專利名稱：：與慢性骨髓增殖性疾病相關(guān)的突變型核酸和慢性骨髓增殖性疾病的評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與慢性骨髓增殖性疾病(chronicmyeloproliferativedisorder;CMPD)相關(guān)的新的突變型核酸和CMPD的評^介方法。
背景技術(shù)：
：近年來，嘗試了通過基因分析對各種疾病進(jìn)行診斷。通過這種方法，通過例如分析特定基因是否有特定突變，可以評價是否發(fā)病以及發(fā)病的可能性。因此，對于所有疾病，進(jìn)行顯示與該發(fā)病有相關(guān)性的基因突變的鑒定。據(jù)報道，JAK2(Janus激酶2)基因中的特定突變是與真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemiavera;PV)，原發(fā)性血小板增多癥(essentialthrombocythemia;ET),原發(fā)性骨髓纖維化癥(idiopathicmyelofibrosis;IMF)等慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)有相關(guān)性的突變(非專利文獻(xiàn)l~4)。該突變是JAK2蛋白質(zhì)的第617位的纈氨酸(V)被苯丙氨酸(F)替代的突變(JAK2V617F)，存在于JAK2基因的JH2區(qū)域，外顯子12的第73位的鳥噤呤即除去內(nèi)含子的ORF(開放閱讀框)的序列中的第2343位的鳥噤呤被胸腺嘧啶替代。而且，據(jù)稱該突變引起與造血細(xì)胞的增加相關(guān)的JAK-STAT途徑的活化，實際上，已有報道稱，在西方各國，PV患者的6599。/0、ET患者的23。/。~72%、和IMF患者的35%~57%都有突變JAK2V617F。然而，患者中存在著盡管顯示出JAK2V""陰性，但也患有CMPD的情況。尤其是，在日本人和西方人中，例如PV患者和ET患者等的血栓現(xiàn)象、出血現(xiàn)象、發(fā)展為急性白血病等臨床特征不同，而且據(jù)報道日本人的JAK2V""陽性患者的CMPD發(fā)病的概率比西方人要低。非專利文獻(xiàn)1:TeffedA.HematologyAmSocHematolEducProgram.2006;240-245.非專利文獻(xiàn)2:BaxterEJ,ScottLM,CampbellPJ等人，Lancet.2005;365:1054-1061.非專利文南史3:KralovicsR，PassamontiF，BuserAS等人,NEnglJMed.2005;352:1779-1790.非專利文獻(xiàn)4:LevineRL，WadleighM,CoolsJ等人，CancerCell.2005;7:387-397.
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供一種與CMPD相關(guān)的新的突變基因，尤其是在JAK2V617F陰性患者中與CMPD相關(guān)的新的突變基因，以及通過檢測該基因來評價CMPD的CMPD評價方法。為了實現(xiàn)前述目的，本發(fā)明的突變型核酸的特征在于，由選自于下述(i)~(iii)構(gòu)成的組中的至少一種核酸構(gòu)成(i)由具有下述(a)和(b)中的任意一種突變的JAK2基因或具有前述突變的其片段構(gòu)成的核酸(a)序列號l中所述的堿基序列中的第2116位的G突變成A(b)序列號l中所述的堿基序列中的第2121位~第2126位的核苷酸殘基缺失(ii)由具有下述(c)突變的EPOR基因或具有前述突變的其片段構(gòu)成的核酸(c)序歹'j號4中所述的堿基序列中的第1641位的C突變成G(iii)由與前述(i)的核酸和(ii)的核酸中的至少一者互補(bǔ)的石成基序列構(gòu)成的核酸。本發(fā)明的突變型多肽的特征在于，由下述(I)或(II)中的任意一種多肽構(gòu)成(I)由具有下述(A)和(B)中的任意一種突變的JAK2蛋白質(zhì)或具有前述突變的其片段構(gòu)成的多肽(A)序列號2中所述的氨基酸序列中的第541位的Arg突變成Lys(B)序歹'J號2中所述的氨基酸序列中的第543位的Glu和第544位的Asp缺失(II)由具有下述(C)突變的EPOR蛋白質(zhì)或具有前述突變的其片段構(gòu)成的多肽(C)序列號5中所述的氨基酸序列中的第502位的Pro突變成Arg。本發(fā)明的CMPD的標(biāo)記物的特征在于，其含有本發(fā)明的突變型核酸或本發(fā)明的突變型多肽。本發(fā)明的CMPD評價方法是一種通過檢測生物試樣中的核酸和多肽中的至少一者的突變來評價CMPD的可能性的評價方法，其特征在于包括下述(X)和(Y)中的任意一個工序(X)檢測前述試樣中有無本發(fā)明的突變型核酸的工序(Y)沖企測前述試樣中有無本發(fā)明的突變型多肽的工序。本發(fā)明的評價用試劑盒是用于評價CMPD的評價用試劑盒，其特征在于，其包括下述探針或引物中的至少一種探針，所述探針為含有選自于前述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變的多核苷酸或由與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，且所述探針能與本發(fā)明的突變型核酸雜交；引物，所述引物為含有選自于前述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變的多核香酸或由與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，且所述引物能與本發(fā)明的突變型核酸雜交。而且，本發(fā)明的評價用試劑盒的特征在于，其含有以本發(fā)明的突變型多肽作為抗原的抗體。本發(fā)明人等進(jìn)行了積極研究，結(jié)果在人JAK2(Janus激酶2)基因和人EPOR(erythropoietinreceptor,促紅細(xì)月包生成素受體)基因中發(fā)現(xiàn)了與CMPD相關(guān)的新突變，從而完成了發(fā)明。本發(fā)相關(guān)，因此可作為CMPD的標(biāo)記物使用。而且，通過檢測該突變，可評價CMPD發(fā)病的可能性。尤其是，由于在以往報道的JAK2V""為陰性的CMPD患者中能檢測到這些突變，因此通過本發(fā)明的突變型核酸和突變型多肽的4全測，對于即使在JAK2V617F的檢測中無法評價的JAK2V617F陰性患者，也可以評價CMPD發(fā)病的可能性。因此，例如通過將JAK2V""和本發(fā)明中的突變組合在一起進(jìn)行一企測，可以更準(zhǔn)確地進(jìn)行評價。因此，本發(fā)明在臨床醫(yī)療等領(lǐng)域中，可以說是極為有用的技術(shù)。而且，本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明中的突變、以及突變與疾病的相關(guān)性。圖l是本發(fā)明的實施例l中的JAK2基因的模式圖和突變位點的示意圖。圖2是本發(fā)明的實施例1中的EPOR基因的模式圖和突變位點的示意圖。具體實施方式本發(fā)明中，作為慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)，可以列舉例如原發(fā)性骨髓纖維化癥(idiopathicmyelofibrosis;IMF)、原發(fā)性骨髓纖維化癥(primarymyelofibrosis;PMF)等骨髓纖維癥(myelofibrosiswithmyeloidmetaplasis;MMM),真寸生纟工纟田胞增多癥、真性多血癥(PV)、繼發(fā)性絕對性紅細(xì)胞增多癥、繼發(fā)性紅細(xì)月包增多癥(secondaryabsolutepolycythemia)、應(yīng)激性紅細(xì)胞增多癥、應(yīng)激性多血癥(stresspolycythemia)等紅細(xì)胞增多癥、多血癥(polycythemia),原發(fā)性血小板增多癥(essentialthrombocythemia;ET),高嗜酸性粒細(xì)胞綜合征(hypereosinophilicsyndrome:HES)等。<突變型核酸和標(biāo)記物〉本發(fā)明的突變型基因，如前所述，其特征在于，由選自于下述(i)~(iii)構(gòu)成的組中的至少一個核酸構(gòu)成(i)由具有下述(a)和(b)中的任意一種突變的JAK2基因或具有前述突變的其片段構(gòu)成的核酸(a)序列號l中所述的堿基序列中的第2116位的G突變成A(b)序列號l中所述的堿基序列中的第2121位~第2126位的核苷酸殘基缺失(ii)由具有下述(c)突變的EPOR基因或具有前述突變的其片段構(gòu)成的核酸(c)序列號4中所述的堿基序列中的第1641位的C突變成G(iii)由與前述(i)的核酸和(ii)的核酸中的至少一者互補(bǔ)的；咸基序列構(gòu)成的核酸。本發(fā)明人等新發(fā)現(xiàn)的基因突變(a)~(c)分別是(a)人JAK2基因的置換突變、(b)人JAK2基因的缺失突變、和前述(c)EPOR基因的置換突變。前述序列號1的堿基序列是JAK2基因的DNA序列(有義《連)，為除去內(nèi)含子的cDNA序列。在前述序列號l的堿基序列中，堿基t為堿基u的序列是JAK2基因的內(nèi)含子被剪切了的成熟mRNA的序列。在前述序列號l的堿基序列中，第495位~第3893位的區(qū)域為CDS。前述CDS的堿基序列示于序列號3。JAK2基因的序列例如登錄于NCBI，登錄號為No.NM—004972。另一方面，前述序列號4的堿基序列為EPOR基因的DNA序歹'J(有義鏈)，是除去內(nèi)含子的cDNA序列。在前述序列號l的堿基序列中，堿基t為堿基u的序列是EPOR基因的內(nèi)含子被剪切了的成熟mRNA的序列。在前述序列號4的堿基序列中，第137位~第1663位的區(qū)域是CDS。前述CDS的堿基序列示于序列號6。在序列號6中，第1~第72位的堿基序列是編碼EPOR蛋白質(zhì)信號部分的序列，第73~第1527位的石威基序列是編碼成熟EPOR蛋白質(zhì)的序列。EPOR基因的序列例如登錄于NCBI,登錄號為No.NM—000121。在本發(fā)明的突變型核酸被翻"^爭時，由于前述(a)突變，JAK2蛋白質(zhì)的全長氨基酸序列中的第541位的Arg變?yōu)長ys,由于前述(b)突變，JAK2蛋白質(zhì)的全長氨基酸序列中的第543位的Glu和第544位的Asp缺失。而且，在本發(fā)明的突變型核酸被翻譯時，由于前述(c)突變，EPOR蛋白質(zhì)的全長氨基酸序列中的第502位的Pro變?yōu)锳rg。以下，將前述(a)突變稱為"R541K"或"JAK2R541K"，將前述(b)突變稱為"E543-D544del"或"JAK2E543-D544del",將前述(c)突變稱為"P478R"或"EPORP47811，，。在前述(a)~(c)中，序列號1或4的堿基序列用于規(guī)定JAK2基因或EPOR基因中的新的突變位點，本發(fā)明的突變型核酸的序列不限于它們的全長序列。因此，本發(fā)明的突變型核酸只要具有前述任意一個突變即可，可以是序列號1或4的堿基序列構(gòu)成的全長基因，也可以是其部分序列構(gòu)成的多核苷酸。作為具體例子，還可以列舉例如由序列號3或序列號6所示的CDS或其部分序列構(gòu)成的多核苷酸。作為前述(i)的片段，可以列舉例如序列號1中所述的堿基序列中含有第2116位的堿基(A)的5~10000個連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，優(yōu)選8~1000個連續(xù)的石威基序列構(gòu)成的多核苷酸，更優(yōu)選IO~100個連續(xù)的石威基序列構(gòu)成的多核苷酸。而且，作為前述(ii)的片段，可以列舉例如序列號4中所述的堿基序列中含有第2121位~第2126位的核苷酸殘基缺失的5~1OOOO個連續(xù)的石威基序列構(gòu)成的多核苷酸，優(yōu)選8~1000個連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，更優(yōu)選10~100個連續(xù)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸。而且，本發(fā)明的突變型核酸例如可以是JAK2基因的反義鏈或其片段構(gòu)成的核酸，也可以是EPOR基因的反義鏈或其片段構(gòu)成的核酸。此時，作為本發(fā)明的突變型核酸，如前述(iii)所示，可以列舉由與前述(i)的核酸和(ii)的核酸中的至少一者互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸。另外，本發(fā)明中的突變型核酸只要具有前述任意一個突變即可，不僅可以是序列號l所示的堿基序列構(gòu)成的基因、序列號3所示的不含內(nèi)含子序列的堿基序列構(gòu)成的基因、它們的片段、以及由序列號4所示的堿基序列構(gòu)成的基因、序列號6所示的不含內(nèi)含子序列的堿基序列構(gòu)成的基因或它們的片段，還可以是例如含有內(nèi)含子的基因、其片段或它們的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的核酸。此外，本發(fā)明的突變型核酸不限于DNA,例如還可以是RNA。本發(fā)明的突變型核酸是突變型RNA時，例如，如前所述，序列號l、序列號3、序列號4或序列號6的堿基序列中，"t"為"u"。而且，前述突變型核酸例如可以是原本包含于前述試樣中的DNA或RNA。而且，DNA例如可以是由原本包含于前述試樣中的DNA通過PCR等核酸擴(kuò)增法合成的DNA,也可以是由原本包含于前述試樣中的RNA(總RNA、mRNA等)通過RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)等合成的cDNA。其次，本發(fā)明的慢性骨髓增殖性疾病標(biāo)記物的特征在于，其含有本發(fā)明的突變型核酸。如前所述，由于本發(fā)明的突變型核酸中的突變顯示出與慢性骨髓增殖性疾病發(fā)病的相關(guān)性，因此本發(fā)明的突變型核酸可作為慢性骨髓增殖性疾病的標(biāo)記物使用。因此，如后所述，通過例如檢測其是否存在，可以評價前述疾病的發(fā)病和發(fā)病可能性。<突變型多肽>本發(fā)明的突變型多肽，如前所述，其特征在于由下述(I)或(II)的任意一種多肽構(gòu)成。該突變型多肽是例如前述的本發(fā)明的突變型核酸的表達(dá)產(chǎn)物。(I)由具有下述(A)和(B)中的任意一種突變的JAK2蛋白質(zhì)或具有前述突變的其片段構(gòu)成的多肽(A)序列號2中所述的氨基酸序列中的第541位的Arg突變成Lys(B)序列號2中所述的氨基酸序列中的第543位的Glu和第544位的Asp在夬失(II)由具有下述(C)突變的EPOR蛋白質(zhì)或具有前述突變的其片段構(gòu)成的多肽(C)序列號5中所述的氨基酸序列中的第502位的Pro突變成Arg。本發(fā)明人等新發(fā)現(xiàn)的多肽的突變(A)~(C)分別是(A)13人JAK2蛋白質(zhì)的置換突變、(b)人JAK2蛋白質(zhì)的缺失突變、和前述(c)EPOR蛋白質(zhì)的置換突變。前述序列號2的氨基酸序列是JAK2蛋白質(zhì)的氨基酸序列，該序列例如登錄于NCBI，登錄號為No.NM—004972。前述序列號5的氨基酸序列是EPOR蛋白質(zhì)的氨基酸序列，例如登錄于NCBI,登錄號為No.NM—000121。在前述序列號5中，第l位~第24位的氨基酸序列是EPOR蛋白質(zhì)的信號序列，第25~第508位是除去信號序列的成熟EPOR蛋白質(zhì)的序列。在前述(A)~(C)中，序列號2或5的氨基酸序列是用于規(guī)定突變的位點，本發(fā)明的突變型多肽的序列不限于它們的全長序列。因此，本發(fā)明的突變型多肽只要具有前述任意一個突變即可，可以是序列號2或5的氨基酸序列構(gòu)成的全長多肽(蛋白質(zhì))，也可以是其部分序列構(gòu)成的多肽片段。而且，作為具體例子，還可以列舉序歹'J號5的第25~第508位的成熟EPOR蛋白質(zhì)或其部分序列構(gòu)成的多肽片段。其次，本發(fā)明的慢性骨髓增殖性疾病標(biāo)記物的特征在于含有本發(fā)明的突變型多肽。如前所述，由于本發(fā)明的突變型多肽中的突變顯示出與慢性骨髓增殖性疾病發(fā)病的相關(guān)性，因此本發(fā)明的突變型多肽可作為慢性骨髓增殖性疾病的標(biāo)記物-使用。因此，如后所述，通過例如檢測其是否存在，可以評價前述疾病的發(fā)病和發(fā)病可能性?！碈MPD評價方法〉本發(fā)明的CMPD評^介方法是一種通過一全測生物試樣中的核酸和多肽中的至少一者的突變來評價CMPD的可能性的評價方法，其特征在于包括下述(X)和(Y)中的任意一個工序(X)檢測前述試樣中有無本發(fā)明的突變型核酸的工序，(Y)檢測前述試樣中有無本發(fā)明的突變型多肽的工序。本發(fā)明中，可以進(jìn)行本發(fā)明的突變型核酸和突變型多肽中的任意一者的檢測。在檢測到本發(fā)明的突變型核酸或突變型多肽時，例如可以判斷為是CMPD,或者有患CMPD的可能性，在檢測不到時，例如可以判斷為患CMPD的可能性低，或者沒有患CMPD可能性。而且，檢測本發(fā)明的突變型核酸的方法和檢測突變型多肽的方法都沒有特別限制，可以采用以往7>知的突變的一全測方法。供于本發(fā)明的試樣沒有特別限定，可以列舉例如白細(xì)胞等血細(xì)胞試樣、全血試樣、骨髓試樣等。而且，前述試樣優(yōu)選例如是人或人以外的哺乳類等的生物試樣。以下，對(X)工序和(Y)工序分別進(jìn)行說明，但其只是一個例子，并不限制本發(fā)明。(第l實施方式)作為第l實施方式，對前述(X)工序，即檢測前述試樣中有無本發(fā)明的突變型核酸的工序的其中一例進(jìn)行說明。對于前述試樣中有無突變型核酸，例如可以通過對前述試樣中的核酸^r測選自于下述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變來進(jìn)行。(a)序列號1中所述的堿基序列中的第2116位的G突變成A(b)序列號l中所述的堿基序列中的第2121~第2126位的核苷酸殘基缺失(c)序列號4中所述的堿基序列中的第164H立的C突變成G前述突變的一企測可以對任意一者進(jìn)4亍，也可以對兩種以上或全部突變進(jìn)^"。而且，優(yōu)選同時沖企測前述(a)和(b)突變。前述突變例如可以使用能與含有前述突變的區(qū)域特異性雜交的探針，通過進(jìn)行前述探針與前述試樣中的核酸的雜交來檢測。此時，在確認(rèn)了前述纟采針與前述試樣中的核酸雜交時，可以判斷為有突變，在沒有確認(rèn)到雜交時，可以判斷為沒有突變。作為前述探針，可以列舉，例如所述探針為含有前述(a)~(c)中任意一個突變的多核苷酸或與由其互補(bǔ)的石咸基序列構(gòu)成的多核苷酸，且所述探針能與含有前述突變的突變型核酸雜交。作為這種檢測方法，可以列舉例如侵入#r測法(Invader)法、Tm分析法等。而且，前述突變例如可以使用能與含有前述突變的區(qū)域特異性雜交的引物，通過進(jìn)行以前述試樣中的核酸作為模板的核酸擴(kuò)增反應(yīng)來檢測。此時，通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增產(chǎn)物時，可以判斷為有突變，在沒有獲得擴(kuò)增產(chǎn)物時，可以判斷為沒有突變。作為前述引物，可以列舉，例如所述引物為含有選自于前述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變的多核苷酸或由與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，且所述引物能與含有前述突變的突變型核酸雜交。作為這種方法，可以列舉例如ASP(allelespecificprimer,等位基因特異性引物)-PCR法等。此時，作為前述引物，優(yōu)選使用例如在其3，區(qū)域，尤其優(yōu)選3，端或3，端起的第l個堿基或第2個堿基的位點上具有前述突變堿基或與前述突變石成基互補(bǔ)的石威基的引物。此外，可以列舉對于前述試樣中的核酸，擴(kuò)增出含有發(fā)生檢測目的的突變的位點的區(qū)域，分析擴(kuò)增產(chǎn)物的全堿基序列的直接測序法、焦磷酸測序法，在溫度梯度柱中對前述擴(kuò)增產(chǎn)前述核酸擴(kuò)增方法沒有任何限制，可以列舉例如PCR法、NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)法、TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)16法、SDA(鏈取代擴(kuò)增)法等。而且，核酸擴(kuò)增反應(yīng)的條件沒有特別限制，可以通過以往^^知的方法進(jìn)4亍。(第2實施方式)作為第2實施方式，對于前述(Y)工序，即纟全測前述試樣中是否有本發(fā)明的突變型多肽的工序的其中一例進(jìn)行說明。前述試樣中有無突變型多肽，例如可以通過對前述試樣中的多肽外企測選自于下述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變來進(jìn)行。(A)序列號2中所述的氨基酸序列中的第541位的Arg突變成Lys(B)序列號2中所述的氨基酸序列中的第543位的Glu和第5444立的Asp缺失(C)序列號5中所述的氨基酸序列中的第502位的Pro突變成Arg前述突變的纟企測可以對任意一者進(jìn)行，也可以對兩種以上或全部突變進(jìn)行。而且，優(yōu)選同時檢測前述(A)和(B)突變。多肽中的突變例如可以使用以本發(fā)明的突變型多肽作為抗原的抗體，通過前述抗體與前述試樣中的多肽的抗原抗體反應(yīng)來4全測。此時，在確認(rèn)了前述抗體與前述試樣中的多肽的抗原抗體反應(yīng)時，可以判斷為有突變，在沒有確認(rèn)到抗原抗體反應(yīng)時，可以判斷為沒有突變。抗體的種類沒有特別限定，可以使用單克隆抗體、多克隆抗體等。作為抗原抗體反應(yīng)的方法，沒有限制，可以列舉免疫印跡法、免疫細(xì)胞化學(xué)法等?！碈MPD評價用試劑盒>作為本發(fā)明的CMPD評價用試劑盒，可以列舉例如可以在本發(fā)明的突變型核酸的檢測中使用的第l評價用試劑盒和可以在本發(fā)明的突變型多肽的檢測中使用的第2評價用試劑盒。本發(fā)明的第l評價用試劑盒，如前所述，是用于評價慢性骨髓增殖性疾病的評價用試劑盒，其特征在于其包括下述探針或引物中的任意一者探針，所述探針為含有選自于下述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變的多核苷酸或由與其互補(bǔ)的磁<基序列構(gòu)成的多核苷酸，且所述探針能與本發(fā)明的突變型核酸雜交；引物，所述引物為含有選自于下述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變的多核苷酸或由與其互補(bǔ)的石威基序列構(gòu)成的多核香酸，且所述引物能與本發(fā)明的突變型核酸雜交。另夕卜，本發(fā)明的第2評價用試劑盒，如前所述，其特征在于含有以本發(fā)明的突變型多肽作為抗原的抗體。通過使用這些本發(fā)明的評價用試劑盒，可以簡便且容易地進(jìn)行本發(fā)明的CMPD評價方法。而且，引物、J笨針和抗體與前述相同。前述本發(fā)明的第l評價用試劑盒的構(gòu)成沒有特別限制，例如，還可以含有核酸擴(kuò)增所必需的引物、DNA聚合酶、dNTPs、各種添加劑等。而且，本發(fā)明的第2評價用試劑盒的構(gòu)成也沒有特別限制，例如，還可以含有用于才全測前述抗體的二抗、用于檢測抗體所帶有的標(biāo)記的酶和底物等。另外，本發(fā)明的評價用試劑盒還可以再含有使用說明書。實施例下面，對本發(fā)明的實施例進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明不受下述實施例的限制。[實施例1]從通過公知的基準(zhǔn)診斷的PV患者(n=52)、ET患者(n=55)、IMF患者(n=3)、CMPD-未分類(CMPD-U)患者(n=15)和高嗜酸性粒細(xì)胞綜合征(hypereosinophilicsyndrome:HES)(n=5)的共計130名患者中制備出基因組DNA。另外，從正常人中制備基因組DNA。而且，分別用QIAampDNAMini試劑盒(商品名，QIAGEN公司制)從由患者中采集的骨髓的血沉棕黃層中才是耳又患者的基因組DNA，從由正常人中釆集的末梢血粒細(xì)胞中提取正常人的基因組DNA。而且，正常人基因組DNA作為正常對照使用，使用突變分析裝置(愛科來公司制)，進(jìn)行突變和多態(tài)性的分析。為了分析130名患者的基因組DNA的JAK2V""的突變，按照常規(guī)方法(BaxterEJ等人，AcquiredmutationofthetyrosinekinaseJAK2inhumanmyeloproliferativedisorders.Lancet.2005;365:1054-1061)進(jìn)行ASP-PCR法和直接測序法。并且，用TOPOTA克隆試劑盒(商品名；Invitrogen公司制)，將PCR產(chǎn)物導(dǎo)入到pCR(注冊商標(biāo))2.1-TOPO載體中，通過對獲得的重組質(zhì)粒測序，確認(rèn)前述PCR產(chǎn)物的序列。通過前述分析，在52名PV患者中的31名(59.6%)、55名ET患者中的28名(50.9%)、3名IMF中的l名(33.3%)、15名CMPD-U患者中的5名(33.3%)、5名HES患者中的1名(20%)中確認(rèn)了JAK2V617F。根據(jù)該結(jié)果，如前所述，確認(rèn)了JAK2V""陽性的日本PV患者的發(fā)病率(59.6%)低于西方人的發(fā)病率(65~99%)。接著，對JAK2V""陰性的CMPD患者的基因組DNA進(jìn)行突變分析。其結(jié)果是，在JAK2V""陰性的PV患者中確認(rèn)了序列號1中的第2116位(序列號3的CDS中的第1621位)的核苷酸殘基G被A替代(JAK2R541K),序列號1中的第2121~第2126位(序歹'J號3的CDS中的第1625~第1630位)的核苷酸殘基(計6bp)缺失的突變(JAK2E543—D544del)。圖l中示出了JAK2基因的部分區(qū)域的模式圖和測序結(jié)果。圖l中，箭頭指示新發(fā)現(xiàn)的突變(jAK2R541KE543-D544del)的位置。在圖l中，左側(cè)的堿基序列是野生型等位基因的序列，右側(cè)的堿基序列是突變型等位基因的序列。而且，添加下劃線的密碼子是發(fā)生突變的密碼子。如圖l所示，JAK2R5411^。JAK2E543-D544del在JAK2基因的外顯子12(含有非轉(zhuǎn)錄區(qū)域的外顯子1和2時，為外顯子14)內(nèi)，是存在于SH2功能域和蛋白激酶1功能域之間的新突變。該突變與已才艮道的缺失突變相鄰(ScottLM等人，JAK2exon12mutationsinpolycythemiaveraandidiopathicerythrocytosis.NEnglJMed.2007;356:459-468)。而且，由于序列號1中的第2116位的G被A代換，序列號2中的第541位的氨基酸殘基由精氨酸(R)被賴氨酸(L)代換。從正常人中沒有檢測到這些突變JAK2""k和JAK2E543—D544del。檢測到突變的一名患者，其臨床特征示于下表l。其結(jié)果，如下表l所示，盡管該患者是JAK2V""陰性PV患者，但與JAK2V617F陽性患者一樣，可以確認(rèn)呈現(xiàn)PV中典型的臨床特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>WBC:白細(xì)胞數(shù)(/lU)RBC:紅細(xì)胞數(shù)(X10Vul)Hb:血紅蛋白濃度(mg/100ml)Ht:紅細(xì)胞比容(％)PLT:血小板數(shù)(X104/H1)然后，對于前述CMPD患者，進(jìn)行EPOR基因的全測序。其結(jié)果是，從兩名JAK2V617F陰性ET患者中確認(rèn)了序列號3中的第1641位(序列號6的CDS中的第1505位)的核苷酸殘基C被G替代的突變(EPORP5Q2R)。圖2中示出了EPOR基因的部分區(qū)域的模式圖和測序結(jié)果。粗箭頭表示新發(fā)現(xiàn)的突變(EPORP478K)的位置，Y表示基因中的酪氨酸殘基的位置。圖中的堿基序列是野生型等位基因的序如該圖所示，EPORP，R從脯氨酸變?yōu)榫彼帷Ｔ撏蛔兪谴嬖谟贓POR基因的胞漿結(jié)構(gòu)域的作為負(fù)調(diào)控區(qū)域的外顯子8中的新突變。而且，由于序列號3中的第1641位的C被G替代，序列號4中的第502位的氨基酸殘基由脯氨酸變?yōu)榫彼帷Ｔ谡Ｈ酥袥]有檢測到該突變EPORP5G2R。如上所述，在JAK2V617F陰性CMPD患者中發(fā)現(xiàn)了JAK2R541K、JAK2E543-D544de>EPORP5()2R,因此通過這些突變的檢測，對迄今為止無法評價的JAK2V617FK性的試樣也可以進(jìn)行患CMPD的可能性的評價。而且，由于這些突變是在JAK2V""陰性CMPD患者中新發(fā)現(xiàn)的，因此認(rèn)為不屬于繼發(fā)突變。工業(yè)上利用的可能性如上所述，本發(fā)明的突變型核酸及其表達(dá)產(chǎn)物突變型多肽由于與CMPD相關(guān)，因此可作為CMPD的標(biāo)記物使用。而且，通過對其進(jìn)行檢測，可以評價CMPD發(fā)病的可能性。尤其是，由于在以往報道的JAK2V""呈陰性的CMPD患者中檢測到這些突變，因此通過本發(fā)明的突變型核酸和突變型多肽的檢測，對于在JAK2V617F的檢測中無法評價的JAK2V617F陰性患者也可以評價CMPD發(fā)病的可能性。因此，本發(fā)明在臨床醫(yī)療等領(lǐng)域中可以說是極為有用的技術(shù)。而且，本發(fā)明人等首次發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明中的突變以及突變與疾病的相關(guān)性。權(quán)利要求1.一種突變型核酸，其由選自于下述(i)～(iii)構(gòu)成的組中的至少一個核酸構(gòu)成(i)由具有下述(a)和(b)中的任意一種突變的JAK2基因或具有前述突變的其片段構(gòu)成的核酸，(a)序列號1中所述的堿基序列中的第2116位的G突變成A，(b)序列號1中所述的堿基序列中的第2121位～第2126位的核苷酸殘基缺失；(ii)由具有下述(c)突變的EPOR基因或具有前述突變的其片段構(gòu)成的核酸，(c)序列號4中所述的堿基序列中的第1641位的C突變成G；(iii)由與前述(i)的核酸和(ii)的核酸中的至少一者互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的核酸。2.由下述(I)或(II)中任意一種多肽構(gòu)成的突變型多肽(I)由具有下述(A)和(B)中的任意一種突變的JAK2蛋白質(zhì)或具有前述突變的其片段構(gòu)成的多肽，(A)序列號2中所述的氨基酸序列中的第541位的Arg突變成Lys，(B)序列號2中所述的氨基酸序列中的第543位的Glu和第544位的Asp缺失；(II)由具有下述(C)突變的EPOR蛋白質(zhì)或具有前述突變的其片段構(gòu)成的多肽，(C)序列號5中所述的氨基酸序列中的第502位的Pro突變成Arg。3.—種慢性骨髓增殖性疾病的標(biāo)記物，其含有權(quán)利要求l所述的突變型核酸。4.一種慢性骨髓增殖性疾病的標(biāo)記物，其含有權(quán)利要求2所述的突變型多肽。5.—種評1介方法，其為通過^r測生物試樣中的核酸和多肽中的至少一者的突變來評價慢性骨髓增殖性疾病的可能性的評價方法，其特征在于，包括下述(X)和(Y)中任意一種工序(X)檢測前述試樣中有無權(quán)利要求l所述的突變型核酸的工序，(Y)檢測前述試樣中有無權(quán)利要求2所述的突變型多肽的工序。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的評價方法，其中，在前述(X)工序中，對前述試樣中的核酸，^r測選自于下述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變(a)序列號1中所述的堿基序列中的第2116位的G突變成A,(b)序列號l中所述的堿基序列中的第2121位~第2126位的核普酸殘基缺失，(c)序列號4中所述的堿基序列中的第1641位的C突變成G。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的評價方法，在前述(X)工序中，使用探針，所述探針為含有選自于前述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變的多核普酸或由與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，且所述探針能與權(quán)利要求l所述的突變型核酸雜交，通過前述4罙針與前述試樣中的核酸的雜交來才企測前述突變8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的評價方法，在前述(X)工序中，使用引物，所述引物為含有選自于前述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變的多核苷酸或由與其互補(bǔ)的石咸基序列構(gòu)成的多核苷酸，且所述引物能與權(quán)利要求l所述的突變型核酸雜交，通過以前述試樣中的核酸作為才莫板的核酸擴(kuò)增反應(yīng)來檢測前述突變。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的評價方法，前述引物在其3，區(qū)域中具有前述突變堿基或與前述突變堿基互補(bǔ)的^咸基。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的評價方法，在前述(Y)工序中，對于前述試樣中的多肽，檢測選自于下述(A)~(C)構(gòu)成的組中的至少一個突變(A)序列號2中所述的氨基酸序列中的第541位的Arg突變成Lys,(B)序列號2中所述的氨基酸序列中的第543位的Glu和第544位的Asp擊夬失，(C)序列號5中所述的氨基酸序列中的第502位的Pro突變成Arg。11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的評價方法，其中，在前述(Y)工序中，使用以權(quán)利要求2所述的突變型多肽作為抗原的抗體，通過前述抗體與前述試樣中的多肽的抗原抗體反應(yīng)來檢測前述突變。12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的評價方法，其中，前述試樣是JAK2V""突變?yōu)殛幮缘纳镌嚇印?3.—種評價用試劑盒，其為用于評價慢性骨髓增殖性疾病的評價用試劑盒，其特征在于，包括下述引物或探針中的任意一種探針，所述探針為含有選自于下述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變的多核苷酸或由與其互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的多核香酸，且所述探針能與權(quán)利要求l所述的突變型核酸雜交；引物，所述引物為含有選自于下述(a)~(c)構(gòu)成的組中的至少一個突變的多核苷酸或由與其互補(bǔ)的石成基序列構(gòu)成的多核苷酸，且所述引物能與權(quán)利要求l所述的突變型核酸雜交。14.一種評價用試劑盒，其為用于評價慢性骨髓增殖性疾病的評價用試劑盒，其特征在于，含有以權(quán)利要求2所述的突變型多肽作為抗原的抗體。全文摘要提供一種與CMPD的發(fā)病相關(guān)的新的突變基因，尤其是盡管為JAK2^V617F陰性但CMPD發(fā)病的患者所具有的與CMPD的發(fā)病相關(guān)的新的突變基因以及評價CMPD的評價方法。通過檢測人來源的生物試樣中的JAK2基因或EPOR基因中的下述突變，來評價慢性骨髓增殖性疾病的可能性。(a)序列號1中所述的堿基序列中的第2116位的G突變成A，(b)序列號1中所述的堿基序列中的第2121位～第2126位的核苷酸殘基缺失，(c)序列號4中所述的堿基序列中的第1641位的C突變成G。文檔編號C12N15/09GK101617044SQ20088000546公開日2009年12月30日申請日期2008年10月31日優(yōu)先權(quán)日2007年11月7日發(fā)明者山口博樹,稻見光春申請人:愛科來株式會社;學(xué)校法人日本醫(yī)科大學(xué)