或Ri質(zhì)粒上，或分別包含在所謂的雙元載體中。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法描述于，例如HorschRB等(1985)Science225:1229f中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最適合于雙子葉植物，但也適合于單子葉植物。通過(guò)農(nóng)桿菌對(duì)植物的轉(zhuǎn)化描述于，例如WhiteFF,VectorsforGeneTransferinHigherPlants,TransgenicPlants，第1巻，EngineeringandUtilization,S.D.Kung和R.Wu編輯，AcademicPress,1993，第15—38頁(yè)；JenesB等TechniquesforGeneTransfer,TransgenicPlants,第1巻,EngineeringandUtilization,S.D.Kung和R.Wu編輯，AcademicPress,1993，第128-143頁(yè)；Potrykus(1991)AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol42:205-225。轉(zhuǎn)化可能導(dǎo)致暫時(shí)的或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。盡管本發(fā)明的多核苷酸可插入這些廣泛類別的任何植物和植物細(xì)胞中，但其特別用于農(nóng)作物植物細(xì)胞中。本發(fā)明的多核苷酸可直接轉(zhuǎn)化到質(zhì)?；蚪M中。質(zhì)粒表達(dá)利用優(yōu)于核表達(dá)基因的大量拷貝數(shù)目以允許高表達(dá)水平，在所述質(zhì)粒表達(dá)中基因通過(guò)同源重組插入到每一植物細(xì)胞中存在的數(shù)千拷貝的環(huán)形質(zhì)粒基因組中。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸插入到質(zhì)粒靶向載體中，并轉(zhuǎn)化到想要的植物宿主的質(zhì)?；蚪M中。獲得了對(duì)含有核苷酸序列的質(zhì)粒基因組同型的植物，并且其優(yōu)先能夠高水平表達(dá)所述核苷酸。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化4支術(shù)例如廣泛描述于美國(guó)專利號(hào)5,451,513、5,545,817、5,545,818和5,877,462，WO95/16783和WO97/32977及McBride等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，7301-7305中,此處所有均以其整體引入作為參考。用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)包括例如使用生物射彈或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如，氯化4丐或PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)將位于選擇標(biāo)記側(cè)翼的克隆質(zhì)粒DNA區(qū)與核苷酸序列一起引入合適的靶組織。稱為靶序列的1到1.5kb側(cè)翼區(qū)促進(jìn)與質(zhì)?；蚪M的同源重組，并因此允許原質(zhì)體系特異區(qū)域的替換或修飾。開始，賦予壯觀霉素和/或鏈霉素抗性的葉綠體16SrRNA和rpsl2基因中的點(diǎn)突變用作轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記(Svab等(19卯)PNAS87，8526-8530;Staub等(1992)PlantCell4，39-45)。這些標(biāo)記之間克隆位點(diǎn)的存在允i午用于引入外源基因的質(zhì)粒靶向載體的產(chǎn)生(Staub等(1993)EMBOJ.12，601-606)。通過(guò)用顯性選擇標(biāo)記——編碼壯觀霉素解毒酶氨基葡糖苷-3'-腺苷轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌aadA基因替換隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因來(lái)獲得轉(zhuǎn)化頻率的顯著提高(Svab等(1993)PNAS90，913-917)。用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的其它選擇標(biāo)記為本領(lǐng)域已知并包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以是任何植物，例如，但不限于樹、切花、觀賞植物、蔬菜或農(nóng)作物植物。所述植物可選自苜蓿屬(Medicago)、番茄屬(Lycopersicon)、蕓莒屬(Brassica)、香瓜屬(Cucumis)、癡屬(Solanum)、核桃屬(Juglans)、棉屬(Gossypium)、蘋果屬(Malus)、葡萄屬(Vitis)、金魚草屬(Antirrhinum)、楊屬(Populus)、草莓屬(Fragaria)、擬南芥屬、云杉屬(Picea)、辣椒屬(Capsicum)、幕屬(Chenopodium)、菊屬(Dendranthema)、牽牛屬(Pharbitis)、松屬(Pinus)、豌豆屬(Pisum)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍?qū)?Zca)、小麥屬(Triticum)、小黑麥屬(Triticale)、黑麥屬(Secale)、黑麥草屬(L()lium)、大麥屬(Hordeum)、大豆屬(Glycine)、黃杉屬(Pseudotsuga)、伽藍(lán)菜屬(Kalanchoe)、甜菜屬(Beta)、向日葵屬(Helianthus)、煙草屬(Nic()tiana)、南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、草莓屬、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬、驢食草屬(Onobrychis)、車軸草屬(trifolium)、胡盧巴屬(Trig()nella)、豇豆屬(Vigna)、橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘆巴屬(D獄us)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、煙草屬、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana、菊苣屬(Ciahorium)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬、萱草屬(Heterocallis)、水仙屬(Nemesis)、天竺葵屬(Pelargonium)、稷屬(Panieum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛萊屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、喇叭舌屬(Salpiglossis)、藍(lán)英花屬(Browaalia)、菜豆屬(Phaseolus)、燕麥屬(Avena)和蔥屬(Allium),或者所述植物選自谷類植物(其包括小麥、大麥、高粱、黑麥、黑小麥、玉米、稻、甘蔗)和樹(其包括蘋果、梨、柑橘、梅、櫻桃、桃子、油桃、杏、木瓜、芒果、白楊、松樹、水杉、雪松和橡樹)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)"植物"可以是雙子葉農(nóng)作物植物，如豌豆、苜蓿、大豆、胡蘿卜、芹菜、番茄、馬鈴薯、棉花、煙草、胡椒、油菜、甜菜、巻心菜、花椰菜、綠花椰菜、萵苣和擬南芥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。優(yōu)選地，植物是農(nóng)作物植物。農(nóng)作物植物是農(nóng)業(yè)中使用的所有植物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物，優(yōu)選禾本科(尸OflCefle)、芭蕉升牛(yV/MSflcefle)、百合牙+(Zj7/aceae)或鳳梨考牛(jB/Y附CVicefle)的才直物,優(yōu)選禾本科家族的植物。因此，在另一實(shí)施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍?qū)?、小麥屬、稻屬、大麥屬、黑麥屬、燕麥屬、甘蔗?Saccharum)、高粱屬(Sorghum)、狼尾草屬、狗尾草屬(Setaria)、稷屬、蟋蟀草屬(Eleusine)、芒屬(Miscanthus)、短柄草屬(Brachypodium)、羊茅屬(Festuca)或黑麥草屬植物。當(dāng)植物是玉蜀黍?qū)?Zefl)時(shí)，優(yōu)選的物種是玉米(Z.附《^)。當(dāng)植物是小麥屬(7Wricw附)時(shí)，優(yōu)選的物種是普通小麥(r."eWv"附)、斯佩爾特小麥(r"sy^/似e)或硬粒小麥(r.J"ra附)。當(dāng)植物是稻屬(Orw")時(shí)，優(yōu)選的物種是稻(aMftVfl)。當(dāng)植物是大麥屬(/iWfife"m)時(shí)，優(yōu)選的物種是大麥(/f.VW/^/M)。當(dāng)植物是黑麥屬(&Cfl/e)時(shí)，優(yōu)選的物種是黑麥(S.cwr"/e)。當(dāng)植物是燕麥屬C4vwfl)時(shí)，優(yōu)選的物種是燕麥(Asflriva)。當(dāng)植物是甘蔗屬(S""'/l"/WM)時(shí)，優(yōu)選的物種是甘蔗(義6|/^"'""""附)。當(dāng)植物是高梁屬(S"^/i"附)時(shí)，優(yōu)選的物種是蜀黍(S.vw/g"re)、兩色蜀黍(S.6Zo/w)或蘇丹草(S.sf^fl麼w^)。當(dāng)植物是狼尾草屬(尸eww&C"附)時(shí)，優(yōu)選的物種是御谷(尸.g/fl"c'w附)。當(dāng)植物是狗尾草屬(&似nVi)時(shí)，優(yōu)選的物種是谷子(S./似/Zcfl)。當(dāng)植物是黍?qū)?尸flm'CM附)時(shí)，優(yōu)選的物種是野生稷(P.附Z"flce"附)或柳枝稷(P.w>gWM/w)。當(dāng)植物是糝屬CE7e附/"e)時(shí)，優(yōu)選的物種是糝子CE".cwflc"w")。當(dāng)植物是芒屬(MZscaw幼"力時(shí)，優(yōu)選的物種是芒(M.wVie"s&)。當(dāng)植物是羊茅屬(/^W"cfl)時(shí)，優(yōu)選的物種是葦狀羊茅(F."n/"^""n'fl,紫羊茅(F.rw^Yi)或草甸羊茅(F./^fl&"^)。當(dāng)植物是黑麥草屬(Z^/Zw附)時(shí)，優(yōu)選的物種是多年生黑麥草(丄./;erewwe)或多花黑麥草(丄.附M似yZw"附)?；蛘咧参锟梢允切『邴湆?7>/,/c(^ec/e)。或者在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是雙子葉植物，優(yōu)選地是豆科(Fabaceae)、癡科(Solanaceae)、蕓苔科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、錦蔡科(Malvaceae)、亞麻科(Linaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(ConvoIvulaceae)、蕃蔽科(Rosaceae)、葫聲科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、萏草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑橘(Citrus)科的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)或蕓莒科(Brassicaceae)的植物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是豆科(Fabaceae)，優(yōu)選地是大豆屬(Glycine)、豌豆屬(Pisum)、落花生屬(Arachis)、鷹嘴豆屬(Cicer)、蠶豆屬(Vicia)、菜豆屬(Phaseolus)、羽扇豆屬(Lupinus)、苜蓿屬(Medicago)或兵豆屬(Lens)。優(yōu)選的豆科(Fabaceae)物種是截形苜蓿(M.truncatula)、紫苜蓿(M.sativa)、大豆(G.max)、豌豆(P.sativum)、花生(A.hypogea)、鷹口觜豆(C.arietinum)、蠶豆(V.faba)、茱豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinusalbus)、黃習(xí)習(xí)扇豆(Lupinusluteus)、狹葉習(xí)習(xí)扇豆(L叩inusangustifolius)或兵豆(Lensculinaris)。更優(yōu)選的是大豆(G.max)和花生(A.hypogea)、紫苜蓿(M.sativa)物種。最優(yōu)選的是大豆(G.max)。當(dāng)植物是茄科(Solanaceae)時(shí)，葉尤選的屬是^屬(Solanum)、番癡屬(Lycopersicon)、煙草屬(Nicotiana)或辣椒屬(Capsicum)。優(yōu)選的茄科物種是馬鈴薯(S.tuberosum),番茄(L.csculcntum)、煙草(N.tabaccum)或黃燈籠辣椒(C.chinense)。更優(yōu)選的是馬鈴薯(S.tuberosum)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，植物是十字花科(Brassicaceae),優(yōu)選的是蕓莒(Brassica)或蘿卜屬(Raphanus)。優(yōu)選的十字花科(Brassicaceae)物種是歐洲油菜(B.napus)、甘藍(lán)(B.oleracea)、芥菜(B.juncea)或蕪青(B.rapa)物種。更優(yōu)選的是歐洲油菜(B.napus)物種。當(dāng)植物是藜科(Chenopodiaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是甜菜屬(Beta)，優(yōu)選的物種是甜菜(B.vulgaris)。當(dāng)植物是菊科(Asteraceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是向日葵屬(Helianthus)，優(yōu)選的物種是向日葵(H.annuus)。當(dāng)植物是錦葵科(Malvaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是棉屬(Gossypium)或-火葵屬(Abdmoschus)。當(dāng)屬是棉屬(Gossypium)時(shí)，優(yōu)選的物種是陸地棉(G.hirsutum)或海島棉(G.barbadense),最優(yōu)選的物種是陸地棉(G.hirsutum)。秋葵屬(Abelmoschus)的優(yōu)選的物種是咖啡黃葵(A.esculentus)。當(dāng)植物是亞麻科(Linaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是亞麻屬(Linum),優(yōu)選的物種是亞麻(L.usitatissimum)。當(dāng)植物是大戟科(Euphorbiaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是木薯屬(Manihot)、麻風(fēng)樹屬(Jatropa)或蓖麻屬(Ricinus),優(yōu)選的物種是木薯(M.esculenta)、麻風(fēng)樹(J.curcas)或荒麻(R.comunis)。當(dāng)植物是旋花科(Convolvulaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是番薯屬(Ipomea)，優(yōu)選的物種是I.batatas。當(dāng)植物是薔薇科(Rosaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是薔薇屬(Rosa)、蘋果屬(Malus)、梨屬(Pyrus)、李屬(Prunus)、懸鉤子屬(Rubus)、茶簾子屬(Ribes)、越橘屬(Vaccinium)或草莓屬(Fragaria),優(yōu)選的物種是雜種荷蘭草莓(Fragariaxananassa)。當(dāng)才直物是葫蘆科(Cucurbitaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是黃瓜屬(Cucumis)、西瓜屬(Citrullus)或南瓜屬(Cucurbita)，優(yōu)選的物種是黃瓜(Cucumissativus)、西瓜(Citrulluslanatus)或西葫，(Cucurbitapepo)。當(dāng)植物是山茶科(Theaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是山茶屬(Camellia),優(yōu)選的物種是茶(Camelliasinensis)。當(dāng)植物是茜草科(Rubiaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是咖啡屬(Coffea)，優(yōu)選的物種是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。當(dāng)植物是梧桐科(Sterculiaceae)時(shí)，優(yōu)選的屬是可可樹屬(Theobroma)，優(yōu)選的物種是可可樹(T.cacao)。當(dāng)植物是柑橘屬(Citrus)時(shí)，優(yōu)選的物種是甜橙(C.sinensis)、檸檬(C.limon)、桔(C.reticulata),柚(C.maxima)和柑橘物種的雜種等等。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述植物是大豆、馬鈴薯或玉米植物。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可用于控制植物寄生線蟲對(duì)農(nóng)作物感染的方法中，所述方法包括以下步驟從包含表達(dá)盒的種子生長(zhǎng)農(nóng)作物，所述表達(dá)盒包含有效連接本發(fā)明多核苷酸的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，其中所迷表達(dá)盒穩(wěn)定整合到種子基因組中。因此，本發(fā)明包含賦予植物線蟲抗性的方法，所述方法包括步驟制備包含有效連接啟動(dòng)子的本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)盒；用所述表達(dá)盒轉(zhuǎn)化受體植物；產(chǎn)生所述受體植物的一林或更多抹轉(zhuǎn)基因后代；并選擇后代的線蟲抗性。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子是根特異性的或線蟲誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子或在線蟲進(jìn)食位點(diǎn)例如合胞體或巨細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。性。所述線蟲可以是任何植物寄生線蟲，像長(zhǎng)針線蟲科(Longidoridae)、毛刺線蟲科(Trichodoridae)、滑刃線蟲科(Aphelenchoidida)、粒線蟲科(Anguinidae)、刺線蟲考牛(Belonolaimidae)、環(huán)線蟲考+(Criconematidae)、異皮線蟲科(Heterodidae)、紐帶線蟲科(Hoplolaimidae)、根結(jié)線蟲科(Mdoidogynidae)、4十線蟲牙牛(Paratylenchidae)、》豆體線蟲矛牛(Pratylenchidae)、小墊刃線蟲科(Tylenchulidae)、墊刃線蟲科(Tylenchidae)等科的線蟲。優(yōu)選地，所述寄生線蟲屬于誘導(dǎo)巨細(xì)胞或合胞體細(xì)胞的線蟲科。誘導(dǎo)巨細(xì)胞或合胞體細(xì)胞的線蟲發(fā)現(xiàn)于長(zhǎng)針線蟲科、毛刺線蟲科、異皮線蟲科、根結(jié)線蟲科、短體線蟲科或小墊刃線蟲科。尤其發(fā)現(xiàn)于異皮線蟲科和根結(jié)線蟲科。因此，本發(fā)明靶定的寄生線蟲屬于選自偽根瘤線蟲屬(Naccobus)、仙人掌胞嚢線蟲屬(Cactodera)、長(zhǎng)形胞嚢線蟲屬(Dolichodera)、球異皮線蟲屬(Globodera)、異皮線蟲屬(Heterodera)、Punctodera、長(zhǎng)4十線蟲線蟲屬(Longidorus)或根結(jié)線蟲屬(Meloidogyne)的一種或更多種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寄生線蟲屬于選自偽根瘤線蟲屬(Naccobus)、仙人掌胞嚢線蟲屬、長(zhǎng)形胞嚢線蟲屬、球異皮線蟲屬、異皮線蟲屬、Punctodera或根結(jié)線蟲屬的一種或更多種。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寄生線蟲屬于選自球異皮線蟲屬、異皮線蟲屬或根結(jié)線蟲屬的一種或更多種。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寄生線蟲屬于選自球異皮線蟲屬或異皮線蟲的一種或兩種。在另一實(shí)施方案中，所述寄生線蟲屬于根結(jié)線蟲屬。當(dāng)寄生線蟲是球形胞嚢線蟲屬((7/Wo&m)時(shí)時(shí)，物種優(yōu)選選自蕃草屬3求異皮線蟲((7."c/r"/efle)、蒿3求異皮線蟲(G"."rfe附/5i'ae)、G./^/^(y^'、G.附ex/oma、G*.附Z〃e/o"/、蘋果球異皮線蟲(G1.w"W、馬鈴薯白線蟲((7./m仏V/fl)、馬鈴薯金線蟲(G./ys,oc/^"w、)、煙草異皮線蟲(Gr"Mc"附)和(7.v/"/mVie。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述球形胞嚢線蟲屬包括馬鈴薯白線蟲(G.、煙草異皮線蟲((7.TflA"c"附)或馬鈴薯金線蟲(G"."人vtoc7i/e船&)中的至少一種。當(dāng)所述寄生線蟲是異皮線蟲屬時(shí)，物種優(yōu)選選自燕麥異皮線蟲(H.avenae)、胡蘿卜異皮線蟲(H.carotae)、鷹嘴豆異皮線蟲(H.ciceri)、十字花科異皮線蟲(H.cruciferae)、H.delvii、褐藻異皮線蟲(H.elachista)、菲力普異皮線蟲(H.filipjevi)、H.gambiensis、大豆異皮線蟲、豌豆異皮線蟲(H.goettingiana)、蕎麥異皮線蟲(H.graduni)、蛇麻異皮線蟲(H.humuli)、大麥異皮線蟲(H.hordecalis)、小麥異皮線蟲(H.latipons)、燕麥異皮線蟲(H.major)、苜蓿異皮線蟲(H.medicaginis)、水稻異皮線蟲(H.oryzicola)、巴基斯坦異皮線蟲(H.pakistanensis)、酸模異皮線蟲(H.rosii)、甘蔗異皮線蟲(H.sacchari)、甜菜異皮線蟲、高粱異皮線蟲(H.sorghi)、車軸草異皮線蟲、蕁麻異皮線蟲(H.urticae)、豇豆異皮線蟲(H.vigni)和玉米異皮線蟲(H.zeae)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述寄生異皮線蟲包括大豆異皮線蟲、燕麥異皮線蟲、木豆異皮線蟲、豌豆異皮線蟲、車軸草異皮線蟲、玉米異皮線蟲或甜菜異皮線蟲中的至少一種。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寄生線蟲包括大豆異皮線蟲或甜菜異皮線蟲中的至少一種。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寄生線蟲是大豆異皮線蟲。當(dāng)寄生線蟲是根結(jié)線蟲屬時(shí)，所述寄生線蟲選自高粱根結(jié)線蟲(M.acronea)、M.arabica、花生才艮結(jié)線蟲(M.arenaria)、甘藍(lán)才艮結(jié)線蟲(M.artiellia)、短尾才艮結(jié)線蟲(M.brevicauda)、山茶才艮結(jié)線蟲(M.camelliae)、哥倫比亞根結(jié)線蟲(M.chitwoodi)、咖啡根結(jié)線蟲(M.cofeicola)、短小根結(jié)線蟲(M.esigua)、禾草根結(jié)線蟲(M.graminicola)、北方根結(jié)線蟲(M.hapla)、南方根結(jié)線蟲、印度根結(jié)線蟲(M.indica)、海濱根結(jié)線蟲(M.inornata)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)、林氏根結(jié)線蟲(M.lini)、蘋果根結(jié)線蟲(M.mali)、小頭根結(jié)線蟲(M.microcephala)、小突根結(jié)線蟲(M.microtyla)、納西根結(jié)線蟲(M.naasi)、薩拉斯根結(jié)線蟲(M.salasi)和泰晤士根結(jié)線蟲(M.thamesi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寄生線蟲包括爪哇根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲或哥倫比亞根結(jié)線蟲中的至少一種。盡管已經(jīng)按照某些實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，變型可應(yīng)用于此處描述的組合物、方法和方法的步驟或步驟順序，而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。實(shí)施例實(shí)施例l:克隆編碼蔗糖異構(gòu)酶N末端截短形式的多核香酸在PCR反應(yīng)中使用約0.1ng含歐文氏菌(Env/m'")蔗糖異構(gòu)酶AF279281序列的質(zhì)粒DNA作為DNA模板。用于PCR擴(kuò)增截短的蔗糖異構(gòu)酶序列的引物示于表1中并基于AF279281序列設(shè)計(jì)。由SEQIDNO:12描述的引物序列包含用于容易克隆的JmI限制性位點(diǎn)。由SEQIDNO:13描述的引物序列包含用于容易克隆的X/^I限制性位點(diǎn)。由SEQIDNO:12和SEQII)NO:13描述的引物序列用于擴(kuò)增截短的蔗糖異構(gòu)酶序列。擴(kuò)增到的DNA片段大小通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證并從凝膠中提取I)NA。將純化后的片段使用TOPOTA克隆試劑盒參照制造商說(shuō)明書(Invitrogen)TOPO克隆至pCR2.1中。使用AppliedBiosystem373A(AppliedBiosystems,FosterCity,California,美國(guó))自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆到的片段測(cè)序并通過(guò)使用來(lái)自序列分析工具VectorNTI(Invitrogen，Carlsbad,California,美國(guó))中的序列比對(duì)ClustalW(EuropeanBi()informaticsInstitute,Cambridge，英國(guó))驗(yàn)證該序列為預(yù)期的序列。由SEQIDNO:l描述了編碼歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶的N末端截短形式的多核苷酸。為了方便克隆而在引物中引入的限制性位點(diǎn)不包含于序列之中。表l:用于擴(kuò)增SEQIDNO:l多核苷酸的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例2:用于轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建為了評(píng)估所克隆的編碼蔗糖異構(gòu)酶編碼基因N末端截短形式的歐文氏菌多核苷酸的功能，4吏用限制性內(nèi)切酶ylscl和X/^I將對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:l的1-1464位核苷酸的基因片段克隆到啟動(dòng)子下游，以產(chǎn)生表2中描述的有效連接到所述啟動(dòng)子序列上的表達(dá)載體。合胞體優(yōu)選的啟動(dòng)子包括大豆MTN3啟動(dòng)子SEQIDNO:7(p-47116125)(USSN60/899,714)、擬南芥過(guò)氧化物酶POX啟動(dòng)子SEQIDNO:8(p-At5g05340)(USSN60/876,416)、擬南芥TPP6辨酸海藻糖砩酸酶啟動(dòng)子SEQIDNO:9(p-Atlg35910)(IJSSN60/874,375)、MTN21啟動(dòng)子SEQIDNO:10(p-Atlg21890)(USSN6()/743，341)和At5gl2170類啟動(dòng)子SEQIDNO:ll(USSN60/899,693)。表2中描述的雙元載體中的植物選擇標(biāo)記為來(lái)自擬南芥的乙酰羥酸合酶(AHAS)基因的抗除草劑形式(Sathasivan等，PlantPhys.97:1044-50，1991)。使用ARSENAL(滅草煙，BASFCorp,FlorhamPark,NJ)作為選擇表2:包含SEQIDNO:l片段的表達(dá)載體栽體表達(dá)盒的組成(啟動(dòng)子::NCP編碼基因)R,mi超級(jí)啟動(dòng)子::SEQIDNO:lRJT22p-Atlg218卯::SEQIDNO:lRJT23p-47116125::SEQIDNO:lRJT51p-At5g05340::SEQIDNO:lRJT52p-At5gl2170::SEQIDNO:lRJT53p-Atlg35910::SEQIDNO:l實(shí)施例3:轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)根的產(chǎn)生和線蟲生物測(cè)定通過(guò)電穿孔將雙元載體RJT21、RJT22、RJT23、RJT51、RJT52和RJT53轉(zhuǎn)化至毛根農(nóng)桿菌K599菌林中。使用已知方法用轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌林誘導(dǎo)大豆發(fā)根的形成。通過(guò)使用未轉(zhuǎn)化的毛根農(nóng)桿菌還從大豆栽培種Williams82(SCN易感)和Jack(SCN抗性)中產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因發(fā)根，用作測(cè)定中線蟲生長(zhǎng)的對(duì)照。在轉(zhuǎn)化有載體的轉(zhuǎn)基因發(fā)根和作為對(duì)照的來(lái)自Williams82和Jack的非轉(zhuǎn)基因發(fā)根中進(jìn)行生物測(cè)定以評(píng)估線蟲抗性。每一雙元載體轉(zhuǎn)化中產(chǎn)生幾個(gè)獨(dú)立的發(fā)根系用于生物測(cè)定。對(duì)于每一轉(zhuǎn)化林系而言，根據(jù)如上概述的方法用SCN接種幾個(gè)重復(fù)孔。線蟲接種四周后，對(duì)每孔中的胞嚢數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并測(cè)定雌性指數(shù)。雌性指數(shù)為胞嚢數(shù)與易感的栽培種Williams82相比的關(guān)系。對(duì)于每一轉(zhuǎn)化林系，測(cè)定重復(fù)孔的數(shù)目(n)、每孔胞嚢的平均數(shù)(MEAN)和標(biāo)準(zhǔn)差(SE)值。結(jié)果表明檢測(cè)的六個(gè)構(gòu)建體中五個(gè)在多個(gè)轉(zhuǎn)基因林系上顯示出胞嚢數(shù)顯著下降。構(gòu)建體RJT21、RJT22、RJT23、RJT52和RJT53的生物測(cè)定結(jié)果顯示在多個(gè)轉(zhuǎn)基因抹系上胞嚢數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著減少(p值<().05)并且在測(cè)定的大部分轉(zhuǎn)基因林系中顯示出胞嚢數(shù)降低的一般趨勢(shì)。構(gòu)建體RJT51的生物測(cè)定結(jié)果未顯示出對(duì)胞嚢數(shù)的顯著影響。實(shí)施例4:SEQIDNO:l蔗糖異構(gòu)酶片段的蔗糖異構(gòu)酶測(cè)定由SEQIDNO:l代表的蔗糖異構(gòu)酶多核苷酸的N末端截短形式是來(lái)自大黃歐文氏菌(EnWm'flW^/70"ri"')的蔗糖異構(gòu)酶的截短形式(由SEQIDNO:3代表的登陸號(hào)為AF279281的序列)。SEQIDNO:l和SEQIDNO:3的I)NA序列比對(duì)示于圖1中。由SEQIDNO:l描述的截短的NCPDNA序列編碼的多核苷酸(SEQIDNO:2)導(dǎo)致N末端截短。基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SEQ11)NO:2描述的多肽不具有蔗糖異構(gòu)酶活性。進(jìn)行兩組實(shí)-瞼(下文中的測(cè)定A和測(cè)定B)來(lái)證實(shí)NCP的截短形式不能作為蔗糖異構(gòu)酶起作用(即截短的蛋白質(zhì)不能催化蔗糖異構(gòu)化成異麥芽酮糖(palatinose))。測(cè)定A.使用轉(zhuǎn)基因大豆根的蔗糖異構(gòu)酶活性測(cè)定對(duì)轉(zhuǎn)化有RJT51和RJT53的轉(zhuǎn)基因大豆根進(jìn)行分析。從根樣品中提取蔗糖并在HPLC上對(duì)一式三份等分試樣進(jìn)行跑樣。對(duì)照樣品由W82和Jack組成并且W82補(bǔ)充有外部異麥芽酮糖(W82+異麥芽酮糖)。除陽(yáng)性對(duì)照(W82十異麥芽酮糖)外，在分析的任何樣品中未檢測(cè)到異麥芽酮糖。測(cè)定B.〗吏用大腸桿菌的蔗糖異構(gòu)酶活性測(cè)定產(chǎn)生用于在細(xì)菌中表達(dá)的含全長(zhǎng)(SEQIDNO:3)和截短的(SEQIDN():l)歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶基因的構(gòu)建體。此外，產(chǎn)生用于在細(xì)菌中表達(dá)的含全長(zhǎng)(SEQIDNO:6)和截短的(SEQIDNO:4)普城沙雷氏菌蔗糖異構(gòu)酶基因的構(gòu)建體。由SEQIDNO:5描述的截短的沙雷氏菌蔗糖異構(gòu)酶氨基酸序列與由SEQIDNO:2描述的截短的歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶序列間的氨基酸總體百分比同一性示于圖2。四個(gè)構(gòu)建體包含在IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控下的來(lái)自歐文氏菌和沙雷氏菌的指定的全長(zhǎng)和截短的蔗糖異構(gòu)酶基因。將四個(gè)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并且蔗糖異構(gòu)酶表達(dá)不受IPTG誘導(dǎo)(樣品a)或通過(guò)加入IPTG而得以誘導(dǎo)(樣品b)。加入IPTG后，來(lái)自轉(zhuǎn)基因細(xì)菌的粗提物與卯mM蔗糖溫育。在加入蔗糖后0分鐘和60分鐘取出樣品。在指定的時(shí)間點(diǎn)上，中止反應(yīng)并且將混合物中的等分試樣注射進(jìn)HPLC來(lái)測(cè)定蔗糖含量。觀察到加入IPTG對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有關(guān)鍵影響，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中使用的IPTG誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在未加入IPTG時(shí)在某種程度上也是有活性的。結(jié)果顯示兩種全長(zhǎng)基因形式(來(lái)自歐文氏菌和沙雷氏菌)都具有蔗糖異構(gòu)酶活性，因?yàn)楫?dāng)蔗糖完全耗盡時(shí)，在60分鐘溫育后均可產(chǎn)生顯著量的異麥芽酮糖。與之相反，兩個(gè)截短的基因形式在相同的實(shí)驗(yàn)條件下未能產(chǎn)生任何可檢測(cè)到的異麥芽酮糖，并且蔗糖峰保持不變。結(jié)果示于表3中。表3.測(cè)定在大腸桿菌中表達(dá)的構(gòu)建體的蔗糖含量的HPLC測(cè)定樣品名稱蔗糖(nmol)異麥芽酮糖海藻糖(nmol)(nmol)SRS73-5aT01870.0n.a,n.a,SRS73-5aT602239.1ii.a,ii.a,SRS73-5bT01918.5n丄n.a,SRS73-5bT602277.7ii.a,n.a,SRS74-4aT01944.2239.21.7SRS74-4aT6017.21911.0189.8SRS74-4bT01186.4137.2n.a,SRS74-4bT609.33254.6315.7<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>SRS73-5NCP截短的歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶(SEQIDNO:l)SRS74-4全長(zhǎng)歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶(SEQIDNO:3)SRS75-2截短的沙雷氏菌蔗糖異構(gòu)酶(SEQIDNO:4)SRS76-3全長(zhǎng)沙雷氏菌蔗糖異構(gòu)酶(SEQIDNO:6)表中"a，，樣品未加IPTG;"b，，樣品加入IPTG實(shí)施例5:蔗糖異構(gòu)酶多肽的額外的N末端截短形式如實(shí)施例3中所公開的，當(dāng)與組成型啟動(dòng)子和線蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有效連接并在大豆根中表達(dá)時(shí)，由SEQIDNO:l描述的歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶NCP基因的截短形式導(dǎo)致降低的胞嚢數(shù)。如實(shí)施例4中所公開的，已顯示歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶基因的截短形式不具有蔗糖異構(gòu)酶活性。此外，來(lái)自沙雷氏菌的同源蔗糖異構(gòu)酶基因的截短形式不具有蔗糖異構(gòu)酶活性，如實(shí)施例4中所示。使用BLAST算法用由SEQIDNO:2描述的截短的歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶氨基酸序列來(lái)鑒定同源基因。鑒定到與由SEQIDNO:2描述的歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶多肽的N末端截短形式同源的幾個(gè)示例性蔗糖異構(gòu)酶基因的截短形式并且由SEQIDNO:5和SEQIDNO14-20描述。所述同源物表現(xiàn)出與由SEQIDNO:2描述的歐文氏菌截短的蔗糖異構(gòu)酶NCP基因的一定范圍的同源性。鑒定到的截短的同源物與由SEQIDNO:2描述的歐文氏菌截短的蔗糖異構(gòu)酶的氨基酸比對(duì)示于圖3中。顯示鑒定到的同源物和SEQIDN():2相互之間的百分比同一性的矩陣表示于圖4中。實(shí)施例6:同源物的載體構(gòu)建將對(duì)應(yīng)于由SEQIDNO:5和SEQIDNO14-20描述的氨基酸序列的核苷酸序列克隆入植物雙元載體中，所述核苷酸序列編碼與由SEQIDN():2描述的歐文氏菌截短的蔗糖異構(gòu)酶同源的基因的截短形式。SEQIDN():4和SEQIDNO21-27描述了截短的同源物DNA序列。使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將所描述的核苷酸序列有效連接到由SEQIDNO:9描述的線蟲誘導(dǎo)型啟動(dòng)子p-Atlg35910上。雙元載體中的植物選擇標(biāo)記產(chǎn)生對(duì)除草劑滅草煙(Imazapyr)的抗性。實(shí)施例7:生物測(cè)定和胞嚢計(jì)數(shù)使用在共有的未決USSN12/001,234中公開的生才艮植物測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行生物測(cè)定來(lái)評(píng)估由SEQIDNO:l的截短的歐文氏菌蔗糖異構(gòu)酶賦予的線蟲抗性。在轉(zhuǎn)化有實(shí)施例6中描述的雙元載體后產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因根。將多個(gè)轉(zhuǎn)基因根系傳代培養(yǎng)并且以約500J2/孔的水平用表面凈化的品種3SCN第二階段的幼蟲(J2)接種。線蟲接種后四周，對(duì)每孔中的胞嚢數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于每一轉(zhuǎn)化構(gòu)建體，計(jì)算每抹系的胞嚢數(shù)以測(cè)定平均胞嚢數(shù)和構(gòu)建體的標(biāo)準(zhǔn)誤。每一轉(zhuǎn)化構(gòu)建體的胞嚢數(shù)值與平行檢測(cè)的空載體對(duì)照的胞嚢數(shù)值相比較來(lái)確定所檢測(cè)的構(gòu)建體是否導(dǎo)致胞嚢數(shù)目的下降。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或使用僅僅例行試驗(yàn)?zāi)軌虼_認(rèn)此處描述的本發(fā)明的特定實(shí)施方案的許多等同方案。此類等同方案旨在包括在以下權(quán)利要求中。權(quán)利要求1.編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽N末端截短形式的分離的多核苷酸，其當(dāng)轉(zhuǎn)化至植物中時(shí)顯示抗線蟲活性，其中所述多肽不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性。2.權(quán)利要求l的分離的多核苷酸，其選自a.具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸；b.編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸；c.與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸有70%序列同一性的多核苷酸；d.編碼與具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽有70%序列同一性的多肽的多核苷酸；e.在嚴(yán)格條件下與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；和f.在嚴(yán)格條件下與編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。3.權(quán)利要求2的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有如SEQIDN():l、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列。4.權(quán)利要求2的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有如SEQIDN():2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽。5.轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物，所述載體包含編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽N末端截短形式的分離的多核苷酸，其當(dāng)轉(zhuǎn)化入植物中時(shí)顯示抗線蟲活性，其中所述多肽不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性。6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述分離的多核苷酸選自a)具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸；b)編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸；c)與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸有70。/。序列同一性的多核苷酸；d)編碼與具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽有70%序列同一性的多肽的多核苦酸；e)在嚴(yán)格條件下與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸雜交的多核苦酸；和f)在嚴(yán)格條件下與編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。7.權(quán)利要求6的植物，其中所述多核苷酸具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列。8.權(quán)利要求6的植物，其中所述多核苷酸編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽。9.權(quán)利要求5的植物，其進(jìn)一步被限定為單子葉植物。10.權(quán)利要求9的植物，其中所述植物選自玉米、小麥、稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱、香蕉和黑麥草。11.權(quán)利要求5的植物，其進(jìn)一步被限定為雙子葉植物。12.權(quán)利要求ll的植物，其中所述植物選自豌豆、苜蓿、大豆、胡蘿卜、芹菜、番茄、馬鈴薯、棉花、煙草、胡椒、油菜、甜菜、巻心菜、花椰菜、綠花椰菜、萵苣和擬南芥。13.權(quán)利要求12的植物，其中所述植物是大豆。14.表達(dá)載體，其包含有效連接編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽N末端截短形式的多核苷酸的啟動(dòng)子，所述多核苷酸當(dāng)轉(zhuǎn)化到植物中時(shí)顯示抗線蟲活性，其中所述多肽不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性。15.權(quán)利要求14的表達(dá)栽體，其中所述多核苷酸選自a)具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苦酸；b)編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸；c)與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸有70°/。序列同一性的多核苷酸；d)編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸；e)在嚴(yán)格條件下與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、`25、26或27中定義的序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；和f)在嚴(yán)格條件下與編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、`18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。16.權(quán)利要求14的表達(dá)栽體，其中所述啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子和合胞體特異性啟動(dòng)子。17.權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其中所述多核苷酸具有如SEQIDNO:`1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列。18.權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其中所述多核苷酸編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽。19.產(chǎn)生具有提高的線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包括步驟a)將表達(dá)載體引入植物中，該表達(dá)載體包含有效連接編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽N末端截短形式的多核苷酸的啟動(dòng)子，所述多核苷酸當(dāng)轉(zhuǎn)化到植物中時(shí)顯示抗線蟲活性，其中所述多肽不顯示蔗糖異構(gòu)酶酶促活性；和b)選擇具有提高的線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述多核苷酸選自a)具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸；b)編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸；c)與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或`27中定義的序列的多核苷酸有70%序列同一性的多核苷酸；d)編碼與具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽有70%序列同一性的多肽的多核苷酸；e)在嚴(yán)格條件下與具有如SEQIDNO:1、3、4、6、21、22、23、24、25、26或27中定義的序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；和f)在嚴(yán)格條件下與編碼具有如SEQIDNO:2、5、14、15、16、17、18、19或20中定義的序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供編碼蔗糖異構(gòu)酶多肽N末端截短形式的多核苷酸，所述多肽能夠賦予植物提高的線蟲抗性。本發(fā)明還提供產(chǎn)生具有提高的線蟲抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法、這種轉(zhuǎn)基因植物的種子及表達(dá)載體，其所有均包含本發(fā)明的多核苷酸。文檔編號(hào)C12N15/82GK101600803SQ200880003905公開日2009年12月9日申請(qǐng)日期2008年2月5日優(yōu)先權(quán)日2007年2月8日發(fā)明者A·威格,B·茨爾施,J·托斯伯格,K·赫伯斯,R·桑切斯-費(fèi)爾南德斯,R·阿申齊,S·喬杜里,翔黃申請(qǐng)人:巴斯福植物科學(xué)有限公司