專利名稱：：通過測量cd36診斷動脈粥樣硬化斑塊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用在體液和/或斑塊等的CD36濃度的測量來診斷、分類和監(jiān)測動脈粥樣硬化斑塊。
背景技術(shù)：
：動脈粥樣硬化是一種漸進性炎性疾病，其中動脈壁中的脂質(zhì)、細胞外基質(zhì)、巨噬細胞和激活血管平滑肌細胞導致動脈粥樣硬化斑塊的增長。動脈粥樣硬化病變的發(fā)展會引出各種急性缺血性事件，如急性冠脈綜合征、短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)和中風，因為部分斑塊是分離的并被血流攜帶，直到該斑塊由于尺寸超過了動脈的尺寸而停滯。然而，雖然動脈粥樣硬化進程中炎癥介質(zhì)的參與己經(jīng)得到廣泛認可，但不同組分的鑒定以及它們的相對重要性并不清楚。具體地，炎癥以何種方式可促進無癥狀的纖維型斑塊向易受攻擊和有癥狀的病變的轉(zhuǎn)變尚不完全清楚。CD36有許多細胞功能。它是一種脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(FAT)，屬于清道夫受體B類家族，在代謝活躍組織中整個細胞膜的長鏈脂肪酸(LCFA)的攝取中、在泡沫細胞形成中、以及在OxLDL被巨噬細胞的攝取中發(fā)揮著重要的作用。然后，脂質(zhì)豐富的巨噬細胞被分化成泡沫細胞或獲得泡沫細胞的特點，并促成動脈粥樣硬化病變的形成。此外，巨噬細胞的CD36，與TSP和整合素(xvj33一起，能吞噬凋亡的中性粒細胞。而且，該蛋白是血小板粘附和聚集中膠原的受體之一。再者，通過與Src族絡(luò)氨酸激酶相互作用，細胞質(zhì)CD36在信號傳導中發(fā)揮著重要作用。亞洲和非洲人口中CD36的缺乏已被認為與胰島素抵抗有關(guān)。CD36(ClusterDeterminant36，決定簇36)的別名包括CD36[HUGO基因名稱]、GPlllb、GPIV、0KM5-抗原和PASIV。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在有動脈粥樣硬化斑塊的個體的體液樣本中或者在動脈粥樣硬化斑塊本身中，CD36的濃度升高與所述動脈粥樣硬化斑塊成為癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的增加的風險相關(guān)。因此，本發(fā)明涉及用于診斷、分類和監(jiān)測動脈粥樣硬化斑塊的方法，例如以便區(qū)別穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊和不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊。此外，本文提出，循環(huán)非細胞結(jié)合CD36蛋白(可溶性CD36，(sCD36))或其碎片或片段，可選地為脂蛋白復合物的一部分，可能是對血管中動脈粥樣硬化斑塊的有用的診斷或預(yù)測標記，尤其是在頸動脈或冠狀動脈中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD36在血漿和動脈粥樣硬化斑塊中的濃度隨著動脈粥樣硬化斑塊向癥狀性動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展而升高。因此，CD36濃度的升高可用作動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的標志。該方法可用于診斷個體發(fā)生本文所述的缺血性事件的風險，而且該方法還可用于對個體監(jiān)測一段時期，觀察動脈粥樣硬化斑塊是否在發(fā)展。因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種用于分類個體中的動脈粥樣硬化斑塊的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)禾n/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，分類所述動脈粥樣硬化斑塊。第二方面涉及一種用于診斷個體中動脈粥樣硬化斑塊的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述動脈粥樣硬化斑塊。本發(fā)明的第三方面涉及一種用于監(jiān)測個體中動脈粥樣硬化斑塊的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與之前在相同的個體中測量的CD36多肽或其部分的濃度和/或CD36編碼核酸分子或其部分的濃度相聯(lián)系，禾P/或iv)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及v)基于根據(jù)iii)和/或iv)的所述聯(lián)系，監(jiān)測所述動脈粥樣硬化斑塊的任何進展。本發(fā)明的第四方面涉及一種用于診斷個體處于具有和/或發(fā)生癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述個體是否處于具有和/或發(fā)生癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險中。本發(fā)明的進一步方面涉及一種用于診斷個體中動脈粥樣硬化斑塊的負荷的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述個體中動脈粥樣硬化斑塊的負荷。本發(fā)明的再進一步方面涉及一種用于診斷個體中由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述個體中由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的程度。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于確定個體治療方案的方法，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的程度和/或診斷個體具有和/或發(fā)生癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險，v)基于iv)的結(jié)果，確定對所述個體的治療方案。本發(fā)明的最后一個方面涉及一種用于本文所述方法的試劑盒，其中該試劑盒包括至少一個檢測單元?？梢岳斫獾氖牵摍z測單元為至少一種抗體，其中所述抗體是針對CD36多肽或其部分。此外，還應(yīng)理解的是，該檢測單元選自能夠檢測CD36編碼核酸分子的至少一種引物，至少一種探針和至少一種引物對。圖h對應(yīng)斑塊穩(wěn)定性的頸動脈粥樣硬化的患者血漿中的可溶性CD36(sCD36)。給出的數(shù)據(jù)作為自最后臨床癥狀開始的時間段的函數(shù)。頸動脈粥樣硬化是按照統(tǒng)一的標準通過腦前彩色雙功能超聲(1)和CT血管造影術(shù)(2)來診斷和分類。從檢査和血液取樣前的最后癥狀開始，與經(jīng)歷癥狀3-6個月(3-6mnd)或大于6個月(〉6mnd)的患者相比，經(jīng)歷臨床癥狀在2個月內(nèi)(〈2mnd)的患者的sCD36較高。N^患者個數(shù)，p-顯著性水平(Mann-WhitneyU檢驗)。血漿sCD36以相對單位被測量，即相對于常規(guī)醫(yī)院血液樣本中EDTA血漿而言。斑塊的臨床癥狀代表腦血管癥狀的出現(xiàn)。癥狀性動脈粥樣硬化斑塊是在狹窄頸內(nèi)動脈同側(cè)的中風、TIA(短暫性腦缺血發(fā)作)或一過性黑矇的患者中的斑塊。誤差線代表SEM。(1)GrantEG,BensonCB,MonetaGL等人，Carotidarterystenosis:gray-scaleandDopplerUSdiagnosis-SocietyofRadiologistsinMltrasoundConsensusConference,Radiology.2003;229:340-346(2)AndersonGB,AsforthR，SteinkeDE等人，CTangiographyforthedetectionandcharacterizationofcarotidarterybifurcationdisease.Stroke.2000;31:2168-2174。圖2:動脈粥樣硬化頸動脈狹窄患者中可溶性CD36(sCD36)的血漿水平。按照他們的最后臨床癥狀出現(xiàn)后的月數(shù)(mth)，將患者分組。最近2個月內(nèi)(空白條，n=16)，3-6個月(方塊線條，n=15)，或大于6個月(黑條，n=31)。*，p<0.02對2個月；#，p<0.02對2個月。圖3:頸動脈粥樣硬化患者血漿中的可溶性CD36(sCD36)。頸動脈狹窄是按照統(tǒng)一的標準通過腦前彩色雙功能超聲(1)和CT血管造影術(shù)(2)來診斷和分類。根據(jù)超聲分類將患者分為無回聲(Echolucent，EL)和強回聲(Echogenic，EG)。N、患者個數(shù)，p二顯著性水平(Mann-Whitney"檢驗)。血漿sCD36以相對單元被測量，即相對于常規(guī)醫(yī)院血液樣本的EDTA血漿而言。誤差線代表SEM。(1)GrantEG,BensonCB,MonetaGL等人，Carotidarterystenosis:gray-scaleandDopplerUSdiagnosis-SocietyofRadiologistsinMltrasoundConsensusConference,Radiology.2003;229:340-346(2)AndersonGB,AsforthR，SteinkeDE等人，CTangiographyforthedetectionandcharacterizationofcarotidarterybifurcationdisease.Stroke.2000;31:2168-2174。圖4:動脈粥樣硬化性頸動脈狹窄患者的可溶性CD36(sCD36)的水平?；趧用}粥樣硬化性頸動脈的超聲檢査后的回音強度，將患者分組。EL，無回聲斑塊(n=20);EG，強回聲/異質(zhì)性斑塊(n=39)(*)，p=0.09。圖5:根據(jù)患者是否在手術(shù)前的六個月經(jīng)歷過中風、TIA或一過性黑蒙，將動脈內(nèi)膜切除患者的頸內(nèi)動脈的動脈粥樣硬化斑塊分為兩組。根據(jù)腦血管癥狀的存在或不存在，將斑塊分別定性為有癥狀(n=3)或無癥狀(n=4)?？扇苄訡D36(sCD36)是在手術(shù)前那天抽出的血液樣本的血漿中測量。這些患者與頸動脈斑塊的基因表達譜圖分析(微陣列)中涉及的患者一致(表1)，例外的是來自其中一名患者的血液樣本丟失，從而沒有測量sCD36。N=患者個數(shù)。血漿sCD36是以相對單位被測量，即相對于常規(guī)醫(yī)院血液樣本的EDTA血漿而言。誤差線代表SEM。圖6:連續(xù)切片的代表性顯微照片，說明通過動脈內(nèi)膜切除術(shù)從不穩(wěn)定性疾病的患者除去的頸動脈粥樣硬化性病變中免疫染色的抗CD36(A)、抗鈣防衛(wèi)蛋白(B)和抗平滑肌肌動蛋白(C)。CD36免疫反應(yīng)性定位于如B組所見的眾多CD68-陽性巨噬細胞病變的部分富脂質(zhì)核心(*)。該核心之外未見免疫染色。在鄰近介質(zhì)(m)的區(qū)域看見最強的抗CD-36免疫染色。C組顯示介質(zhì)中的抗平滑肌肌動蛋白免疫染色。線比例尺100pm。發(fā)明詳細說明定義^^,J^存^^^"炎該術(shù)語是在它的傳統(tǒng)意義上被使用，即脂質(zhì)、細胞外物質(zhì)、炎癥介質(zhì)、炎癥細胞(即白細胞)、巨噬細胞和血管平滑肌細胞在動脈壁上的堆積。i^拔絲^^^r/參^^^"炎患有癥狀的個體中的動脈粥樣硬化斑塊，例如以同側(cè)中風、短暫性腦缺血發(fā)作或一過性黑蒙的形式。在過去的6個月或更長時間內(nèi)未經(jīng)歷癥狀性動脈粥樣硬化斑塊中提到的癥狀的個體中的動脈粥樣硬化斑塊。穩(wěn)定絲動嚴蕭摔^眾資免在6個月或更長的預(yù)定時間段內(nèi)未顯示出發(fā)展跡象的個體中的動脈粥樣硬化斑塊。^"穩(wěn)定絲^^^r/^^眾^"炎:顯示出發(fā)展跡象的個體中的動脈粥樣硬化斑塊。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語動脈粥樣硬化斑塊是在動脈壁上的堆積和膨脹，在此膨脹是由例如，巨噬細胞、細胞碎片、脂質(zhì)如膽固醇和脂肪酸、鈣和纖維結(jié)締組織引起。由此，在個體內(nèi)動脈粥樣化發(fā)展的進程被稱為動脈粥樣硬化形成，而該疾病進程的總的結(jié)果被稱為動脈粥樣硬化癥。因此，術(shù)語動脈粥樣斑塊可與本發(fā)明中的動脈粥樣硬化斑塊交換使用。術(shù)語"CD36編碼核酸分子"是指編碼CD36基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。珍^f:本文使用的診斷指技術(shù)人員通過其能估計和/或確定患者是否經(jīng)受給定疾病或情況的方法。該技術(shù)人員通?；谝粋€或多個診斷指標做出診斷，即標記的量或濃度，或標記的量的變化，其是該情況的存在、嚴重性或不存在的標志。本文所用的術(shù)語"/^^^""指將一患者中標記的存在或該標記的量與經(jīng)受給定條件或有經(jīng)受給定條件的危險的患者中它的存在或其量作比較，或者與己知免受給定條件的人中它的存在或其量作比較。如上所討論，可將患者樣本中的標記水平與和特定診斷相關(guān)的已知水平作比較。該樣本的標記水平被認為與診斷相關(guān)；也就是說，技術(shù)人員可以利用該標記水平確定患者是否經(jīng)受特定類型的診斷，并相應(yīng)地做出反應(yīng)?；蛘?，該樣本的標記水平可以與已知的和好結(jié)果(例如，沒有疾病等)相關(guān)的標記水平作比較。應(yīng)理解的是，本發(fā)明中的術(shù)語"標記"指CD36多肽和/或CD36編碼核酸分子。本文中使用的^^定珍4^指技術(shù)人員通過其能確定患者中特定疾病存在或不存在的方法。術(shù)語"診斷"并不表示以100%精確性確定特定疾病存在或不存在的能力。實際上，技術(shù)人員應(yīng)理解，術(shù)語"診斷"指某些疾病在主體內(nèi)存在的增加的可能性。在優(yōu)選的實施方式中，診斷顯示疾病是以約5%的增加的幾率存在，約10%的幾率，約15%的幾率，約20%的幾率，約25%的幾率，約30%的幾率，約40%的幾率，約50%的幾率，約60%的幾率，約75%的幾率，約90%的幾率，約95%的幾率。本文中的術(shù)語"約"指+/-2%。診斷、分類和監(jiān)測動脈粥樣硬化斑塊狀態(tài)本發(fā)明是基于患者的斑塊和血液樣本的分析，該患者已經(jīng)經(jīng)受或患有頸內(nèi)動脈狹窄，并通過頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)或置入支架的頸動脈血管成形術(shù)治療。基于患者樣本中CD36多肽和/或CD36編碼核酸分子的濃度的研究結(jié)果，本發(fā)明允許監(jiān)測向癥狀性斑塊的發(fā)展。導致動脈粥樣硬化斑塊從無癥狀向癥狀性發(fā)展的動脈粥樣硬化斑塊的去穩(wěn)定作用對診斷、分類和監(jiān)測是很重要的，因為去穩(wěn)定作用可以引起各種急性缺血性事件，例如中風、短暫性腦缺血發(fā)作和急性冠狀動脈綜合征。本發(fā)明涉及一種用于診斷、分類和監(jiān)測個體中動脈粥樣硬化斑塊的方法，以便預(yù)測和預(yù)防由該斑塊的去穩(wěn)定作用引起的急性缺血性事件。該方法可用于診斷、分類和監(jiān)測任意動脈中，尤其是頸動脈和冠狀動脈中的動脈粥樣硬化斑塊。它還是一種用于確定個體是否具有和/或發(fā)生癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險的方法。此外，本發(fā)明涉及一種通過測量CD36多肽或CD36核酸分子的濃度來確定動脈粥樣硬化斑塊負荷(即個體中斑塊的數(shù)量)的方法。本發(fā)明還涉及一種通過測量CD36多肽或CD36核酸分子的濃度來確定動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的程度的方法。此外，本發(fā)明涉及一種通過測量CD36多肽或CD36核酸分子的濃度來確定個體的治療方案的方法。因此，本發(fā)明一方面涉及一種用于分類個體中的動脈粥樣硬化斑塊的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度，和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，分類所述動脈粥樣硬化斑塊。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于診斷個體中動脈粥樣硬化斑塊的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度，禾口/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述動脈粥樣硬化斑塊。動脈粥樣硬化斑塊的分類和/或診斷包括確定是否無癥狀的斑塊是不穩(wěn)定的并具有更高的發(fā)展為癥狀性斑塊的危險。癥狀性斑塊可導致急性缺血性事件的發(fā)展。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)了CD36多肽和/或CD36編碼核酸分子與無癥狀斑塊轉(zhuǎn)為癥狀性斑塊的去穩(wěn)定作用之間的相互關(guān)系。因此，與標準水平相比，CD36多肽和/或CD36編碼核酸分子的濃度的升高預(yù)示著無癥狀斑塊發(fā)展為癥狀性斑塊的去穩(wěn)定作用。本發(fā)明的又一方面涉及一種用于監(jiān)測個體中動脈粥樣硬化斑塊的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度，和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與之前在相同的個體中測量的CD36多肽或其部分的濃度和/或CD36編碼核酸分子或其部分的濃度相聯(lián)系，禾n/或iv)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及v)基于根據(jù)iii)和/或iv)的所述聯(lián)系，監(jiān)測所述動脈粥樣硬化斑塊的任何進展。因此，監(jiān)測動脈粥樣硬化斑塊的去穩(wěn)定作用的進展也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，不管是個體中的無癥狀斑塊還是癥狀性斑塊。CD36多肽和/或CD36編碼核酸分子的濃度是如步驟i)或ii)中所述來確定，并與標準水平相聯(lián)系。該聯(lián)系的結(jié)果可以與在所述個體中其他時間點確定的CD36多肽和/或CD36編碼核酸分子的濃度相比較。通過監(jiān)測不同時間點個體中CD36多肽和/或CD36編碼核酸分子的濃度，可以跟蹤動脈粥樣硬化斑塊的去穩(wěn)定作用的發(fā)展。這種對個體的監(jiān)測可用于確定本文其他處所述的個體的治療方案。本發(fā)明的進一步方面涉及一種用于診斷個體處于具有和/或發(fā)生癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險中的方法，所述方法包括在來自所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度，和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述個體是否處于具有和/或發(fā)生癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險中。本發(fā)明的再進一步方面涉及一種用于診斷個體中動脈粥樣硬化斑塊的負荷的方法，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度，和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述個體中的動脈粥樣硬化斑塊的負荷。此外，本發(fā)明涉及一種用于診斷個體中由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的方法，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度，和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述個體中由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的程度。此外，本發(fā)明涉及一種用于確定個體的治療方案的方法，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度，和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的程度和/或診斷個體具有和/或獲得癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險，V)基于iv)的結(jié)果，確定對所述個體的治療方案。應(yīng)理解的是，該治療的效果可以隨后被監(jiān)測。本發(fā)明涉及機體所有類型的動脈中的動脈粥樣硬化斑塊，例如供給胳膊和腿的頸動脈、冠狀動脈、腎動脈。以下列出一些癥狀，其與動脈硬化癥和動脈粥樣硬化斑塊的去穩(wěn)定作用以及發(fā)展為癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的增大的危險性有關(guān)。狹窄是血管中不正常的變窄。血管型的狹窄常常與經(jīng)過狹窄血管的湍流產(chǎn)生的噪音(雜音)有關(guān)。這種雜音可通過聽診器聽到。然而，其他更精確的診斷方法包括超聲、磁共振成像/磁共振血管造影術(shù)，計算機斷層掃描/CT-血管造影術(shù)，其顯示解剖成像和/或流動現(xiàn)象。在本發(fā)明范圍內(nèi)的還包括與確定、分類、診斷、監(jiān)測冠心病(CHD)有關(guān)的方法，冠心病又稱為冠狀動脈疾病(CAD)、缺血性心臟病、動脈粥樣硬化性心臟病。冠心病是動脈粥樣硬化斑塊在為心肌供應(yīng)氧氣和營養(yǎng)的動脈壁內(nèi)積聚的最終結(jié)果。典型地，冠心病的癥狀只有在疾病的晚期狀態(tài)時才被注意到。患有冠心病的大多數(shù)個體，在該疾病發(fā)展時，好幾年甚至幾十年都未顯示出疾病的任何跡象，直到癥狀(常為"突發(fā)性"心臟病)的第一次發(fā)作出現(xiàn)。該疾病發(fā)展的原因常常是動脈粥樣硬化斑塊的破裂，該斑塊可破裂并開始限制血液流向心肌。急性心肌梗塞也是本發(fā)明涉及的一種情況，其通常也被稱為心臟病發(fā)作。急性心肌梗塞是涉及向心臟部分的血液供應(yīng)中斷的情況。該血液供應(yīng)的中斷常常是由內(nèi)動脈壁的動脈粥樣硬化斑塊的破裂引起。動脈粥樣硬化斑塊可阻塞血液在動脈中通過，其導致缺血或氧氣不足，引起心臟組織的損傷和潛在性死亡。處于具有和/或發(fā)生急性心肌梗塞危險中的個體通常的特征是危險因素的作用，例如血管疾病的既往病史，如動脈粥樣硬化冠心病和/或心絞痛，先前的心臟病發(fā)作或中風。心絞痛主要是由冠狀動脈疾病引起，由于心肌缺血從而缺氧氣供應(yīng)引起胸痛，其通常是由于冠狀動脈的阻塞或痙攣。因此，根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，本文中的方法和試劑盒也涉及確定個體是否處于具有/發(fā)生動脈粥樣硬化斑塊引起的心絞痛的危險中。頸動脈狹窄是頸動脈管腔的狹窄，通常是由動脈硬化癥引起。非嚴格的術(shù)語"頸動脈狹窄"在常見的醫(yī)療用途中指頸內(nèi)動脈近端部分的狹窄(在頸動脈球囊處)，因為這是迄今為止頸動脈內(nèi)狹窄的最常見的位置。頸動脈其他部分的狹窄也會發(fā)生。因此，在本發(fā)明上下文中，術(shù)語"頸動脈狹窄"涵蓋了頸動脈的至少一處的狹窄，并且尤其是頸內(nèi)動脈的近端部分的狹窄。動脈粥樣硬化頸動脈狹窄可能是無癥狀的或它可能通過大腦中腦血管或視網(wǎng)膜動脈的栓塞而引起癥狀。本文所用的術(shù)語"栓子"是在其傳統(tǒng)意義上使用，即在該事件中通過循環(huán)從身體的一個部位遷移并引起身體另一部位中血管阻塞的栓塞物(目標物)。腦動脈的栓子引起短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)或腦血管意外(CVA)。視網(wǎng)膜的栓子導致一過性黑蒙或視網(wǎng)膜梗塞。頸動脈狹窄的診斷通常是通過頸動脈的彩色流動雙功能超聲掃描來確定。該測試具有中度敏感性和特異性，并產(chǎn)生許多假陽性結(jié)果。本發(fā)明的方法和試劑盒還涉及短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)，其通常被稱為"小中風"。TIA是由腦部受限制區(qū)域的血流供給的暫時性障礙引起。腦部的血液供給障礙常常導致短暫的神經(jīng)功能障礙，其通常持續(xù)小于24小時。與TIA相關(guān)的癥狀差別很大，取決于受TIA影響的腦部區(qū)域。經(jīng)常遇到的癥狀包括視力的暫時喪失(典型地為一過性黑蒙)；言語困難(失語癥)；身體一側(cè)無力(輕偏癱)；以及通常在身體的一側(cè)的麻木或刺痛(皮膚感覺異常)。意識的減弱是非常少見的。如果神經(jīng)系統(tǒng)癥狀持續(xù)超過24小時，則它被歸類為腦血管意外或中風。中風或腦血管意外(CVA)的臨床特征是由于腦部血液供給障礙導致腦功能喪失的迅速發(fā)展。這種障礙可能是由于血栓或栓塞引起的血液供給缺少(局部缺血)，或者是由于出血。中風的傳統(tǒng)定義是"腦血管的神經(jīng)功能缺損持續(xù)超過24小時或在24小時內(nèi)因死亡中斷"。在本發(fā)明中，所述方法和試劑盒涉及由動脈粥樣硬化斑塊引起的中風，該斑塊引起腦部的血液供給障礙。先前的中風或短暫性腦缺血發(fā)作是典型的中風的危險因素。CD36就本發(fā)明而言，短語中使用的術(shù)語"CD36"，例如"循環(huán)性CD36"或"非細胞結(jié)合CD36"和權(quán)利要求中使用的術(shù)語"CD36"包括由抗CD36的特異性抗體識別的CD36蛋白或其片段，如sc5522、sc9154和sc7309。這包括全長CD36蛋白、多肽或其肽片段，以及包括其脂蛋白的高分子量血漿片段復合物中存在的該蛋白質(zhì)或其片段，所有這些都優(yōu)選地是可溶性的(sCD36)。術(shù)語"循環(huán)性CD36"和"可溶性CD36"在本文中可作為同義詞使用。循環(huán)性CD36可從細胞膜穴樣內(nèi)陷(caveolae)中分泌出來，或者是微粒的一部分，該微粒包括源于細胞膜穴樣內(nèi)陷膜的膜部分，細胞膜穴樣內(nèi)陷膜從細胞膜釋放出來并存在于血液循環(huán)中。在這方面，所關(guān)注的細胞膜穴樣內(nèi)陷可存在于細胞的細胞膜中，如脂肪細胞、巨噬細胞、單核細胞和凝血細胞。CD36是471個氨基酸的跨膜蛋白(在氨基酸殘基位置439-460和可能在7-28具有1或2個跨膜區(qū))。CD36是帶有棕櫚基結(jié)合位點的高度糖基化的88kDa糖蛋白。CD36存在于細胞膜穴樣內(nèi)陷中，在此它在調(diào)節(jié)細胞的膽固醇進出細胞的運動中發(fā)揮作用。CD36作為其中成員的分子家族CD36—〉SR-B類一>宿主防御清道夫受體一>清道夫受體超家族CD36的分子結(jié)構(gòu)471個氨基酸殘基；跨膜區(qū)(殘基439-465)和438氨基酸氨基末端區(qū)域可完全在細胞外，或可在該氨基末端附近具有第二潛在的跨膜區(qū)；短的細胞質(zhì)尾(殘基466-471);在細胞外區(qū)域留有一疏水區(qū)域，其可能與外部細胞膜有關(guān)聯(lián)(殘基184-204)據(jù)報導CD36的分子量取決于如下所示的細胞類型血小板88kDa/113kDa胎兒紅細胞78kDa乳腺上皮細胞85kDa紅白血病細胞88kDa,85kDa,57kDa8HeLa細胞85(160)kDa85kDa真皮微血管內(nèi)皮細胞80-90kDa在CD36的轉(zhuǎn)錄后修飾中，已鑒別出兩種可選擇的CD36mRNA形式。第一種mRNA類型是在HEL細胞中表達，并省略氨基酸殘基41-143。第二種mRNA類型還未被翻譯出，但其中末尾的89個氨基酸殘基被省略。因此，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD36的形式，其中開放閱讀框分別是90-1708和357-1775。CD36的翻譯后修飾CD36被稱為重度糖化，在胞外部分帶有10個N-連接的糖基化位點。糖基化作用被提出以討論它的對蛋白裂解的抗性；蘇氨酸92已經(jīng)顯示是磷酸化的；CD36也在N-和C-末端細胞質(zhì)尾上被棕櫚?；?。調(diào)節(jié)CD36分子的轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)和DNA成分Oct-2:在B細胞分化期間顯示由Oct-2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的第一基因；PEBP2:PEBP2/CBF轉(zhuǎn)錄因子可能對單核細胞中CD36的組成型表達很重要；CBF:PEBP2/CBF轉(zhuǎn)錄因子可能對單核細胞中CD36的組成型表達很重要。CD36的底物是未知的。有可能CD36調(diào)節(jié)殘基Thr92的自動磷酸化。修飾CD36的酶是未知的。有可能Thr92是被胞外蘇氨酸激酶磷酸化。細胞內(nèi)信號可能與Fyn、Lyn和Yes的磷酸化作用有關(guān)，但細胞質(zhì)尾與這些PTK相互作用的方式是未知的。CD36的主要細胞表達CD36在紅系細胞發(fā)展的階段是在血小板、成熟的單核細胞和巨噬細胞、微血管內(nèi)皮細胞、乳腺血管內(nèi)皮細胞上表達，以及在一些巨噬細胞產(chǎn)生的樹突狀細胞、肌肉細胞、肝細胞和脂肪細胞上表達。由CD36結(jié)扎調(diào)節(jié)的生理活動仍然是未知的。高達50%的氧化型LDL是通過CD36被攝取，由此CD36似乎是一種重要的清道夫受體。然而，鑒于在CD36缺乏患者中疾病狀態(tài)的明顯缺乏，其他機制似乎也能彌補它的缺乏。CD36序列根據(jù)本發(fā)明方法的CD36多肽和/或CD36核酸分子優(yōu)選地具有以下所示的序列之一。此外，核酸分子可以是與如下所示的序列的一種或多種互補的RNA核酸GeneSymbolCD36HGNCChromosomalLocation7ql1.2UniGeneIDBuildl91(2006年5月7日)Hs.l20949NCBI(全長)Hs.248425Hs.75613Hs.325823EntrezGene948EntrezgeneHGNC:1663HPRD:01430SwissProtP16671EMBL-EBIOMIM173510NCBI248310NCBI608404NCBI參考序列NP—000063.2NCBINP—001001547.1NCBINP—001001548.1NCBINM—000072NCBI畫001001547NCBINM001001548NCBI核苷酸序列(SEQIDNO.:1)NM—0010015482338bpmRNA線性PRI20-JAN-2008人類CD36分子(凝血酶敏感蛋白受體)(CD36)，轉(zhuǎn)錄變體l，mRNA。登錄號NM—001001548(版本號NM—001001548.1)起點Igaggactgcagtgtaggactttcctgcagaataccatttgatcctattaagaattgtcca1aatgttggagcatttgattgaaaaatccttcttagccatttt犯agatagctttccaatg:1attagacgaattgattctttctgtgactcatcagttcatttcctgtaaaattcatgtctt;1gctgttgatttgtgaataagaaccagagcttgtagaaaccactttaatcatatccaggagIItttgcaagaaacaggtgcttaacactaattcacctcctgaacaagaaaaatgggctgtgaIIccggaactgtgggctcatcgctggggctgtcattggtgctgtcctggctgtgtttggagg>1tattctaatgccagttggagacctgcttatccagaagacaattaaaaagcaagttgtcct:1cgaagaaggtacaattgcttttaaaaattgggttaaaacaggcacagaagtttacagaca:1gttttggatctttgatgtgcaaaatccacaggaagtgatgatgaacagcagcaacattcaLIagttaagcaaagaggtccttatacgtacagagttcgttttctagccaaggaaaatgtaac>1ccaggacgctgaggacaacacagtctctttcctgcagcccaatggtgccatcttcgaaccilttcactatcagttggaacagaggctgacaacttcacagttctcaatctggctgtggcagc!1tgcatcccatatctatcaaaatcaatttgttcaaatgatcctcaattcacttattaacaagtcaaaatcttctatgttccaagtcagaactttgagagaactgttatggggctatagggatccatttttgagtttggttccgtaccctgttactaccacagttggtctgttttatccttacaacaatactgcagatggagtttataaagttttcaatggaaaagataacataagtaaagttgccataatcgacacatataaaggtaaaaggaatctgtcctattgggaaagtcactgcga:1catgattaatggtacagatgcagcctcatttccaccttttgttgagaaaagccaggtatt;1gcagttcttttcttctgatatttgcaggtcaatctatgctgtatttgaatccgacgttaatctgaaaggaatccctgtgtatagatttgttcttccatccaaggcctttgcctctccagt>1tgaaaacccagacaactattgtttctgcacagaaaaaattatctcaaaaaattgtacatc;1atatggtgtgctagacatcagcaaatgcaaagaagggagacctgtgtacatttcacttcc1tcattttctgtatgcaagtcctgatgtttcagaacctattgatggattaaacccaaatga;1agaagaacataggacatacttggatattgaacctataactggattcactttacaatttgc[1aaaacggctgcaggtcaacctattggtcaagccatcagaaaaaattcaagtattaaagaaIItctgaagaggaactatattgtgcctattctttggcttaatgagactgggaccattggtga'1tgagaaggcaaacatgttcagaagtcaagtaactggaaaaataaacctccttggcctgat:1agaaatgatcttactcagtgttggtgtggtgatgtttgttgcttttatgatttcatattg;1tgcatgcagatcgaaaacaataaaataaacctggctcaagcacaaaccaatttgtgttgttctgattcaataattggtttctgggtggccaattcagaagaagagtgtacatgctcaaca>1aatcctaggccctgcattcctgtcatcctcatccgggggaaacaccatcatcccagtagciltgccctattcaactgcaacagtctccaggaccatcagtatactgcatttcatgtgcacca:1aatattttgaaagacatttataaataattggcttatgactcatatttctctatgaatacc;1ttcatacagcaggtataactcttttctttatgggcttaaatattttgtcactgatcctgcaaatggacatcattttagcacactagcggtttatattttaaggaccttcattctctgttc>1tgcacctcttctggaaattgagtaaattttgct鍾ttttttactcagttgcaactta>1cgcttggcatcttcagaatgcttttctagcattaagagatgtaaatgataaaggaattat1tgtatgaaatattacaaagcgtagactatgcattgttattcattataatattttttgctg1tcataatcgcctcataaagacaggtttcaaccattoaaatatgttcttccttaaaaaa登錄號NM—000072(版本號NM—000072.2)(SEOIDNO.:2)NM—0000721983bpmRNA線性PRI20-JAN-2008定義人類CD36分子(凝血酶敏感蛋白受體)(CD36)，轉(zhuǎn)錄變體3，mRNA-起點1gaggactgcagtgtaggactttcctgcagaataccatttgatcctattaagaattgtcca61aatgttggagcatttgattgaaaaatccttcttagccattttaaagatagctttccaatg121attagacgaattgattctttctgtgactcatcagttcatttcctgtaaaattcatgtctt181gctgttgatttgtgaataagaaccagagcttgtagaaaccactttaatcatatccaggag241tttgcaagaaacaggtgcttaacactaattcacctcctgaacaagaaaaatgggctgtga301ccggaactgtgggctcatcgctggggctgtcattggtgctgtcctggctgtgtttggagg361tattctaatgccagttggagacctgcttatccagaagacaattaaaaagcaagttgtcct421cgaagaaggtacaattgcttttaaaaattgggttaaaacaggcacagaagtttacagaca481gttttggatctttgatgtgcaaaatccacaggaagtgatgatgaacagcagcaacattca541agttaagcaaagaggtccttatacgtacagagttcgttttctagccaaggaaaatgtaac601ccaggacgctgaggacaacacagtctctttcctgcagcccaatggtgccatcttcgaacc661ttcactatcagttggaacagaggctgacaacttcacagttctcaatctggctgtggcagc721tgcatcccatatctatcaaaatcaatttgttcaaatgatcctcaattcacttattaacaa781gtcaaaatcttctatgttccaagtcagaactttgagagaactgttatggggctataggga841tccatttttgagtttggttccgtaccctgttactaccacagttggtctgttttatcctta901caacaatactgcagatggagtttataaagttttcaatggaaaagataacataagtaaagt961tgccataatcgacacatataaaggtaaaaggaatctgtcctattgggaaagtcactgcga1021catgattaatggtacagatgcagcctcatttccaccttttgttgagaaaagccaggtatt1081gcagttcttttcttctgatatttgcaggtcaatctatgctgtatttgaatccgacgttaa1141tctgaaaggaatccctgtgtatagatttgttcttccatccaaggcctttgcctctccagt1201tg犯犯cccagac犯ct3ttgtttctgc3c3ga犯犯attatctc犯犯3attgt3catc1261atatggtgtgctagacatcagcaaatgcaaagaagggagacctgtgtacatttcacttcc1321tcattttctgtatgcaagtcctgatgtftcagaacctattgatggattaaacccaaatga1381agaagaacataggacatacttggatattgaacctataactggattcactttacaatttgc1441aaaacggctgcaggtcaacctattggtcaagccatcagaaaaaattcaagtattaaagaa1501tctgaagaggaactatattgtgcctattctttggcttaatgagactgggaccattggtga1561tgagaaggcaaacatgtfcagaagtcaagtaactggaaaaataaacctccttggcctgat1621agaaatgatcttactcagtgttggtgtggtgatgtttgttgcttttatgatttcatattg1681tgc3tgc嗎3tcg犯犯caat33aata敏犯gtatgtacca犯犯at3ttgcttc犯ta1741atattagcttatatattacttgttttcactttatcaaagagaagttacatattaggccat1801atatatttctagacatgtctagccactgatcatttttaaatataggtaaataaacctata1861aatattatcacgcagatcactaaagtatatctttaattctgggagaaatgagataaaaga1921tgtacttgtgaccattgtaacaatagcacaaataaagcacttgtgccaaagttgtccaaa登錄號NM—01001547(版本號NM—01001547.1)(SEQIDNO.:3)NM—0010015472050bpmRNA線性PRI20-JAN-2008人類CD36分子(凝血酶敏感蛋白受體)(CD36),轉(zhuǎn)錄變體2，mRNAc起點Iagatgtcaggataaccttaaggatagatgaagggttgagagcctgtgcctcatttctgag>1ttctcagctgctatgccgtggaaatcctgtttactttctgcatctgctcctgcaagactc:1tggagccagtcttgaggtcctacatctccgaaagcaagctcttctagaagttgatagctt;1tccaatgattagacgaattgattctttctgtgactcatcagttcatttcctgtaaaattc[1atgtcttgctgttgatttgtgaataagaaccagagcttgtagaaaccactttaatcatatIIccaggagtttgcaagaaacaggtgcttaacactaattcacctcctgaacaagaaaaatgg>1gctgtgaccggaactgtgggctcatcgctggggctgtcattggtgctgtcctggctgtgt:1ttggaggtattctaatgccagttggagacctgcttatccagaagacaattaaaaagcaag;1ttgtcctcgaagaaggtacaattgcttttaaaaattgggttaaaacaggcacagaagtttacagacagttttggatctttgatgtgcaaaatccacaggaagtgatgatgaacagcagca>1acattcaagttaagcaaagaggtccttatacgtacagagttcgttttctagccaaggaaailatgtaacccaggacgctgaggacaacacagtctctttcctgcagcccaatggtgccatct11tcgaaccttcactatcagttggaacagaggctgacaacttcacagttctcaatctggctg11tggcagctgcatcccatatctatcaaaatcaatttgttcaaatgatcctcaattcactta841ttaacaagtcaaaatcttctatgttccaagtcagaactttgagagaactgttatggggct901atagggatccat加gagtttggttccgtaccctgttactaccacagttggtctgtttt961atccttacaacaatactgcagatggagtttataaagttttcaatggaaaagataacataa1021gtaaagttgccataatcgacacatataaaggtaaaaggaatctgtcctattgggaaagtc1081actgcgacatgattaatggtacagatgcagcctcatttccaccttttgttgagaaaagcc1141aggtattgcagttcttttcttctgatatttgcaggtcaatctatgctgtatttgaatccg1201acgttaatctgaaaggaatccctgtgtatagatttgttcttccatccaaggcctttgcct1261ctccagttgaaaacccagacaactattgtttctgcacagaaaaaattatctcaaaaaatt1321gtacatcatatggtgtgctagacatcagcaaatgcaaagaagggagacctgtgtacattt1381cacttcctcattttctgtatgcaagtcctgatgtttcagaacctattgatggattaaacc1441caaatga卿卿acat3ggacatacttgg3tattg犯cct3t犯ctggattcacttoc1501aatttgcaaaacggctgcaggtcaacctattggtcaagccatcagaaaaaattcaagtat1561taaagaatctgaagaggaactatattgtgcctattctttggcttaatgagactgggacca1621ttggtgatgagaaggcaaacatgttcagaagtcaagtaactggaaaaataaacctccttg1681gcctgatagaaatgatcttactcagtgttggtgtggtgatgtttgttgcttttatgattt1741catattgtgcatgcagatcgaaaacaataaaataagtaagtatgtaccaaaaaatattgc1801ttcaataatattagcttatatattacttgttttcactttatcaaagagaagttacatatt1861aggccatatatatttctagacatgtctagccactgatcatttttaaatataggtaaataa1921acctataaatattatcacgcagatcactaaagtatatctttaattctgggagaaatgaga1981taaaagatgtacttgtgaccattgtaacaatagcacaaataaagcacttgtgccaaagtt2041gtcc3a犯a3蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.:4)登錄號NP—01001548(版本號NP—001001548.1)起點1mgcdmcgliagavigavlavfggilmpvgdlliqktikkqvvleegtiafknwvktgte61vyrqfWifdvqnpqevmmnssniqvkqrgpytyrvrflakenvtqdaedntvsflqpnga121ifepslsvgteadnftvlnlavaaashiyqnqfVqmilnslinkskssmfqvrtlrellw181gyrdpflslvpypvtttvglfypynntadgvykvfngkdniskvaiidtykgkmlsywe241shcdmingtdaasf^pfVeksqvlqffssdicrsiyavfesdvnlkgipvyrfvlpskaf301aspvenpdnycfctekiisknctsygvldiskckegrpvyislphflyaspdvsepidgl361npneeehrtyldiepitgftlqfakrlqvnllvkpsekiqvlknlkmyivpilwlnetg421tigdekanmfrsqvtgkinllgliemillsvgvvmfvafmisycacrsktik(SEQIDNO.:5)mgcdrncgliagavigavlavfgg工lmpvgDIjIj工QKTIKKqvvleegtiafknwvktgtevy:rqfwifdvqnpqevmmnssniqvkqrgpytyrvrflakenvtqdaedntvsflqpngaifepslsvgteadnftvlnlavaaashiyqnqfvqmilnslinkskssmfqvrtlrellwgyrdpflslvpypvtttvglfypynntadgvykvfngkdniskvaiidtykgkrnlsyweshcdmingtdaasfppfveksqvlqffssdicrsiyavfesdvnlkgipvyrfvlpskafasp-VENPDNYCFCTEK工工SKKTCTSYGVLDISKCKEGRPVYISIjPHFJLYASPDVSEPIDGIjNPNEEE-HRTYLDIEPITGFTLQFAKRIjQVNIiLiVKPSEKIQVLKNLKRNY工VP工LrWLNETGTIGDEKANMFRSQVTGKINLIjGIj工EM工IASVGVVMFVAFMISYCACRSKT工K登錄號NP—000063(版本號NP—000063.2)(SEQIDNO.:6)起點1mgcdmcgliagavigavlavfggilmpvgdlliqktikkqvvleegtiafknwvktgte61vyrqfwifdvqnpqevmmnssniqvkqrgpytyrvrflakenvtqdaedntvsflqpnga121ifepslsvgteadnftvlnlavaaashiyqnqfVqmilnslinkskssmfqvrtlrellw181gyrdpflslvpypvtttvglfypynntadgvykvfngkdniskvaiidtykgkrnlsywe241shcdmingtdaasQpfVeksqvlqffssdicrsiyavfesdvnlkgipvyrfVlpskaf301aspvenpdnycfctekiisknctsygvldiskckegrpvyislphflyaspdvsepidgl361npneeehrtyldiepitgftlqfakrlqvnllvkpsekiqvlknlkmyivpilwlnetg421tigdekanmfrsqvtgkinllgliemillsvgvvmfVafmisycacrsktik(SEQIDNO.:7)mgcdrncgl工agavigavlavfggilmpvgdll耶t工kkqwleegt工afknwvktgtevyrqfwifdvqnpqevmmnssniqvkqrgpytyrvrflakenvtqdaedntvsflqpnga工FEPSIjSVGTEADNFTVLNLiAVAAASHIYQNQFVQM工!LNSLINKSKSSMFQVRTLREl)LWgyrdpf;lslvpypvtttvglfypynntadgvykvfngkdn工skva:e:edtykgkrnlsyweshcdmingtdaasfppfveksqvlqffssdicrsiyavfesdvnlkgipvyrfvlpskafasp-venpdnycfctek工工sknctsygvldiskckegrpvyislphflyaspdvsep工dglnpneee-hrtyldiepitgftlqfakrlqvnllvkpsekiqvlknlkrny工vpilwlnetgtigdekanmfrsqvtgk工nl]lgi)工em工liisvgvvmfvafmisycacrsktik登錄號NP—001001547(版本號NP_001001547.1)(SEQIDNO.:8)起點1mgcdmcgliagavigavlavfggilmpvgdlliqktikkqvvleegtiafknwvktgte61vyrqfwifdvqnpqevmmnssniqvkqrgpytyrvrflakenvtqdaedntvsflqpnga121ifepslsvgteadnftvlnlavaaashiyqnqfVqmilnslinkskssmfqvrtlrellw181gyrdpflslvpypvtttvglfypynntadgvykvfngkdniskvaiidtykgkrnlsywe241shcdmingtdaasfj)pfveksqvlqffssdicrsiyavfesdvnlkgipvyrfvlpskaf301aspvenpdnycfctekiisknctsygvldiskckegrpvyislphflyaspdvsepidgl361npneeehrtyldiepitgftlqfakrlqvnllvkpsekiqvlknlkrnyivpilwlnetg421tigdekanmfrsqvtgkinllgliemillsvgvvmfvafmisycacrsktik(SEQIDNO.:9)MGCDRNCGL工AGAVIGAVLAVYRQFW工FDVQNPQEVMMNSIFEPSLSVGTEADNFTVLNLGYRDPFIiSWPYPVTTTVGL)SHCDMINGTDAASFPPFVEKASPVENPDNYCFCTEKIISK.NPNEEEHRTYKDIEP工TGFTTIGDEKANMFRSQVTGKINLWGGIIjMPVGDIi!LIQKTIKKQWLEEGTIAFKNWVKTGTESNIQVKQRGPYTYRVRFLAK■ENVTQDAEDNTVSFLQPNGAAVAAASHIYQNQFVQM工LNSLINKSKSSMFQVRTLRELLWFYPYNNTADGVYKVFNGKDNISKVAIIDTYKGKRNLSYWESQVLQFFSSD工CRS工YAVFESDVKLKGIPVYRFVLPSKAFNCTSYGVLDISKCKEGRPVYISIiPHFLYASPDVSEPIDGL)IiQFAKKLQWIjIA/KPSEK工QVLKNLiKRNY工VP工IjWLNETGLGLIEMILLSVGVVMFVAFMISYCACRSKT工K序列同一性本文中功能等價體和變體可交換地使用。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，提供了CD36的變體及其片段的變體。當為多肽時，變體是基于與預(yù)定的氨基酸序列相比，它們的同一性或它們的同源性的程度來確定，所述預(yù)定的氨基酸序列是SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9中之一，當變體是片段時，分別為上述任意氨基酸序列的片段。因此，變體優(yōu)選地具有與預(yù)定的序列有至少91%的同一性，例如至少91%的序列同一性，例如至少92%的序列同一性，例如至少93%的序列同一性，例如至少94%的序列同一性，例如至少95%的序列同一性，例如至少96%的序列同一性，例如至少97%的序列同一性，例如至少98%的序列同一性，例如99%的序列同一性。以下術(shù)語用于描述兩種或多種多核苷酸之間的序列關(guān)系"預(yù)定的序列"、"比較窗"、"序列同一性"、"序列同一性的比例"和"基本同一性"。"預(yù)定的序列"是作為序列比較的基礎(chǔ)使用的定義序列；預(yù)定的序列可以是較大序列的子序列，例如作為全長DNA的一個片段，它的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，序列表中給出的基因序列，如SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的多核苷酸序列，或可包括完整的DNA或基因序列。通常，預(yù)定的序列為至少20個核苷酸的長度，常見地為至少25個核苷酸，并且經(jīng)常是至少50個核苷酸的長度。由于兩種多核苷酸可各自(1)包括與兩種多核苷酸之間相似的序列(即完整的多核苷酸序列的一部分)和(2)可進一步包括與兩種多核苷酸之間不同的序列，兩種(或多種)多核苷酸之間的序列比較典型地是通過在"對比窗"上比較這兩種多核苷酸的序列而形成，以識別并比較序列相似性的局部區(qū)域。本文使用的"比較窗"指至少20個連續(xù)核苷酸位置的概念性片段，其中多核苷酸序列可與至少20個連續(xù)核苷酸的預(yù)定的序列作比較，并且當與預(yù)定的序列(不包括增加或缺失)比較以便最佳排列兩個序列時，其中比較窗中的多核苷酸的部分可包括增加或缺失(即缺口)20%或更少。用于排列比較窗的序列的最佳排列可通過Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源算法；通過Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源排列算法；通過Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444的相似方法的探究；通過這些算法(威斯康星遺傳學軟件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison，Wis.)的計算機化的實現(xiàn)；或者通過檢察來進行；并且選擇出通過不同算法產(chǎn)生的最佳排列(即在比較窗上產(chǎn)生同源性的最高比例)。術(shù)語"序列同一性"意思是兩種多核苷酸序列在比較窗上是一致的(即在核苷酸-核苷酸連接的基礎(chǔ)上)。術(shù)語"序列同一性的比例"是通過以下來計算在比較窗上比較兩種最佳排列的序列；確定出現(xiàn)在兩個序列中的相同的核苷酸堿基的位置數(shù)目(例如A、T、C、G、U、或I)以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目；用匹配位置的數(shù)目除以比較窗中的位置的總數(shù)目(即窗口大小)；然后該結(jié)果乘以100以得到序列同一性的比例。本文使用的術(shù)語"基本同一性"指多核苷酸序列的特征，其中在至少20個核苷酸位置的比較窗上，常見地在至少25-50個核苷酸的比較窗上與預(yù)定的序列比較，該多核苷酸包括有至少85%序列同一性的序列，優(yōu)選地至少90-95%序列同一性，更通常至少99%序列同一性，其中該序列同一性的比例是通過比較預(yù)定序列和該多核苷酸序列而計算得到。該多核苷酸序列可包括比較窗上預(yù)定的序列的總的20%或更少的缺失或增加。該預(yù)定的序列可以是較大序列的子序列，例如作為本文所示的全長SEQIDNO:l、SEQIDNO:2禾口/或SEQIDNO:3多核苷酸序列的一部分。術(shù)語"轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物"在本文中是指基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，如RNA轉(zhuǎn)錄物，例如未拼接的RNA轉(zhuǎn)錄物、mRNA轉(zhuǎn)錄物和所述mRNA轉(zhuǎn)錄拼接產(chǎn)物，以及基因翻譯的產(chǎn)物，例如從任意基因mRNA轉(zhuǎn)錄物翻譯的多肽和所述多肽的翻譯后程序的各種產(chǎn)物，如多肽的翻譯后蛋白水解程序的產(chǎn)物或所述多肽的各種翻譯后修飾的產(chǎn)物。本文使用的術(shù)語"基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物"指含有與基因相同的序列信息的前信使RNA分子(前體mRNA)(雖然核苷酸U代替T),或成熟信使RNA分子(mRNA)，它是由于前體mRNA的拼接而產(chǎn)生的，并且是基因的遺傳信息翻譯成蛋白質(zhì)的模板。本文使用的術(shù)語"基因的翻譯產(chǎn)物"指由CD36基因編碼的蛋白質(zhì)。本文使用的術(shù)語"基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物"指由CD36編碼基因(SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3)編碼的轉(zhuǎn)錄物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，CD36的許多同工型(isoform)是己知的。同工型是有少許差異的蛋白質(zhì)的形式，通常是拼接變體或者是一些翻譯后修飾的產(chǎn)物。本發(fā)明涉及CD36的任意同工型。本文給出的例子并不意味著限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明涉及通過例如確定與SEQIDNO:l、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3或其部分的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對應(yīng)的至少一種CD36轉(zhuǎn)錄物的濃度，來分類、診斷和/或監(jiān)測個體中動脈粥樣硬化斑塊的方法。具體地，本發(fā)明涉及的方法包括確定CD36編碼核酸分子的濃度的步驟，CD36編碼核酸分子是下述CD36編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(i)本發(fā)明中與SEQIDNO:l、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3或其片段一致的核酸序列，(ii)與SEQIDNO:l、SEQIDNO:2和/或SEQIDNO:3或其片段具有至少90%同一性的核酸序列，(iii)與(i)或(ii)的任意序列互補的核酸序列。具體地，本發(fā)明涉及的方法包括確定CD36編碼核酸分子的濃度的步驟，CD36編碼核酸分子是CD36編碼基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物本發(fā)明還涉及的方法包括確定下述CD36多肽或其部分的濃度的步驟，在(i)變異蛋白，對應(yīng)于和SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9或其變體、或其片段一致的蛋白質(zhì)，(ii)多肽序列，與(i)的變異蛋白或其片段具有至少90%的同一性。因此，本發(fā)明的一種實施方式是將以上同一的變異蛋白和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于下述目的i)分類個體中的動脈粥樣硬化斑塊ii)診斷個體中的動脈粥樣硬化斑塊iii)監(jiān)測個體中的動脈粥樣硬化斑塊iv)診斷個體處于具有和/或獲得癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險中V)診斷個體中動脈粥樣硬化斑塊的負荷Vi)診斷個體中由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄，和/或Vii)確定個體的治療方案在一種實施方式中，序列同一性是通過利用CD36肽的片段來確定，其包括至少25個連續(xù)氨基酸并且具有的氨基酸序列與SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8或SEQIDNO:9具有至少80%，如85%、如90%、如95%、如99%的同一性，其中同一性比例是以威斯康星遺傳學軟件包7.0版中的算法GAP、BESTFIT或FASTA，利用缺省空位權(quán)重(defaultgapweight)確定。保守性氨基酸替換如下所示的氨基酸基團中的替換被視為保守性氨基酸替換。氨基酸的不同基團之間的替換被視為非保守性氨基酸替換。P、A、G、S、T(中性，弱疏水性)Q、N、E、D、B、Z(親水性，酸性胺)H、K、R(親水性，堿性)F、Y、W(疏水性，芳香性)L、I、V、M(疏水性)C(交聯(lián)成形)個體本發(fā)明涉及個體，例如任意性別或年齡的哺乳動物，尤其是人。該個體對于由本文所述的動脈粥樣硬化引起的疾病而言是無癥狀的。因此，本發(fā)明的個體可能永遠都不會患有任何與動脈粥樣硬化有關(guān)的疾病。然而，同樣屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，本發(fā)明的個體可能先前己經(jīng)患有與動脈粥樣硬化有關(guān)的疾病，但在施行本發(fā)明的方法的時候是無癥狀的。樣本根據(jù)本發(fā)明的樣本可以是體液樣本，尤其是無細胞血漿或血清樣本，或者30斑塊的組織樣本等。無細胞血漿可以在血液樣本離心后用顯微鏡驗證。離心導致血細胞與血漿分離。血液樣本在2,500至3000G范圍內(nèi)的離心將產(chǎn)生無細胞血漿。在一種實施方式中，樣本是外周靜脈血樣本。優(yōu)選的實施方式是無細胞樣本，優(yōu)選地為無細胞血漿樣本。合適的血漿制劑可以是來自肝素-穩(wěn)定的血、檸檬酸穩(wěn)定的血或EDTA穩(wěn)定的血中的血漿。樣本可以是新鮮的或冷凍的。例如，將樣本冷凍在-8(TC并且在確定CD36和/或CD36編碼核酸的濃度之前，解凍僅一次。在具體的實施方式中，本發(fā)明的樣本可以是動脈粥樣硬化斑塊的活組織切片(biopsy)。具體地，該活組織切片是來自頸動脈粥樣硬化斑塊。檢測方法核酸分子檢測方法在本發(fā)明上下文中，"核酸分子檢測方法"應(yīng)理解為基于DNA和/或RNA的檢測的分析方法，尤其是mRNA形式的RNA，并且尤其是如下所述的在高密度寡核苷酸微陣列上檢測。被檢測的序列尤其是以上披露的CD36序列。當檢測來自動脈粥樣硬化斑塊的組織樣本的CD36升高時，該核酸分子檢測方法尤其有用。然而，該核酸分子檢測方法還能用于測量CD36編碼核酸分子的濃度的升高。提供用于檢測mRNA的方法也是在本發(fā)明的一般范圍內(nèi)。該方法常常涉及樣本提取、PCR擴增、核酸分裂和標記、延伸反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法中的任意一種將核酸(或基因組DNA、RNA或mRNA)與樣本分離。一名技術(shù)人員將了解，如果要檢測基因的拷貝數(shù)目的改變，優(yōu)選分離基因組DNA。相反地，當要檢測基因(例如CD36編碼基因)的表達水平時，優(yōu)選地分離RNA(mRNA)。對于那些對全細胞或其他組織樣本進行分析的實施方式來說，在繼續(xù)進行各種樣本制備操作之前，從細胞或病毒中提取核酸通常是很有必要的。因此，在樣本收集后，核酸可以從收集的細胞、病毒外殼等被釋放，進入粗提取物中，接著經(jīng)額外處理以制備用于隨后操作的樣本，如污染(DNA結(jié)合)蛋白質(zhì)的變性、純化、過濾和脫鹽。核酸從樣本細胞中的釋放和DNA結(jié)合蛋白的變性通常可通過物理或化學方法完成。例如，化學方法通常采用細胞溶解劑來破壞細胞并從細胞中提取核酸，接著用離液鹽(chaotropicsalt，例如異硫氰酸胍或尿素)處理該提取物，以使任何污染的和潛在地干擾的蛋白質(zhì)變性?；蛘撸锢矸椒捎糜谔崛『怂岷褪笵NA結(jié)合蛋白變性(例如微型通道內(nèi)的物理突起或穿透細胞膜的尖銳邊緣的顆粒)，并提取它們的內(nèi)容物。這些結(jié)構(gòu)與用于攪拌的壓電元件的相結(jié)合能為溶解提供合適的剪切力。更多傳統(tǒng)的細胞提取的方法也可使用，例如，采用限制橫截面尺寸的通道，當樣本以足夠的流動壓力通過該通道時，導致細胞溶解。此外，細胞提取和污染蛋白質(zhì)的變性可通過給樣本施加交流電流來完成。更具體地，將細胞的樣本流經(jīng)微管列陣，同時將交流電流作用于流動流體上。將細胞進行超聲攪拌或迫使細胞通過微小孔隙，由此使細胞受高剪切應(yīng)力導致破裂，也是可能的提取方法。分離總mRNA的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。RNA可通過各種技術(shù)從生物樣本中分離出來。在一種實施方式中，總核酸是利用如酸胍-苯酚-氯仿提取方法從給定的樣本中提取，而mRNA是通過雜交方法用聚(dT)矩陣來分離，其通過例如寡核苷酸柱層析或通過利用(dT)n磁珠，結(jié)合mRNA的多聚腺苷酸3'-端(例如，參見Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第二版)，第1-3巻，ColdSpringHarborLaboratory,(1989)或者CurrentProtocolsinMolecjilarBiology,F.Ausubel等人編GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork(1987))。結(jié)合mRNA可以隨后被洗滌和從基質(zhì)上洗脫，并可選地沉淀。通過在無核糖核酸酶(RNAse)環(huán)境中用蛋白酶K處理和脫氧核糖核酸酶(DNAse)處理，接著用苯酚萃取并可選地在鹽的存在下用乙醇沉淀，可分離出細胞總RNA。例如，所述鹽為氯化鈉、乙酸鈉、氯化鋰或乙酸銨。樣本可來自組織和/或體液，如本文其他處限定的那樣。在分析該樣本之前，例如在寡核苷酸陣列上，通?？扇〉氖窃谠摌颖旧线M行一或多次樣本準備操作。典型地，這些樣本制備操作包括細胞內(nèi)物質(zhì)的提取(比如從全細胞樣本中提取核酸)等的處理、核酸的擴增、分裂、轉(zhuǎn)錄、標記和/或延伸反應(yīng)?？蓪⑦@些不同操作中的一種或多種隨時納入本發(fā)明中。提取之后，通常需要的是從粗提取物的其他成分(例如變性蛋白、細胞膜顆粒和鹽)中分離核酸。顆粒物質(zhì)的去除通常是通過過濾或絮凝來完成。而且，當使用化學變性方法時，可能需要在進入下一個步驟之前，脫去該樣本的鹽分。脫去樣本的鹽分和核酸的分離通?？梢徊酵瓿?，例如通過將核酸與固相結(jié)合并洗掉污染鹽，或?qū)颖具M行凝膠過濾色譜使鹽穿過透析膜。合適的用于核酸結(jié)合的固體載體包括，例如硅藻土或者硅土(即玻璃棉)。本領(lǐng)域中同樣熟知的合適的硅膠排除介質(zhì)可隨時納入本發(fā)明的裝置中，并且可在商業(yè)上獲得，例如獲自PharmaciaandSigmaChemical?；蛘?，脫鹽方法通常可利用與其它元素相比的DNA的高電泳遷移率和負性(negativity)。電泳方法也可用于從其他細胞污染物和碎片中提純核酸。當施加一個合適的電場時，樣本中存在的核酸將向正極遷移并被困在捕獲膜上。然后，通過施加適當?shù)牧黧w流將保留在膜之外的樣本雜質(zhì)洗掉。當逆轉(zhuǎn)電壓時，核酸以基本上較純的方式從膜上釋放。此外，也可將粗過濾器覆蓋在該屏障(barrier)上以避免該屏障被顆粒物質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸引起的任何污染，因此允許重復使用。在類似的方面，帶有負電荷的核酸的高電泳遷移率可用于分離核酸和污染物，通過利用凝膠短柱或其他合適的凝膠基質(zhì)，減慢或延緩其他污染物的流動，同時允許速度更快的核酸通過。本發(fā)明提供核酸親和基質(zhì)，其承載大量不同的核酸親和配體，容許從樣本中同時選擇和除去大量的預(yù)選核酸，還提供了生產(chǎn)這些親和基質(zhì)的方法。通常，該方法包括步驟a)提供核酸擴增模板陣列，該陣列包括一表面，其上附著具有不同核酸序列的至少50個寡核苷酸，并且其中各個不同的寡核苷酸是定位在所述表面的預(yù)定區(qū)域，所述寡核苷酸的密度大于約60個不同寡核苷酸每1平方厘米，并且所述不同寡核苷酸都具有相同的3'末端核酸序列和相同的5'末端核酸序列。b)擴增大量的所述寡核苷酸以提供擴增的核酸庫；和c)將該核酸庫附著到固體載體上。例如，核酸親和色譜是基于互補的單鏈核酸的趨勢，以通過互補的堿基配33對形成雙鏈或復式結(jié)構(gòu)。核酸(DNA或RNA)能容易地附著到固體載體(基質(zhì))上，在此它作為一種固定配體，其與接觸該固定配體的溶液中存在的互補核酸相互作用并形成雙鏈(duplex)。非結(jié)合組分可以從該結(jié)合復合物上被洗掉，以提供一種不含有與該親和柱結(jié)合的目標分子的溶液，或提供分離的目標分子本身。捕獲在雜化雙鏈中的核酸可以經(jīng)加熱、調(diào)節(jié)鹽濃度或利用去穩(wěn)定劑如甲酰胺、TWEEN.TM,20變性劑或十二垸基硫酸鈉(SDS)，通過變性從該親和基質(zhì)中分離和釋放。親和柱(基質(zhì))典型地是通過提供親和配體的單一種類，用于分離單一核酸。此外，承載單一親和配體的親和柱(例如oligodt柱)已被用于分離多種核酸，其中核酸都有著共同的序列(例如聚A)。使用的親和基質(zhì)的類型取決于分析的目的。例如，當需要分析復合核酸樣本中特定基因的mRNA表達水平(例如總mRNA)時，通常需要的是消除由基因產(chǎn)生的組成性地過度表達的核酸，并由此傾向于掩蓋在典型的較低水平表達的基因產(chǎn)物。因此，在一種實施方式中，親和基質(zhì)可以用于除去大量的預(yù)選定的基因產(chǎn)物(如肌動蛋白、GAPDH等)。這是通過提供承載與基因產(chǎn)物(例如mRNA或由此得到的核酸)互補的核酸親和配體的親和基質(zhì)來完成。核酸樣本和親和基質(zhì)的雜交將導致親和配體和它們的目標核酸之間的雙鏈構(gòu)造。當從親和基質(zhì)上洗脫樣本時，該基質(zhì)將保留雙鏈核酸，并脫去廢棄的過度表達的目標核酸的樣本。親和基質(zhì)還可用于識別樣本中未知的mRNA或cDNA。當親和基質(zhì)包含與樣本中各已知基因(例如，cDNA文庫中，從mRNA反轉(zhuǎn)錄的DNA、直接使用的或擴增的或從DNA模板中聚合的mRNA)互補的核酸時，被親和基質(zhì)捕獲的己知核酸離開富含那些未知的核酸序列的樣本。實際上，該親和基質(zhì)被用于實施差減雜交以分離未知的核酸序列。然后，留下的"未知"序列可根據(jù)標準方法被純化和測序。親和基質(zhì)還可用于捕獲(分離)從而純化未知的核酸序列。例如，可以制備包含核酸(親和配體)的親和基質(zhì)，該核酸(親和配體)與未事先確定的或者未事先知道其在特定核酸樣本中的表達的序列互補。然后，該樣本與親和基質(zhì)雜交，而保留在該親和基質(zhì)上的那些序列是"未知的"核酸。保留的核酸可以從基質(zhì)上被洗脫(例如，在增加的溫度、增加的去穩(wěn)定劑濃度或減少的鹽條件下)，然后該核酸可根據(jù)標準方法測序。類似地，親和基質(zhì)可用于有效地捕獲(分離)大量已知的核酸序列。再次制備基質(zhì)，該基質(zhì)載有與需要被分離的那些核酸互補的核酸。將該樣本在一定條件下接觸基質(zhì)，其中互補的核酸序列與基質(zhì)中的親和配體雜交。非雜交物質(zhì)被從該基質(zhì)上洗掉，離開所需要的序列結(jié)合。然后將該雜交雙鏈變性，提供一系列分離的核酸。隨后可根據(jù)標準方法分離該批中不同的核酸(例如凝膠電泳)。如上所述，親和基質(zhì)可用于選擇性地從含有核酸的實質(zhì)上任意樣本中除去核酸(例如，在cDNA文庫中，從mRNA反轉(zhuǎn)錄的DNA、直接使用的或擴增的或從DNA模板中聚合的mRNA等)。結(jié)合在柱上的核酸可通過用低鹽濃度緩沖劑洗滌來除去，該緩沖劑包含去穩(wěn)定劑，如甲酰胺；或通過提高柱溫來除去。在優(yōu)選的實施方式中，將親和基質(zhì)裝在圓柱的外套中。然后將樣本施加于該親和基質(zhì)(例如通過泵，如自動進樣器驅(qū)動的采樣泵，注入柱子上或加至柱子)。將載有樣本的親和基質(zhì)(例如親和柱)經(jīng)受一定條件，在該條件下，包括該親和基質(zhì)的核酸探針與互補的目標核酸進行特異性雜交。這些條件可通過保持合適的pH、鹽和溫度條件來實現(xiàn)，以促進如上討論的雜交。對于許多應(yīng)用來說，可能需要從細胞、細胞碎片或其他污染物中提取和分離信使RNA。因此，在一些情況下，本發(fā)明的裝置包括mRNA純化室或通道。通常，這種純化利用了mRNA上的聚-A尾。具體地并如上所述，聚-T寡核苷酸可被固定在裝置的腔室或通道內(nèi)，以作為mRNA的親和配體。聚-T寡核苷酸可被固定在該腔室或通道納入的固體載體上，或者可選擇地，可被固定在該腔室或通道本身的表面上。聚-T寡核苷酸在該腔室或通道的表面上的固定可通過本文所描述的方法完成，例如包括該表面的氧化和硅垸化，隨后為寡核苷酸的標準DMT合成。在操作中，將裂解的樣本引至高鹽溶液以增加雜交的離子強度，據(jù)此mRNA雜交至固定的聚-T。然后結(jié)合在固定的聚-T寡核苷酸上的mRNA在低離子強度的緩沖劑中被洗掉。該聚-T寡核苷酸可固定在多孔表面上，例如多3孔硅、分子篩硅凝膠、燒結(jié)顆?；蚱渌腆w載體。樣本制備之后，可將該樣本進行一種或多種不同的分析操作。通?？蛇M行各種分析操作，包括利用例如微毛細管電泳的基于大小的分析，和/或利用例如雜交至寡核苷酸陣列的基于序列的分析。在后一種情況下，可用寡核苷酸探針的陣列來探測核酸樣本。寡核苷酸陣列通常包括底物，其具有連接至該底物的大量位置不同的寡核苷酸探針。這些陣列可利用機械或光導合成方法來生產(chǎn)，其包括了光刻法和固相寡核苷酸合成方法的結(jié)合。用于寡核苷酸陣列的光導合成的基本策略如下用光敏保護基修飾的固體載體表面是通過光刻用掩模來照射，在照射區(qū)域產(chǎn)生反應(yīng)的羥基。然后，選定的核苷酸，典型地為3'-0-亞磷酰胺-活化的脫氧核苷(5'羥基用光敏保護基保護)，出現(xiàn)在該表面并耦合出現(xiàn)在暴露于光的位置。封蓋和氧化之后，將底物漂洗，并且通過第二掩模照射該表面以暴露額外的羥基以便耦合。第二選定的核苷酸(例如，5'-被保護的3'-0-亞磷酰胺-活化的脫氧核苷)出現(xiàn)在該表面。選擇性的脫保護和耦合循環(huán)被重復，直到獲得需要的產(chǎn)物。由于采用了光刻，該過程可易于小型化以產(chǎn)生高密度陣列的寡核苷酸探針。而且，寡核苷酸在各位點的序列是已知的。參見Pease等，除涉及用于流體脫保護的機械引導和合成步驟的增加以外，機械合成方法與光導方法類似。對于一些實施方式，可制備具有所有可能的給定長度探針的寡核苷酸陣列。該陣列上的靶序列的雜交模式可用于重建該目標DNA序列。大量探針的雜化分析可用于測序DNA的長的延伸或提供寡核苷酸陣列，該寡核苷酸陣列是特異性的并與特定的核酸序列互補。例如，在特別優(yōu)選的實施方式中，寡核苷酸陣列將包含寡核苷酸探針，其互補于特定的靶序列以及這些序列的個別或多重突變。這些陣列在特異性疾病的診斷中尤其有用，這些疾病是以特定核酸序列的出現(xiàn)為特征。樣本收集和核酸提取之后，典型地將該樣本的核酸部分進行一個或多個制備反應(yīng)。這些制備反應(yīng)包括體外轉(zhuǎn)錄、標記、分裂、擴增和其他反應(yīng)。核酸擴增增大了所關(guān)注的目標核酸序列的拷貝數(shù)目。各種擴增方法都適合用于本發(fā)明的方法和裝置，包括例如，聚合酶鏈反應(yīng)方法(或)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，自我持續(xù)序列復制(3SR)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)。后兩種擴增方法包括基于等溫轉(zhuǎn)錄的等溫反應(yīng)，其生成單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈DNA(dsDNA)，擴增產(chǎn)物分別為約30或100比1的比例。因此，當采用這后兩種方法時，序列分析可利用任一種類型的底物來完成，即與DNA或RNA互補的。常見地，需要在雜交之前擴增核酸樣本。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，任何擴增方法都可使用，如果定量結(jié)果是人們需要的，則必須注意使用一種保持或控制擴增核酸的相對頻率的方法。"定量"擴增的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。例如，定量PCR包括用相同的引物同時地共同擴增已知數(shù)量的控制序列。這就設(shè)置了可用于校準該PCR反應(yīng)的內(nèi)部標準。然后該高密度陣列可包括專門針對該內(nèi)部標準的探針，用于該擴增核酸的定量。因此，在一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種優(yōu)化探針組用于檢測特定基因的方法。通常，該方法包括提供一高密度陣列，其包含與目標基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的子序列互補的一種或多種特定長度的許多探針。在一種實施方式中，該高密度陣列可包含與特定mRNA互補的各個特定長度的探針。然后該高密度陣列的探針與它們的目標核酸單獨地雜交，然后與高復合性、高密度核酸樣本雜交，該核酸樣本不包含與探針互補的目標物。因此，例如當目標核酸為RNA時，該探針首先與它們的目標核酸單獨地雜交，然后與由cDNA文庫(如反轉(zhuǎn)錄聚A+mRNA)制成的RNA雜交，其中雜交的RNA的意義(sense)與目標核酸的意義是相對的(以保證該高復合性的樣本不包含該探針的目標物)。那些探針顯示出與它們的目標物的強烈的雜交信號，而與高復雜性樣本很少或沒有交叉雜交，它們是用于本發(fā)明的高密度陣列的優(yōu)選的探針。PCR擴增通常包括用目標核酸的一條鏈作為模板，用于生成該序列的大量的互補物。通常，與目標序列的互補鏈片段的不同末端互補的兩個引物序列與它們各自目標序列的鏈雜交，并且在聚合酶和三磷酸核苷的存在下，該引物沿著目標序列延伸。延伸物從目標序列中融解，并重復該過程，這次是用之前步驟合成的目標序列的額外拷貝。PCR擴增典型地包括變性、雜交和延伸反應(yīng)的重復循環(huán)，以生成足夠量的目標核酸。PCR各循環(huán)的第一步包括經(jīng)引物37延伸形成的核酸雙鏈的分離。一旦該鏈被分離，PCR中的下一歩包括將該分離的鏈與從側(cè)面攻擊該目標序列的引物雜交。然后將該引物延伸以形成目標鏈的互補拷貝。為了PCR擴增成功，設(shè)計該引物使得各引物沿著雙鏈序列雜交的位置就是由一個引物合成延伸產(chǎn)物的位置，當與模板(互補的)分開時，其作為用于其他引物延伸的模板。變性、雜交和延伸的循環(huán)被重復必要的很多次，以獲得所需要量的擴增核酸。在PCR方法中，鏈分離通常是通過加熱該反應(yīng)至足夠高的溫度、足夠長的時間來實現(xiàn)，以引起該雙鏈變性，但不引起聚合酶的不可逆的變性。典型的熱變性包括在幾秒至幾分鐘的范圍內(nèi)約80攝氏度至105攝氏度的溫度。然而，鏈分離可通過任意合適的變性方法來完成，包括物理、化學或酶的手段。例如，鏈分離可被解旋酶、或能夠表現(xiàn)出解旋酶活性的酶誘導。除PCR和IVT反應(yīng)外，本發(fā)明的方法和裝置還適用于許多其他反應(yīng)類型，例如反轉(zhuǎn)錄、切口平移等。通常，樣本中的核酸被標記以促進隨后步驟中的檢測。標記可在擴增、體外轉(zhuǎn)錄或缺口平移過程中完成。具體地，通過使用標記的引物或?qū)擞浀膁NTP納入擴增序列，擴增、體外轉(zhuǎn)錄或缺口平移可將標記納入擴增的或轉(zhuǎn)錄的序列。然后，檢測樣本核酸和陣列上的寡核苷酸探針之間的雜交，例如使用落射熒光顯微鏡。典型地，將樣本在雜交期間混合，以增強樣本中的核酸和陣列上核酸探針的雜交。在一些情況下，雜交的寡核苷酸可在雜交后被標記。例如，當生物素標記的dNTP被用于例如擴增或轉(zhuǎn)錄時，鏈親和素連接的信息基團可用于標記雜交的復合物。這種操作很容易被整合到本發(fā)明的系統(tǒng)中。此外，樣本中的核酸可在擴增后標記。擴增后標記典型地包括將特定的可檢測組共價連接到擴增序列上。合適的標記或可檢測組包括本領(lǐng)域所熟知的各種熒光的或放射性的標記基團。這些標記也可用本領(lǐng)域所熟知的方法與該序列耦合。檢測方法取決于所選擇的標記物。熒光標記物是優(yōu)選的，因為它極度敏感和簡單。標準的標記程序被用于確定序列和反應(yīng)物(reagent)之間的相互作用發(fā)生的位置。例如，如果目標序列被標記并暴露于不同探針的矩陣，只有那些探針與目標物相互作用的位置會顯示出一些信號。此外，其他方法也可用于掃描該矩陣以確定相互作用在哪發(fā)生。當然，通過重復掃描在各多重條件下發(fā)生的相互作用，相互作用的光譜可以短暫的方式被確定。然而，不是單獨地測試各個個體的相互作用，而是多重序列的相互作用可同時在矩陣上確定。檢測與高密度陣列探針雜交的標記的目標(樣本)核酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。因此，例如當使用比色標記物時，該標記物的簡單可見就足夠了。當使用放射性標記的探針時，輻射的檢測(例如用照相軟片或固態(tài)探測器)就是足夠的。然而，在優(yōu)選的實施方式中，目標核酸是用熒光標記物來標記的，且該標記物在探針陣列上的定位是用熒光顯微鏡完成的。雜交陣列是用光源在特定熒光標記的激發(fā)波長處激發(fā)，并檢測在發(fā)射波長產(chǎn)生的熒光。在特別優(yōu)選的實施方式中，激發(fā)光源是適于激發(fā)熒光標記的激光。目標多核苷酸可被任何的許多方便的檢測記號標記。熒光標記物是優(yōu)選的，因為它以弱的背景提供非常強的信號。在高分辨率和靈敏度下通過快速掃描程序，它還可光學探測。其他潛在的標記族包括放射性同位素、化學發(fā)光化合物、標記結(jié)合蛋白、重金屬原子、光譜標記、磁性標記和連接酶。用于標記的其他方法可繞開目標序列的任何標記。該目標物可暴露于探針中，并且雙鏈雜交僅在那些位置上形成。添加雙鏈雜交反應(yīng)物將檢測雜交在哪發(fā)生?？墒褂们度肴玖?，如溴化乙錠，只要探針自身不向它們自身折回在很大程度上形成發(fā)夾環(huán)。然而，短寡核苷酸探針中發(fā)夾環(huán)的長度將典型地足以形成穩(wěn)定的雙鏈。合適的色原體將包括分子和化合物，其在獨特的波長范圍內(nèi)吸收光以便可觀察到顏色，或當被特定波長或波長范圍的輻射照射時發(fā)射光，如熒光增白劑。膽素蛋白質(zhì)，如藻紅蛋白也可用作標記物。各種各樣合適的染料都可使用，主要是被選擇以提供強烈的顏色，而周圍環(huán)境的吸收最小。說明性的染料類型包括喹啉染料、三芳甲垸染料、吖啶染料、茜素染料、酞類、昆蟲染料、偶氮染料、蒽醌染料、菁染料、吩噻嗪染料和吩噁嗪染料。各種不同的熒光增白劑可單獨或與淬滅分子結(jié)合使用。所關(guān)注的熒光增白劑分成包括具有某些主要官能團的不同種類。這些主要官能團包括1-和2-氨基萘、p，p'-二氨基二苯乙烯、芘類、季菲啶鹽、9-氨基啶、p,p'-二氨基二苯甲酮亞胺、蒽類、氧碳菁、部花菁、3-氨基馬萘雌酮、茈類、雙苯并惡哇、雙-p-噁唑基苯、1,2-苯并吩嗪、視黃醇、雙-3-氨基吡啶鹽、嚏根草苷元、四環(huán)素、sterophenol、苯并咪唑基苯胺、2-羰基-3-色烯、吲哚、占噸、7-羥基香豆素、吩噁嗪類、水楊酸鹽、毒毛旋花苷元、卟啉類、三芳基甲垸類和核黃素。具有連接的官能團或者可被修飾以納入這些官能團的個別熒光化合物包括，例如丹磺酰氯、熒光素如3，6-二羥基-9-苯基占噸氫醇、羅丹明異硫氰酸酯、N-苯基-l-氨基-8-磺酸萘、N-苯基-2-氨基-6-磺酸萘、4-乙酰胺基-4-異硫氰酸根合-均二苯代乙烯-2，2'-二磺酸、芘-3-磺酸、2-甲苯氨基萘-6-磺酸酯、N-苯基-N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸酯、溴化乙錠、stebrine、金胺-0,2-(9'-蒽基)棕櫚酸酯、丹?；字Ｒ掖及?、N,N'-二(十八烷基)氧雜羰花青、部花青，4-(3'芘基)丁酸鹽、d-3-氨基脫氧馬萘雌酮、12-(9'-蒽基)硬脂酸鹽、2-甲基蒽、9-乙烯基蒽、2,2'-(乙烯撐-P-苯撐)-二苯并噁唑、p-雙[2-(4-甲基-5-苯基-噁唑基)]苯、6-二甲氨基-1,2-苯并吩嗪、視黃醇、雙(3'-氨基吡啶)l,10-癸二醇二碘化物、hellibrienin的磺基萘基腙、氯四環(huán)素、N-(7-二甲氨基-4-甲基-2-氧代-3-色烯基)馬來酰亞胺、N-[p-(2-苯并咪唑基)-苯基]馬來酰亞胺、N-(4-fluoranthyl)馬來酰亞胺、雙(高香草酸)、刃天青、4-氯-7-硝基-2，l，3-苯并二噁唑、部花菁540、試鹵靈、玫瑰紅、乙基2，4-二苯基-3(H)-呋喃酮。理想的是，熒光增白劑應(yīng)在高于約300nm處吸收光，優(yōu)選地約350nm，更優(yōu)選地高于約400nm，通常在比吸收光的波長高約10nm的波長處發(fā)射光。應(yīng)該注意的是，結(jié)合染料的吸收和發(fā)射特性可能與非結(jié)合染料不同。因此，當提到染料的不同波長范圍和特性時，意在說明使用的染料，而不是非結(jié)合的染料并以任意溶劑中為特性。熒光增白劑通常是優(yōu)選的，因為通過用光照射熒光增白劑，人們可以獲得多種放射。由此，單一的標記物能提供多種可測量的情況。檢測信號也可由化學發(fā)光源和生物發(fā)光源提供?；瘜W發(fā)光源包括被化學反應(yīng)電子激發(fā)，然后可發(fā)射光的化學物。該發(fā)射的光作為檢測信號或為熒光受體提供能源。己經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量不同家族的化合物在不同條件下提供化學發(fā)光?；衔锛易逯皇?,3-二氫-1，-4-二氮雜萘二酮。最受歡迎的化合物是5-氨基化合物的魯米諾。該家族的其他成員包括5-氨基-6,7,8-三甲氧基-和二甲氨基〉calbenz類似物。用堿性過氧化氫或次氯酸鈣和堿可使這些化合物發(fā)冷光。其他家族的化合物是2,4,5-三苯基咪唑，以洛粉堿作為現(xiàn)有產(chǎn)品的通用名稱。化學發(fā)光類似物包括對位-二甲氨基和-甲氧基取代物。化學發(fā)光還可在堿性條件下用草酸酯獲得，通常為草?；钚怎ィ鏿-硝苯基，以及過氧化物，如過氧化氫?；蛘撸瑹晒馑乜膳c熒光素酶或光澤精結(jié)合用于提供生物發(fā)光。自旋標記物是由帶有未配對的電子自旋的報告分子提供，其可通過電子自旋共振(ESR)譜檢測。示范性的自旋標記物包括有機自由基、過渡金屬復合物，尤其是釩、銅、鐵、錳等。示范性的自旋標記物包括氮氧自由基。此外，擴增序列可進行其他擴增后的處理。例如，在一些情況下，可能需要的是在雜交前用寡核苷酸陣列使該序列分段，以便提供更易于進入探針的片段，其避免了成環(huán)和/或與多重探針雜交。核酸的分裂通?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的物理、化學或酶方法完成。在各種樣本制備操作之后，該樣本通常將進行一種或多種分析操作。尤其優(yōu)選的分析操作包括，例如用寡核苷酸陣列進行基于序列的分析，和/或例如用微細管陣列電泳進行基于大小的分析。在一些實施方式中，可能需要的是提供附加的或替代的方式用于分析樣本中的核酸。微細管陣列電泳通常包括使用可能充有或不充有特定分離介質(zhì)的細的毛細管或通道。通過毛細管的樣本的電泳為樣本提供基于大小的分離曲線。微細管陣列電泳通常為基于大小的測序、PCR產(chǎn)物分析和限制性片段排列大小提供了快速的方法。這些毛細管的高表面體積比允許應(yīng)用較高電場穿過毛細管，而毛細管沒有大量的熱變化，因此允許更快的分離。此外，當與共焦成像方法相結(jié)合時，這些方法提供在埃摩爾范圍內(nèi)的靈敏度，其與放射性測序方法的靈敏度相似。在許多毛細管電泳方法中，毛細管，例如蝕刻、加工或模塑成平面基層的熔融二氧化硅毛細管或通道，被充入合適的分離/篩分基質(zhì)。典型地，本領(lǐng)域已知的各種篩分基質(zhì)都可用于微細管陣列。這些基質(zhì)的實例包括，例如羥乙基纖維素、聚丙烯酰胺和瓊脂糖。凝膠基質(zhì)可被引入并在毛細管通道內(nèi)聚合。然41而，在一些情況下，這可能導致通道內(nèi)氣泡的誘捕，這會干擾樣本分離。因此，通常需要的是在毛細管的平面元(planarelement)配合之前，在毛細管通道內(nèi)放置預(yù)成型的分離基質(zhì)。固定這兩個部分，例如通過聲波焊接，永久地將該基質(zhì)固定在通道內(nèi)。通道之外的聚合作用有助于保證沒有氣泡形成。而且，焊接過程的壓力有助于保證無孔隙的體系。除了用于核酸"指紋"和其他基于大小的分析外，毛細管陣列還可用于測序應(yīng)用。特別地，凝膠基測序技術(shù)可隨時適用于毛細管陣列電泳。反轉(zhuǎn)錄PCR也可用于本發(fā)明，以檢測CD36編碼基因的轉(zhuǎn)錄物的濃度。RT-PCR，被稱為"第一鏈反應(yīng)"，互補DNA是由信使RNA模板用dNTPs和依賴RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)通過反轉(zhuǎn)錄過程制成。RT-PCR利用了成熟mRNA的特性，其被稱為3'多聚腺苷酸區(qū)域，通常稱作聚A尾，是常見的聚(T)DNA引物的結(jié)合位點。在細菌mRNA的情況下，缺少聚(A)尾的序列特異性引物可生成以擴增目標mRNA序列。這些引物將退火至溶液中各mRNA的3'端，允許通過反轉(zhuǎn)錄酶進行互補DNA的5'—>3'的合成。通過使用基因特異性引物或隨機六聚體引物，cDNA也可由mRNA制成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，并且互補DNA已經(jīng)從原始的單鏈mRNA產(chǎn)生，則啟動標準的聚合酶鏈反應(yīng)，稱為"第二鏈反應(yīng)"。如果初始的mRNA模板是來源于相同的組織，隨后的PCR反應(yīng)可用于探測由反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA文庫?？梢栽O(shè)計引物以擴增在源組織中表達的目標基因。然后，可用實時定量PCR來比較基因表達的水平。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語"雜交"表示常規(guī)雜交條件下的雜交，優(yōu)選地為嚴格的條件下，如Sambrook等人所述(MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)。術(shù)語"嚴格的"在與雜交條件相結(jié)合使用時和本領(lǐng)域所限定的相同，即在熔點Tm下15-20。C，參見Sambrook等人，1989，頁數(shù)11.45-11.49。優(yōu)選地，條件是"非常嚴格的"，即在熔點Tm下5-1(TC。在非常嚴格的條件下，雜交只有在寡核苷酸序列和所關(guān)注的位點之間的同一性為100%時才發(fā)生，而如果寡核苷酸和DNA位點之間只有一個不匹配，雜交也不發(fā)生。通過調(diào)整本領(lǐng)域所述的雜交緩沖液的溫度和/或離子強度，可達到這種優(yōu)化的雜交結(jié)果。然而，同等高的特異性可用高親和力的DNA類似物獲得。一種這樣的高親和力DNA類似物被稱作"鎖核酸"(LNA)。LNA是一種新型的雙環(huán)核酸類似物，其中呋喃環(huán)構(gòu)形被連接2'-0位置至4'-C位置的亞甲基連接限制。所有這些LNA的共同點是對互補核酸的親和力，是目前為止報導的最高親和力的DNA類似物(Drum等人(1999)，ClinicalChemistry45，1898-1905;WO99/14226EXIQON)。LNA探針可在市場上從ProligoLLC(美國科羅拉多州，Bojilder)購買得到。另一種高親和力DNA類似物是所謂的蛋白質(zhì)核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被包含酰胺的骨架代替，尤其是氨乙基甘氨酸骨架。核酸堿基被保留并且直接或間接地結(jié)合到骨架的酰胺部分的aza-氮原子上(Science(1991)254:1497-1500)。多種不同的標記可耦合到探針上。其中優(yōu)選的是熒光報告基團，因為它們產(chǎn)生高的信噪比。合適的熒光基團的例子包括熒光黃、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、吖啶、Hoechst33258、羅丹明、羅丹明綠、四甲基羅丹明、德州紅(TexasRed)、CascadeBlue、俄勒岡綠(OregonGreen)、AlexaFluor、銪和釤。另一種類型的標記物是酶標記。在與目標核酸序列雜交后，將酶的底物加入并測量有色產(chǎn)物的形成。酶標記的例子包括(3-牛乳糖、過氧物酶、辣根過氧物酶、脲酶、糖苷酶、堿性磷酸酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和熒光素酶。進一步的標記物包括化學發(fā)光基團，如酰肼類，比如魯米諾和草酸酯類。再進一步的可能性是利用放射性同位素，并用閃爍計數(shù)檢測雜種。放射性同位素可選自32p、33P、35S、125I、45Ca、"C和311。一種特別優(yōu)選的基于探針檢測的實施方式包括利用捕獲探針來捕獲目標核酸序列。捕獲探針是結(jié)合到固體表面上，如珠、孔或棍。然后，捕獲的目標核酸序列可以在非常嚴格的條件下與檢測探針接觸，并可以檢測等位基因?；谔结樇夹g(shù)的一種實施方式是基于TAQMAN技術(shù)。這是一種利用被稱為TAQMAN⑧探針的雙標記熒光寡核苷酸探針測量PCR產(chǎn)物積累的方法。這種探針是由用兩種不同的熒光染料標記的短(約20-25個堿基)寡脫氧核苷酸組成。在5'端點上是報告染料，而在3'端點上是淬火染料。該寡核苷酸探針序列與PCR擴增子中存在的內(nèi)部目標序列是同源的。當探針原封不動時，兩種熒光團之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，并且來自報告劑的放射光被淬火劑淬滅。在PCR的延伸階段，該探針被聚合酶的5'核酸酶活性分裂，從而將報告劑從寡核苷酸淬滅劑釋放出并且引起報告劑放射強度的增大。其他合適的方法包括利用質(zhì)譜、單堿基延伸，確定探針和目標核酸序列之間的雜種的Tm曲線，利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性，利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性異源雙鏈、利用RFLP或RAPID,利用來自所述生物樣本的目標核酸序列的測序。寡核苷酸引物和/或探針本發(fā)明的一個方面涉及寡核苷酸引物和/或探針，用于檢測CD36編碼核酸分子或其部分，尤其用于檢測CD36轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或其部分，其中所述至少一種核酸引物和/或探針檢測至少一種CD36轉(zhuǎn)錄物或其部分。正如技術(shù)人員所知，本發(fā)明的分離的寡核苷酸引物是與其所基于的序列足夠互補的核酸分子，并且足夠長，以選擇性地與有意擴增的核酸分子的對應(yīng)的區(qū)域雜交。該引物能夠起動上述方法中有意的核酸分子的相應(yīng)區(qū)域的合成。類似地，本發(fā)明的分離的寡核苷酸探針是一種分子，例如足夠長且與所關(guān)注的核酸序列足夠互補的核酸分子，其在高度嚴格或較低嚴格條件下選擇性地結(jié)合到所關(guān)注的核酸序列上。因此，可以理解的是，至少一種寡核苷酸引物和/或探針能夠擴增CD36編碼核酸分子或其部分。技術(shù)人員可進一步理解的是，根據(jù)本發(fā)明，利用至少一種寡核苷酸引物和/或探針，例如利用3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25種寡核苷酸引物和/或探針。本發(fā)明的一種實施方式涉及分離的寡核苷酸，包括與CD36轉(zhuǎn)錄物或其部分的序列100%相同的至少IO個連續(xù)核苷酸。如本文他處解釋的那樣，這種探針可用于確定至少一種CD36轉(zhuǎn)錄物或其部分的濃度。優(yōu)選地，分離的寡核苷酸包括與SEQIDNO:10-45或?qū)?yīng)的互補鏈相同的序列的至少10個連續(xù)堿基，或者與SEQIDNO:10-45或其互補鏈有至少90%序列同一性、更優(yōu)選地有至少95%序列同一性的鏈。所述分離的寡核苷酸包括本發(fā)明的基因標記。根據(jù)本發(fā)明，在檢測中使用3個探針組A、B和C。探針組ASEQIDNO:10>HG-U133A—2:206488—S_AT(目標序列)a3CtggattcactttacaatttgcaaaacggctgcaggtC3acctattggtca3gccatcaaaaataaacctccttggcctgatagaaatgatcttactcagtgttggtgtggtgatgtttgttgcttttatgatttcatattgtgcatgcagatcg參考https:〃www.affVmetrix.com/anaylsis/netaffx/f|iillrecord.affkpk=HG-U133A2%3A206488SAT探針序列(5'-3'):探針X:探針Y:位置目標鏈SEQIDNO:ll:AACTGGATTCACTTTACAATTTGCA1451311272反義SEQIDNO:12:GCAAAACGGCTGCAGGTCAACCTAT113231294反義SEQIDNO:13:GTCAACCTATTGGTCAAGCCATCAG2274431309反義SEQIDNO:14:GGAACTATATTGTGCCTATTCTTTG6625151364反義SEQIDNO:15:GTGCCTATTCTTTGGCTTAATGAGA5534551375反義SEQIDNO:16:AATGAGACTGGGACCATTGGTGATG2421511393反義SEQIDNO:17:TGGAAAAATAAACCTCCTTGGCCTG5175351449反義SEQIDNO:18:CCTCCTTGGCCTGATAGAAATGATC6862591461反義SEQIDNO:19:GATCTTACTCAGTGTTGGTGTGGTG464091482反義SEQIDNO:20:TTGGTGTGGTGATGTTTGTTGCTTT1276891496反義SEQIDNO:21:GATTTCATATTGTGCATGCAGATCG1714131524反義探針組BSEQIDNO:22>HG-U133A—2:209555—S—AT(目標序列)45aaccaatttgtgttgttctgattcaataattggtttctgggtggccaattcagaagaagacctcttGtggaaattgagtaaattttgctttttttttttactcagttgcaacttacgcttggcatcttcagaatgcttttctagcattaagagatgtaaatgataaaggaattattgtatgaaatattacaaagcgtagactatgcattgttattcattataatattttttgctgtcataatcgcctcata參考shttps:〃www.affymetrix.com/analysis/netaffx/f[illrecord.affxpk=HG-U133A2%3A209555SAT探針序列(5'-3'):探針X:探針Y:位置目標鏈SEQIDNO:23:AACCAATTTGTGTTGTTCTGATTCA5861351702反義SEQIDNO:24:TTGGTTTCTGGGTGGCCAATTCAGA1196771731反義SEQIDNO:25:AACAGTCTCCAGGACCATCAGTATA221171774反義SEQIDNO:26:GTATACTGCATTTCATGTGCACCAA6634311794反義SEQIDNO:27:GTCACTGATCCTGCAAATGGACATC4994431924反義SEQIDNO:28:ATGGACATCATTTTAGCACACTAGC454391940反義SEQIDNO:29:AGCACACTAGCGGTTTATATTTTAA624711954反義SEQIDNO:30:TTTAAGGACCTTCATTCTCTGTTCT6756551974反義SEQIDNO:31:CAGTTGCAACTTACGCTTGGCATCT1391872044反義SEQIDNO:32:GCTTGGCATCTTCAGAATGCTTTTC6673112058反義SEQIDNO:33:TTTTTGCTGTCATAATCGCCTCATA6836592168反義探針組CSEQIDNO:34>HG-U133A—2:209554—AT(目標序列)gaaatctgggcttggatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcacatatgcagtgtggtgggagtggggcaacttggggaatatgttacatgtgtgactgtgttggccctggcgaagtaatgtgtcagaaagggtaaatgtgtggacacttgcaagtgctcatggatgaatttatatgtttg3gtC3t3ga3^3gtgteccctttg3teg33gC3C3ttttctttcc3鄉(xiāng)gcgtggtotta3cc3gc3g犯ttat3gc3ggtat3cat^ctt,tg考https:〃www.affvmetrix.com/analvsis/netaffx/f^illrecord.affxpk=HG-U133A2%3A209554AT探針序列(5'-3'):探針X:探針Y:位置目標鏈SEQIDNO:35:GAAATCTGGGCTTGGATGTGTGTGT3503573352反義SEQIDNO:36:GTGTGCACATATGCAGTGTGGTGGG3274653393反義SEQIDNO:37:GTGTGGTGGGAGTGGGGCAACTTGG3944673408反義SEQIDNO:38:GAGTGGGGCAACTTGGGGAATATGT6443913417反義SEQIDNO:39:GTTACATGTGTGACTGTGTTGGCCC2894253440反義SEQIDNO:40:GTTGGCCCTGGCGAAGTAATGTGTC6024173457反義SEQIDNO:41:GTGTGGACACTTGCAAGTGCTCATG3144673495反義SEQIDNO:42:ACTTGCAAGTGCTCATGGATGAATT101013503反義SEQIDNO:43:AGTGTACCCTTTGATAGAAGCACAT137513550反義SEQIDNO:44:AAGGCGTGGTTATTAACCAGCAGAA2771493585反義SEQIDNO:45:ATAGCAGGTATACATAACTTAAGTG18113612反義進一步優(yōu)選的分離的寡核苷酸可包括與SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或其對應(yīng)的互補鏈的任意序列相同的至少10個連續(xù)堿基，或者與SEQIDNO:l、SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或其對應(yīng)的互補鏈具有至少90%的序列同一性的鏈，更優(yōu)選地為至少95%的同一性，所述分離的寡核苷酸包括本發(fā)明的多態(tài)性。分離的寡核苷酸的長度取決于目的。當被用于從基因組DNA的樣本的擴增時，引物的長度應(yīng)為至少15，并且更優(yōu)選甚至更長，以保證需要的目標核酸序列的特異性擴增。當被用于從mRNA的擴增時，引物的長度可以較短，同時仍然保證特異性擴增。在一種具體的實施方式中，引物對中的一條可以為等位基因特異性引物，在這種情況下，擴增只有在樣本中存在特異性等位基因時發(fā)生。當分離的寡核苷酸被用作雜交探針用于檢測時，長度優(yōu)選地是在10-15個核苷酸范圍內(nèi)。這就足以保證與擴增的目標核酸序列在樣本中的特異性雜交。當使用比DNA結(jié)合更強的核苷酸(如LNA禾B/或PNA)時，引物的長度可以有些短，例如，下降至7-8個堿基。長度可以是至少15個連續(xù)核苷酸，例如至少20個核苷酸。上限優(yōu)選地確定分離的寡核苷酸的最大長度。因此，分離的寡核苷酸可少于IOOO個核苷酸，更優(yōu)選少于500個核苷酸，更優(yōu)選少于IOO位核苷酸，例如少于75個核苷酸，例如少于50個核苷酸，例如少于40個核苷酸，例如少于30個核苷酸，例如少于20個核苷酸。分離的寡核苷酸可包括10至50個核苷酸，例如10至15、15至20、20至25，或包括20至30個核苷酸，或15至25個核苷酸。根據(jù)用途，多態(tài)性可位于核酸序列的中心，在核酸序列的5'端、或在核酸序列的3'端。對于基于單個堿基延伸的檢測，寡核苷酸的序列與突變/多態(tài)性相鄰，或者在3'或者在5'方向。分離的寡核苷酸序列可與目標核苷酸序列的編碼鏈的子序列或與目標核苷酸序列的非編碼鏈的子序列互補，因為多態(tài)性在編碼和非編碼鏈中估計有相似的效率。分離的寡核苷酸序列可由RNA、DNA、LNA、PNA單體，或由能夠與目標核酸序列雜交的化學修飾的核苷酸制成。該寡核苷酸也可由所述單體的混合物制成。引物或探針的統(tǒng)稱為術(shù)語"寡核苷酸"，其包括天然和/或非天然核苷酸的寡核苷酸，包括它們的任意結(jié)合。天然和/或非天然核苷酸可通過天然磷酸二酯鍵或非天然鍵連接。寡核苷酸可與多核苷酸交換使用。本發(fā)明的低聚物或聚合物序列是由單體亞單位化學或酶促加成形成。本文使用的術(shù)語"寡核苷酸"包括天然的線性低聚物或經(jīng)修飾的單體或鏈接，包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其端基異構(gòu)形式、肽核酸單體(PNA)、鎖核苷酸單體(LNA)等，能夠通過單體對單體相互作用的常規(guī)模式特異性地與單鏈多核苷酸標記結(jié)合，例如Watson-Crick的堿基配對、堿基堆積，Hoogsteen或反Hoogsteen型的堿基配對等。通常，單體是通過磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小為幾個單體單元(如3-4)至幾十個單體單元(如40-60)的寡核苷酸。無論何時寡核苷酸是由字母的序列表示，例如"ATGCCTG"，可以理解的是，核苷酸從左至右為5'—〉3'順序，并且除非另有說明，"A"表示脫氧腺苷，"C"表示脫氧胞苷，"G"表示脫氧鳥苷，以及"T"表示胸苷。通常，本發(fā)明的寡核苷酸包括四種天然核苷酸，然而，它們也可包括甲基化或非天然的核苷酸類似物。合適的寡核苷酸可通過Beaucage和Carruthers描述的亞磷酰胺方法(TetrahedronLett.，22，1859-1862，1981)或者通過Matteucci等人的三酯方法(J.Am.Chem.Soc.,103，3185,1981)制備，在此將二者納入作為參考，或者使用商業(yè)的自動寡核苷酸合成儀或VLSIPS.TM.技術(shù)通過其他化學方法制備。當寡核苷酸指"雙鏈"時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，一對寡核苷酸存在于例如典型地與DNA相關(guān)的氫鍵鍵合的螺旋結(jié)構(gòu)中。除了雙鏈寡核苷酸的100%互補形式外，本文使用的術(shù)語"雙鏈"意思還表示包括像突起和環(huán)狀這種結(jié)構(gòu)特點的那些形式。例如，如US5.770.722中所述的單分子雙鏈DNA。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很清楚的是，當采用有天然或非天然核苷酸的寡核苷酸時，例如在需要用酶處理的情況下，通常需要由天然核苷酸組成的寡核苷酸。當核苷酸用合成程序被成串地結(jié)合在一起時，它們通常被稱作寡核苷酸。免疫學方法在本發(fā)明的上下文中，"免疫學方法"應(yīng)理解為表示基于免疫化學的，尤其是基于抗原抗體反應(yīng)的分析方法。免疫學方法的例子包括免疫測定，例如放射性免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA，與固相技術(shù)結(jié)合ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定))或其他免疫熒光測定。免疫測定可通過將待研究的樣本暴露于CD36-結(jié)合抗體并檢測和定量結(jié)合到該抗體的CD36的量來完成。在這些測定中，檢測和定量是以己知的方式直接或間接地完成。因此，通過使用合適的標記物使抗原-抗體復合物的檢測和定量成為可能，該標記物可被抗CD36的抗體攜帶和/或被抗一級抗體的二級抗體攜帶。根據(jù)上述免疫測定的類型，例如，放射性標記、化學發(fā)光標記、熒光染料或其他酶，如磷酸酶或過氧化物酶，可在合適的底物的協(xié)助下被檢測和定量。在本發(fā)明的一種實施方式中，免疫學方法是在合適的固相的協(xié)助下完成?？商峒暗暮线m的固相包括由聚苯乙烯或薄膜制成的(例如用聚雙氟乙烯制成，PVDF)通常的商業(yè)化微孔板，其習慣上用于ELISA技術(shù)。為了實行本發(fā)明的方法，將合適的樣本應(yīng)用于固相上，例如患者的液體樣本。該樣本優(yōu)選地為血槳樣本，其中CD36或其片段是以非結(jié)合形式存在或以可結(jié)合到它的配體LDL上的形式存在。本文假定sCD36存在于和血漿中高分子片段形成的復合物中，意味著優(yōu)選的是冷凍和解凍待測試的樣本，以便所述高分子復合物(脂質(zhì)-蛋白質(zhì)復合物)可能被降解。在一個方面，本發(fā)明涉及一種方法，其中通過下述步驟測定CD36多肽濃度，i)提供待研究的樣本，ii)提供抗-CD36抗體，iii)將該樣本暴露于抗-CD36抗體，iv)可選擇地，將所述CD36-抗體復合物暴露于至少針對所述CD36-抗體復合物的另外的抗體中，以及v)檢測和定量所述抗體的量。在本發(fā)明的更具體的方面，提供一種通過固相ELISA酶免疫測定法測定血漿樣本中人CD36的方法，其包括步驟(i)提供待研究的血漿樣本，(ii)提供本文所限定的抗-CD36抗體，(iii)將該待研究的樣本暴露于固相和所述抗體中，以及(iv)檢測和定量與CD36結(jié)合的抗體的量；并且在本發(fā)明更優(yōu)選的方面，提供一種通過固相ELISA酶免疫測定法測定血漿樣本中人CD36的方法，其包括步驟(i)提供待研究的樣本，(ii)提供抗-CD36抗體，(iii)將待研究的該樣本暴露于與固相結(jié)合的該抗CD-36抗體中，(iv)可選擇地將該CD36-抗體復合物暴露于第二抗-CD36抗體中，和(iv)檢測和定量與CD36結(jié)合的抗體的量，其中，所述固相優(yōu)選地為微孔板，CD36優(yōu)選地存在于高分子量血漿部分(的一部分)，所述高分子量血槳部分優(yōu)選地為CD36-脂蛋白復合物，所述抗-CD36抗體優(yōu)選地選自以下具體指出的單克隆抗體，所述測定優(yōu)選的是通過固相酶免疫測定完成，其中在酶免疫測定中，該樣本暴露于第一、人CD36-結(jié)合抗體，并且結(jié)合的CD36的量是用載有酶標記物的第二CD36-結(jié)合抗體測量，在這里測量時通過酶-催化的顯色反應(yīng)或化學發(fā)光來完成。50通過多重懸浮點陣技術(shù)測定CD36的濃度也在本發(fā)明范圍內(nèi)?？贵w本發(fā)明的一個方面涉及針對本文其他處所述的CD36多肽或其部分的抗原表位的抗體。該抗體可用在本發(fā)明的方法中，涉及用于分類動脈粥樣硬化斑塊、診斷動脈粥樣硬化斑塊、監(jiān)測動脈粥樣硬化斑塊、診斷具有和/或獲得癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險、診斷動脈粥樣硬化斑塊的負荷和/或確定個體的治療方案的方法。因此，本文中的抗原表位涵蓋了能夠被抗體或其結(jié)合的片段識別的任意抗原表位。本文使用的術(shù)語"抗體"包括多克隆和單克隆抗體，以及它們的片段，例如能夠結(jié)合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。它包括常規(guī)的小鼠單克隆抗體和人抗體，以及非人類抗體的人源化形式，而且它還包括從噬菌體抗體文庫分離的"抗體"。本發(fā)明的抗體可以是多克隆或單克隆，并且可通過本領(lǐng)域已知的體內(nèi)或體外方法產(chǎn)生。因此，抗-CD36抗體選自多克隆和單克隆CD36-特異性抗體。單克隆抗體是由雜交瘤產(chǎn)生的抗體。制備單克隆抗體-合成雜交瘤細胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如通過將產(chǎn)生B淋巴細胞的抗體和永生化的B-淋巴細胞細胞株融合。多克隆抗體是從(對給定的抗原)免疫的動物的血液中純化的抗體分子的混合物(對給定的抗原有特異性)，在這里非限制性的例子是來自兔的抗體分子。這種抗體是多克隆的，因為它們是許多不同的產(chǎn)生抗體的細胞的產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及單克隆和/或多克隆抗體的混合物。至少兩種單克隆抗體的混合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。應(yīng)理解的是，該混合物可包括3、4、5、6、7、8、9、10或15種單克隆抗體。本文使用的抗-CD36抗體可以是上述單克隆抗體，和/或分離的多克隆抗體，可通過免疫處理獲得，其中純化和重組的人類CD36用作抗原成分，而該抗體優(yōu)選地對以液體形式存在于人血血漿中的CD36蛋白質(zhì)的各種片段有特異性，該片段可選擇地作為CD36-脂蛋白復合物的一部分，例如，與存在于無細胞血漿的高分子量片段中的低密度脂蛋白(LDL)、IDL(中密度脂蛋白)或VLDL(極低密度脂蛋白)結(jié)合的CD36或其片段。在一種實施方式中，sCD36與氧化型LDL(oxLDL)、氧化型LDL、氧化型IDL和/或氧化型VLDL相關(guān)。在另一種實施方式中，在與氧化型HDL形成的復合物中發(fā)現(xiàn)了sCD36。在一種實施方式中，抗體選自sc7309(CD36(SMf)，小鼠IgM)，和多克隆CD36特異性蛋白，如sc5522(CD36(N-15)，羊IgG，抗原表位N-末端(h))，sc9154(CD36(H-300)，兔IgG，抗原表位1-300(h))，如sc5522和sc9154(兩者均來自SantaCruzBiotechnologyInc.，美國加州圣克魯斯)。用于檢測血漿中循環(huán)CD36的ELISA測定的抗體優(yōu)選地被標記以方便檢測，該標記物優(yōu)選地是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的生物素化的形式。具體地，CD36-特異性單克隆抗體可選自185-1G2Vilella131.1Tandon，Rockville131.2Tandon，Rockville131.4Tandon，Rockville131.5Tandon，Rockville131.7Tandon，RockvilleNAM28-8C12Bl雄hard，NantesAmAK-5Kehrel，MuensterCXB-IVC7CLB，AmsterdamLyp10.5McGregor,LyonLyp13.10McGregor,Lyon診斷、分類和監(jiān)測中使用的標準水平在患有動脈粥樣硬化斑塊的個體中，CD36多肽和/或CD36核酸分子的濃度的至少為標準水平1.15倍的升高是動脈粥樣硬化斑塊向癥狀性動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的標志。具體地，標準水平的至少1.25倍的升高，例如至少1.30倍的升高，如標準水平的至少1.35倍的升高，例如標準水平的1.40倍，如標準水平的至少1.45倍的升高，例如標準水平的1.50倍，如標準水平的至少1.55倍的升高，如標準水平的至少1.60倍的升高，如標準水平的至少1.65倍的升高，如標準水平的至少1.70倍的升高，如標準水平的至少1.75倍的升高，如標準水平的至少1.80倍的升高，如標準水平的至少1.85倍的升高，如標準水平的至少2.0倍的升高，如標準水平的至少2.25倍的升高，如標準水平的至少2.50倍的升高如標準水平的至少3倍的升高，如標準水平的至少3.50倍的升高，如標準水平的至少4倍的升高，如標準水平的至少4.50倍的升高，如標準水平的至少5倍的升高，如標準水平的至少6、7、8、9或10倍的升高，是動脈粥樣硬化斑塊向癥狀性動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展的標志。術(shù)語"標準水平"是指來自個體的隨機組的一系列樣本中CD36多肽或CD36編碼核酸分子的濃度。在一種實施方式中，標準水平是在來自無癥狀個體的隨機組一系列樣本中測定。該系列包括來自至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或例如至少100位個體的樣本。在另一種實施方式中，標準水平是指來自例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或者例如至少100位個體的一系列樣本中的CD36多肽或CD36編碼核酸分子的濃度，其中在提供樣本時的2個多月前，3個多月前，4個多月前，5個多月前或6個多月前，沒有觀察到與動脈粥樣硬化癥有關(guān)的癥狀。在一種實施方式中，標準水平是來自例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或者例如至少100位個體的一系列樣本中的CD36多肽或CD36編碼核酸分子的濃度，其中在提供樣本時的2個多月前，3個多月前，4個多月前，5個多月前或6個多月前，沒有觀察到與頸動脈狹窄和/或頸動脈硬化癥有關(guān)的癥狀。治療方案的確定本發(fā)明的一個方面涉及CD36多肽或CD36編碼核酸分子的濃度在確定基于CD36多肽或CD36編碼核酸分子的濃度的個體治療方案中的用途。因此，本發(fā)明涉及一種用于確定個體的治療方案的方法，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD3653編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的程度和/或診斷個體具有和/或獲得癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險，v)基于iv)的結(jié)果確定對所述個體的治療方案。如果個體面臨的狹窄的增加程度的危險是基于本文的方法確立，則所述個體的治療方案可被確定。例如，觀察到的狹窄的治療可包括通過血管成形術(shù)機械地擴大動脈，和/或擴張機體的至少一條動脈，或機體的兩條、三條或四條動脈。在具體的實施方式中，分別機械地擴大頸動脈和/或冠狀動脈的至少一條或兩條。此外，治療方案可包括動脈內(nèi)膜切除術(shù)，包括動脈線中，動脈粥樣化斑塊物質(zhì)或阻礙的移除。動脈內(nèi)膜切除術(shù)可分別在頸動脈和/或冠狀動脈的至少一條或兩條上施行。此外，如果個體面臨具有和/或發(fā)生癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險被確立，則可以啟動個體的預(yù)防性治療，以便減慢和/或抑制無癥狀斑塊向癥狀性斑塊的發(fā)展。例如，該治療方案包括用降低膽固醇的藥物治療，如他汀類。他汀類包括洛伐他汀(Mevacor)、普伐他汀(Pravachol)、辛伐他汀(Zocor)、阿托伐他汀(Lipitor)、羅蘇伐他汀(Crestor)。他汀類藥物是HMG-CoA還原酶抑制劑。不受理論的約束，認為他汀類通過抑制HMG-CoA還原酶有助于預(yù)防機體內(nèi)膽固醇的產(chǎn)生。此外，結(jié)合他汀類，煙酸和/或腸道膽固醇吸收抑制補充劑(例如，依替米貝)也可用于減慢和/或抑制無癥狀斑塊向癥狀性斑塊的發(fā)展。在進一步的實施方式中，該治療方案包括用減慢和/或抑制凝血(在該過程中，血液形成固體凝塊)的藥劑治療。試劑盒在一個方面，本發(fā)明涉及用于分類個體中動脈粥樣硬化斑塊的試劑盒，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，分類所述動脈粥樣硬化斑塊。在本發(fā)明的另一方面，涉及一種用于診斷個體中動脈粥樣硬化斑塊的試劑盒，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述動脈粥樣硬化斑塊。在又一方面，本發(fā)明涉及一種用于監(jiān)測個體中動脈粥樣硬化斑塊的試劑盒，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與之前在相同的個體中測量的CD36多肽或其部分的濃度和/或CD36編碼核酸分子或其部分的濃度相聯(lián)系，和/或iv)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及v)基于根據(jù)iii)和/或iv)的所述聯(lián)系，監(jiān)測所述動脈粥樣硬化斑塊的任何進展。在進一步的方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷個體處于具有和/或發(fā)生癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險的試劑盒，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述個體是否處于具有和/或發(fā)生癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險中。在進一步方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷個體中動脈粥樣硬化斑塊的負荷的試劑盒，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)禾n/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述個體中的動脈粥樣硬化斑塊的負荷。此外，本發(fā)明涉及一種用于診斷個體中由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的試劑盒，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷所述個體中由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的程度。此外，本發(fā)明涉及一種用于確定個體治療方案的試劑盒，所述方法包括在所述個體的樣本中，i)測定CD36多肽或其部分的濃度和/或ii)測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，iii)將i)和/或ii)中測定的所述濃度與標準水平相聯(lián)系，以及iv)基于根據(jù)iii)的所述聯(lián)系，診斷由動脈粥樣硬化斑塊引起的狹窄的程度和/或診斷個體具有和/或獲得癥狀性動脈粥樣硬化斑塊的危險，v)基于iv)的結(jié)果，確定對所述個體的治療方案。因此，本發(fā)明的一種或多種試劑盒包括至少一個檢測單元，用于測定CD36多肽或其部分的濃度和/或用于測定CD36編碼核酸分子或其部分的濃度，尤其是轉(zhuǎn)錄物。該檢測單元選自能夠檢測本文其他處所述的CD36編碼核酸分子或其部分的至少一種引物，至少一種探針和至少一種引物對。如上所述，該檢測單元可以是能夠與指示CD36編碼核酸分子或其部分的濃度的mRNA或mRNA形式的轉(zhuǎn)錄物雜交的任意核苷酸探針，如DNA、RNA、PNA、或LNA探針。雜交條件優(yōu)選地如本文對于探針的描述。在另一種實施方式中，檢測單元是能夠特異性地與CD36多肽或其部分結(jié)合的抗體。CD36編碼核酸分子，以mRNA形式存在的轉(zhuǎn)錄物的濃度和/或CD36多肽或其片段的濃度可由人手工地或通過電腦或其他機器來對比。算法可用于檢測異同點。例如，算法可評分和比較被表達的基因或未表達的基因?；蛘?，算法可査找特定基因、轉(zhuǎn)錄物或其翻譯產(chǎn)物的表達強度的變化，并給兩個樣本之間的強度變化評分。相同點可在兩個樣本中表達的基因、轉(zhuǎn)錄物或其翻譯產(chǎn)物，和兩個樣本中均未表達的基因的基礎(chǔ)上，或者在表達強度在數(shù)字上相似的那些基因的基礎(chǔ)上來確定。通常，檢測操作將用診斷裝置之外的閱讀裝置進行。然而，在一些情況下可能需要將數(shù)據(jù)搜集操作納入該診斷裝置本身。檢測儀器可以是熒光檢測器、或光譜檢測器、或其他檢測器。盡管雜交是特異性相互作用的類型之一，其用在圖譜實施方式中有明顯的用途，但抗體試劑也可能非常有用。從各種分析操作(例如寡核苷酸和/或微細管陣列)中收集數(shù)據(jù)將典型地用本領(lǐng)域已知的方法來完成。例如，可用激光掃描陣列以激發(fā)與上述探針陣列的區(qū)域雜交的熒光標記的目標物，然后其可用電荷耦合裝置(CCD)成像，以便大范圍掃描該陣列。此外，用于從陣列中收集數(shù)據(jù)的其他特別有用的方法是通過使用激光共焦顯微鏡，其將易于自動化的程序的簡便和速度與高分辨率檢測相結(jié)合。在數(shù)據(jù)收集操作之后，該數(shù)據(jù)將典型地被報告給數(shù)據(jù)分析運算。為了促進樣本分析運算，由裝置的閱讀器獲得的數(shù)據(jù)將典型地用數(shù)字計算機來分析。典型地，該計算機將適當?shù)乇痪幊桃员憬邮蘸蛢Υ鎭碜匝b置的數(shù)據(jù)，以及分析和報告收集的數(shù)據(jù)，即解釋熒光數(shù)據(jù)以確定雜交探針的序列、背景的常態(tài)化和單個堿基錯配雜交，排列SBH應(yīng)用中的序列數(shù)據(jù)等。實驗和實施例患者將取自連續(xù)切除術(shù)患者的頸動脈斑塊根據(jù)患者在手術(shù)前的6個月是否經(jīng)歷同側(cè)中風、TIA，或者一時性黑蒙分為兩組。分別根據(jù)存在或不存在血管痙攣現(xiàn)象，將斑塊定性為癥候性或無癥狀。根據(jù)統(tǒng)一的標準，采用腦前彩色雙功能超聲診斷并分類頸內(nèi)動脈狹窄(GrantEG，BensonCB，MonetaGL，AlexandrovAV，BakerJD，BluthEI，CarrollBA，EliasziwM，GockeJ，HertzbergBS，KatanickS，NeedlemanL，PelleritoJ，PolakJF，RhollKS，WoosterDL，ZierlerRE.Carotidarterystenosis:gray-scaleandDopplerUSdiagnosis-SocietyofRadiologistsinMltrasoundConsensusConference.Radiology.2003;229:340-346)禾卩CT血管造影術(shù)(AndersonGB,AshforthR，SteinkeDE,FerdinandyR，F(xiàn)indlayJM.CTangiographyforthedetectionandcharacterizationofcarotidarterybifurcationdisease.2000;31:2168-2174)。在患有冠狀動脈疾病(CAD)、外周動脈疾病或中風/TIA超過6個月的患者臨床檢査期間，檢測到無癥狀的的頸內(nèi)動脈狹窄。頸動脈內(nèi)膜切除標本頸動脈粥樣硬化斑塊是在頸動脈內(nèi)膜切除期間取自患者。將用于蛋白質(zhì)和RNA提取的斑塊迅速凍結(jié)在液氮中。為了免疫印跡，通過金屬刃勻漿器，按0.1ml/10mg濕重量組織的比例，將取自斑塊的組織粉末在冰冷的裂解緩沖液57中攪勻(含有蛋白酶抑制劑混合物的PBS[GibcoPaisleyUK]有1%的TritonX-100和0.1%的吐溫20)。將提取物在冰上培養(yǎng)15分鐘，并在12000g離心(4t:下15分鐘)。保留上清液，并用BCA法(PierceCheshireUK)測量樣本中的蛋白質(zhì)濃度。血液采樣方案將外周靜脈血液吸入無熱原的EDTA管，將該管立即浸入融化的冰中，并在2500g離心20分鐘，在20分鐘內(nèi)獲得貧血小板血漿。所有樣本均儲存在-80°C，并在分析程序開始前僅解凍一次。高密度寡核苷酸微陣列將總RNA用MagNAPurekitIII(RocheAppliedScience,印第安納波利斯，印度)從冰凍的頸動脈組織分離，用分光光度量化，并儲存在-8(TC。編碼14500個基因的人類基因組U133A2.0陣列購自Affymetrix(圣塔克萊拉，加拿大)，并根據(jù)制造商的兩個周期的目標標記方案進行雜交。簡單地說，cDNA是從總100ng總RNA中制備，并且cRNA是由cDNA的體外轉(zhuǎn)錄獲得。然后重復該周期，從600ngcRNA中制備cDNA。此后，生物素標記的cRNA由cDNA的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，并在與該陣列雜交前被分段。為進行數(shù)據(jù)分析，使用GeneChipOperationSoftware(1.3)禾卩ArrayAssist(3.4)。實施例1、用于檢測血清中CD36的ELISA分析試劑盒的實施例ELISA分析，使用的試劑和分析條件磷酸鹽緩沖液，0.1mol/l，pH8.0Na2HP04,2H20，0.1mol/l，pH8.0，儲存在4°CPOD緩沖液NaH2P04,H20，1.5mol/lNa2HP04,2H20，8.5mol/lNaCl400mmol/lpH7.4儲存在4°C溶菌酶溶液的制備溶菌酶，SigmaL-6876,20mg/ml。每份lml，儲存在-2(TC，儲存期限1年，4X:下的儲存期限為4天。POD-親和素DakoP364:顯色劑四甲基聯(lián)苯胺微孔過氧化物酶底物(l種成分)目錄號No.50-76-06，KirkegardandPerrylaboratories。2-25。C下儲存期限l年磷酸lmol/1POD-親和素溶液POD緩沖液12ml溶菌酶溶液POD-親和素6^1僅僅就在使用前制備抗體抗-CD36:生物素(酰)化的sc-9154(兔多克隆抗體，來自圣克魯斯)儀器自動微孔板沖洗器Elx50(BiotekInstruments)ELISA板在4。C下用捕獲抗體羊(sc5522)-CD36(O.lug/ml)過夜包被，接著在4"C下用磷酸緩沖鹽水(PBS)和0.1%吐溫封閉2天。將該板儲存在-2(TC備用。將用抗CD36的抗體包被的微孔板的每個孔用340|il沖洗緩沖液沖洗3次，使用程序12。在未抽吸沖洗緩沖液時終止最后的沖洗，在應(yīng)用標準液(EDTA-血漿池)和樣本(含可能的對照品)之前，以及在加入試劑之前，首先立即倒出該沖洗緩沖液。標準將通過常規(guī)血液采樣取自100位受試者的EDTA血液在3000g離心10分鐘，吸取血漿的上層并混合?；旌涎獫{以350^1的等份被冷凍，并用稀釋物作為標準曲線。其他EDTA血漿混合物用作高和低的內(nèi)部分析對照品。批間測定變異系數(shù)，根據(jù)相同樣本的76次單獨測定，估算為10%，根據(jù)15個不同日的高對照品的平行測定，估算為6%。批間測定變異系數(shù)，根據(jù)進行的每次運行中的對照品估算為16.4%。只有當對照品變化范圍在+A1.96xSD(批間測定)時，運行方被接受。Elisa測定方法將微孔板在Ek50上沖洗。標準品、對照品、樣本以及稀釋緩沖液排成兩列，10(V1/L。標明應(yīng)用位置。微孔板用塑料膜覆蓋，并在振動臺上培養(yǎng)60分鐘。將該板在Elx50上沖洗，10(^1生物素化的SC-9154加到每個孔，用塑料膜覆蓋，并在振動臺上培養(yǎng)60分鐘。將該板在Elx50上沖洗。將100^1POD-親和素溶液加到每個孔，用塑料膜覆蓋并在振動臺上孵育約30分鐘。將該板在Elx50上沖洗。在通風櫥內(nèi)將100^1TMB加到每個孔，用塑料膜覆蓋，并在振動臺上培養(yǎng)IO分鐘。以每個孔加ioopi磷酸終止該反應(yīng)(在通風櫥內(nèi))，用塑料膜覆蓋直到讀數(shù)。在反應(yīng)終止后60分鐘內(nèi)，在Multiscan上讀出450nm、620nm處的消滅情況。計算兩個軸上帶有線性刻度的三次樣條。用EDTA池的稀釋液作為標準曲線，結(jié)果是相對于EDTA血漿池來表達。Elisa稀釋緩沖液磷酸鹽緩沖液1Ommo1/1，含0.145mol/lNaCl，pH7.4。實施例2、動脈粥樣硬化斑塊中的CD36基因表達表l、與癥狀性頸動脈粥樣硬化的患者(r^4)相比，CD36在無癥狀斑塊(r^4)中的表達不同。Affimetrix芯片(HumanGenomeU133A2.0Array)上的全部5個探針組檢測CD36(Hs120940)。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>實施例3-5患者62名高度頸內(nèi)動脈狹窄的連續(xù)患者(270%)用頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)(CEA，53名患者)或者用置入支架的頸動脈血管成形術(shù)(CAS，9名患者)治療(表2)。研究包括19名(31%)女性和43(69%)名男性，平均年齡65.5歲(分布在44_83歲)。根據(jù)它們的癥狀將患者分為兩組。在過去2個月內(nèi)，16名(26%)患者經(jīng)歷過臨床癥狀，例如與狹窄頸內(nèi)動脈同側(cè)的中風、短暫性腦缺血發(fā)作(丁1八)或一過性黑蒙，其中46名(74%)患者在超過2個月前具有該癥狀(11=22)或者從未經(jīng)歷過上述癥狀(n=24)(表2)。按照統(tǒng)計的標準用腦前彩色雙功能和CT血管造影術(shù)對頸動脈狹窄進行診斷和分類(Anderson等人，Stroke.2000;GrantEG等人，Radiology.2003;229:340-346)。在超過六個月前患有冠狀動脈疾病(CAD)、外周動脈疾病或中風/TIA的患者的臨床檢査期間，檢測到無癥狀的頸動脈狹窄。根據(jù)前面所述的方法(EuropeanCarotidPlaqueStudy,EurJVaseEndovascSurg.1995;10:23-30;MathiesenEBetal，Circulation.2001;103:2171-2175)，按照超聲檢查時的斑塊回音強度，將斑塊也分為兩組，并分類為無回聲或強回聲/異質(zhì)性。腦前動脈的三重超聲、臨床中樞檢驗和腦彌散加權(quán)磁共振成像(MRI)在該程序之前的兩天內(nèi)或在該程序之后進行。將伴隨炎癥性疾病的患者從該研究中排除，例如感染和自動免疫疾病、或者肝臟或腎臟疾病。該方案獲得區(qū)域道德委員會的批準，并獲得所有個體簽署的知情同意書。表2根據(jù)#臨床癥狀以及出現(xiàn)癥狀后的月數(shù)的患者的基線變量52月(n=16)>2月或無癥狀(n=6)P年齡，年66(7.8)65(9.3).98男性*12(75)31(67).57狹窄度。/。80(80-95)80(70-95)65無回音的頸動脈斑塊*7(43.8)13(28.3).25腦MRI局部缺血f(n=53)11(68.8)31(67.4).94體重指數(shù)，kg/m226.7(20.4-35.5)25.8(19-35.5).72CEA治療*15(93.8)38(82.6).28收縮壓，mmHg151(110-196)150(110-194)60舒張壓，mmHg73(32-99)80(49-101).59糖尿病*4(25)10(22).79他汀類治療*13(81.3)41(89.1)42目前吸煙*7(43.8)25(54.3).74新蝶呤，nmo1/18.7(4.9-18.0)9.1(5.7-60.3).48CRP，mg/13.5(1.0-39.0)5(0.6-28.0).93總白細胞數(shù)，109/18.3(4.0-12.1)7.5(3.8-11.1).31纖維蛋白原，g/14.0(2.9-6.6)3.9(2.6-6.9)87膽固醇，mmo1/14.3(3.6-5,9)4.4(2.8-7.5)68HDL膽固醇，mmo1/11.3(0.7-1.9)1.2(0.8-2.5).82甘油三酸脂，mmo1/11.4(0.6-3.8)1.5(0.7-3.7).31LDL(n=49)2.6(2.0-4.0)2.6(1.5-5.1)46HbAlc，％5.7(5.2-6.9)5.8(0.9-8.8).95卩-血小板球蛋白，IU/ml53.3(26.7-142.1)54.8(15.4-268.5).61血小板數(shù)，109/1225.5(132-391)261(168-441).10#臨床癥狀包括狹窄頸內(nèi)動脈同側(cè)的中風、TIA或一過性黑蒙。數(shù)字是未調(diào)整的均數(shù)(SD)或者*數(shù)字(百分數(shù))。62血液采樣方案將外周靜脈血吸到無熱原的EDTA管內(nèi)，將該管立即進入融化的冰中，并在4。C下于2500g離心25分鐘，20分鐘內(nèi)獲得貧血小板血漿。所有樣本均儲存在-8(TC并僅解凍一次。免疫組織化學頸動脈內(nèi)膜切除期間取患者的頸動脈粥樣硬化斑塊，將丙酮固定部分使用以下物質(zhì)染色單克隆鼠抗人CD36(FA6-152,NovusBiologicais，Littleton,CO)，抗人CD3IgG(DakoCvtomation,Glostrup,Denmark),以及抗人平滑肌肌動蛋白(DakoCvtomation),親和純化多克隆鼠抗人巨噬細胞(鈣防衛(wèi)蛋白)IgG(MCA874G，SerotecLtd.，英國牛津)，以及綿羊抗大鼠馮維勒布蘭德因子IgG(Cedarlane，加拿大安大略湖)。一級抗體被生物素化的抗鼠或抗綿羊IgG(VectorLaboratories,加拿大伯林蓋姆)跟蹤。免疫反應(yīng)性通過親和素一生物素一過氧化物酶復合物(VectastainElite試劑盒，VectorLaboratories)被進一步擴增。用二氨基聯(lián)苯胺作為商業(yè)化金屬加強體系的色原體(PierceChemical，Rockford，以色列)。將該部分用蘇木精復染。一級抗體的省略用作陰性對照。可溶性CD36酶聯(lián)免疫測定(ELISA)ELISA板在《C用捕獲抗體羊(sc5522)-CD36(0.1嗎/ml)包被過夜，接著用磷酸緩沖鹽水(PBS)和0.1%吐溫在4'C封閉2天。將該板儲存在-20"C直至使用。檢測抗體sc9154是其他地方所述的生物素化的(GlintborgD等人，2007年11月3日出版前網(wǎng)絡(luò)公開)。所有抗體均來自圣克魯斯生物技術(shù)公司(加拿大圣克魯斯)。按照常規(guī)血液采樣，將取自100位受試者的EDTA-血漿作為標準血漿，并以增加的稀釋度重復兩份使用。其他EDTA-血漿作為高和低對照品，PBS用作背景對照?；颊叩臉颖疽赃m宜的稀釋度重復兩份使用。在室溫培養(yǎng)l小時后，沖洗該孔，應(yīng)用生物素化的抗CD36(sc9154)并培養(yǎng)30分鐘。沖洗后，加入TMB微孔過氧化酶底物(Kementec，Copenhagen,denmark)。通過磷酸終止該反應(yīng)，并在Multiscan上，于450nm和620nm處測定消滅情況(Thermo，Langenselbold，德國)。相對標準EDTA-血漿池計算吸收值并表示為相對單位。對照品可以與真值偏差1SD。批間測定和長期批間測定的變異系數(shù)分別為6%和16%。其他在模塊化平臺上，通過高靈敏顆粒增強免疫比濁法測定C-反應(yīng)蛋白(CRP)水平(RocheDiagnostic,瑞士巴塞爾)。通過前面所述的常規(guī)的實驗室方法測定脂質(zhì)參數(shù)和HbAlc的濃度。通過分別從IBLHamburg(Hamburg,德國)和DiagnosticaStago(Asnieres，法國)獲得的ELISA測定新喋呤以及P血小板球蛋白(P-TG)的血漿水平。統(tǒng)計分析采用Mann-WhitneyU檢驗比較2組個體。當比較3組個體時，采用非參數(shù)的克魯斯凱-沃利斯檢驗方法。如果發(fā)現(xiàn)顯著差異，采用Mann-WhitneyU檢驗計算組中各對之間的差異。通過斯皮爾曼等級檢驗計算相關(guān)系數(shù)(r)。當比較比例時，采用Fisher的確切檢驗。分別采用針對連續(xù)和絕對因變量的線性和二元回歸分析計算變量之間的關(guān)系。P值(兩側(cè))<0.05視為顯著。實施例3、血漿CD36和斑塊穩(wěn)定性與CRP和新蝶呤相反，在過去兩個月內(nèi)有與頸動脈狹窄相關(guān)癥狀的患者與其他患者相比，sCD36的血漿水平明顯較高，(2.17VS1.27，p=0.019，數(shù)據(jù)是根據(jù)均數(shù)與范圍按相對單位給出)。而且，當根據(jù)它們的最近的臨床癥狀，將患者分為三組時(即，最近2個月內(nèi)有癥狀[『16];最近3-6個月內(nèi)有癥狀[11=15];或無癥狀斑塊，即無癥狀或者癥狀在超過6個月前[n=31])，與其他兩組相比，前面那組具有明顯升高的血槳sCD36水平(圖2)。將患者組作為一個整體，血漿sCD36水平明顯與總白細胞數(shù)(F0.43，p〈0.02)和纖維蛋白原(i=0.40，p<0.02)相關(guān)。然而，在校正這些參數(shù)后，sCD36仍然是最近兩個月內(nèi)(p=0.049，Cl:1.0-2.7)來自斑塊的臨床癥狀的重要預(yù)報者。我們已經(jīng)報導過2型糖尿病和肥胖個體中血漿sCD36水平的升高，但在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)sCD36與各BMI、糖尿病的發(fā)生或者血糖生成控制(即HbAlc)之間沒有聯(lián)系(數(shù)據(jù)未顯示)。我們之前已經(jīng)證實CD36在血漿中以可溶性形式存在，其在2型糖尿病患者和多囊性卵巢癥候群患者中水平升高，與動脈硬化癥的危險因子有關(guān)，如胰島素耐受性和血糖生成控帝iJ(HandbergA等人，C/ra^/a^w.2006;114:1169-1176;GlintborgD等人，A'"&tesCflm2007年11月13日出版前網(wǎng)絡(luò)公開)。在本研究中，通過顯示血漿sCD36水平與動脈粥樣硬化性病變的本質(zhì)之間的更直接的關(guān)系，我們擴大了這些發(fā)現(xiàn)，與BMI和糖尿病的發(fā)生無關(guān)。因此，盡管前2個月內(nèi)頸動脈有癥狀性疾病的那些患者與其他頸動脈粥樣硬化癥患者之間，在心血管疾病的傳統(tǒng)的危險標志或系統(tǒng)炎癥和血小板激活的成立標志中并沒有區(qū)別，然而血漿sCD36的水平在前面那組患者中明顯升高。不被理論約束，這些患者中一種可能的sCD36的細胞來源，基于我們之前觀察到的在癥狀性頸動脈斑塊中升高的CD36mRNA水平，結(jié)合我們目前的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)顯示出與無癥狀斑塊相比，癥狀性斑塊內(nèi)巨噬細胞中CD36的強免疫染色，可能表明血槳sCD36水平升高能反映出從癥狀性和不穩(wěn)定的病變中的釋放增加。實施例4、血漿CD36和斑塊形態(tài)學超聲斑塊外觀或者回音強度原則上可分為低水平回聲斑塊、腔表面上帶有薄的通常不完整的殼(無回聲斑塊)、以及中等或者高水平回聲的斑塊，這種斑塊通常反應(yīng)致密的纖維組織和鈣化物的較高含量(強回聲/異質(zhì)性斑塊)。關(guān)于斑塊形態(tài)的數(shù)據(jù)獲取自59例患者，并在圖4中可見。與強回聲/異質(zhì)性斑塊(n=39，p=0.09)的那些患者相比，無回聲斑塊的患者(n=20)往往具有更高的sCD36水平。實施例5、頸動脈病變中CD36的表達在癥狀性頸動脈病變患者中，血漿sCD36水平的細胞來源尚不清楚，但最近己確認CD36為在癥狀性頸動脈斑塊中被明顯上調(diào)的87個基因之一，，表明在這些患者中斑塊本身有助于升高血漿sCD36。為進一步說明這些觀點，對2例有癥狀性疾病的患者(<2個月)和2例無癥狀患者的頸動脈斑塊進行免疫65組織化學分析(圖6)。染色這些動脈粥樣硬化病變的連續(xù)切片顯示出癥狀性患者斑塊中的抗CD36免疫染色，該免疫染色位于斑塊的富含脂質(zhì)的核心(圖6A)，對鈣防衛(wèi)蛋白-陽性的巨噬細胞具有強免疫染色(圖6B)。在核心區(qū)域以及帶有非常弱或無抗CD36免疫染色的區(qū)域可見不同強度的CD36免疫反應(yīng)，比如在該核心的無細胞中心，但其他區(qū)域顯示更強的免疫染色。如圖6所示，鄰近介質(zhì)的斑塊區(qū)域顯示最強的CD36免疫反應(yīng)。然而，在核心外未見抗-CD36免疫染色。來自無癥狀疾病的患者的病灶中，富含脂質(zhì)的鈣防衛(wèi)蛋白陽性區(qū)域也可見CD36免疫染色，但在這些患者中，動脈粥樣硬化斑塊較少發(fā)展，并且與有癥狀性疾病患者中的病灶相比，CD36陽性免疫染色區(qū)域較小。CD36被認為通過其結(jié)合并內(nèi)化動脈壁中捕獲的改性LDL，促進充滿脂質(zhì)的巨噬泡沫細胞的形成，而在頸動脈硬化病變的起始和發(fā)展發(fā)揮關(guān)鍵作用(Collot-TeixeiraS等人，CaW/ovosci仏2007;75:468-477;TuomistoTT等人，AAerasc/era^.2005;180:283-291)。事實上，先前的研究已經(jīng)報導了加速的CD36表達與動脈硬化癥6的進展并行，尤其是位于泡沫的大型巨噬細胞(NakataAetal.j他".騰/er7%讓6r置腸/.1999;19:1333-1339)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與無癥狀斑塊相比，癥狀性斑塊中CD36的強免疫染色主要位于動脈粥樣硬化斑塊的脂肪核心中負載脂肪的巨噬細胞，進一步支持了增強的CD36與晚期動脈硬化癥之間的關(guān)系。此外，在過去兩個月內(nèi)，與其他患者相比，在那些具有與他們的頸動脈狹窄相關(guān)的癥狀的患者中，血漿sCD36的水平顯著提高。這種CD36以其可溶性形式釋放的機制尚不清楚，但是已經(jīng)表明血漿sCD36水平能作為CD36表達改變的那些情況的生物標記，如改性的脂蛋白和低級炎癥的水平升高(TuomistoTT等人，JAmwc/em'5.2005;180:283-291)。此外，泡沫細胞凋亡與斑塊去穩(wěn)定性和血栓形成，以及隨后發(fā)展的急性缺血事《牛有關(guān)(LittlewoodTD和Bennett.CwrC^"丄^zV/o/.2003;14:469-475)，可以推測，負載脂質(zhì)的巨噬細胞的凋亡可導致CD36釋放的增強。因此，可積極設(shè)想，近期有癥狀性頸動脈斑塊的患者中，升高的血漿sCD36水平與急性癥狀具有時間依賴性關(guān)系，至少部分地反應(yīng)了斑塊去穩(wěn)定期間sCD36釋放的增強。CD36不僅在單核細胞上和巨噬細胞上表達，而且在內(nèi)皮細胞(AdachiH和TsujimotoM.丄—W2006;45:379-404)以及血小板(IkedaH.T7o狄aWo/gdb/Za^//.1999;74:99-104)上表達。近期，Podrez及其同事建議，與血小板相關(guān)的CD36可作為氧化應(yīng)激的傳感器和血小板激活的調(diào)節(jié)劑，促進高脂血條件下的血栓癥(PodrezEA等人，A/"wMe丄2007;13:1086-1095)，例如在血小板和不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化性病變之間的相互作用期間。與sCD36相反，我們發(fā)現(xiàn)血漿CRP、新蝶呤和卩-TG水平?jīng)]有關(guān)系，它們分別是系統(tǒng)炎癥、單核細胞/巨噬細胞以及血小板激活的可靠標記?？赡艿氖?，sCD36反映斑塊不穩(wěn)定性和癥狀性疾病的能力可表現(xiàn)出它反映斑塊去穩(wěn)定化中涉及的幾種病源性過程的能力，例如血小板和單核細胞/巨噬細胞的激活，以及病變中的病源性事件，如泡沫細胞凋亡、血小板和動脈粥樣硬化斑塊之間的相互作用。我們認為血漿中的sCD36是斑塊不穩(wěn)定性和癥狀性頸動脈粥樣硬化的標志，可能至少部分地是由于CD36從覆蓋脂肪核心的泡沫細胞滲透層釋放到循環(huán)中，而這種釋放在斑塊破裂期間被加強。本研究的結(jié)果提出用sCD36預(yù)測即將到來的心血管事件。參考文獻將本文的所有文獻和專利參考文獻通過引用納入本文，包括以下選擇的有關(guān)CD36的參考文獻AndersonGB，AshforthR，SteinkeDE,FerdinandyR,FindlayJM.CTAngiographyforthedetectionandcharacterizationofcarotidarterybifiircationdisease,Stroke.2000;31:2168-2174GrantEG,BensonCB,MonetaGL,AlexandrovAV，BakerJD,BluthEI，CarrollBA，EliasziwM，GockeJ，HertzbergBS,KatarickS,NeedlemanL，PelleritoJ，PolakJF,RhollKS,WoosterDL，ZierlerE.Carotidarterystenosis:gray-scaleanddopplerUSdiagnosis-SocietyofRadiologistsinUltrasoundConsensusConference,iW油gy.2003;229:340-346EuropeanCarotidPlaqueStudyQCarotidarteryplaquecomposition-relationshiptoclinicalpresentationandultrasoundB-modeimaging,五wrJKiwc￡Womsc5W^.1995;10:23-30MathiesenEB，BonaaKH,JoakimsenO.Echolucentplaquesareassociatedwithhighriskofischemiccerebrovasculareventsincarotidstenosis:theTromsostudy,GVrw/加'wz.2001;103:2171-2175HandbergA,LevinK,HojlundK,Beck-NielsenH.Identificationoftheoxidisedlow-densitylipoproteinscavengerreceptorCD36inplasma:Anovelmarkerofinsulinresistance.CzTrw/^'ow.2006;114:1169-1176GlintborgD，HojlundK,AndersenM，HenriksenJE,Beck-NielsenH,HandbergA.SolubleCD36andriskmarkersofinsulinresistanceandatherosclerosisareelevatedinpolycysticovarysyndromeandsignificantlyreducedduringpioglitazonetreatment.D/"Z"esC^e.PublishedonlineaheadofprintNovember13,2007.Collot-TeixeiraS,MartinJ,McDermot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