專利名稱：慢病毒載體的生產(chǎn)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)慢病毒載體的方法。
背景技術：
慢病毒例如I型人類免疫缺陷病毒是很有希望的基因治療工具，這 是因為它們能夠轉導并整合至分裂細胞及非分裂細胞的基因組中。然而， 用于大規(guī)模臨床應用的復制缺陷慢病毒載體的生產(chǎn)仍面臨著挑戰(zhàn)。慢病
毒載體的生產(chǎn)通常通過以多種不同質(zhì)粒構建體共轉染293T人胚腎細胞 實現(xiàn)。最初的臨床慢病毒載體生產(chǎn)是基于一個雙質(zhì)粒體系(Lu W n/.， 2004)。為了進一步提高該體系的安全性，可以將慢病毒基因組分至4個 質(zhì)粒中。這些質(zhì)粒為自失活轉移載體、包含^^-/^/的包裝質(zhì)粒、rev質(zhì) 粒以及通常編碼水泡性口膜炎病毒糖蛋白G (VSV-G)的包膜糖蛋白質(zhì) 粒。為了大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒，已通過貼壁細胞的生長將其變成細胞工廠 (cell factory )。此外，已在無血清的條件下使用3-L生物反應器在懸浮 培養(yǎng)物中瞬時地生產(chǎn)出慢病毒載體。
由于用于病毒生產(chǎn)的瞬時轉染體系可能存在問題并且很費時，已經(jīng) 開始嘗試開發(fā)穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)體系。然而，慢病毒蛋白酶和融合包膜 蛋白VSV-G的毒性妨礙了組成型載體的生產(chǎn)。 一種生產(chǎn)方法是使用受四 環(huán)素誘導型啟動子體系或蛻皮激素誘導型啟動子體系控制的誘導型包裝 細胞系。其他的生產(chǎn)方法涉及將毒性VSV-G蛋白替換為低毒糖蛋白。
慢病毒載體還可以被多種病毒表面蛋白假型化。最常用的是水泡性 口膜炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)。另外，多種不同的包膜糖蛋白例 如來自？反轉錄病毒(如貓內(nèi)源性反轉錄病毒RD114env、改良的長臂 猿白血病病毒GalV或莫洛尼小鼠白血病病毒MLV)、曱病毒、狂犬病 病毒或桿狀病毒的包膜糖蛋白也已用于假型慢病毒載體。
假型化可擴大慢病毒的轉導范圍，在多種不同細胞和組織中已經(jīng)獲 得了長時間的轉基因表達(Delenda， 2004 )。假型化還可強化脆弱的慢病毒，使得可通過超速離心濃縮獲得高效價。
桿狀病毒在基因送遞應用方面具有多個優(yōu)點。它們具有大插入容量
(> 100 kb )并且能夠轉導大多數(shù)哺乳動物細胞系——甚至是無血清條件 下的大規(guī)模懸浮細胞培養(yǎng)物(Scotte/fl/.，2007)。另外，桿狀病毒易于以 大規(guī)模及高效價生產(chǎn)，并且由于它們不能在哺乳動物細胞中復制而很少 呈現(xiàn)安全問題。幾乎不能檢測到細胞毒性，甚至在較高感染復數(shù)(MOI) 的情況下也是如此。
桿狀病毒已經(jīng)被用于昆蟲細胞中的大規(guī)模蛋白的生產(chǎn)，以及用于病 毒樣顆粒(VLP)例如肝炎VLP的生產(chǎn)。已經(jīng)使用雜交桿狀病毒產(chǎn)生出 了完整病毒。在哺乳動物細胞中，桿狀病毒介導的重組流感病毒、腺病 毒(Cheshenko C "/， 2001)和AAV ( Auang " "/， 2007 )的生產(chǎn)已經(jīng)有記 載。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明， 一種生成慢病毒載體的方法，包括將慢病毒轉移構 建體、gflg、 po/、包膜蛋白和"v中的每一種分別地克隆至相同的桿狀病 毒或不同的桿狀病毒中，并且以這些桿狀病毒或每種桿狀病毒轉導生產(chǎn) 細胞。


以下的附示說明了本發(fā)明的實施方案。
圖1的示意圖顯示了克隆的桿狀病毒供體質(zhì)粒BAC-轉移體 (transfer), BAC陽gag-pol、 BAC-VSVg和BAC國rev。 圖2的示意圖為桿狀病毒介導的慢病毒的生產(chǎn)。
具體實施例方式
為了實施本發(fā)明的方法，所述桿狀病毒必須包含慢病毒轉移構建 體、g"g、戶八合適的包膜蛋白和/w。
術語"慢病毒轉移構建體"應是本領域技術人員已知的。慢病毒轉移 構建體是慢病毒RNA基因組/慢病毒載體RNA和轉基因盒的來源。慢病 毒轉移構建體的一個實例是LV1-GFP。用于產(chǎn)生慢病毒轉移構建體的方 法亦應是本領域技術人員已知的。術語"包膜蛋白"應是本領域技術人員已知的。包膜蛋白是保護病毒
的核酸的蛋白質(zhì)。適合在本發(fā)明中使用的包膜蛋白的一個實例為VSV-G。 術語"生產(chǎn)細胞"應是本領域技術人員已知的。適合在本發(fā)明中使用 的生產(chǎn)細胞的實例有293T細胞、H印G2細胞、CHO細胞、BHK細胞、 Sf9細胞、Sf21細胞、293細胞、BTI-Tn 5 B 1-4細胞、COS細胞、NIH/3T3 細胞、Vero細胞、NSO細胞或PerC6細胞。而且，生產(chǎn)細胞可以;故貼 壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。
優(yōu)選地，生產(chǎn)本發(fā)明的功能性慢病毒需要的所有元件被克隆至3種 不同的桿狀病毒中。更優(yōu)選地，它們被克隆至2種不同的桿狀病毒中， 并且最優(yōu)選地，它們被克隆至單種桿狀病毒中。這可通過將BAC-轉移 體、BAC-gag-pol、 BAC-VSVg和BAC-rev的特征合并至單種桿狀病毒 中實現(xiàn)。
已經(jīng)構建了 4種源自苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(爿"tog/7i/;/^ cfl/^/bf"/cflf multicapsid nucleopolyhedrovirus ) ( AcMNPV )的重組軒狀病 毒BAC-轉移體、BAC-gag-pol、 BAC-VSVg和BAC-rev。它們可編碼 在哺乳動物細胞中生成慢病毒載體需要的所有元件。通過用這些桿狀病 毒轉導293T細胞，已經(jīng)產(chǎn)生了功能性慢病毒。
由于生產(chǎn)容易、桿狀病毒的濃度、在無血清條件下對懸浮哺乳動物 細胞的有效轉導以及安全性這些原因，桿狀病毒技術是規(guī)模化病毒生產(chǎn) 的有吸引力的選擇。慢病毒載體的生產(chǎn)還可以采用編碼或展示病毒蛋白 rev、 tat、 net、 vit或vpu的桿狀病毒來實現(xiàn)，其方式為但不限于將所述 病毒蛋白與一種桿狀病毒蛋白融合。所述桿狀病毒蛋白可以是大包膜蛋 白gp64或者殼體蛋白vp39和p24。
所產(chǎn)生的慢病毒可以被異源蛋白或其他配體例如VSV-g、 gp64、親 和素、鏈霉親和素或生物素假型化。
以下的實施例舉例說明了本發(fā)明。 #存希才法
^ f4Z并炎'^毒^^在發(fā)
將用于在哺乳動物細胞中產(chǎn)生第3代慢病毒載體的所有必需元件 亞克隆至桿狀病毒供體載體pFastBacl中，以構建4種源自苜蓿丫紋夜 蛾核多角體病毒(AcMNPV)的重組桿狀病毒BAC-轉移體、 BAC-gag-pol、 BAC-VSVg和BAC-rev (圖1)。首先，將包含多克隆位點
(尸附證緒尸s/脂/I/4/ni /尸fld爭薩M/尸附c販oRI"/ml/5V"腸cI )的多聚接頭(polylinker)克隆至pFastBacl的獨特JvHI位點。該多 聚接頭的序列為
5'CACGTGGCTAGCCTGCAGGTCGACCTTAAGTTAATTAAACTAG TACGCGTGTTTAAACGAATTCGGGCCCATTTAAATGGCGCGCC-3 ，(SEQ ID No: 1 )。為了方便桿狀病毒效價測定，所述供體載體還包含受 多角體蛋白啟動子控制的紅色熒光蛋白標記基因(DsRed)。
為了生成第3代自失活慢病毒轉移構建體，來自質(zhì)粒 LV國hPGK國ANGFP-WPRE-SIN (Makinen， 2006 )的(LV1-GFP ) ANGFP 被GFP替換。在該構建體中，GFP標記基因受磷酸甘油酸激酶(PGK) 啟動子驅(qū)動。pBAC-轉移體載體的構建通過將來自LV1-GFP的相關序列 分兩階段亞克隆至pFastBacl供體栽體多聚接頭中實現(xiàn)。為了克隆所述 序列的第一部分，將LV1-GFP用5srBI和消化并亞克隆至所述供 體載體多聚接頭的Sh^I""I位點中。所述序列的第二部分的克隆是通 過將LV1-GFP用」wl和^rll消化，并將片段插入至所述改良的 pFastBacl質(zhì)粒的和JwII位點中。
由CMV啟動子驅(qū)動表達和的包裝構建體(pBAC-gag-pol) 源自通過^/;"Ll消化的質(zhì)粒pMDLg/pRRE( Follenzi and Naldini， 2002 )， 將該構建體亞克隆至所述供體載體的S附/I位點。在連接之前，將J/mLl 端用T4DNA聚合酶(Finnzymes， Helsinki, Finland )平端化。
將來自質(zhì)粒pCMV-VSVG的VSV-G包膜構建體分兩階段亞克隆至 pFastBacl栽體中。首先，將pCMV-VSVG以JVWl消化并使用T4 DNA 聚合酶平端化，然后以五co/ I消化。將該片段亞克隆至所述多聚接頭的 S附/I/五coRI位點。將所述序列的第二部分用五"RI從pCMV-VSVG上 消化下，并亞克隆至多聚接頭E^RI位點。
使用正向引物和反向引物通過聚合酶鏈反應(PCR)從質(zhì)粒 pRSV-REV (Dull W /， 1998 )獲得Rev cDNA。所述正向引物為 5'CGAAGGAATTCGTCGCdCATGGCAGGAAGAAGCGGA-3' ( SEQ ID No: 2)。 rev基因的第l-18位核苷酸的序列為粗體，Kozak共有序列 為斜體，五coRI位點以下劃線示出。所述反向引物為 5'AGCTAGCTAGCGTATTCTCCTGACTCCAATATTGT-3' ( SEQ ID No:3)。 rev基因的第349-325位核苷酸的序列為粗體，并且A^d位點以下 劃線示出。將擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)五"RI和A7^1消化，4吏用Wizard Clean up試劑盒(Promega， Madison, WI， USA)純化，并亞克隆至所述 pFastBacl多聚接頭的五"RI/A7^I位點，以形成pBAC-rev。 Rev cDNA 受CMV啟動子的控制，所述CMV啟動子在之前作為pcDNA3載體 (Invitrogen)的A^"I/f"RI片段被亞克隆至pFastBacl多聚接頭的 5Wfll/五coRI位點。
將293T細胞鋪板接種24 h，然后進行轉導。將細胞在都補加有10% 胎牛血清(FBS )的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM )或RPMI 1640 中培養(yǎng)。在無血清或補加血清的DMEM或RPMI中以每個細胞50-1000 pfu的不同感染復數(shù)(MOI)進行轉導。在37。C下于無血清培養(yǎng)基中孵 育4 h后或者于補加血清的DMEM或RPMI中孵育18 h后，洗滌細胞 并更換培養(yǎng)基。在轉導后48h收集包含慢病毒的細胞上清液，并且在室 溫下以1500 rpm離心10 min。
作為對照，制備了未使用所述3種桿狀病毒(BAC-gag-pol、BAC-Rev 或BAC-VSVg)中的其中一種的數(shù)批培養(yǎng)上清。還通過常規(guī)的四質(zhì)粒瞬 時轉染方法(Follenzi and Naldini， 2002 )在293T細胞中制備了慢病毒。 為了增強細胞在平板底部的貼附，依照制造商的說明書以多聚-L-賴氨酸 包,皮平板。
虔^#^放#浙定
慢病毒轉化單位(TU/ml)通過分析能夠轉導HeLa細胞的病毒顆粒 的數(shù)目確定。在第一天，將Hela細胞以每孔lxl()S個細胞接種于6孔板 中，或者以每孔5xl()S個細胞接種于96孔板中。在第二天以系列稀釋度 進行慢病毒轉導。在第五天以熒光顯微鏡觀察細胞并通過流式細胞儀分 析，以得出被表達GFP的慢病毒轉導的細胞的百分數(shù)。效價的計算如 Follenzi and Naldini， 2002中所述。
脊差萄^炎矽/^^S
將Hela細胞(5xl03 )接種于96孔板上，第二天以桿狀病毒產(chǎn)生的 慢病毒轉導，并將細胞培養(yǎng)至最多6周。通過流式細胞儀監(jiān)測GFP表達， 每周一次。作為另一個對照，還以表達GFP的桿狀病毒BAC-轉移體轉 導Hela細胞，并以類似的方式監(jiān)測表達情況。通過p24 ELISA試劑盒(NENTM Life Science Products HIV-1 p24 ELISA)確定慢病毒殼體蛋白p24的量(pg/ml)。通過p24ELISA測定 法對細胞培養(yǎng)上清液中有復制能力的慢病毒(RCL)進行測試。用慢病 毒轉導HeLa細胞，并通過流式細胞儀監(jiān)測轉導效率。將細胞培養(yǎng)4周， 收集上清液并且重復地測量該上清液中p24的濃度作為RCL的標示物。 這還通過以收集的上清液轉導原初HeLa細胞得到確證，并通過熒光顯 微鏡和流式細胞儀監(jiān)測GFP表達。
通過GraphPadPrism 4 ( GraphPad Software Inc., San Diego， CA，
USA)進行統(tǒng)計分析。
并炎'病#^>#建
將關鍵的第三代元件克隆至4種桿狀病毒中。通過限制分析驗證桿 狀病毒質(zhì)粒構建體，并且在昆蟲細胞中生產(chǎn)4種桿狀病毒。為了監(jiān)測桿 狀病毒生產(chǎn)的穩(wěn)定性，用針對桿狀病毒的大包膜蛋白的抗gp64抗體對每 一批細胞進行免疫印跡分析。在昆蟲細胞中對濃縮的桿狀病毒進行終點 效價測定(IU/ml)。產(chǎn)生的所有病毒都被測得為高效價(>101GIU/ml), 該測量的高效價被用于控制慢病毒生產(chǎn)中的MOI。
慢病毒的生產(chǎn)通過以4種桿狀病毒轉導293T細胞。使用不同的培養(yǎng) 基和孵育時間進行轉導。在轉導后20 h通過熒光顯微鏡監(jiān)測轉導效率。 在轉導后48 h收集包含慢病毒的上清液，并且測定在HeLa細胞中的效 價，作為轉導單位(TU/ml)。
當在無血清條件下進行4 h轉導時，MOI均為500的4種桿狀病毒 均產(chǎn)生平均為6.0xl05 TU/ml的慢病毒效價。MOI為750的桿狀病毒濃 度產(chǎn)生了平均為1.2 xl06 TU/ml的更高的慢病毒效價。在使用更高的桿 狀病毒濃度(4種桿狀病毒的MOI均為1000 )時，檢測到了效價的降低。 當桿狀病毒被過夜轉導時，MOI為250的4種桿狀病毒產(chǎn)生平均為 2.5X106 TU/ml的最高效價。當RPMI培養(yǎng)基被用于轉導時，MOI為50 時就以達到平均為5.9xl05 TU/ml的最高效價。這些效價與由常規(guī)的四質(zhì) 粒轉導方法(Follenzi and Naldini， 2002 )產(chǎn)生的效價是相當?shù)?。不同的質(zhì)粒比可影響質(zhì)粒轉染中的效價。當使用與通常使用的質(zhì)粒
比相同的桿狀病毒比的時候，慢病毒效價比預期的低0.64倍。還將BAC-轉移體病毒加倍，以觀察是否能獲得更高的慢病毒效價。然而，所述效 價與用相似劑量的桿狀病毒進行生產(chǎn)相比沒有顯著不同。以加倍量的 BAC-轉移體獲得的效價平均為1.4xl06 TU/ml。
作為陰性對照，每次不使用其中一種桿狀病毒(BAC-gag-pol、 BAC-Rev或BAC-VSVg)進行慢病毒生產(chǎn)。收集的培養(yǎng)基被用于轉導 HeLa細胞，并且在轉導后四天通過流式細胞儀對GFP陽性細胞的數(shù)目 (% )進行分析。在這些實驗中未測定到GFP陽性細胞。
經(jīng)常使用的慢病毒生物效價(TU/ml)的滴定方法是通過ELISA測 量p24濃度(pg/ml)。 p24在培養(yǎng)基中的濃度為191 ± 105 ng/ml，這與 代表性病毒制品的值相當。然而，p24濃度沒有將生物活性顆粒分開。 為了比較感染顆粒和p24比率，從以不同量或比例的桿狀病毒產(chǎn)生的多 種制品測量了這兩個參數(shù)。結果顯示出良好的TU/p24比率。
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在收集的慢病毒培養(yǎng)基中殘留的桿狀病毒通過終點效價測定進行評 估，并且效價為用于293T細胞轉導的劑量的0.1-0.5%。為了確證轉基 因表達源自所產(chǎn)生的慢病毒，而不是源自殘留的桿狀病毒，將293T細 胞僅以BAC-轉移體桿狀病毒轉導。然后，將HeLa細胞以通過類似于慢 病毒制備中的方式收集的培養(yǎng)基進行轉導，在轉導后4天以流式細胞儀 對GFP陽性細胞進行分析。未檢測到GFP陽性細胞。
桿狀病毒載體不會在脊推動物細胞中復制，并且它們無法整合至宿 主的基因組中。來自這些栽體的基因表達是瞬時的，通常在兩周內(nèi)消失。 然而，來自整合的慢病毒的轉基因表達是相對穩(wěn)定的，被認為不會出現(xiàn) 轉基因表達的沉默。桿狀病毒產(chǎn)生的慢病毒轉導可導致有效的GFP表 達，這在轉導后43天后仍能觀察到(圖5A)。在第三天還通過熒光顯微 鏡在HeLa細胞中檢測到了表達。在轉導后17天，MOI為100和1000 (在第3天分別位18.7±1.9%和11.5±0.4 % )時桿狀病毒介導的GFP表 達消失。
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有復制能力的慢病毒(RCL)的測試是通過p24ELISA測定法進行 的。將H6La細胞以包含慢病毒的培養(yǎng)基轉導。通過流式細胞儀確證轉導效率。將細胞培養(yǎng)4周，并重復地測量上清液中p24的濃度。p24濃 度升高表明病毒復制的進行，但沒有檢測到這種升高。將2.5周后收集 自轉導的HeLa細胞的培養(yǎng)基進一步用于轉導原初HeLa細胞，但用熒 光顯微鏡或流式細胞儀均未檢測到GFP表達。
總之，已證明，使用雜交桿狀病毒可成功地生成功能性慢病毒。由 桿狀病毒產(chǎn)生的慢病毒的效價與使用常規(guī)的四質(zhì)粒轉染方法產(chǎn)生的效價 是相當?shù)?。當使用最佳劑量的桿狀病毒及延長的轉導時間的時候，獲得 了良好的慢病毒效價。當使用高劑量的桿狀病毒的時候，觀察到慢病毒 效價的降低及細胞死亡。這一點可能歸因于VSV-G對生產(chǎn)細胞的毒性。 當不使用表達VSV-G的桿狀病毒時沒有出現(xiàn)問題，桿狀病毒顆粒的總數(shù) 保持不變。通過以RPMI 1640替換DMEM培養(yǎng)基，最低的桿狀病毒劑 量(MOI50)產(chǎn)生最佳的慢病毒效價。這一點與這樣的事實是一致的， 即轉導培養(yǎng)基可影響桿狀病毒介導的基因在脊推動物細胞中的表達。為 了確證所生成慢病毒的功能性，HeLa細胞被轉導，持續(xù)的GFP表達出 現(xiàn)6周。然而，用對照桿狀病毒時，GFP表達在17天內(nèi)消失。如果通 過不使用BAC-gag-pol、 BAC-Rev或BAC-VSVg來生產(chǎn)慢病毒，則無慢 病毒產(chǎn)生。
雖然桿狀病毒是安全的，但是慢病毒制品被桿狀病毒污染是不希望 的。在所述慢病毒制品中殘留的桿狀病毒的量僅為簡單慢病毒生產(chǎn)方案 中使用的桿狀病毒劑量的0.1-0.5%,所述簡單慢病毒生產(chǎn)方案中的293T 細胞在桿狀病毒轉導后僅被洗滌一次。通過簡單地增加額外的洗滌步驟 或者使用合適的下游純化策略，可進一步降低殘留的桿狀病毒。
與使用慢病毒載體相關的一個主要關注點是生成人致病性病毒的可 能性。為了避免這一點，將慢病毒基因組分至4個不同的生產(chǎn)質(zhì)粒中， 目的是使通過重組形成RCL的風險最小。在桿狀病毒生成的慢病毒制品 中沒有檢測到RCL。 p24水平在延長培養(yǎng)后沒有增加，在轉導后2.5周 內(nèi)沒有檢測到GFP表達。
用貼壁細胞進行用于臨床研究的病毒規(guī)?；a(chǎn)仍很困難。因此， 使慢病毒生產(chǎn)與懸浮細胞培養(yǎng)物相適應將是有利的。在無血清條件下 HEK293細胞適應的懸浮物中的初步結果顯示了十分有效的桿狀病毒轉 導效率(95.1% GFP陽性細胞)。Delenda, 2004. J. Gene /Wee/. 6 Suppl 1: S125-S138.
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Cheshenko, 3/, Gene The/", 8， 846-854 (2001).
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Dull,甜a/.丄Wra/. 72, 8463-8471 (1998).
權利要求
1.一種生成慢病毒載體的方法，包括將慢病毒轉移構建體、gag、pol、包膜蛋白和rev中的每一種分別地克隆至相同的桿狀病毒或不同的桿狀病毒中，并且以這些桿狀病毒或每種桿狀病毒轉導生產(chǎn)細胞。
2. 根據(jù)權利要求l的方法，其中所述包膜蛋白為VSV-G。
3. 根據(jù)權利要求2的方法，其中所述慢病毒轉移構建體、gtfg、 /^/、 VSV-G和rev被分別地克隆至BAC-轉移體、BAC-gtfg-/w/、 BAC-VSVg 和BAC-rev中。
4. 根據(jù)權利要求1的方法，其中所述慢病毒轉移構建體、g"g、 /^/、 所述包膜蛋白和"v的每一種均被克隆至所述相同的桿狀病毒中。
5. 根據(jù)前述任一項權利要求的方法，其中所述生產(chǎn)細胞為293T細 胞、HepG2細胞、CHO細胞、BHK細胞、Sf9細胞、Sf21細胞、293 細胞、BTI-Tn 5 B 1-4細胞、COS細胞、NIH/3T3細胞、Vero細胞、NSO 細胞或PerC6細胞。
6. 根據(jù)前述任一項權利要求的方法，其中所述慢病毒轉移構建體為 第3代慢病毒轉移構建體。
全文摘要
本發(fā)明是一種生成慢病毒載體的方法，包括將慢病毒轉移構建體、gag、pol、包膜蛋白和rev的每一種分別地克隆至相同的桿狀病毒或不同的桿狀病毒中，并且以這些桿狀病毒或每種桿狀病毒轉導生產(chǎn)細胞。
文檔編號C12N15/79GK101631863SQ200880004377
公開日2010年1月20日 申請日期2008年2月11日 優(yōu)先權日2007年2月12日
發(fā)明者H·P·萊施, K·J·艾瑞尼, S·艾拉赫圖阿拉 申請人:Ark治療學有限公司