專利名稱：用于產(chǎn)生同質(zhì)糖蛋白的遺傳改良酵母的制作方法
用于產(chǎn)生同質(zhì)糖蛋白的遺傳改良酵母
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生具有優(yōu)化和同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白的遺傳改 良酵母。這些酵母包括Ochl基因的失活；通過同源重組整合含有第
一啟動子，和含有a-l-2甘露糖苷酶I的編碼序列的開放閱讀框的表達(dá)
盒到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中；以及含有不同于第一啟動子的第二啟動子和外 源糖蛋白的編碼序列的盒的整合。這些酵母允許產(chǎn)生優(yōu)化和同質(zhì)的 98%糖基化的EPO。
具有復(fù)合體型的聚糖的糖蛋白或糖肽類的產(chǎn)生，即與人類中的翻 譯后修飾加入的低聚糖相同的結(jié)構(gòu)，已經(jīng)是在制藥業(yè)中被尋求了相當(dāng) 多年的目標(biāo)。事實上，許多研究己經(jīng)表明低聚糖對于優(yōu)化治療性糖蛋 白的活性或一旦其被使用進(jìn)一步改善其半衰期的重要性。
例如，人類促紅細(xì)胞生成素(HuEPO)是在Asn-24, Asn-38和 Asn-83上含有三個N-糖基化位點和在Ser-126位點上有粘蛋白型的6>-糖基化位點的一個166個氨基酸的糖蛋白。EPO是一個研究,糖基化 顯著相關(guān)的模型，因為其糖基化結(jié)構(gòu)代表其40%的分子量。被認(rèn)為是 天然的EPO分子是尿的形式(uHuEPO) (Takeuchi等人，1988, Tusda 1988, Rahbeck-nielsen 1997)。重組EPO (rHuEPO)目前是在CHO細(xì) 胞中(Sasaki H等人，Takeuchi等人，1988)或在BHK細(xì)胞中(Nimtz 等人，1993)產(chǎn)生的。在細(xì)胞系中表達(dá)的rHuEPO具有不同于在uHuEPO 中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)的N-聚糖結(jié)構(gòu)。這些差別可以在體外有作用(Higuchi 等人.，1992; Takeuchi等人，1990)，但是通過去糖基化形式的嚴(yán)重失活 和通過與結(jié)構(gòu)中存在的唾液酸的數(shù)目相關(guān)的活性增加，在體內(nèi)似乎更 敏感(Higuchi M等人，1992)。
為了產(chǎn)生具有優(yōu)化的N-或O-糖基化的糖蛋白，提出了許多技術(shù)解 決方案?？梢蕴岬降氖峭ㄟ^不同的糖基轉(zhuǎn)移酶加入糖，例如半乳糖、 葡萄糖、果糖或甚至是唾液酸，或者通過抑制某種糖，例如用甘露糖 苷酶抑制甘露糖在體外修飾聚糖結(jié)構(gòu)。這一技術(shù)在WO 03/031464 (Neose)中有描述。但是可以令人懷疑的是如何大規(guī)模使用這一技術(shù)，因為其涉及對存在于同一糖蛋白上的幾個特定低聚糖的順序修飾的許多步驟。在每一步驟中，應(yīng)該實現(xiàn)反應(yīng)的嚴(yán)格控制，并且應(yīng)該保證同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生?，F(xiàn)在當(dāng)不得不在一個糖蛋白上修飾許多低聚糖的情況下，順序的反應(yīng)可以造成不合需要的和異質(zhì)的修飾。因此，這一技術(shù)和生物藥的制備不相容。另外，生產(chǎn)用純化酶的工業(yè)規(guī)模使用似乎不代表可行的經(jīng)濟(jì)選擇。
同樣適用于化學(xué)耦合技術(shù)，例如在WO 2006/106348和WO2005/000862文件中描述的那些技術(shù)。這些化學(xué)耦合技術(shù)包括單調(diào)冗長的反應(yīng)，保護(hù)/去保護(hù)步驟、多重檢查。當(dāng)不得不在特定的糖蛋白上修飾許多低聚糖的情況下，順序反應(yīng)也可以造成不合需要的和異質(zhì)的修飾。
應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞系，例如在WO 01/77181 (LFB)中描述的YB2/0或進(jìn)一步在WO 03/055993 (Kyowa)中經(jīng)遺傳修飾的CHO細(xì)胞系的其它技術(shù)已經(jīng)證明抗體的Fc區(qū)域的輕度巖藻糖基化增加ADCC活性100倍。但是，這些技術(shù)特定地與抗體的產(chǎn)生相關(guān)。
最后，已經(jīng)建議過通過用允許表達(dá)甘露糖苷酶和不同的糖基轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化這些微生物而在酵母或絲狀真菌中產(chǎn)生糖蛋白。這一方法在WO 02/00879 (Glycofi)中有描述。但是直到現(xiàn)在，還沒有證明這些微生物在生產(chǎn)臨床批量用的高容量的發(fā)酵罐中是隨時間穩(wěn)定的。另外，也沒有證明這種轉(zhuǎn)化可以產(chǎn)生具有所需的和同質(zhì)聚糖的糖蛋白。
為了產(chǎn)生具有N-聚糖結(jié)構(gòu)的rHuEPO的目的(具有這種結(jié)構(gòu)可以在體內(nèi)獲得最佳活性)，我們在遺傳改良的釀酒酵母(S.cmn^/ae)和栗酒裂殖酵母(S.pom&)中表達(dá)rHuEPO。這些酵母表現(xiàn)出具有同質(zhì)的和被很好研究了特征的N-糖基化單位的rHuEPO的強(qiáng)表達(dá)。在第二階段，根據(jù)其唾液酸化的水平，我們從遺傳改良酵母開始并且引入了其它改良以便產(chǎn)生更復(fù)雜的N-聚糖單位。已知酵母系統(tǒng)具有快速產(chǎn)生大量蛋白的能力，但是此后描述的改良酵母也對產(chǎn)生的蛋白有以"人源化"(humanized)和同質(zhì)的方式進(jìn)行N-糖基化的能力。另外，發(fā)現(xiàn)這些酵母在大規(guī)模的生產(chǎn)條件下是穩(wěn)定的。最后，在引起基因型回復(fù)
的突變情況下，這些酵母被建立為可以被同一地恢復(fù)，這在生產(chǎn)臨床用批量的范圍內(nèi)是必須的。因此，這是說明在整個發(fā)明中使用的靶向整合方法(特定是位點的)的第一個例子，該方法允許控制被打亂的和被選擇的基因組區(qū)域到一個核苷酸范圍內(nèi)，并且因此允許在自發(fā)的基因組回復(fù)的情況下恢
復(fù)打亂。該方法應(yīng)該與WO 02/00879中描述的方法是相反的，其方法為用一個序列庫轉(zhuǎn)化酵母菌株并且隨后無需任何基因組鑒定而選擇最佳克隆。
事實上，在WO 02/00879中整合是隨機(jī)的并且克隆以所產(chǎn)生蛋白的N-聚糖結(jié)構(gòu)的輪廓為基礎(chǔ)被專一地選擇，其包括，在突變、回復(fù)或任何其它遺傳改良的情況下，單純地和簡單地丟失感興趣的克隆。根據(jù)本發(fā)明所述技術(shù)的優(yōu)點是通過給他/她提供控制、追蹤遺傳改良的保證，并且特別是重建嚴(yán)格具有同樣容量的克隆的可能性，給使用者提供增加的安全性。
另外，我們首次提供了來自此后描述的Am61ie菌株的"按要求的聚糖"技術(shù)。在這些條件下，結(jié)構(gòu)的同質(zhì)性比在糖基化像哺乳動物的CHO系統(tǒng)中更重要。事實上，獲得的結(jié)果(見EPO光譜)報道了代表出現(xiàn)在蛋白上約98%的N-聚糖的Man5GlcNAc2型聚糖結(jié)構(gòu)。因此為加強(qiáng)糖基化設(shè)計了該系統(tǒng)以便以非常大的比例獲得所需的單位。
Am犯e菌株是用于產(chǎn)生人們希望得到的人源化的、雜交的或復(fù)合聚糖的任何其它菌株的基礎(chǔ)克隆。該菌株的優(yōu)點是形成起始點，其被證明是穩(wěn)定的和同質(zhì)的產(chǎn)生98%的Man5GlcNAc2糖蛋白的系統(tǒng)，根據(jù)所需的最終結(jié)構(gòu)，其可為其他修飾，例如引入GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖轉(zhuǎn)移酶、半乳糖和/或唾液酸轉(zhuǎn)移酶，根據(jù)需求快速的再加工。

發(fā)明內(nèi)容
表達(dá)盒構(gòu)建的實現(xiàn)是通過在ORF的5'位置整合一個啟動子序列和在3'位置整合一個終止序列。另一方面，將這些盒整合到酵母的基因組中是以同源重組的整合的目的通過將與靶向位點同源的序列加到末端來控制。
對于每個菌株和每個ORF，以獲得穩(wěn)定和最佳表達(dá)允許同質(zhì)糖基化糖蛋白的不同的酶為目的，已經(jīng)確定啟動子序列和整合序列。根據(jù)在圖2中顯示的常規(guī)模型(為構(gòu)建ORF的表達(dá)盒用的裝配PCR)，表達(dá)盒的構(gòu)建用幾個連續(xù)的PCR步驟完成。
通過整合亞細(xì)胞定位信號來部分修飾某個ORF序列，以此來表達(dá) (尋址)在間隔中活性為優(yōu)化的蛋白(環(huán)境，當(dāng)有供體，和底物等存 在時)。
因此，在第一方面，本發(fā)明涉及可以產(chǎn)生有Man5GlcNAc2的結(jié)構(gòu) 的同質(zhì)聚糖的糖蛋白的遺傳改良酵母，所述酵母包括下列改良
a) 通過同源重組將編碼一個抗生素(卡那霉素)抗性基因的異源 序列通過插入使編碼a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶的Ochl基因失活(delta-Ochl 菌株)；
b) 通過同源重組將表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括 選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmtl、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56，或 ADH2啟動子；含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體耙向序列的a-l-2-甘露糖苷酶I 編碼序列的開放閱讀框，以及轉(zhuǎn)錄終止子；
c) 通過同源重組整合表達(dá)盒到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選 自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmtl、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56，或 ADH2啟動子，所述c)中的啟動子與b)中的啟動子不同；含有需要 產(chǎn)生的外源糖蛋白的編碼序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子。
優(yōu)選地，上述酵母已經(jīng)整合了線蟲(C.五/egara)的a-l-2甘露糖 苷酶I，特別是含有SEQID:1的序列。發(fā)現(xiàn)這些酵母能夠產(chǎn)生具有98% 的Man5GlcNac2聚糖的糖蛋白
， Am61ie Manal,6\
Man a 1,6 / \ Manal，3 \
Man pi,4-GlcNAc (31,4-GlcNAc(31-Asn
Man al'3
有利地，a-l-2甘露糖苷酶1是在pGAP啟動子的控制下表達(dá)并且 、源蛋白糖蛋白是在pGALl啟動子的控制下表達(dá)。
12在下列描述中，對在技術(shù)領(lǐng)域中所用的縮寫作出參考Man^甘露 糖,GlcNac-N-乙酰-葡萄糖胺，Gal=半乳糖，F(xiàn)uc =巖藻糖和NANA 代表唾液酸或另外的N-乙酰神經(jīng)氨酸。
在第二方面，本發(fā)明的酵母包括另外的改良以便產(chǎn)生具有75%， 或甚至80%或進(jìn)一步95%或98%以上的GlcNacMan5GlcNAc2結(jié)構(gòu)的
糖蛋白
Man al，6
\
Man al,6 Mancd,3/ \
Man卩l(xiāng),4陽GlcNAc |31,4-GlcNAcpi-Asn
GlcNAc (31，2-Mana1^
為了這一目的，上面的菌株進(jìn)一步包含通過同源重組將表達(dá)盒整 合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26 的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56，或ADH2啟動子，含有編碼人類 N-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶I的編碼序列的，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的 靶向序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)選的，人類N-乙酰葡萄糖胺 基轉(zhuǎn)移酶I含有SEQID:2序列，無酶的胞質(zhì)部分，該胞質(zhì)部分被用于 蛋白的高爾基體定位的Mnn9的胞質(zhì)部分所代替。這一菌株被指定為 "Arielle"。 Arielle應(yīng)該也包含GlcNAc UDP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白盒(在下面描述) 以便合成這類聚糖。有利地是使用啟動子pGAP。 M皿9
Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaac:胞質(zhì)部分(SEQ ID: 13)。
上面的Am61ie菌株可以進(jìn)一步包括通過同源重組將表達(dá)盒整合到 營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀 酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmtl、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56，或ADH2啟動子，含有人類UDP-GlcNAc 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)選地人類 UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含有SEQID:3序列。優(yōu)選地，啟動子是PGK。這個菌株在此后被指定為"Agathe"。
在第三方面，本發(fā)明的菌株包括其它改良以便產(chǎn)生具有75%，或 甚至80%或進(jìn)一步95%或98%以上的GlcNacMan3GlcNAc2結(jié)構(gòu)的糖
蛋白
<formula>formula see original document page 14</formula>
同樣的，上述的Aridle酵母包括通過同源重組將表達(dá)盒整合到營 養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒 酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56，或ADH2啟動子，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾 基體靶向序列的甘露糖苷酶II編碼序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子。 優(yōu)選地，甘露糖苷酶II是小鼠的，特別地是含有SEQID:4的序列。優(yōu) 選地啟動子是TEF。這個菌株在此后被指定為"Anai's"。
在第四方面，本發(fā)明的酵母包括另外的改良以便產(chǎn)生具有75%， 或甚至80%或進(jìn)一步95%或98%以上的GlcNac2Man3GlcNAc2結(jié)構(gòu)的
糖蛋白
<formula>formula see original document page 14</formula>
在這一情況下，上述的AnaYs酵母包括通過同源重組將表達(dá)盒整合 到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的 釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56、或ADH2啟動子，含有N-乙酰葡萄糖 胺基轉(zhuǎn)移酶II的編碼序列的，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體的靶向序列的開 放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)選地，N-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶II是人類 的，特別地是含有SEQID:5的序列。優(yōu)選地啟動子是PMA1，這個菌 株在此后被指定為"Alice"。
在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明的Alice酵母包括另外的改良以便產(chǎn)生具有75%，或甚至80%或進(jìn)一步95%或98%以上的 Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2結(jié)構(gòu)的糖蛋白
Gal卩l(xiāng),4-GlcNAc卩l(xiāng),2
Man al:6
Man P]，4-GlcNAc pl，4-GlcNAcpi-Asn
Man a:l，3
z
Gal(3l，4-GlcNAc卩1,2 。
在這一情況下，上述的Alice酵母包括通過同源重組將表達(dá)盒整合 到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的 釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56、或ADH2啟動子，優(yōu)選地是CaMV啟 動子，含有半乳糖轉(zhuǎn)移酶I的編碼序列的，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體靶向 序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)選地，半乳糖轉(zhuǎn)移酶I是人類的， 特別地是含有SEQID:6的序列，其沒有人類的耙向序列。這一菌株被 指定為"Athena"。
有利地，前面提到的表達(dá)盒的整合是在選自(營養(yǎng)缺陷標(biāo)記選自) URA3、 ADE2、 LYS2、 LEU2、 TRP1、 CAN1、 ADOl、 HIS5、 HIS3、 ARG3、 MET17、 LEM3、 Mnnl、 Mnn9、 gmal2的整合標(biāo)記中實現(xiàn)的。 更有利地是將a-l-2甘露糖苷酶I的表達(dá)盒整合到URA3基因中，將 N-乙酰葡萄糖胺基轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá)盒整合到ADE1或ADE2基因中， 將UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒整合到LYS2基因中，將a-甘露糖 苷酶II的表達(dá)盒整合到LEU2基因中，將N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶II的 表達(dá)盒整合到LEM3或TRP1基因中。將P-l，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá) 盒整合到TRP1或MET17中。
另外，在構(gòu)建體中優(yōu)選使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中的靶向序列，其 是從含有SEQ ID:14的序列的Mntl基因的定位序列和含有SEQ ID:15 的終止子CYC1衍生來。
在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明上述的Alice和Athena酵母， 包括另外的改良以便產(chǎn)生具有75%，或甚至80%或進(jìn)一步95%或98% 以上的選自以下結(jié)構(gòu)的糖蛋白
15GlcNac2Man3GlcNAc2， Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2,或 GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2, Ashley菌株 Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2, Aurel菌株。
在這個情況下，上述的酵母包括通過同源重組將表達(dá)盒整合到營 養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒 酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56、或ADH2啟動子，或nmtl基因的啟動 子，含有a-l,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT8的編碼序列的，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾 基體中的靶向序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子，特別地是CYC1基因 衍生來的終止子。這些菌株可以有利地含有與下述的GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白相對應(yīng)的盒?？梢詫⑦@個盒整合到CAN1或HIS5中。
有利地，a-l,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT8是人類的，特別地是含有SEQ ID:7的序列。
另外，這個菌株應(yīng)該包括通過同源重組將表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷 標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括SV40啟動子，含有GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編 碼序列的，特別地是含有SEQID:8的序列的開放閱讀框?？梢詫⑦@個 盒整合到TRP1 、 ARG3或gmal2中。
在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明的上述酵母 GlcNac2Man3GlcNAc2 (Athena)和 Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2 (Aurel)，包括另外的改良以便產(chǎn)生具有75%，或甚至80%或進(jìn)一步95% 或98%以上的選自以下結(jié)構(gòu)的糖蛋白 NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 Aeron菌株 NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2 Avrel菌株
NANA Gal卩l(xiāng)，4-GlcNAcP 1,2 - Manal,6
Man pi,4-GlcNAc卩1，4- GlcNAc卩l(xiāng)-Asn
NANA Gal (31,4-GlcNAc (31,2_ Man od，3
在這個具體實施方式
中，上述的酵母包括通過同源重組將表達(dá)盒 整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括上述啟動子中的一個或含有
SEQ ID:9序列的皰疹病毒胸苷激酶的啟動子。含有a-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的編碼序列(ST3GAL4基因)的開放閱 讀框和轉(zhuǎn)錄終止子，特別是由含有SEQ ID:15序列的CYC1基因衍生 來的終止子。優(yōu)選地，唾液酸轉(zhuǎn)移酶是人類的(NM一006278)，特別地 是含有SEQ ID:10的序列。
在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明的上述酵母 Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 (Athena) 和
NANA2Gal2GlcNac2MAN3GLCNAc2 (Aeron)包括另外的改良以便產(chǎn)生具 有75%,或甚至80%或進(jìn)一步95%或98%以上的選自下列結(jié)構(gòu)的糖蛋 白
Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2 Azal6e菌株 NANA2Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2 A菌株
NANA Gal p t ,4-GlcNAc p i ，2——Man a 1,6
在這個具體實施方式
中，上述的酵母包括通過同源重組將表達(dá)盒 整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括上述的一個啟動子。
含有P-l,4-n-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶III的編碼序列的開放閱讀框和 轉(zhuǎn)錄終止子，特別地是由含有SEQ ID:15序列的CYCl基因衍生來的 終止子。優(yōu)選地，GNTIII是鼠類的，特別地是含有SEQID:27的序列。
如上面表明，根據(jù)本發(fā)明的酵母整合入表達(dá)外源糖蛋白或糖肽的 盒。糖蛋白可以選自治療用的糖蛋白如細(xì)胞因子、白介素、生長激素、 生長因子、酶和單克隆抗體、疫苗蛋白、可溶受體和所有類型的重組 蛋白。這可以是編碼EPO的序列，特別地是包含編碼EPO的SEQ ID:ll 的盒，該序列帶有SEQ ID:12， SEQ ID:12含有V5抗原決定簇和純化 用N-末端多HIS單位。
本發(fā)明還涉及藥物組合物，該組合物含有具有同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)的糖 蛋白，該結(jié)構(gòu)具有75%、 90%、 95%或進(jìn)一步98%以上的以下結(jié)構(gòu) Man5GlcNAc2， GlcNacMan5GlcNAc2, GlcNacMan3GlcNAc2,
dan卩l(xiāng),4-GlcNAc卩1.,4- GlcNAc|:U-AsnGlcNac2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2, NANA2Gal2GlcNac2Man3 GlcNAc2, GlcNac2Man3 (Fuc)GlcNAc2， Gal2GlcNac2Man3 (Fuc)GlcNAc2， NANA2Gal2GlcNac2Man3 GlcNAc2, Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2， NANA2Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2 。
本發(fā)明還涉及含有EPO作為活性成分的藥物組合物，所述的EPO 具有75%、 90%、 95%或進(jìn)一步98%以上的結(jié)構(gòu) NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2或 NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2。
本發(fā)明還涉及在發(fā)酵器中含有酵母培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)物 以及上述酵母。
在另一個方面，本發(fā)明涉及制備糖蛋白的方法，該糖蛋白具有同 質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有75%、 90%、 95%或進(jìn)一步98%以上的下列結(jié)
構(gòu)
Man5GlcNAc2，
GlcNacMan5GlcNAc2,
GlcNacMan3 GlcNAc2,
GlcNac2Man3 GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc之，
GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2,
Gal2GlcNac2Man3 (Fuc)GlcNAc2,
NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2,
Gal2GlcNac3Man3GlcNAc;
NANA2Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2
該方法包括在發(fā)酵器中培養(yǎng)上述酵母，和從培養(yǎng)基中提取所述糖蛋白。 該方法可以包括純化步驟。
最后，本發(fā)明還涉及上述酵母在發(fā)酵器中制備糖蛋白的用途，該 糖蛋白具有同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有75%、 90%、 95%或進(jìn)一步98% 以上的下列結(jié)構(gòu)
18Man5GlcNAc2,
GlcNacMan5GlcNAc2，
GlcNacMan3 GlcNAc2,
GlcNac2Man3 GlcN人c之，
Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2,
NANA2Gal2GlcNac2Man3 GlcNAc2,
GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2,
Gal2GlcNac2Man3 (Fuc)GlcNAc2,
NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2,
Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac3Man3 GlcNAc2 。
實施例1:創(chuàng)建編碼a-l，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶的Ochl基因的突變菌株 (delta-Ochl菌株)
用PCR擴(kuò)增卡那霉素的抗性基因并且在其兩端加入基因Ochl的 同源側(cè)翼區(qū)(

圖1)，該側(cè)翼區(qū)是每個釀酒酵母或栗酒裂殖酵母菌株的 特異區(qū)域。通過插入這個對抗生素卡那霉素有抗性的基因使得Ochl基 因無功能。將該基因整合到酵母的基因組中是通過電穿孔實現(xiàn)的然后 通過同源重組整合該感興趣的基因。
側(cè)翼區(qū)有約40個堿基并且允許在酵母基因組的Ochl基因的范圍
內(nèi)整合卡那霉素。
在含有5(Vg/mL的卡那霉素的培養(yǎng)基中選擇已經(jīng)整合了卡那霉素 抗性基因的菌株。然后我們通過PCR檢查在Ochl基因中卡那霉素抗 性基因的整合。抽提在培養(yǎng)基中卡那霉素存在時有抗性的克隆的基因 組DNA。選擇寡核苷酸以便在一方面檢查卡那霉素抗性基因的存在并 且在另一方面檢查確實將該基因整合到Ochl基因中。也檢測了野生菌 株的基因組DNA;我們擴(kuò)增了這些菌株的Ochl基因。該基因有1,100 bp。在已經(jīng)整合了卡那霉素盒的菌株中，觀察到的Ochl基因的擴(kuò)增更 長(1，500bp)。
實施例2:活性的檢測
2.1突變酵母菌株的Ochl的甘露糖轉(zhuǎn)移酶的活性另一個證實水平由于大多數(shù)時候的自發(fā)突變?nèi)缓笮枰x擇新克 隆，所以對于每個整合到酵母菌株基因組中的基因，進(jìn)行酶活性的系 統(tǒng)檢査，以便持續(xù)的跟蹤可能的活性水平波動。
可以通過體外分析檢測Ochl酶的活性。在前研究表明通過Ochl 酶轉(zhuǎn)移甘露糖的最好受體是MansGlcNAc2。從酵母的微粒體部分(100 )ig的蛋白)或從總蛋白的裂解液(200嗎)中，測定在MansGlcNAc2 結(jié)構(gòu)上的oc-l,6位置的甘露糖的轉(zhuǎn)移活性。為此，與氨基吡啶基團(tuán)結(jié)合 的Man8GlcNAc2(MsGN2-AP)用作受體并且用["C]-甘露糖標(biāo)記的GDP隱 甘露糖作為放射性甘露糖的供體分子。將微粒體或蛋白和供體(放射 性的GDP-甘露糖)，受體(Man8GlcN2-AP)和deoxymannojirimycin
(甘露糖苷酶I的抑制劑)在控制了 pH的緩沖培養(yǎng)基中孵育。在30°C 孵育30分鐘以后，在反應(yīng)培養(yǎng)基中加入氯仿和甲醇以便獲得3:2:1 (v/v/v)比例的CHCl3/MeOH/H20 。與水相對應(yīng)的上層相含有 Man8GlcNAc2-AP、放射性的Man9GlcNAc2-AP和GDP-["C]-甘露糖。 一旦干燥，樣品用100 的&0/1%乙酸吸收并且通過Sep-Pak C18
(Waters)柱，預(yù)先調(diào)整以便從形成的放射性Man9GlcNAc2-AP中分離 GDP-甘露糖(AP基團(tuán)允許該化合物保留在C18柱上)。通過用H20/1% 乙酸(20 mL)然后用20%甲醇/1%乙酸(4mL)洗脫，可以重新獲得 不同的組份并且用閃爍計數(shù)器計數(shù)。 2.2甘露糖苷酶的活性
通過在0.1 M的PBS， pH 6.5 +/- 120 DMJ (a-l,2-甘露糖苷酶I 抑制劑)+/- 12 SW (甘露糖苷酶II的特異抑制劑)中和4 mMp-硝基 苯基-a-D-甘露吡喃糖苷和100-200 pg的蛋白(來自總蛋白或亞細(xì)胞組 份)在37°C孵育4小時測定甘露糖苷酶的活性。在405 nm檢測吸收。
2.3 N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶活性
在酵母的微粒體組份上檢測GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的活性。在最終50 )iL 在有50 mM HEPES、 10 mM MnCl2、 0.1% TritonX-100的培養(yǎng)基中將 50 |ig的微粒體(BCA分析)和0.01 iaCi的供體(放射性UDP- GlcNAc)、 0.5 mM的受體(3-0-a-D-甘露-吡喃糖基-D-甘露吡喃糖苷)在30°C孵 育25分鐘。用400 的10 mM EDTA終止反應(yīng)，然后樣品通過Dowex AG-1X2柱。然后用3M的甲酸從柱上洗脫放射性受體并且用閃爍計數(shù)器測量放射性(
實施例3:線蟲的a-l-2甘露糖苷酶I的表達(dá)盒
構(gòu)建表達(dá)盒的解釋性圖表圖2
3.1步驟l:獲得ORF
a-甘露糖苷酶I:從具有質(zhì)粒pDONR201的細(xì)菌克隆進(jìn)行PCR (Open Biosystem)
程序
94°C 8分鐘
35個循環(huán) 94°C 20秒 65。C 30秒 72°C 2分鐘
72°C 10分鐘
擴(kuò)增1，644bp的片段 AAAGCAGGCatgggcctccgatcacacgaacaacttgtcgtgtgtgtoggagttatgtttcttctgactgtctgcatca cagcgttt
ttctttcttccgtcaggcggcgctgatctgtatttccgagaagaaaactccgttcacgttagagatgtgcttatcagagaggaaatt
cgtcgtaaagagc^gatgagttecggcggaaagccgacigaagccaatcccattccaattccaaaacctgaaattggagcat
cagatgatgcagaaggacgaagaattttcgtgaaacaaatgattaaattcgcatgggacggatatcggaaatatgcctggggg
gagaatgaattgaggcccaacagtagatcaggacattcttcatcgatatttgggtatggaaagacgggtgcaacaattattgatg
ctattgatacattgtatttggttggattaaaagaagaatataaagaggccagagactggattgctgattttgatttcaaaacgtctgc
gaaaggagatctatcagtttttgaaacaaatatccgattcactggtggcctactctccgcatttgcacttaccggagacaaaatgtt
cttga卿aagcagaagatgtggcaact愈ttcttccggcttttga犯ctccttctggaataccaaattcattaattgatgctcaa
acaggaagatccaaaacgtatagttgggcaagcggaaaggcaattctctcggaatacggttcaattcaacttgaattcgattatc
tctccaatctgactggaaatccagtttttgctcaaaaagctgataaaataagagatgttttaactgcaatggagaaaccagaagg
actttatccaatttatattactatggataatccaccaagatggggacaacatcttttctcaatgggtgcaatggctgacagttggtat
gaatatctgctcaaacaatggattgccactggt^aaaagatgatcgcacgaaaagagaatacgaagaagcgatatttgcaat
ggaaaaacgaatgcttttcaaatcggaacagtcgaatctttggtatttcgcaaaaatgaacggaaatcgcatggaacattcatttg
aacatcttgcatgcttttccggtggaatggttgttcttcatgcaatgaatgagaaaaataaaacaatatcagatcattatatgacgtt
gggaaaagaaattggtcatacatgtcatgaatcgtacgctagatccacaactggaatcggcccagaatccttccaattcacatc
gagtgtagaggcaaaaacagaacgtcgtcaggattcatattatattcttcgtcctgaagtcgttgagacatggttctacttgtgga
gggctacaaaagacgagaaatatcgacaatgggcttgggatcatgttcaaaatttggaggagtattgtaagggcactgccgga
tactctggaatccgaaacgtctacgaatcgagcccggaacaagatgatgtgcagcagtcattcctcttcgctgagctcttcaaat
atctgtatttaattttcagtgaagataacattcttccacttgatcaatgggttttcaataccgaagctcatccattccgs
attcggcatcacgacgagttgatt (SEQ ID:l)
抽提并且用SBIOgene試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且
21將其引入載體TOP02.1。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP10,Invitrogen)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(質(zhì)粒pGLY02.001)。
3.2步驟2:表達(dá)盒的裝配
兩個菌株的甘露糖苷酶I表達(dá)盒的整合將定位在營養(yǎng)缺陷標(biāo)記URA3中。該基因的失效導(dǎo)致對毒劑5-氟尿嘧啶的抗性。然后通過這個盒改良的酵母將對該藥有抗性但是對尿嘧啶還是營養(yǎng)缺陷的。
釀酒酵母的表達(dá)盒
-從野生釀酒酵母的基因組DNA中擴(kuò)增啟動子pGAPBS16(正向)禾卩BS17，(反向)
扁裝配啟動子pGAP (PCR產(chǎn)物)禾nORF (pGLY02.001)BS16(正向)和BS19'(反向)-從質(zhì)粒pYES2.1擴(kuò)增終止子CYC1BS40b (正向)和BS41(反向)
-裝配ORF (質(zhì)粒pGLY02.001)和終止子CYC1 (PCR產(chǎn)物)BS18(正向)和BS41 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY02.002)。
-用URA3的同源區(qū)(自弓l物)裝配啟動子-ORF (PCR產(chǎn)物)和ORF-終止子(pGLY02.002)
BS42 (正向)
BS43 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY02.004)。
栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒
-從野生栗酒裂殖酵母的基因組DNA中擴(kuò)增啟動子adhlBS25和BS26，(反向)
-裝配啟動子adhl (PCR產(chǎn)物)和ORF (pGLY02.001)BS25 (正向)和BS20 (反向)抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體TOP02.1。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP10,Invitrogen)。 用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢査PCR擴(kuò)增物插入載體 (pGLY02扁)。
-用ORF-CYCl (PCR產(chǎn)物)裝配產(chǎn)物啟動子-ORF (pGLY02.009) BS25 (正向)andBS41 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用 PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY02.011 )。
-用URA3同源的側(cè)翼區(qū)擴(kuò)增盒(pGLY02.011)
BS76 (正向)和BS77 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用 PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體。
3.3步驟3:酵母的轉(zhuǎn)化
-酵母感受態(tài)的制備 釀酒酵母Adde:
過程在OD-0.1接種500 ml的酵母并且在30°C孵育直到 5.5<OD<6.5。
在4°C 1500 g離心細(xì)胞5分鐘并且將它們重懸在500 ml的冷無菌 水中。
離心細(xì)胞并且將它們重懸在250 ml的冷無菌水中。 離心細(xì)胞并且將它們重懸在20ml的1M的山梨醇中。離心細(xì)胞并
且將它們重懸在1 ml的1M的山梨醇中。形成80 |iL的部分并且將它
們儲存在-8(TC。
栗酒裂殖酵母Edgar:
過程在OD=0.1接種200 mL的酵母并且在30°C孵育直到 OD=1.5。
在20°C 3,000 rpm離心5分鐘。在冷無菌水中洗細(xì)胞并離心，用 lm的山梨醇洗第二次。通過加入DTT孵育15分鐘以便達(dá)到最終25 mM (為了增加電感受性)。再繼續(xù)以形成在冷的1M山梨醇中的最終懸浮液(密度l-5.109細(xì)胞/mL:約5 mL)。形成40 |iL的部分并且在 -80°<:儲存約10管。
-通過電穿孔轉(zhuǎn)化酵母
對于每個表達(dá)盒，轉(zhuǎn)化酵母使用的DNA或者來自用所選的限制性 酶消化所述質(zhì)粒，或者直接來自在完全裝配后獲得的純化PCR產(chǎn)物。
釀酒酵母盒用限制性酶BamHI和Smal消化pGLY02.004。
用1嗎的DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母在冰上孵育5分鐘。用V=l,500 V給予脈沖。立即加入1 mL的冰冷無菌1 M的山梨醇并用巴斯德移液 管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中然后讓它們在30°C在Infors儀器中放 松至少1小時。將酵母涂布在選擇性培養(yǎng)基(含有10mM5-氟尿嘧啶， 5-FU的YPD)的碟子上。轉(zhuǎn)化體在4-6天內(nèi)出現(xiàn)。
栗酒裂殖酵母盒用100 ng的DNA (PCR產(chǎn)物)轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母 在冰上孵育5分鐘。將細(xì)胞和DNA轉(zhuǎn)移到電穿孔槽中。在V4,500V 給予脈沖并且立即加入0.9 mL冷的1M山梨醇。盡快將細(xì)胞涂布在合 適的培養(yǎng)基上(含有10mM5-FU的YPD)。轉(zhuǎn)化體在4-6天內(nèi)出現(xiàn)。
實施例4: Am61ie和Emma菌株+人類N-乙酰-葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶I 的表達(dá)盒
4.1步驟l:獲得ORF
從商業(yè)質(zhì)粒Biovalley (人類ORF克隆VI. 1)進(jìn)行PCR 程序
94°C 5分鐘
30個循環(huán) 94°C 60秒 56。C 60秒 72°C 2分鐘
72°C 5分鐘
無酶的胞質(zhì)部分的1,327 bp片段的擴(kuò)增。它將被蛋白的高爾基體 定位用的Mnn9的胞質(zhì)部分替代。
Mnn9胞質(zhì)區(qū)從野生釀酒酵母的基因組DNA進(jìn)行PCR 95°C 8分鐘
30個循環(huán)94°C 20秒58。C 30秒 72°C 1分鐘 72°C 10分鐘
擴(kuò)增51 bp的片段(Mnn9的胞質(zhì)部分)。 Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaac (SEO ID: 13) 從這兩個PCR擴(kuò)增物中
獲得單一片段
Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaacgcagggcttgtgctgtggggcgctatcctcttt
gtggcctggaatgccctgctgctcctcttcttctggacgcgcccagcacctggcaggccaccctcagtcagcgctctcgatgg
cgaccccgccagcctcacccgggaagtgattcgcctggcccaagacgccg鄉(xiāng)tggagctggagcggcagcgtgggctg
ctgcagcagatcggggatgccctgtcgagccagcgggggagggtgcccaccgcggcccctcccgcccagccgcgtgtgc
ctgtgacccccgcgccggcggtgattcccatcctggtcatcgcctgtgaccgcagcactgttcggcgctgcctggacaagctg
ctgcattatcggccctcggctgagctcttccccatcatcgttagccaggactgcgggcacgaggagacggcccaggccatcg
cctcctacggcagcgcggtcacgcacatccggcagcccgacctgagcagcattgcggtgccgccggaccaccgcaagttc
cagggctactacaagatcgcgcgccactaccgctgggcgctgggccaggtcttccggcagtttcgcttccccgcggccgtgg
tggtggaggatgacctggaggtggccccggacttcttcgagtactttcgggccacctatccgctgctgaaggccgacccctcc
ctgtggtgcgtctcggcctggaatgacaacggcaaggagcagatggtggacgccagcaggcctgagctgctctaccgcacc
gactttttccctggcctgggctggctgctgttggccgagctetgggctgagctggagcccaagtggccaaaggccttctggga
cgactggatgcggcggccggagcagcggcaggggcgggcctgcatacgccctgagatctcaagaacgatgacctttggcc
gcaagggtgtgagccacgggcagttctttgaccagcacctcaagtttatcaagctgaaccagcagtttgtgcacttcacccagc
tggacctgtcttacctgcagcgggaggcctatgaccgagatttcctcgcccgcgtctacggtgctccccagctgcaggtggag
aaagtgaggaccaatgaccggaaggagctgggggaggtgcgggtgcagtatacgggcagggacagcttcaaggctttcgc
caaggctctgggtgtcatggatgaccttaagtcgggggttccgagagctggctaccggggtattgtcaccttccagttccggg
gccgccgtgtccacctggcgcccccactgacgtgggagggctatgatcctagctggaattagcacctgcctgtccttc
(SEQ ID:2)
裝配PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物用QIAGEN試劑盒從瓊脂糖膠中純化并且弓I 入TOP02.1載體。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP10,Invitrogen)。 用PCR檢査轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入到載體 (pGLY03扁)。
4.2步驟2:表達(dá)盒的裝配
釀酒酵母的表達(dá)盒
釀酒酵母的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá)盒的整合將定位在營養(yǎng)缺陷標(biāo) 記ADE2中。該基因的失效導(dǎo)致酵母顏色變紅的改變并且對腺嘌呤仍 然是營養(yǎng)缺陷的。
-從釀酒酵母的基因組DNA中擴(kuò)增啟動子adh 1 。
25BS29 (正向)和BS30(反向)
-裝配啟動子adhl (PCR產(chǎn)物)和ORF (pGLY03扁): BS29 (正向)禾卩BS59
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用 PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY03.002)。
畫用終止子CYC1 (PCR產(chǎn)物)裝配ORF (pGLY03.001):
CA005 (正向)
BS41 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用 PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY03.011 )。
-用ADE2的同源延伸裝配啟動子-ORF (pGLY03.002)和ORF-終 止子(PCR產(chǎn)物):
BS67 (正向)和BS68 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用 PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY03.010)。
栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒
栗酒裂殖酵母的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá)盒的整合將定位在營養(yǎng)缺 陷標(biāo)記ADE1中。該基因的失效導(dǎo)致酵母顏色變紅的改變并且對于腺 嘌呤還是營養(yǎng)缺陷的。
4人質(zhì)粒pCDNA3.1中擴(kuò)增啟動子hCMV
BS62(正向)和BS58(反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用 PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY03.004)。
-用終止子CYCl (PCR產(chǎn)物)裝配hCMV-ORF(pGLY03.004)
BS62 (正向)和BS41 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢査PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY03.005)。 -用ADE1的同源延伸裝配表達(dá)盒(pGLY03.005): BS69 (正向)和BS70 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用 PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢査PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY03.007)。
4.3步驟3:酵母的轉(zhuǎn)化
-感受態(tài)酵母的制備
如上述制備Am61ie和Emma菌株以便使它們有感受態(tài)。
-釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的電穿孔
過程
含有釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒的20 pg質(zhì)粒用限制性酶 EcoRI消化。通過電穿孔在酵母Amdie和Emma中引入線性化的盒。 在含有必需氨基酸的YNB培養(yǎng)基上選擇酵母。
實施例5: Agathe和Eg6e菌株+ UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒 5.1步驟1:獲得ORF
程序
94°C 3分鐘
30個循環(huán)94°C 20秒 58。C 30秒 72°C 2分鐘
72°C 10分鐘
擴(kuò)增916bp的片段 atgttcgccaacctaaaatacgtttccctgggaattttggtctttcagactaccagtttggttctaacaatgcgttattccagaact ttaaaagaagaaggacctcgttatctatcttctacagcagtggttgttgctgaacttttgaagataatggcctgcattttattggtcta caaagacagcaaatgtagtc加gagcactgaatcgagtactacatgatgaaattcttaateaacctatggaaacactteaactt gctattccatcagggatctatactcttcagaataatttactgtatgtggcactatcaaatctagatgcagctacttatcaggtcacgt atcagttgaaaattcttacaacagcattattttctgtgtctatgcttagtaaaaaattgggtgtataccagtggctgtecctagtaattt tgatgacaggagttgcttttgtacagtggccctcagattetcagcttgattctaaggaactttcagctggttctcaatttgtaggact catggcagttctcacagcatgtttttcaagtggctttgctggggtttactttgagaaaatcttaaaaga^caaaacaatcagtgtg gataagaaatattcagcttggtttctttggaagtatatttggattaatgggtgtatacatttatgatggagaactggtatcaaagaat ggattttttcagggatataaccgactgacctggatagtagttgttcttcaggcacttggaggccttgtaatagctgctgttattaagtatgcagataatattttaaaaggatttgcaacctctttatcgataatattatcaacattgatctcctatttttggcttcaagattttgtgcca accagtgtct證ccttggagccatccttgtaa (SEQ ID:3)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體TOP02.1。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP10,Invitrogen)。 用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢査PCR擴(kuò)增物插入載體 (pGLY04細(xì))。
5.2步驟2:表達(dá)盒的裝配
釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的盒
釀酒酵母和栗酒裂殖酵母兩者UDP-GlcNAc的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)盒的 整合將定位在營養(yǎng)缺陷標(biāo)記LYS2中。該基因的失效導(dǎo)致對毒劑oc-氨基 己二酸的抗性。因此通過該盒改良的酵母將變得對該藥有抗性但是對 賴氨酸還是營養(yǎng)缺陷的。
-從質(zhì)粒pFL61擴(kuò)增啟動子PGK
BS95 (正向)和BS96 (反向)
-用終止子CYC1 (PCR產(chǎn)物)裝配ORF (pGLY04.001) CA017(正向)和BS41 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體TOP02.1。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP10，Invitrogen)。 用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體 (pGLY04纖)。
-用0RF-終止子CYC1片段(pGLY04.002)裝配啟動子PGK(PCR
BS95 (正向)和BS41 (反向)
-用釀酒酵母LYS2的同源延伸裝配表達(dá)盒
BS97(正向)和BS98 (反向)
栗酒裂殖酵母
BS99 (正向)
BS100 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Progema)。用 PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過對釀酒酵母的盒的測序(pGLY04.006)和對栗酒裂殖酵母的盒的測序(pGLy04.005)檢查PCR擴(kuò)增物插入載體。 5.3步驟3:酵母的改良
-感受態(tài)酵母的制備
如上述制備Agathe和Eg6e菌株以便使它們有感受態(tài) -酵母的電穿孔
含有釀酒酵母、栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒的20 )ig質(zhì)粒用限制性酶 EcoRI消化。通過電穿孔將線性化的盒引入到酵母Agathe和Eg6e中。 在含有必需氨基酸和a-氨基己二酸的YNB培養(yǎng)基上選擇酵母。
實施例6: Arielle和Erika菌株+a-甘露糖苷酶II的表達(dá)盒 6.1步驟l:獲得ORF
從小鼠肝的cDNA進(jìn)行PCR
程序
94°C 3分鐘
35個循環(huán)94°C 20秒 58。C 30秒 72°C 4分鐘
72°C 10分鐘
3,453 bp片段的擴(kuò)增 atgaagttaagtcgccagttcaccgtgtttggcagcgcgatcttctgcgtcgtaatcttctcactctacctgatgctggacagg ggtcacttggactaccctcggggcccgcgccaggagggctcctttccgcagggccagctttcaatattgcaagaaaagattga ccatttggagcgtttgctcgctgagaacaacgagatcatctcaaatatcagagactc3gtcatcaacctg3gcgagtctgtgga ggacggcccgcgggggtcaccaggcaacgccagccaaggctccatccacctccactcgccacagttggccctgcaggctg accccagagactgtttgtttgcttcacagagtgggagtcagccccgggatgtgcagatgttggatgtttacgatctgattccttttg ataatccagatggtggagtttggaagcaaggatttgacattaagtatgaagcggatgagtgggaccatgagcccctgcaagtg tttgtggtgcctcactcccataatgacccaggttggttgaagactttcaatgactactttagagacaagactcagtatatttttaataa catggtcctaaagctgaaagaagactcaagcaggaagtttatgtggtctgagatctcttaccttgcaaaatggtgggatattatag atattccgaagaaggaagctgttaaaagtttactacagaatggtcagctggaaattgtgaccggtggctgggttatgcctgatga agccactccacattattttgccttaattgaccaactaattgaagggcaccaatggctggaaaaaaatctaggagtgaaacctcga tcgggctgggccatagatccctttggtcattcacccacaatggcttatcttctaaagcgtgctggattttcacacatgctcatccag agagtccattatgcaatcaaaaaacacttctctttgcataaaacgctggagtttttctggagacagaattgggatcttggatctgct acagacattttgtgccatatgatgcccttctacagctacgacatccctcacacctgtgggcctgatcctaaaatatgctgccagttt gattttaaacggcttcctggaggcagatatggttgtccctggggagttcccccagaagcaatatctcctggaaatgtccaaagc agggctcagatgctattggatcagtaccggaaaaagtcaaaacttttccgcactaaagttctgctggctccactgggagacgac tttcggttcagtgaatacacagagtgggatctgcagtgcaggaactacgagcaactgttcagttacatgaactcgcagcctcatc
29tgaaagtgaagatccagtttggaaccttgtcagattatttcgacgcattggagaaagcggtggcagccgagaagaagagtagc
cagtctgtgttccctgccctgagtggagacttcttcacgtacgctgacagagacgaccattactggagtggctacttcacgtcca
gacctttctacaaacgaatggacagaataatggaatctcgtataagggctgctgaaattctttaccagttggccttgaaacaagct
cagaaatacaagataaataaatttctttcatcacctcattacacaacactgacagaagccagaaggaacttaggactatttcagc
atcatgatgccatcacaggaaccgcgaaagactgggtggttgtggactatggtaccagactctttcagtcattaaattctttggag
aagataattggagattctgcatttcttctcattttaaaggacaaaaagctgtaccagtcagatccttccaaagccttcttagagatg
gatacgaagcaaagttcacaagattctctgccccaaaaaattataatacaactgagcgcacaggagccaaggtaccttgtggtc
tacaatccctttgaacaagaacggcattcagtggtgtccatccgggtaaactccgccacagggaaagtgctgtctgattcggga
aaaccggtggaggttcaagtcagtgcagtttggaacgacatgaggacaatttcacaagcagcctatgaggtttcttttctagctc
atataccaccactgggactgaaagtgtttaagatcttagagtcacaaagttcaagctcacacttggctgattatgtcctatataata
atgatggactagcagaaaatggaatattccacgtgaagaacatggtggatgctggagatgccataacaatagagaatcccttc
ctggcgatttggtttgaccgatctgggctgatggagaaagtgagaaggaaagaagacagtagacagcatgaactgaaggtcc
agttcctgtggtacggaaccaccaacaaaagggacaagagcggtgcctacctcttcctgcctgacgggcagggccagccat
atgtttccctaagaccgccctttgtcagagtgacacgtggaaggatctactcagatgtgacctgtttcctcgaacacgttactcac
aaagtccgcctgtacaacattcagggaatagaaggtcagtccatggaagtttctaatattgtaaacatcaggaatgtgcataacc
gtgagattgtaatgagaatttcatctaaaataaacaaccaaaatagatattatactgacctaaatggatatcagattcagcctagaa
ggaccatgagcaaattgcctcttcaagccaacgtttacccgatgtgcacaatggcgtatatccaggatgctgagcaccggctca
cgctgctctctgctcagtctctaggtgcttccagcatggcttctggtcagattgaagtcttcatggatcgaaggctcatgcaggat
gataaccgtggccttgggcaaggcgtccatgacaataagattacagctaatttgtttcgaatcctcctcgagaagagaagcgct
gtgaacatggaagaagaaaagaagagccctgtcagctacccttccctcctcagccacatgacttcgtccttcctcaaccatccc
tttctccccatggtactaagtggccagctcccctcccctgcctttgagctgctgagtgaatttcctctgctgcagtcctctctacctt
gtgatatccatctggtcaacctgcggacaatacaatcaaagatgggcaaaggctattcggatgaggcagccttgatcctccaca
ggaaagggtttgattgccagttctccagcagaggcatcgggctaccctgttccactactcagggaaagatgtcagttctgaaac
ttttcaacaagtttgctgtggagagtctcgtcccttcctctctgtccttgatgcactcccctccagatgcccagaacatgagtgaag
tc犯cctgagccccatggagatc犯cacgttcc加tccgctt2C2ttggacctga (SEQ ID:4)
該ORF的擴(kuò)增是通過在小鼠肝cDNA上的巢式PCR (3,453 bp) 獲得并且通過酚/氯仿方法純化。將PCR產(chǎn)物引入到載體TOPO-XL中。 通過PCR檢查轉(zhuǎn)化體并且通過測序檢査PCR擴(kuò)增物插入到載體 (pGLY05扁)。
6.2步驟2:表達(dá)盒的裝配
釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的盒
兩個菌株甘露糖苷酶II的表達(dá)盒的整合將定位在營養(yǎng)缺陷標(biāo)記
LEU2中。該基因的失效導(dǎo)致對毒劑三氟亮氨酸的抗性。通過該盒改良 的酵母將因此對該藥變成有抗性但是對亮氨酸還是營養(yǎng)缺陷的。
-從釀酒酵母的基因組DNA中擴(kuò)增啟動子TEF
BS83 (正向)和BS84 (反向)
-用ORF (PCR產(chǎn)物)和終止子(PCR產(chǎn)物)裝配啟動子TEF (PCR抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109， Progenia)。用 PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(對釀酒酵母的 盒是pGLy05.008，對栗酒裂殖酵母的盒是pGly05.009)。
6.3步驟3:酵母的改良
-感受態(tài)酵母的制備
如上述制備Arielle和Erika菌株以便使它們有感受態(tài)。 酵母的電穿孔
過程含有釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒的20嗎質(zhì)粒用限制 性酶EcoRI消化。通過電穿孔將線性化的盒引入酵母Arielle和Erika
中。在含有釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的必需氨基酸和三氟亮氨酸(TFL) 的YNB培養(yǎng)基上選擇酵母。
實施例7: AnaYs和Enrique菌株+N-乙酰-葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶II表達(dá) 6.1步驟1:獲得ORF
從人類成纖維細(xì)胞的互補(bǔ)DNA進(jìn)行PCR-使用Taq聚合酶Isis ('Q畫Biogene)
程序
94°C 3分鐘
30個循環(huán)94°C 30秒
58。C 30秒
68°C 1.30分鐘
1,344 bp片段的擴(kuò)增 atgaggttccgcatctacaaacggaaggtgctaatcctgacgctcgtggtggccgcctgcggcttcgtcctctggagcagca atgggcg織a鄉(xiāng)aagaacgaggccctcgccccaccgttgctggacgccgaacccgcgcggggtgccggcggccgcg gtggggaccacccctctgtggctgtgggcatccgcagggtctccaacgtgtcggcggcttccctggtcccggcggtcccccagcccgaggcggacaacctgacgctgcggtaccggtccctggtgtaccagctgaactttgatcagaccctgaggaatgtagat
aaggctggcacctgggccccccgggagctggtgctggtggtccaggtgcataaccggcccgaatacctcagactgctgctg
gactcacttcgaaaagcccagggaattgacaacgtcctcgtcatctttagccatgacttctggtcgaccgagatcaatcagctga
tcgccggggtgaatttctgtccggttctgcaggtgttctttcctttcagcattcagttgtaccctaacgagtttccaggtagtgaccc
tagagattgtcccagagacctgccgaagaatgccgctttgaaattggggtgcatcaatgctgagtatcccgactccttcggcca
ttatagagaggccaaattctcccagaccaaacatcactggtggtggaagctgcattttgtgtgggaaagagtgaaaattcttcga
gattatgctggccttatacttttcctagaagaggatcactacttagccccagacttttaccatgtcttcaaaaagatgtggaaactg
aagcagcaagagtgccctgaatgtgatgttctctccctggggacctatagtgccagtcgcagtttctatggcatggctgacaag
gtagatgtgaaaacttggaaatccacagagcacaatatgggtctagccttgacccggaatgcctatcagaagctgatcgagtg
cacagacactttctgtacttatgatgattataactgggactggactcttcaatacttgactgtatcttgtcttccaaaattctggaaag
tgctggttcctcaaattcctaggatctttcatgctggagactgtggtatgcatcacaagaaaacctgtagaccatccactcagagt
gcccaaattgagtcactcttaBat3ataac3肌caatacatgtttccag肌actctaactatcagtgBaaagtttactgtggtagcc
atttccccacctagaaaaaatggagggtggggagatattagggaccatgaactctgtaaaagttatagaagactgcagtga
(SEQ ID:5)
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體pTarget (Promega) 中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109,Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并 且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入到載體(pGLY08.002)。
mmn9的胞質(zhì)區(qū)從野生釀酒酵母的基因組DNA進(jìn)行PCR
94°C 8分鐘
30個循環(huán)94°C 20秒 65。C30秒 72°C 1分鐘
72°C 10分鐘
擴(kuò)增51 bp片段(mmn9的胞質(zhì)部分)+ GNTII的同源 Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaacaggttccgcatctac
用Taq Platinium裝配Mnn9 (PCR產(chǎn)物)和ORF (pGLY08.002)
CA005 (正向)和CD005 (反向)
程序
95°C 2分鐘
30個循環(huán)95°C 45秒 54。C 45秒 72°C 2分鐘
72°C 10分鐘
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體pTarget (Promega)中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109,Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并 且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入到載體(pGLY08.007)。
7.2步驟2:裝配釀酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株的表達(dá)盒
GlcNAc-轉(zhuǎn)移酶II的表達(dá)盒的整合將插入到釀酒酵母的Lem3標(biāo)記 和栗酒裂殖酵母的TRP1標(biāo)記中?；騆em3的失效導(dǎo)致對毒劑米替福 新(miltefosine)的抗性。通過該盒改良的酵母將因此對該藥變得有抗 性?；騎RP1的失效導(dǎo)致對毒劑5-氟維生素L (5-fluoro-anthranilic acid)的抗性。通過該盒改良的酵母將因此對該藥變得有抗性但是對于 色氨酸還是營養(yǎng)缺陷的。
-啟動子PMAl的擴(kuò)增
CD001 (正向)aagcttcctgaaacggag
CD008 (反向)acgatacaagagaaagtgacatattgatattgtttgataattaaat
從釀酒酵母的基因組DNA進(jìn)行PCR
程序
95°C 2分鐘
30個循環(huán)95°C 45秒
54。 C 45秒 72°C 2分鐘
72°C 5分鐘
用Taq Expand (Roche)用Mnn9-同源ORF (pGLY08.007)裝配 啟動子PMA1 (PCR產(chǎn)物)
CD007 cgtttgtagatgcggaacctgttaacccacgggttcttt CD001 aagcttcctgaaacggag 94°C 2分鐘
30個循環(huán)94。C 45秒
55。 C 45秒 68°C 1.15分鐘
68°C 5分鐘
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體TOP02.1 (Invitrogen)中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP 10, Invitrogen)。用PCR 檢査轉(zhuǎn)化并且通過測序檢査PCR擴(kuò)增物插入到載體(pGLY08.005)。
33-用Taq聚合酶PhusionTM(Ozyme)用終止子CYC1(PCR產(chǎn)物)裝 配Mnn9-ORF (pGLY08.007)
程序
98°C 2分鐘
3個循環(huán)98。C10秒
52。C 30秒
72。C 40秒 加入引物然后 30個循環(huán) 98。C10秒
61。C30秒
72°C 40秒
72°C 5分鐘
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體pTarget (Promega) 中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109， Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并 且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入到載體(pGLY08.04)。
-用Taq聚合酶Phusion (Ozyme)用帶有釀酒酵母標(biāo)記Lem3同源 末端的Mnn9-ORF終止子CYC1 (PCR產(chǎn)物)裝配啟動子PMA1-Mnn9 (pGLY08扁)
CB053: Atggtaaatttcgatttgggccaagttggtgaagt倉caagcttcctgaaacggag (正向.) CB070: Ttctaccgccgaagagccaaaacgttaataatatcaatggcagcttgcaaattaaagc (反向)
程序
98°C 2分鐘
3個循環(huán)98。C10秒
52。C 30秒
72°C 4分鐘 加入引物然后 30個循環(huán) 98。C10秒
61。C30秒
72°C 1分鐘
72°C 5分鐘
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體pTarget (Promega)中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109，Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并 且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入到載體(pGLY08)。
-從pGLY08.012裝配栗酒裂殖酵母標(biāo)記TRP1的同源末端 CD009 (正向)taaagttgattccgctggtgaaatcatacatggaaaagtttaagcttcctgaaacggag CD010 (反向)atgtgaaatttccttggccacggacaagtccacttttcgtttggcagcttgcaaattaaagc 7.3步驟3:酵母的改良
-感受態(tài)酵母的制備
如上述制備Anai's和Enrique菌株以便使它們有感受態(tài)。 -酵母的電穿孔
過程含有釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒的20 pg質(zhì)粒用限制 性酶EcoRI消化。通過電穿孔將線性化的盒引入酵母Anais和Enrique 中。然后將酵母涂布在含有需要的選擇性藥物的瓊脂糖YPD培養(yǎng)基上。
實施例8: Alice和Elga菌株+半乳糖轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá)盒 8.1步驟l:無需人類定位序列獲得ORF 從人類淋巴母細(xì)胞的cDNA進(jìn)行PCR CD025 (正向)CD026(反向) 94°C 2分鐘
30個循環(huán)94°C 45秒 58。C 45秒 72°C 1.15分鐘
72°C 5分鐘
1,047 bp片段的擴(kuò)增 ccccaactggtcggagtctccacaccgctgcagggcggctcgaacagtgccgccgccatcgggcagtcctccggggagc tccggaccggaggggcccggccgccgcctcctctaggcgcctcctcccagccgcgcccgggtggcgactccagcccagt cgtggattctggccctggccccgctagcaacttgacctcggtcccagtgccccacaccaccgcactgtcgctgcccgcctgc cctgaggagtccccgctgcttgtgggccccatgctgattgagtttaacatgcctgtggacctggagctcgtggcaaagcagaa cccaaatgtgaagatgggcggccgctatgcccccagggactgcgtctctcctcacaaggtggccatcatcattccattccgca accggcaggagcacctcaagtactggctatattatttgcacccagtcctgcagcgccagcagctggactatggcatctatgttat caaccaggcgggagacactatattcaatcgtgctaagctcctcaatgttggctttcaagaagccttgaaggactatgactacacc tgctttgtgtttagtgacgtggacctcattccaatgaatgaccataatgcgtacaggtgtttttcacagccacggcacatttccgttg caatggataagtttggatteagcctaccttatgttcagtattttggaggtgtctctgctctaagtaaacaacagtttctaaccatcaat ggatttcctaataattattggggctggggaggagaagatgatgacatttttaacagattagtttttagaggcatgtctatatctcgcc caaatgctgtggtcgggaggtgtcgcatgatccgccactcaagagacaagaaaaatgaacccaatcctcagaggtttgaccgaattgcacacacaaaggagacaatgctctctgatggtttgaactcactcacctaccaggtgctggatgtacagagatacccattg tatacccaaatcacagtggacatcgggacaccgagctag〖SEO ID:6》
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體pTarget (Promega) 中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109,Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并 且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入到載體(pGLY11.003)。
Mntl定位從釀酒酵母的gDNA進(jìn)行PCR
94°C 3分鐘
30個循環(huán)94。C20秒 58。C 30秒 720C 45秒
72°C 10分鐘
246 bp片段的擴(kuò)增-SEQ ID:14 atggccctctttctcagtaagagactgttgagatttaccgtcattgcaggtgcggttattgttctcctcctaacattgaattccaac agtagaactcagcaatatattccgagttccatctccgctgcatttgattttacctcaggatctatatcccctgaacaacaagtcatct ctgaggaaaatgat2Ctoaaaaattog犯caaa2tgctctgaattcagaggcaagcgaagactccgaagcc
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體pTarget (Promega) 中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌UM109,Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并 且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入到載體。
8.2步驟2:裝配釀酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株的表達(dá)盒
半乳糖轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá)盒的整合將定位在釀酒酵母Alice的標(biāo)記 TRP1中。該基因的失效導(dǎo)致對毒劑氟代維生素L的抗性。通過該盒改 良的酵母將因此對該藥變得有抗性。半乳糖轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá)盒的整合將 定位在釀酒酵母Ashley的標(biāo)記Metl7中。
-從質(zhì)粒pMDC擴(kuò)增啟動子CaMV
CD035 (正向)
CD037 (反向)
程序
94°C 2分鐘
30個循環(huán)94°C 45秒 65。C 45秒 72°C 2分鐘30秒
72°C 5分鐘
36抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其引入載體pTarget。感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Progenia)用這個載體轉(zhuǎn)化。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLYl 1.001)。
-用Mntl定位序列(PCR產(chǎn)物)裝配啟動子CaMV (pGLYll.001)CD035 (正向)和CD028 (反向)
程序
94°C 2分鐘
30個循環(huán) 94。C45秒59。C 45秒72°C 1分鐘15秒
72°C 3分鐘
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Progema)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLYl 1.002)。
-用ORF(PCR產(chǎn)物)裝配啟動子CaMV-Mntl定位(pGLYOl 1.002)
CD035 (正向)
CD029 (反向)
程序
94。C 2分鐘
30個循環(huán) 94。C45秒56。C 45秒72°C 2分鐘30秒
72°C 3分鐘
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體pTarget (Promega)中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109，Promega)。用PCR檢査轉(zhuǎn)化并且通過測序檢査PCR擴(kuò)增物插入到載體(pGLY011.004)。
-用Taq Expand (Roche)用終止子CYC1 (PCR產(chǎn)物)裝配啟動子CaMV-定位Mntl-ORF (pGLYOl 1.004)
CD035 (正向)BS41(反向)
程序95°C 3分鐘
30個循環(huán) 95。C30秒57。C 30秒68°C 2分鐘30秒
68°C 10分鐘
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體pTarget (Promega)中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢査PCR擴(kuò)增物插入到載體(pGLYOl 1.005)。-用Taq Expand (Roche)裝配釀酒酵母的整合盒CD063 (正向)agatgccagaaacaaagcttgttgcaggtggtgctgctcatgcctgcaggtcaacatggtCD064 (反向)gtgtcgacgatcttagaagagtccaaaggtttgactggatgcagcttgc認(rèn)ttaaagcc程序
95°C 3分鐘
30個循環(huán) 95。C30秒57。C 30秒68°C 2分鐘30秒
68°C 10分鐘
用酚/氯仿方法純化PCR擴(kuò)增物并將其引入載體TOPO 2.1(Invitrogen)中。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP10 Invitrogen)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入到載體(pGLYOl 1.008)。
對于栗酒裂殖酵母，整合到序列PET6中
使用Taq Expand (Roche)
CD038 (正向)和CD039 (反向)
將PCR產(chǎn)物引入到載體TOPO-XL。用該載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP10Invitrogen)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入到載體(對于栗酒裂殖酵母是pGLYl 1.006并且對于釀酒酵母是pGLYl 1.007)。
8.3步驟3:酵母的改良
-感受態(tài)酵母的制備
如上述制備Alice和Elga菌株以便使它們有感受態(tài)。-酵母的電穿孔
38過程含有釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒的20 JUg質(zhì)粒用限制
性酶Kpnl和Xhol消化。通過電穿孔將線性化的盒引入酵母Alice和Elga中。然后將酵母涂布在含有需要選擇的瓊脂糖YPD培養(yǎng)基上。
實施例9: Anai's和Enrkme菌株+巖藻糖基化(al,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT8和GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)表達(dá)盒9.1 FUT8的表達(dá)盒9.1.1步驟l:獲得ORF
從人類胰腺和肺的cDNA進(jìn)行PCR程序
94°C 3分鐘
35個循環(huán): 94。C20秒58。C 30秒72°C 2分鐘
72°C 10分鐘
1,801 bp片段的擴(kuò)增c犯2actcca2gga犯tgagtteaaaatct卿aatgcggccatggactggttcctggcgttggattatgctcattctttttgcctgggggaccttgctgttttatataggtggtcacttggtacgagataatgaccatcctgatcactctagccgagaactgtccaagattctggcaaagcttgaacgcttaaaacagcagaatgaagacttgaggcgaatggccgaatctctccggataccagaaggccctattgatcaggggccagctateggaagagtecgcgttttegaagagcagcttgttaaggccaaagaacagattgaaaattacaagaaacagaccagaaatggtctggggaaggatcatgaaatcctgaggaggaggattgaaaatggagctaaagagctctggtttttcctacagagtgaattgaagaaattaaagaacttagaaggaaatgaactccaaagacatgcagatg組ttcttttggatttaggacatcatgaaaggtctataatgacggatctatactacctcagtcagacagatggagcaggtgattggcgggaaaa江g汪ggccaaagatctgacagaactggttcagcggagaataacatatcttcagaatcccaaggactgcagcaaagccaaaaagctggtgtgtaatatcaacaaaggctgtggctatggctgtcagctccatcatgtggtctactgcttcatgattgcatatggcacccagcgaacactcatcttggaatctcagaattggcgctatgctactggtggatgggagactgtatttaggcctgtaagtgagacatgcacagacagatctggcatctccactggacactggtcaggtgaagtgaaggacaaaaatgttcaagtggtcgagcttcccattgtagacagtcttcatccccgtcctccatatttacccttggctgtaccagaagacctcgcagatcgacttgtacgagtgcatggtgaccctgcagtgtggtgggtgtctcagtttgtcaaatacttgatccgcccacagccttggctagaaaaagaaategaagaagccaccaagaagcttggcttcaaacatccagttattggagtccatgtcagacgcacagacaaagtgggaacag犯gctgccttccatcccattgaagagtacatggtgcatgttgaagaacattttcagcttcttgcacgcagaatgcaagtggacaaaaaaagagtgtatttggccacagatgacccttctttattaaaggaggcaaaaacaaagtaccccaattatgaatttattagtgataactctatttcctggtcagctggactgcacaatcgatacacagaaaattcacttcgtggagtgatcctggatatacattttctctctcaggcagacttcctagtgtgtactttttcatcccaggtctgtcgagttgcttatgaaattatgcaaacactacatcctgatgcctctgcaaacttccattctttagatgacatctactattttgggggccagaatgcccacaatcaaattgccatttatgctcaccaaccccgaactgcagatgaaattcccatggaacctggagatatcattggtgtggctggaaatcattgggatggctattctaaaggtgtcaacaggaaattgggaaggacgggcctatatccctcctacaaagttcgagagaagatagaaacggtcaagtaccccacatatcctgaggctgagaaataaagctcagatggaagagataaacgaccaaactcagttcga (SEQ ID:7)
抽提并且用QBIOgene試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物(自人類肺和胰腺cDNA的1，801 bp)并且將其引入載體TOP02.1。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP10,Invitrogen)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體。
9.1.2步驟2:裝配釀酒酵母的表達(dá)盒
-從栗酒裂殖酵母的基因組DNA擴(kuò)增啟動子mntl
BS86 (正向)和BS84 (反向)
-用ORF(pGLY06.001)裝配啟動子mntl (PCR產(chǎn)物)BS86 (正向)和BS88(反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Progema)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY06.003)。
用終止子CYC1 (PCR產(chǎn)物)裝配ORF (pGLY06.001)
CA011 (正向)和BS41 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Progenia)。用PCR檢査轉(zhuǎn)化并且通過測序檢査PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY06.002)。
-用ORF-終止子CYC1 (PCR產(chǎn)物)裝配nmtl-ORF (pGLY06.003)
BS86 (正向)和BS41 (反向)
-將整合用末端裝配到酵母的營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中
9.1.2.1釀酒酵母
FUT8表達(dá)盒的整合定位在釀酒酵母菌株的標(biāo)記CAN1中?；駽AN1的失效導(dǎo)致對刀豆氨酸(canavanine)的營養(yǎng)缺陷。BS147 (正向)和BS148 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Progema)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY06.005)。
9.1.2.2栗酒裂殖酵母
巖藻糖轉(zhuǎn)移酶8的表達(dá)盒和對抗生素腐草霉素(phleomycin)有抗性的盒以串聯(lián)的形式(in tandem)產(chǎn)生。將該雙盒插入到簡單的營養(yǎng)缺陷標(biāo)記HIS5中。在該位點插入該盒將導(dǎo)致對腐草霉素的抗性以及對組氨酸的營養(yǎng)缺陷。
將以前獲得的FUT8的表達(dá)盒與含有SV40啟動子、抗腐草霉素的ORF以及終止子TEF的腐草霉素表達(dá)盒裝配在一起。將這些串聯(lián)的盒插入到標(biāo)記HIS5中。
9.1.3步驟3:酵母的改良
-感受態(tài)酵母的制備
如上述制備Anai's和Enrique菌株以便使它們有感受態(tài)。-酵母的電穿孔
過程含有釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒的20 pg質(zhì)粒用限制性酶EcoRI消化。通過電穿孔將線性化的盒引入酵母Anai's和Enrique中。將酵母以有限稀釋涂布在瓊脂糖YPD培養(yǎng)基上，被刪除的標(biāo)記對于藥物不給予抗性。 一旦釋放了克隆，在基本培養(yǎng)基上建立復(fù)制子以便選擇沒有必需氨基酸就不能生長的克隆。
9.2 GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒
9.2.1獲得ORF
從人類肺的cDNA進(jìn)行PCR
程序
94°C 3分鐘
35個循環(huán) 94。C20秒58。C 30秒72°C 2分鐘
72。C 10分鐘
1,136 bp片段的擴(kuò)增tgacccagctcctctgctaccatgaatagggcccctctgaagcggtccaggatcctgcacatggcgctgaccggggcctcagacccctctgcagaggcagaggccaacggggagaagccctttctgctgcgggcattgcagatcgcgctggtggtctccctctactgggtcacctccatctccatggtgttccttaataagtacctgctggacagcccctccctgcggctggacacccccatcttcgtcaccttctaccagtgcctggtgaccacgctgctgtgcaaaggcctcagcgctctggccgcctgctgccctggtgccgtggacttccccagcttgcgcctggacctcagggtggcccgcagcgtcctgcccctgtcggtggtcttcatcggcatgatcaccttcaataacctctgcctcaagtacgtcggtgtggccttctacaatgtgggccgctcactcaccaccgtcttcaacgtgctgctctcctacctgctgctcaagcagaccacctccttctatgccctgctcacctgcggtatcatcatcgggggcttctggcttggtgtggaccaggagggggcagaaggcaccctgtcgtggctgggcaccgtcttcggcgtgctggctagcctctgtgtctcgctcaacgccatctacaccacgaaggtgctcccggcggtggacggcagcatctggcgcctgactttctacaacaacgtcaacgcctgcatcctcttcctgc ccctgctcctgctgctcggggagcttcaggccctgcgtgactttgcccagctgggcagtgcccacttctgggggatgatgacg ctgggcggcctgtttggctttgccatcggctacgtgacaggactgcagatcaagttcaccagtccgctgacccacaatgtgtcg ggcacggccaaggcctgtgcccagacagtgctggccgtgctctactacgaggagaccaagagcttcctctggtggacgagc ,atgatggtgctgggcggctcctccgcct織cctgggtcaggggctgggagatga卿卿ctccggaggagcccag ccccaaagacagcgagaagag cgccatgg改gtgtgagcaccacaggcaccctggat (SEO ID:8)
抽提并且用QIAGEN試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將 其引入載體TOP02.1。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(TOP10, Invitrogen)。用PCR檢查轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體 (pGLY07.001)。
9.2.2步驟2:裝配釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒
-從pTarget擴(kuò)增啟動子SV40:
BS109 (正向)和BS110(反向)
-用終止子CYCl (PCR產(chǎn)物)裝配ORF (pGLY07.001) CA013(正向)和BS41 (反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用 PCR檢査轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY07.002)。
9.2.2.1釀酒酵母
GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒的整合將定位在釀酒酵母菌株的營 養(yǎng)缺陷標(biāo)記TRPl中。基因TRPl的失效導(dǎo)致對毒劑5-氟維生素L的抗 性。通過該盒改良的酵母將因此變得對該藥有抗性但是對色氨酸仍是 營養(yǎng)缺陷的。
-裝配啟動子SV40盒(PCR產(chǎn)物)、ORF (PCR產(chǎn)物)和終止子 CYC1 (PCR產(chǎn)物)
BS136(正向)和BS137(反向)
抽提并且用Qiagen試劑盒從瓊脂糖膠中純化PCR擴(kuò)增物并且將其 引入載體pTarget。用這個載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌(JM109, Promega)。用 PCR檢査轉(zhuǎn)化并且通過測序檢查PCR擴(kuò)增物插入載體(pGLY07.003)。
9.2.2.2栗酒裂殖酵母
GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒和對抗生素潮霉素(hygromycin)
有抗性的盒以串聯(lián)的形式產(chǎn)生。將該雙盒插入到編碼參與栗酒裂殖酵
42母的N-聚糖成熟的GMA12蛋白的基因中。在該位點插入該盒將導(dǎo)致 對潮霉素的抗性但是也導(dǎo)致基因gmal2的刪除。
將以前獲得的GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)盒與含有SV40啟動子、 抗潮霉素的ORF以及終止子TEF的抗潮霉素表達(dá)盒裝配在一起。將這 些串聯(lián)的盒插入到標(biāo)記gmal2中。
9.2.3步驟3:酵母的改良
-感受態(tài)酵母的制備
如上述制備Apolline和Epiphanie菌株以便使它們有感受態(tài)。 -酵母的電穿孔
過程含有釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒的20 pg質(zhì)粒用限制 性酶EcoRI消化。通過電穿孔將線性化的盒引入酵母Apolline和 Epiphanie中。將釀酒酵母涂布在含有5-氟維生素L的YPD培養(yǎng)基上。 將栗酒裂殖酵母以有限稀釋涂布在瓊脂糖YPD培養(yǎng)基上，被刪除的標(biāo) 記對于藥物不給予抗性。 一旦釋放了克隆，在基本培養(yǎng)基上建立復(fù)制 子以便選擇沒有必需氨基酸就不能生長的克隆。
實施例10: Athena和Etienne菌株+N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶III 的表達(dá)盒
10.1獲得ORF
從鼠科大腦的互補(bǔ)DNA進(jìn)行PCR CB007 (正向)Atgaagatgagacgctacaa CB036 (反向)ctagccctccactgtatc
程序
94°C 2分鐘
30個循環(huán) 94。C45秒 56。C 45秒 72°C 2分鐘
72°C 5分鐘
無酶的胞質(zhì)部分的bp片段的擴(kuò)增將其由用作蛋白的高爾基體定 位的Mntl的胞質(zhì)部分代替。
10.2釀酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株的表達(dá)盒的裝配10.2.1為釀酒酵母的裝配
啟動子nmtl的擴(kuò)增
CB013: tatagtcgctttgttaaatcatatggccctctttctcagtaa CB014: agcgaagactccgaagcccacttctttaagaccttatcc 終止子CYC1的擴(kuò)增 用末端CAN1擴(kuò)增表達(dá)盒 CB030 (正向)cagaaaatccgttccaagag CB031 (反向)tgccacggtatttcaaagct 10.2.2為栗酒裂殖酵母的裝配
GNTIII的表達(dá)盒與抗潮霉素的盒以串聯(lián)的形式。插入0^/^12( 10.3酵母的轉(zhuǎn)化
實施例11:在釀酒酵母和栗酒裂殖酵母中參與高甘露糖基化 ChypermamiosylatioiO的基因的刪除
11.1步驟1:在酵母Amdie、 Arielle、 Anai's、 Alice、 Abel、 Ashley、 Athena、 Azal6e和Aurel中Mnnl基因的刪除
ll丄l構(gòu)建和插入含有抗潮霉素基因的盒到Mnnl基因中
ll丄l.l構(gòu)建表達(dá)盒
用Mnnl 5'末端擴(kuò)增啟動子CaMV
GCAGGTCAACATG
GGGATCCTCTAGAGTC
與啟動子CaMV和Mnnl 3，末端有同源性的潮霉素-終止子TEF的
擴(kuò)增
AAAAAGCCTGAACTC
ACTGGATGGCGGCGTCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTCGa
裝配在釀酒酵母中的刪除Mnnl基因用的插入盒 GCAGGTCAACATG
ACTGGATGGCGGCGT
11.1.1.2酵母的轉(zhuǎn)化
-制備感受態(tài)酵母
如上述制備菌株以便使它們有感受態(tài) -釀酒酵母的電穿孔
過程含有釀酒酵母的表達(dá)盒的20)ig質(zhì)粒用限制性酶消化。通過 電穿孔將線性化的盒引入酵母中。在含有潮霉素的YPD培養(yǎng)基上選擇酵母。
11.1.2刪除在酵母Am61ie、 Arielle、 Anai's、 Alice、 Abd、 AsWey、 Athena、 AzaWe和Aurel中的Mnn9基因。
11.1.2.1構(gòu)建用于整合到含有抗腐草霉素基因的Mnn9基因的盒。 用Mnn9 5'末端擴(kuò)增啟動子SV40CAGAAGTATGCAAA
CB47: TTTTTGCAAAAGCCTAG
與啟動子SV40有同源性的腐草霉素-終止子TEF的擴(kuò)增
CB48:( CCGACCAAGCGACGCCC
CB49: ACTGGATGGCGGCGT
gctggatgstcctccagcgcggggstctcaagctggsgttcttcgcccac
cgacctcgcggagttctaccggcagtgcaaatccgtcggcatccaggaaa cc3gc3gcggct3tccgcgc3tccatgcccccg33ctgc3ggagtgggg3
acagaacgaattgcttgcaggcatctcatgatcagtactgacaataaaaa gattcttgttttcaagaacttgtcatttgtatagtttttttatattgtag
cgtcaatcgtatgtgaatgctggtcgctatactgctgtcgattcgatact aacgccgccatccagtgtcgaaaacgagctctcgagaacccttaat
11丄2.2酵母的轉(zhuǎn)化 -感受態(tài)酵母的制備
如上述制備酵母以便使它們有感受態(tài)。
-釀酒酵母的電穿孔
過程
含有釀酒酵母的表達(dá)盒的20 pg質(zhì)粒用限制性酶消化。通過電穿孔 將線性化的盒引入酵母中。在含有腐草霉素的YPD培養(yǎng)基上選擇酵母。
11.2步驟2:刪除在栗酒裂殖酵母、Emma、 Erika、 Enrique、 Elga、 Etienne中的GMA12基因
11.2.1構(gòu)建含有抗潮霉素基因的整合盒
ext-gma 12/prom-CaMV/hph/Tef-term/ext-gma 12
CB51:( TGCAGGTCAACATG
CB52: ACTGGATGGCGGCGT11.2.2酵母的轉(zhuǎn)化 -感受態(tài)酵母的制備
如上述制備菌株以便使它們有感受態(tài)。 -釀酒酵母的電穿孔
過程含有栗酒裂殖酵母的表達(dá)盒的20 pg質(zhì)粒用限制性酶消化。 通過電穿孔將線性化的盒引入。在含有潮霉素的YPD培養(yǎng)基上選擇酵 母。
實施例12:菌株+釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的N-聚糖唾液酸化用 的表達(dá)盒
為了獲得在釀酒酵母和栗酒裂殖酵母中產(chǎn)生蛋白的N-聚糖的有效 唾液酸化目的，首先不得不將唾液酸的生物合成途徑引入到同樣的酵 母中。為完成這個，我們將腦膜炎奈瑟菌的CMP-唾液酸的生物合成途 徑，在胞質(zhì)溶液中定位的酶引入酵母的基因組中。
用于唾液酸化作用的串聯(lián)盒(從Athena、 Aurel和Azal6e菌株中) 的制備
12.1盒Sl
構(gòu)建由啟動子PET56、唾液酸合成酶的ORF、終止子CYC1然后 是啟動子PET565、 CMP-唾液酸合成酶的ORF和終止子CYC1組成的 串聯(lián)的盒。
-獲得ORF:
唾液酸合成酶(1,050 bp) Atgcaaaacaacaacgaatttaaaattggtaatcgttcagtaggttacaaccacgaaccattgattatctgtgaaateggcatca atcatgaaggctctttaaaaacagcttttgaaatggttgatgctgcctataatgcaggcgctgaagttgttaaacatcaaacacac atcgttgaagacgaaatgtctgatgaggccaaacaagtcattccaggcaatgcagatgtctctatttatgaaattatggaacgttg cgccctgaatgaagaagatgagattaaattaaaagaatacgtagagagtaagggtatgatttttatcagtactcctttctctcgtgc agctgctttacgattacaacgtatggatattccagcatataaaatcggctctggcgaatgtaataactacccattaattaaactggt ggcctettttggtaagcctattattctctctaccggcatgaattctattgaaagcatcaaaaagtcggtagaaattattcgagaagc aggggtaccttatgctttgcttcactgtaccaacatctacccaaccccttacgaagatgttcgattgggtggtatgaacgatttatct gaagcctttccagacgcaatcattggcctgtctgaccataccttagataactatgcttgcttaggagcagtagctttaggcggttc gattttagagcgtcactttactgaccgcatggatcgcccaggtccggatattgtatgctctatgaatccggatacttttaaagagct caagcaaggcgctcatgctttaaaattggcacgcggcggcaa犯aagacacgattatcgcgggagaaaagccaactaaaga tttcgcctttgcatetgtcgtagcagataaagacattaaaaaaggagaactgttgtccggagataacctatgggttaaacgccca ggc^tgg昭3cttc3gcgtc^icg犯Mg犯ac3ttetttggt^iggtcgctgcttgc^tattcgc^aggtgctc朋atC3aaaaaactgatattgaataa
CMP-唾液酸合成酶(687 bp):atggaaaaacaaaatattgcggttatacttgcgcgccaaaactccaaaggattgccatoaaaaatctccggaaaatgaatggcatatcattacttggtcatacaattaatgctgctatatcatcaaagtgttttgaccgcataattgtttcgactgatggcgggttaattgcagaagaagctaaaaatttcggtgtcgaagtcgtcctacgccctgcagagctggcctccgatacagccagctctatttcaggtgtaatacatgctttagaaacaattggcagtaattccggcacagtaaccctattacaaccaaccagtccattacgcacaggggctcatattcgtgaagctttttctctatttgatgagaaaataaaaggatccgttgtctctgcatgcccaatggagcatcatccactaaaaaccctgcttcaaatcaataatggcgaatatgcccccatgcgccatctaagcgatttggagcagcctcgccaacaattacctcaggcatttaggcctaatggtgcaatttacattaatgatactgcttcactaattgcaaataattgtttttttatcgctccaaccaaactttatattatgtctcatcaagactctatcgatattgatactgagcttgatttacaacaggcagaaaacattcttaatcacaaggaaagctaa
-表達(dá)盒
啟動子PET56
AAAATTGCGGGAAAGGACTGTGTT12.2盒S2
CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒和對抗生素潮霉素有抗性的盒以串聯(lián)的形式產(chǎn)生。將該雙盒插入到mnnl基因中。將該盒插入到該位點將導(dǎo)致對潮霉素的抗性但是也導(dǎo)致mnnl基因的刪除。
-獲得ORF
來源于鼠科的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(1,011 bp)atggctccggcgagagaaaatgtcagtttattcttcaagctgtactgcttggcggtgatgactctggtggctgccgcttacaccgtagctttaagatacacaaggacaacagctgaagaactctacttctc肌ccactgccgtgtgtatcacag犯gtgataaagttactgataagtgttggcctgttagctaaggaaactggc江gtttgggtagatttaaagcctcattaagtg犯aatgtcttggggagccccaaggaactggcgaagttgagtgtgccatcactagtgtatgctgtgcagaacaacatggccttcctggctctcagtaatctggatgcagcagtgtaccaggtgacctatcaactgaagatcccctgcactgctttatgtactgttttaatgttaaatcgaacactcagcaaattacagtggatttccgtcttcatgctgtgtggtggggtcacactcgtacagtggaaaccagcccaagcttcaaaagtcgtggtagcgcagaatccattgttaggctttggtgctatagctattgctgtattgtgctctggatttgcaggagtttattttgaaaaagtcttaaagagttccgacacttccctttgggtgagaaacattcagatgtatctgtcagggatcgttgtgacgttagctggtacctacttgtcagatggagctgaaattcaagaaaaaggattcttctatggctacacgtattatgtctggtttgttatcttccttgctagtgtgggaggcctctacacgtcagtggtggtgaagtatacagacaacatcatgaaaggcttctctgctgccgcagccattgttctttctaccattgctteagtcctactgtttggattacagataacactttcatttgcactgggagctcttcttgtgtgtgtttccatatatctctatgggttacccagacaagatactacatccattcaacaagaagcaacttcaaaagagagaatcattggtgtgtga
-構(gòu)建表達(dá)盒
將CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒(啟動子CaMV、 ORF、終止子CYC1)與含有啟動子CaMV、抗潮霉素的ORF、以及終止子TEF的潮霉素抗性表達(dá)盒裝配在一起。將這些串聯(lián)的盒插入到標(biāo)記mmil中。12.3盒S3:
唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3GAL4的表達(dá)盒和對抗生素腐草霉素有抗性的盒以串聯(lián)的形式產(chǎn)生。將該雙盒插入到基因mmi9中。將該盒插入到該位點將導(dǎo)致對潮霉素的抗性但是也導(dǎo)致mrm9基因的刪除。
-獲得ORF
人類唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3GAL4 (990 bp)atggtcagcaagtcccgctggaagctcctggccatgttggctctggtcctggtcgtcatggtgtggtattccatctcccgggaagacagtttttattttcccatcccagagaagaaggagccgtgcctccagggtgaggcagagagcaaggcctctaagctetttggcaactactcccgggatcagcccatcttcctgcggcttgaggattatttctgggtcaagacgccatctgcttacgagctgccctatgggaccaaggggagtgaggatctgctcctccgggtgctagccatcaccagctcctccatccccaagaacatccagagcctcaggtgccgccgctgtgtggtcgtggggaacgggcaccggctgcggaacagctcactgggagatgccatcaacaagtacgatgtggtcatcagattgaacaatgccccagtggctggctatgagggtgacgtgggctccaagaccaccatgcgtctcttctaccctgaatctgcccacttcgaccccaaagtagaaaacaacccagacacactcctcgtcctggtagctttcaaggcaatggacttccactggattgagaccatcctgagtgataagaagcgggtgcgaaagggtttctggaaacagcctcccctcatctgggatgtcaatcctaaacagattcggattctcaaccccttcttcatggagattgcagctgacaaactgctgagcctgccaatgcaacagccacggaagattaagcagaagcccaccacgggcctgttggccatcacgctggccctccacctctgtgacttggtgcacattgccggctttggctacccagacgcctacaacaagaagcagaccattcactactatgagcagatcacgctcaagtccatggcggggtcaggccataat gtctcccaagaggccctggccattaagcggatgctggagatgggagctatcaagaacctcacgtccttctga
鼠科動物唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3GAL4 (1，002 bp)atgaccagcaaatctcactggaagctcctggccctggctctggtccttgttgttgtcatggtgtggtattccatctcccgagaagataggtocattgagttc證attttcccatctcagagaagaaagagccatgcttccagggtgaggcagagagacaggcctct^gatttttggcaaccgttctagggaacagcccatctttctgcagcttaaggattatttttgggtaaagacgccatccacctatgagctgccctttgggactaaaggaagtgaagaccttcttctccgggtgctggccatcactagctattctatacctgagagcataaagagcctcgagtgtcgtcgctgtgttgtggtgggaaatgggcaccggttgcggaacagctcgctgggcggtgtcatcaacaagtacgacgtggtcatcagattgaacaatgctcctgtggctggctacgagggagatgtgggctccaagaccaccatacgtctcttctatcctgagtcggcccactttgaccctaaaatagaaaacaacccagacacgctcttggtcctggtagctttcaaggcgatggacttccactggattgagaccatcttgagtgataagaagcgggtgcgaaaaggcttctggaaacagcctcccctcatctgggatgtcaaccccaaacaggtccggattctaaaccccttctttatggagattgcagcagacaagctcctgagcctgcccatacaacagcctcgaaagatcaagcagaagccaaccacgggtctgctagccatcaccttggctctacacctctgcgacttagtgcacattgctggctttggctatccagatgcctccaacaagaagcagaccatccactactatgaacagatcacacttaagtctatggcgggatcaggccataatgtctcccaagaggctatcgccatcaagcggatgctagagatgggagctgtcaagaacctcacatacttctga
將CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒(啟動子CaMV、 ORP、終止子CYC1)與含有啟動子CaMV、抗潮霉素的ORF以及終止子TEF的抗潮霉素的表達(dá)盒裝配在一起。將這些串聯(lián)的盒插入到標(biāo)記mrml中。實施例13:同質(zhì)的糖基化EPO的產(chǎn)生
13.1人類促紅細(xì)胞生成素(EPO)的核苷酸序列的擴(kuò)增
用適當(dāng)?shù)囊飶娜祟惖哪I互補(bǔ)DNA中獲得人類EPO核苷酸序列 的擴(kuò)增物。
13.2克隆釀酒酵母的表達(dá)載體中的EPO序列
將截去了其終止密碼的人類huEPO的核苷酸序列(585個堿基對) 整合到釀酒酵母的表達(dá)載體中。在引入序列和質(zhì)粒pSC的序列(抗原決 定簇V5和多組氨酸標(biāo)簽)之間的閱讀框的連續(xù)性通過對獲得的質(zhì)粒 (pSC-EPO)測序而證實。發(fā)現(xiàn)蛋白EPO的表達(dá)是在釀酒酵母菌株通過 半乳糖誘導(dǎo)的啟動子pGALl的控制之下。具有質(zhì)粒的酵母的選擇是通 過對尿嘧啶的原養(yǎng)型回復(fù)實現(xiàn)的(在質(zhì)粒中存在URA3序列)。
在表達(dá)質(zhì)粒中獲得的序列
1atgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtggcttctcctgtccctgct
51gtcgctccctctgggcctcccagtcctgggcgccccaccacgcctcatct
101gtgacagccgagtcctggagaggtacctcttggaggccaaggaggccgag
151aatatcacgacgggctgtgctgaacactgcagcttgaatgagaatatcac
201tgtcccagacaccaaagttaatttctatgcctggaagaggatggaggtcg
251ggcagcaggccgtagaagtctggcagggcctggccctgctgtcggaagct
301gtcctgcggggccaggccctgttggtcaactcttcccagccgtgggagcc
351cctgcagctgcatgtggataaagccgtcagtggccttcgcagcctcacca
401ctctgcttcgggctctgggagcccagaaggaagccatctcccctccagat
451gcagcctcagctgctccgctccgaacaatcactgctgacactttccgcaa
501actcttccgagtctactccaatttcctccggggaaagctgaagctgtaca
551caggggaggcctgcaggacaggcgacagaaAGGGCGAGCTTCGAGGTCAC
601CCATTCGAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTAC
651GCGTACCGGTa (SEQID:ll)在表達(dá)質(zhì)粒中經(jīng)過測序的EPO的蛋白序列(SEQ ID:12)
TGHHHHHH*
抗原決定簇V5 多組氨酸
13.3RNA的抽提
將酵母在16000 g離心5分鐘。除去上清并且將沉淀重懸在500 pL的TES緩沖液(10 mM TrisHCl pH7.5 10mM EDTA, 0.5% SDS)中。加 入200 酚和200 )iL氯仿，然后以每5分鐘震蕩30秒在65°C孵育 20分鐘并且在-80。C孵育1小時。以13,200 rpm離心20分鐘，然后回 收水相并且加入335i^L酚和67pL氯仿。震蕩并且以11,000 rpm離心 5分鐘?；厥账嗖⑶壹尤?00 pL氯仿。震蕩并且以13,200 rpm離心 2分鐘?；厥账嗖⑶壹尤雙H 5.2的30 jiL 3M醋酸鈉和600 的無 水乙醇。在-20。C孵育l小時。以13,200 rpm離心15分鐘。除去上清 同時小心沉淀。令其干燥，將其吸收在100 pLEDPC水中，然后將其 置于有violet Nucleospin (Nucleospin RNAII)過濾器的管中。以11,000 g 離心1分鐘。除去過濾器并且加入350 |iL 70%乙醇。加載Nucleospin RNAII柱。以8000 g離心30秒。將柱置于新的管中，加入350 的 膜脫鹽緩沖液。以11,000 g離心1分鐘。將95 (iL DNA酶(DNase) 溶液置于柱的中心，然后在室溫孵育15分鐘。加入200 ^LRA2溶液 (使DNA酶失活)并且以8,000 g離心30秒。將600 |aL RA3溶液加 入柱的中心。以8,000 g離心30秒。將柱置于新的管中，加入250 RA3 溶液。以11,000 g離心2分鐘以驅(qū)動該柱。將柱置于1.5 mL管中并且 加入50 iiLDEPC水。以11,000 g離心1分鐘。將樣品儲存在-80。C。
13.4逆轉(zhuǎn)錄用于RT-PCR的Super Script III第一鏈合成系統(tǒng)(Super Script III First-Strand Synthesis System)
5 )ig腦A
隨機(jī)六聚體 50 ng"L dNTP混合物 10 mM DEPC水
在65°C孵育5分鐘 加入10 )iL轉(zhuǎn)錄混合物
最多8 )liL
1
1 (iL
qsp 10 p_L
RT緩沖液
MgCl2
DTT
RNase Out Superscript
10X 25 mM 0.1 M 40 U/|iL
2 (iE 4jliL 2
1 }iL
200 U/jiL 1 jiL
孵育
25°C 10分鐘 50°C 50分鐘85°C 5分鐘
在冰中恢復(fù)并且加入1 pLRNaseH。留在37°C孵育20分鐘，然后 在-20。C儲存cDNA。 13.5蛋白的抽提
在4。C以1,500 g離心5分鐘之后，在500 juL的無菌水中吸收細(xì) 胞沉淀，然后在4。C以最高速度離心30秒。將沉淀吸收在500 ^L磷 酸鈉50 mM裂解緩沖液，pH 7.4， 5%甘油，1 mM PMSF中，在4°C以 l,500g離心10分鐘。然后將沉淀吸收在需要獲得50-100OD的裂解緩 沖液體積中。然后將樣品用玻璃珠震蕩4x30秒并且進(jìn)行以最大速度離 心10分鐘以便從蛋白上清中分離珠子和細(xì)胞碎片。進(jìn)行對上清的BCA
13.6 EPO的純化
首先將總蛋白用10mMTrisHCl緩沖液，pH6.0透析。在用10mM Tris-HClpH6.0平衡陽離子交換SP葡聚糖凝膠(Sephadex) C50柱之 后，將所有經(jīng)過透析的蛋白加載在柱上。在用lOmMTrisHCl緩沖液 pH 6.0洗柱之后，用10 mM Tris HC1緩沖液pH 6.0、 250 mM NaCl將 蛋白洗脫下來。在280 nm檢測每個組份的吸收以及通過Bradford分析 檢測洗脫蛋白的量。然后在12%丙烯酰胺膠上用SDS-PAGE電泳分析 蛋白。
13.7 EPO蛋白的檢測-Western印記法(Western Blot)
將總蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上以便進(jìn)行通過抗-EPO抗體(R&D Systems)的檢測。轉(zhuǎn)移之后，將膜用封閉溶液(TBS, 1%封閉溶液 (Roche))飽和1小時。然后將膜與抗-EPO抗體溶液接觸(1:500稀釋) 1小時。在用0.1% Tween 20-TBS漂洗三次后，將膜與第二抗-小鼠-HRP 抗體接觸以便進(jìn)行通過化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence) (Roche檢測溶 液)的檢測。
141.結(jié)果
14.1:在Ochl基因中整合了卡那霉素盒的克隆的驗證
為了抑制Ochl活性，在其整合之后將引入的盒完全測序以便在酵 母的基因組中定位受影響的基因組區(qū)域。然后完成了酶活性的缺失， 加強(qiáng)了前面的結(jié)果，然后用質(zhì)譜測定聚糖的結(jié)構(gòu)。在P/。瓊脂糖-TBE膠上對從釀酒酵母克隆基因組DNA完成的PCR 反應(yīng)的分析顯示具有卡那霉素盒的特異寡核苷酸對的2 kb擴(kuò)增片段。 該釀酒酵母克隆在培養(yǎng)基中具有對卡那霉素的抗性。該片段的大小符 合卡那霉素盒的理論大小。第二片段是通過卡那霉素盒內(nèi)部的一個寡 核苷酸和與Ochl基因雜交的盒外部的一個寡核苷酸的方法擴(kuò)增的。預(yù) 期片段的理論大小是1.5kb，其符合獲得片段的大小。因此我們可以定 論克隆1、2、3和4確實己經(jīng)整合了卡那霉素盒并且將后者整合到Ochl 基因中(見圖3)。
在對培養(yǎng)基中存在的卡那霉素有抗性的栗酒裂殖酵母菌株上進(jìn)行 同樣類型的PCR。因此，將每個菌株的兩個突變克隆分離并且檢測 a-l,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶酶活性的缺失。
檢測在突變酵母菌株上的甘露糖轉(zhuǎn)移酶Ochl的活性
在通過釀酒酵母和栗酒裂殖酵母中的同源重組獲得的突變Aochl
中驗證Ochl活性的缺失
在通過PCR驗證野生釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的卡那霉素表達(dá)盒 的插入之后，檢測該插入的陽性克隆的甘露糖轉(zhuǎn)移酶Ochl活性的缺 失。檢測在釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的微粒體上Ochl的活性。圖4顯 示Ochl活性的檢測在a-釀酒酵母的野生菌株和所選克隆的微粒體組 份，b-栗酒裂殖酵母的野生菌株和所選克隆的微粒體組份。根據(jù)圖4， 我們可以觀察到在釀酒酵母(a)和栗酒裂殖酵母(b)的所選克隆中 Ochl酶活性的缺失。
通過N-聚糖的分析驗證菌株
還原和垸基化并且用胰蛋白酶消化來自兩種改良菌株的總蛋白。 通過SepPak C18除去自由多糖?；厥盏碾暮吞请慕?jīng)PNGase處理。在 通過質(zhì)譜在Maldi-Tof模式中分析聚糖之前，在SepPak C18上純化然 后甲基化聚糖。圖5顯示在菌株Addle和Edgar的N-聚糖上進(jìn)行的質(zhì)譜。
酵母的命名 釀酒酵母Aochl =Adde 栗酒裂殖酵母Aochl = Edgar
兩種菌株具有從Mari7至Man|Q的寡甘露糖苷形式的N-聚糖，與在釀酒酵母的野生菌株中的相比，較短形式表明缺失了野生的聚甘露糖 基化形式。
Edgar菌株(Aochl)的主要結(jié)構(gòu)是Man9和Man8，是在哺乳動物中 新合成的蛋白運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)中常見的結(jié)構(gòu)。這提示由于高爾基體的甘 露糖轉(zhuǎn)移酶作用的不可能引起糖基化的阻斷，轉(zhuǎn)移酶只將甘露糖移植 到聚糖上，在聚糖上酶Ochl已經(jīng)移植了一個連接在a1,6位置的甘露糖。
14.2在URA3基因中整合了甘露糖苷酶I盒的克隆的驗證
對在基因URA3中甘露糖苷酶I表達(dá)盒的插入是陽性的AdMe和 Edgar酵母檢測其甘露糖苷酶I的生化活性。圖6顯示釀酒酵母和栗酒 裂殖酵母在微粒體中的甘露糖苷酶活性的分析。實驗進(jìn)行三次重復(fù)。 在野生的釀酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株中，我們可以觀察到不被DMJ 抑制的甘露糖苷酶活性。相反，所選菌株具有在DMJ處理過程中測定 的甘露糖苷酶活性的顯著抑制。另外，因為檢定的甘露糖苷酶I活性在 酵母的微粒體中存在，我們可以推斷該酶在順面高爾基體/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分 泌途徑中表達(dá)，顯示細(xì)胞系統(tǒng)很好地識別整合在蛋白C-末端的HDEL 滯留信號。
酵母的命名
釀酒酵母Ad61e +甘露糖苷酶I = Am61ie 栗酒裂殖酵母Edgar +甘露糖苷酶I:Emma 14.3在改良酵母中整合了 N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶(GlcNAc轉(zhuǎn)移 酶I)盒的克隆的驗證
圖7顯示野生和改良酵母在微粒體中GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I的活性。 在Amdie-GlcNacTI和Emma-GlcNacTI酵母的微粒體或組份中， 我們觀察到與在對照酵母(野生的和/或Aochl-Mdsel酵母)中觀察到 的標(biāo)記相比，通過放射性GlcNAc基團(tuán)轉(zhuǎn)移的受體標(biāo)記的增加。該轉(zhuǎn)移 涉及通過GlcNAcTI的表達(dá)在改良酵母中的N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶活 性的存在。
改良酵母的命名
釀酒酵母Amdie + GlcNAcTI = Agathe 栗酒裂殖酵母Emma + GlcNAcTI = Eg6e14.4在改良酵母中整合了 UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白盒的克隆的驗證 在親代或改良酵母培養(yǎng)物上通過RT-PCR分析UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)
蛋白的表達(dá)。在總的被抽提RNA的逆轉(zhuǎn)錄步驟之后，通過使用 UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特異引物的PCR (巢式PCR)分析cDNA。 因此，在通過UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒改良的酵母中觀察到該 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA的表達(dá)(圖8)。 改良酵母的命名
釀酒酵母Agathe + UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白=Arielle 栗酒裂殖酵母Eg6e + UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白=Erika
14.5在改良酵母中整合了甘露糖苷酶II盒的克隆的驗證
a-通過PCR擴(kuò)增驗證
通過PCR檢測釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的所選克隆以便檢查在酵 母基因組中的甘露糖苷酶II表達(dá)盒的存在。 b-甘露糖苷酶II的表達(dá)
在親代或改良酵母的培養(yǎng)物上通過RT-PCR分析甘露糖苷酶II的 表達(dá)。在經(jīng)抽提的RNA的逆轉(zhuǎn)錄步驟之后，通過使用特異的甘露糖苷 酶II的引物用PCR分析cDNA (巢式PCR)。因此在通過甘露糖苷酶 II表達(dá)盒改良的酵母中觀察到該蛋白的mRNA的表達(dá)。
c-甘露糖苷酶II活性的檢測
對于甘露糖苷酶II表達(dá)盒的插入是陽性的Addle和Edgar酵母， 檢測其甘露糖苷酶II的生化活性。
根據(jù)圖9，我們可以觀察到在親代釀酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株中 對苦馬豆堿的抑制作用不敏感的甘露糖苷酶活性。相反，所選菌株具 有當(dāng)用苦馬豆堿處理時測定的甘露糖苷酶活性的顯著抑制。另外，因 為在高爾基體酵母組份中檢測到測定的甘露糖苷酶II活性，我們可以 推斷在高爾基體系統(tǒng)分泌途徑中適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)了該酶。
改良酵母的命名
釀酒酵母Arielle +甘露糖苷酶II = Anaifs
栗酒裂殖酵母Erika +甘露糖苷酶II = Enrique
14.6在改良酵母中整合了N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶II盒的克隆的驗
證a-通過PCR擴(kuò)增驗證
通過PCR檢測釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的所選克隆以便檢查在酵母基因組中GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II表達(dá)盒的存在(結(jié)果未顯示)。b-GIcNAc轉(zhuǎn)移酶II的表達(dá)
在親代或改良酵母培養(yǎng)物上通過RT-PCR分析GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II的表達(dá)。在經(jīng)抽提的RNA的逆轉(zhuǎn)錄歩驟之后，通過GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II的特異引物用PCR分析cDNA (巢式PCR)。因此在通過GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II表達(dá)盒改良的酵母中觀察到經(jīng)轉(zhuǎn)錄的mRNA的表達(dá)(結(jié)果未顯示)。
改良酵母的命名
釀酒酵母Anais + GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II = Alice栗酒裂殖酵母Enrique + GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II = Elga14.7整合了半乳糖轉(zhuǎn)移酶I盒的克隆的驗證a-通過PCR擴(kuò)增驗證
通過PCR檢測釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的所選克隆以便檢查在酵母基因組中GalTI表達(dá)盒的存在(結(jié)果未顯示)。
b-半乳糖轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá)
在親代或改良酵母的培養(yǎng)物上通過RT-PCR分析GalTI的表達(dá)。在經(jīng)抽提的RNA的逆轉(zhuǎn)錄步驟之后，通過使用GalTI的特異引物用PCR分析cDNA (巢式PCR)。因此在通過GalTI表達(dá)盒改良的酵母中觀察到經(jīng)轉(zhuǎn)錄的mRNA的表達(dá)(結(jié)果未顯示)。
c- GalTI的活性
在抽提改良酵母的總蛋白之后，將2 pg蛋白放置在硝酸纖維素膜上。然后將膜用偶聯(lián)了生物素的雞冠珊瑚樹凝集素(eo^n'"" cAto^///lectin)孵育，該凝集素可以特異地識別糖蛋白的聚糖上存在的Gal-P-l，4-GlcNAc單位的半乳糖。將膜與偶聯(lián)了辣根過氧化物酶(HRP)的鏈霉親和素(streptavidin)接觸以便進(jìn)行通過化學(xué)發(fā)光(Roche檢測溶液)的檢測。
14.8整合了GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白盒的克隆的驗證
a-通過PCR擴(kuò)增驗證
通過PCR檢測釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的所選克隆以便檢查在酵母基因組中的GDP-巖藻糖表達(dá)盒的存在。b- GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)
在親代改良酵母的培養(yǎng)物上通過RT-PCR分析GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。在經(jīng)抽提的RNA的逆轉(zhuǎn)錄步驟之后，通過使用GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特異引物用PCR分析cDNA (巢式PCR)。因此在通過GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)盒改良的酵母中觀察到經(jīng)轉(zhuǎn)錄的mRNA的表達(dá)(圖10)。
改良酵母的命名
釀酒酵母Ana'i's + GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白=Apolline栗酒裂殖酵母Enrique + GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白=Epiphanie14.9整合了巖藻糖轉(zhuǎn)移酶8 (FUT8)的克隆的驗證a-通過PCR擴(kuò)增驗證
通過PCR檢測釀酒酵母和栗酒裂殖酵母的所選克隆以便檢查在酵母基因組中的FUT8表達(dá)盒的存在。b- FUT8的表達(dá)
在親代或改良酵母的培養(yǎng)物上通過RT-PCR分析FUT8的表達(dá)。在經(jīng)抽提的RNA的逆轉(zhuǎn)錄步驟之后，通過使用FUT8的特異引物用PCR分析cDNA (巢式PCR)。因此在通過FUT8表達(dá)盒改良的酵母中觀察到經(jīng)轉(zhuǎn)錄的mRNA的表達(dá)(結(jié)果未顯示)。
改良酵母的命名
釀酒酵母Apolline + FUT8 = Ashley
栗酒裂殖酵母Epiphanie + FUT8 = Esther
14.10在Am犯e菌株中EPO表達(dá)的特殊例子
Amdie菌株具有專一產(chǎn)生N-聚糖Man5GlcNAc2 (圖ll)的能力，該結(jié)構(gòu)是在哺乳動物中遇到的，被認(rèn)為是一種簡單類型的聚糖；并且作為用于加工帶有半乳糖、巖藻糖或唾液酸的更復(fù)雜聚糖的基礎(chǔ)。在上面描述了該菌株中的每個基因組改良的出現(xiàn)。這些步驟的每一個進(jìn)入了包括選擇最佳產(chǎn)生克隆和機(jī)會百分比最大化的驗證"包"以便獲得可利用的克隆。使用的方法允許對遺傳改良過程的完全控制需要整合的序列是完全己知的，如同未來整合的目標(biāo)基因組區(qū)。關(guān)于可能的斷裂效應(yīng)，后者的位點更需要廣泛的研究，這就是為什么由于其斷裂之后獲得的表現(xiàn)型缺失效應(yīng)而需要最后選擇整個目標(biāo)。
進(jìn)行追蹤產(chǎn)生克隆的基因組穩(wěn)定性的整個過程在每次產(chǎn)生之后，定期將克隆移出到其原始選擇用的嚴(yán)苛培養(yǎng)基上，并且再開始驗證過程?？寺∷械谋磉_(dá)盒以便在某個菌株的基因組重排的情況下，可以進(jìn)行有機(jī)體的遺傳改進(jìn)。整合盒的過程不是標(biāo)準(zhǔn)化的并且如同使用者安排好的，可以設(shè)想產(chǎn)生"根據(jù)需要的"菌株以便獲得特異的糖基化。
Am犯e菌株是應(yīng)該用作加工任何其它為了產(chǎn)生人源化雜交或復(fù)合
聚糖的菌株的基礎(chǔ)克隆。
在改良酵母中用作表達(dá)EPO的質(zhì)粒含有啟動子Gall。該啟動子是釀酒酵母中已知最強(qiáng)的啟動子之一并且現(xiàn)在被用于產(chǎn)生重組蛋白。該啟動子通過半乳糖被誘導(dǎo)并且通過葡萄糖被抑制。事實上，在甘油中的釀酒酵母培養(yǎng)物中，加入半乳糖允許以約1,000倍誘導(dǎo)GAL基因。如果在沒有半乳糖時在該培養(yǎng)物中加入葡萄糖，GAL基因?qū)⒉辉俦徽T導(dǎo)，只達(dá)到單獨用半乳糖獲得的1%的水平(Johnston, M. (1987)Microbiol. Rev.)。在5，通過加入抗原決定簇V5以及多組氨酸標(biāo)簽修改我們質(zhì)粒中的人類EPO的整合序列以便幫助檢測和純化產(chǎn)生的蛋白。
首先用于產(chǎn)生人類EPO的酵母在不含尿嘧啶的YNB培養(yǎng)基、2%葡萄糖中培養(yǎng)直到達(dá)到ODW2。在24-48小時培養(yǎng)之后，將2%半乳糖加入到培養(yǎng)物中以便誘導(dǎo)產(chǎn)生我們感興趣的蛋白。在誘導(dǎo)0、 6、 24和48小時之后取出樣品。
在改良酵母中EPO mRNA的表達(dá)
對總的經(jīng)抽提的RNA的RT-PCR分析表明在被半乳糖誘導(dǎo)后(圖12帶1和3)轉(zhuǎn)化的酵母克隆中的EPO信使RNA的表達(dá)與在無半乳糖誘導(dǎo)(圖12帶2和4)的改良酵母中觀察到的不同。因此半乳糖的存在導(dǎo)致EPO基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)。對擴(kuò)增片段的測序證實了恰當(dāng)?shù)膍RNA的產(chǎn)生。
在改良酵母中表達(dá)的EPO蛋白的純化
通過半乳糖誘導(dǎo)rhuEPO蛋白表達(dá)后獲得的總蛋白然后置于平衡至pH 6的葡聚糖凝膠C50樹脂上。在柱的出口檢測280 nm的吸收(圖13)。在12%丙烯酰胺膠上通過SDS-PAGE電泳分析從柱中洗脫的蛋白。在SDS-PAGE膠的遷移之后，或通過考馬斯藍(lán)染色(圖14)或通過western印記完成對蛋白的分析。在這種情況下將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上以便進(jìn)行通過抗-EPO抗體的檢測(R&D Systems)。
圖15顯示約35 kDa蛋白的存在。該蛋白是考馬斯藍(lán)染色中的大多數(shù)蛋白并且在western印記分析中通過抗-EPO抗體被顯示(在柱出口的第29管)。
因此所有這些結(jié)果顯示了通過遺傳改良酵母產(chǎn)生EPO蛋白。
權(quán)利要求
1、遺傳改良的酵母，能夠產(chǎn)生具有含Man5GlcNac2結(jié)構(gòu)的同質(zhì)聚糖的糖蛋白，所述酵母包括下列改良a)通過編碼抗生素抗性基因的異源序列的同源重組通過插入將編碼α1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶的Och1基因失活(delta-Och1菌株)，b)通過同源重組將表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2啟動子，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體靶向序列的α-1-2甘露糖苷酶I編碼序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子，c)通過同源重組將表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2啟動子，所述c)中的啟動子與b)中的啟動子不同，含有需要產(chǎn)生的外源糖蛋白編碼序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的酵母，其特征在于a-1-2甘露糖苷酶I是線 蟲的oc-l-2甘露糖苷酶I，特別是含有SEQID:1的序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2的酵母，能夠產(chǎn)生具有75%以上 GlcNacMan5GlcNac2結(jié)構(gòu)的糖蛋白，進(jìn)一步包括通過同源重組將表達(dá) 盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmtl、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56或ADH2啟動子，含有內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)或高爾基體靶向序列的N-乙酰-葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶I編碼序列的開放 閱讀框或者轉(zhuǎn)錄終止子。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3的酵母，其特征在于人類N-乙酰-葡萄糖胺轉(zhuǎn) 移酶I包含沒有酶的胞質(zhì)部分的SEQ ID:2序列，酶的胞質(zhì)部分被用于 蛋白高爾基體定位的mmn9的胞質(zhì)部分(SEQID:13)所替代。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4的酵母，其特征在于其進(jìn)一步包括通過同源重組將表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56或ADH2啟動子, 含有人類UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止 子。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5的酵母，其特點在于人類UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白包含SEQ ID:3序列。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4至6中的任一項的酵母，能夠產(chǎn)生具有75%以 上GlcNacMan3GlcNac2結(jié)構(gòu)的糖蛋白，進(jìn)一步包括通過同源重組將表 達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmtl、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56或ADH2啟動子,含有內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)或高爾基體靶向序列的甘露糖苷酶II編碼序列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄 終止子。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7的酵母，其特點在于甘露糖苷酶II是鼠科的甘 露糖苷酶II并且包含SEQ ID:4序列。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7至8中的任一項的酵母，能夠產(chǎn)生具有75%以 上GlcNac4Man3GlcNac2結(jié)構(gòu)的糖蛋白，進(jìn)一步包括通過同源重組將 表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56或ADH2啟動子，含有 N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶II編碼序列的，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體耙向序 列的開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9的酵母，其特征在于N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶 II是人類的并且包括SEQ ID:5序列。
11、 根據(jù)權(quán)利要求9至10的任一項的酵母，能夠產(chǎn)生具有75%以 上Gal4GlcNac4Man3GlcNac2結(jié)構(gòu)的糖蛋白，進(jìn)一步包括通過同源重 組將表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列 SEQ ID:16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56或ADH2啟動子， 含有半乳糖轉(zhuǎn)移酶I編碼序列的，含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體靶向序列的開 放閱讀框和轉(zhuǎn)錄終止子。
12、 根據(jù)權(quán)利要求ll的酵母，其特征在于半乳糖轉(zhuǎn)移酶I是人類 的，并且包含沒有人類靶向序列的SEQ ID:6序列。
13、 根據(jù)權(quán)利要求1至10的任一項的酵母，其特征在于整合標(biāo)記 選自URA3、 ADE2、 LYS2、 LEU2、 TRP1、 CAN1、 ADOl、 HIS5、 HIS3、 ARG3、 MET17、 LEM3、 Mnnl、 M皿9、 gmal2。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13的酵母，其特征在于a-l-2-甘露糖苷酶I的 表達(dá)盒被整合到URA3基因中，N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶I的表達(dá)盒被 整合到ADE1或ADE2基因中，UDP-GlcNAc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)盒被整 合到LYS2基因中，a-甘露糖苷酶II的表達(dá)盒被整合到LEU2基因中， N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶II的表達(dá)盒被整合到CYH1或TRP1基因中。
15、 根據(jù)權(quán)利要求1至14的任一項的酵母，其特征在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或 高爾基體的靶向序列是從Mntl基因的定位序列衍生的并且包括SEQ ID:14序列。
16、 根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項的酵母，其特征在于終止子是從 CYC1基因衍生的并且包括SEQID:15序列。
17、 根據(jù)權(quán)利要求3至10任一項的酵母，能夠產(chǎn)生具有75%以上 的選自M肌5GlcNac之，GlcNacMan5GlcNac2, GlcNacMan3GlcNac2, GlcNac2Man3GlcNac2， Gal2GlcNac2Man3GlcNac2, GlcNac2Man3 (Fuc)GlcNac2, Gal2GlcNac2Man3 (Fuc)GlcNac2結(jié)構(gòu)的糖蛋白，進(jìn)一步包括通過同源重組將表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo) 記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒酵母或栗 酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56或ADH2啟動子，或Mntl基因的啟動子，含有a-l，6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶FUT8編碼序列的、含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體靶向序列的 開放閱讀框和從包含SEQ ID:15序列的基因CYC1衍生的轉(zhuǎn)錄終止子。
18、 根據(jù)權(quán)利要求17的酵母，其特征在于a-l,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶 FUT8是人類的并且包括SEQ ID:7序列。
19、 根據(jù)權(quán)利要求17或18的任一項的酵母進(jìn)一步包括通過同源 重組將表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒包括選自分別具有序 列SEQID:16-26的釀 酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56或ADH2啟動子， 或SV40啟動子，含有GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼序列的，特別是含有 SEQ ID:8序列的開放閱讀框。
20、 根據(jù)在先權(quán)利要求的任一項的酵母，其特征在于a-l-2甘露糖 苷酶I是在啟動子pGAP的控制下表達(dá)的并且外源蛋白糖蛋白是在啟動 子pGALl的控制下表達(dá)的。
21、 根據(jù)權(quán)利要求11至20的任一項的酵母，能夠產(chǎn)生具有75% 以 上 的 選 自 NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2 和 NANA4Gal4GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2結(jié)構(gòu)的糖蛋白，其特征在于其 進(jìn)一歩包括通過同源重組將表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中，該表達(dá)盒 包括選自分別具有序列SEQ ID:16-26的釀酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、 pGALl、 PGK、 TEF、 adhl、 nmt 1、 SV40、 PMA1、 CaMV、 pet56或ADH2啟動子，或含有SEQ ID:9序列的皰疹病毒胸苷激酶的 啟動子，含有cc-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列的開放閱讀框和從含有SEQ ID:15序列的CYC1基因衍生的終止子。
22、 根據(jù)權(quán)利要求21的酵母，其特征在于唾液酸轉(zhuǎn)移酶是人類 ST4GAL4，特別是含有SEQ ID:IO的序列。
23、 根據(jù)權(quán)利要求1至22的任一項的酵母，其特征在于糖蛋白選 自治療用糖蛋白如細(xì)胞因子、白介素、生長激素、生長因子、酶和單 克隆抗體、疫苗蛋白、可溶受體和任何類型的重組蛋白。
24、 根據(jù)權(quán)利要求23的酵母，其特征在于糖蛋白是EPO,特別是 具有SEQ ID:12的EPO， SEQ ID:12含有抗原決定簇V5和純化用N-末端多-HIS單位。
25、 一種含有糖蛋白的藥物組合物，該糖蛋白具有同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)， 該結(jié)構(gòu)包括具有90%、 95%或進(jìn)一步98%以上，例如90%、 95%或進(jìn) 一歩98%以上的選自GlcNacMan5GlcNAc2，GlcNacMan3GlcNAc2,GlcNac4Man3GlcNAc2，Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2,GlcNac(Fuc)Man5GlcNAc2,GlcNac(Fuc)Man3 GlcNAc2,GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2,Gal4GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2，NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或NANA4GaWGlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2的結(jié)構(gòu)。
26、 一種藥物組合物，其包括作為活性成分的EPO，所述EPO具 有卯％以上的NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或 NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或 NANA4Gal4GlcNac4Man3GkNAc2或 NANA4Gal4GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2的結(jié)構(gòu)。
27、 一種在發(fā)酵器中的培養(yǎng)物，其含有酵母培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 和根據(jù)權(quán)利要求1至24任一項的酵母。
28、 一種制備糖蛋白的方法，所述糖蛋白具有同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)，該 結(jié)構(gòu)具有75%以上的選自Man5GlcNAc2,GlcNacMan5GlcNAc2,GlcNacMan3 GlcNAc2，GlcNac2Man3 GlcNAc2,Gal2GlcNac2Man3GlcNAc之，NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2,GlcNac2Man3 (Fuc)GlcNAc2,Gal2GlcNac2Man3CFuc:)GlcNAc:2,NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc之，的結(jié)構(gòu)，該方法包括在發(fā)酵器中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至24任一項的酵 母，和從培養(yǎng)基中抽提所述的糖蛋白。
29、 根據(jù)權(quán)利要求1至24任一項的酵母在發(fā)酵器中制備糖蛋白的 用途，該糖蛋白具有同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有75%以上的選自 Man5GlcNAc2,GlcNacMan5GlcNAc2, GlcNacMan3GlcNAc2, GlcNac2Man3GlcNAc2, Gal2GlcNac2Man3 GlcNAc2,NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2, GlcNac2Man3 (Fuc)GlcNAc2, Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2, NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2的結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生具有優(yōu)化的和同質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)的糖蛋白的遺傳改良酵母。這些酵母包括Och1基因的失活；通過同源重組將含有第一啟動子，和含有α-1，2-甘露糖苷酶I的編碼序列的開放閱讀框的表達(dá)盒整合到營養(yǎng)缺陷標(biāo)記中；以及整合含有與所述第一啟動子不同的第二啟動子和外源糖蛋白的編碼序列的盒。這些酵母使得產(chǎn)生具有優(yōu)化的和98％同質(zhì)糖基化的EPO成為可能。
文檔編號C12N15/81GK101679991SQ200880006086
公開日2010年3月24日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者C·雅沃, V·卡爾 申請人:格萊科德公司