專利名稱：具有細(xì)胞分級分離處理功能的流式細(xì)胞儀以及活細(xì)胞分級分離處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對混合有多個(gè)不需要的活細(xì)胞和多個(gè)目標(biāo)活細(xì)胞的活細(xì)胞群中 的特定活細(xì)胞進(jìn)行處理的流式細(xì)胞儀、以及從上述活細(xì)胞群中分級分離出目標(biāo) 活細(xì)胞并對其進(jìn)行回收的活細(xì)胞分級分離處理方法。
背景技術(shù)：
例如，在研究例如癌等對細(xì)胞或染色體進(jìn)行分析時(shí)，以往使用的是顯微 鏡。但是，在利用顯微鏡進(jìn)行分析時(shí)，收集大量數(shù)據(jù)以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)性研究需要 較多的勞力和時(shí)間。目前，大多情況下，進(jìn)行細(xì)胞或染色體分析時(shí)，使用能 夠在短時(shí)間內(nèi)對很多樣品(細(xì)胞或染色體)進(jìn)行分析以獲得可靠性較高的統(tǒng) 計(jì)數(shù)據(jù)的流式細(xì)胞儀。在流式細(xì)胞4義中，形成樣品液流，即形成含有抗體已 被熒光染色的細(xì)胞等樣品粒子的樣品液的流動，并將激光朝向該樣品液照 射，然后對從流動的大量樣品粒子的每一個(gè)樣品粒子中放出的熒光和散射光 進(jìn)行測量，由此能夠獲得可靠性高的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。這樣的流式細(xì)胞儀被廣泛應(yīng) 用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究。
然而，在今后的醫(yī)療領(lǐng)域中抱有較大期望的是利用被稱為再生細(xì)胞的 干細(xì)胞(stem cell)來進(jìn)行治療。干細(xì)胞是指構(gòu)成活體的細(xì)胞在進(jìn)行生理性增 殖和分化等過程中，同時(shí)具有自我增殖能力和分化成具有特定功能的細(xì)胞的 能力的細(xì)胞。即，干細(xì)胞是自身就具有自我復(fù)制能力和發(fā)育成其它細(xì)胞的能 力的細(xì)胞。干細(xì)胞包括從胚胎中提取的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、從成人身體提 取的成體干細(xì)胞、從胎兒身體提取的胎兒干細(xì)胞等各種類型。若能夠使該干 細(xì)胞分化為因受傷或疾病而受損的器官等細(xì)胞，則可通過移植來進(jìn)行修復(fù)， 因此利用干細(xì)胞的研究在再生醫(yī)療領(lǐng)域等中盛行。
從胚胎干細(xì)胞或胎兒干細(xì)胞等提取干細(xì)胞時(shí)，理論上存在必須破壞胚胎 (殺死胚胎)的問題。因此，有關(guān)現(xiàn)代再生醫(yī)療的研究大部分涉及的是能夠從活著的人(兒童或成人)身上以不損傷其身體的方式提取干細(xì)胞的成體干細(xì) 胞研究。在成體干細(xì)胞的研究中，理所當(dāng)然地需要成體細(xì)胞。成體干細(xì)胞雖 然是能夠在骨髓、血液、眼角膜和視網(wǎng)膜、肝臟、皮膚等中找到的細(xì)胞，但 很少能找到，通常來講，在提取的大量細(xì)胞樣品中只能找到極微量的成體干 細(xì)胞。例如，在骨髓間質(zhì)中存在能夠分化成骨骼、軟骨、脂肪、肌肉、腱、 神經(jīng)等很多組織的、被稱為間葉系干細(xì)胞的細(xì)胞，其在針對疾病或外傷引起 的組織缺損的再生醫(yī)療方面?zhèn)涫懿毮俊５窃摷?xì)胞在骨髓中僅以10萬分之 1的比例存在。因此為了使缺損組織再生，需要在體外進(jìn)行培養(yǎng)而增加細(xì)胞。 為此必須從該骨髓中的多個(gè)細(xì)胞中分離和提取出極微量的干細(xì)胞。為了盡量 在短時(shí)間內(nèi)從大量的細(xì)胞樣品中分離和提取出極微量的成體干細(xì)胞，目前所 利用的是使用了上述流式細(xì)胞儀的、對細(xì)胞進(jìn)行分離和回收的系統(tǒng)(細(xì)胞分 選器)。
例如，在下述非專利文獻(xiàn)1中記載有與這樣的細(xì)胞分選器相關(guān)的一個(gè)例
子。圖4為對下述非專利文獻(xiàn)1所記載的細(xì)胞分選器100進(jìn)行說明的概略構(gòu) 成圖。在細(xì)胞分選器100中，從噴嘴103中射出作為噴射流104的、含有大 量細(xì)胞樣品102的樣品液。在這些大量細(xì)胞樣品102中含有少量的干細(xì)胞， 且在大量細(xì)胞樣品102中實(shí)施熒光標(biāo)記以表征這樣的干細(xì)胞。細(xì)胞分選器 100中，將測量用激光106照射在該噴射流104上，以將激光106依次照射 在大量細(xì)胞樣品102上。并且，通過包括光電增倍管108和光電增倍管110 的、未圖示的評價(jià)單元來獲得由每個(gè)細(xì)胞樣品102所發(fā)出的各種散射光和熒 光的信息。而且在未圖示的評價(jià)單元中，判別出照射了激光106的細(xì)胞樣品 是否為干細(xì)胞樣品(另外，在下述非專利文獻(xiàn)1中，對含有很多干細(xì)胞的樣 品細(xì)胞的集團(tuán)部分進(jìn)行特定)。至此，雖然其為通常的流式細(xì)胞儀的構(gòu)成， 但在細(xì)胞分選器100中具有對特定了的細(xì)胞進(jìn)行分離(分選)的功能。在細(xì)胞 分離器IOO中，例如通過未圖示的壓電元件等使噴嘴103在高頻下發(fā)生振動， 由此4吏噴射流104強(qiáng)制性地變成液滴112。當(dāng)形成該液滴112時(shí)，干細(xì)胞樣 品等特定細(xì)胞樣品進(jìn)入液滴的瞬間，對該特定液滴施加正(+)電荷或負(fù)(-)電 荷(圖示例中為正電荷)(充電)。
液滴112依次通過由兩個(gè)電場形成電才及板114、 116來形成的、水平方 向上的電場118之間。此時(shí)，只有凈皮充電了的液滴112才會通過該水平方向上的電場來改變下降方向(偏轉(zhuǎn))而落下來，并回收在所需試管120中。由此，
只有干細(xì)胞樣品等特定細(xì)胞樣品102才回收在試管120中。而沒被充電的其 它細(xì)胞樣品102垂直落下并回收在廢液容器122中。
非專利文獻(xiàn)1:"利用超高速細(xì)胞分選器MoFloTM的干細(xì)胞的新分析和 新分離方法"，[在線]，[平成19年2月19曰檢索]，互聯(lián)網(wǎng)〈URL: http:〃www.takarabio.co.jp/goods/bioview/pdfs/42/42—15-16.pdf>

發(fā)明內(nèi)容
然而，如上述非專利文獻(xiàn)l所述，為了使樣品液成為噴射流，必須顯著 變小噴嘴出口部分的直徑，例如設(shè)定為25]imi。在上述非專利文獻(xiàn)l的例子 中，直徑為幾/mi ~ 20/xm程度的細(xì)胞由于通過該狹窄的出口部分時(shí)受到物理 剪切力，因此連所需的干細(xì)胞也受到損傷的可能性高。此外，干細(xì)胞也可能 通過強(qiáng)制成為液滴時(shí)的高頻振動而受到損傷。此外，向含有細(xì)^^羊品的液滴 充電且施加高電場的情況下，連干細(xì)胞等所需細(xì)胞也受到電擊，從而存在連 該所需細(xì)胞也受到損傷的問題。即使利用這樣的細(xì)胞分選器分離出干細(xì)胞樣 品，以使其分化成所需器官等的細(xì)胞，若所分離出的干細(xì)胞樣品受到損傷， 則也無法完全排除發(fā)生多種且危險(xiǎn)問題的可能性，例如不能良好地進(jìn)行分化 或者表現(xiàn)為不良細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)等。因此，不能使細(xì)胞受到損傷的、需慎 重處理的研究領(lǐng)域中，依然無法4吏用這樣的高速細(xì)胞分選器。
這樣，在細(xì)胞處理方面需慎重處理的領(lǐng)域中，過去是按照例如在規(guī)定時(shí) 刻移動上述細(xì)胞分選器100的試管120的方式對包含在液滴112進(jìn)行下降的 特定細(xì)胞樣品進(jìn)行分離和回收的。但是，試管120自身的移動速度與噴射流 104被液滴化后所形成的液滴112的下降速度相比，只能達(dá)到明顯低的速度。 在高速流動大量樣品的情況下，相對于大量的細(xì)胞樣品只能獲得極少量的特 定細(xì)胞樣品。另外，根據(jù)試管120的移動速度而顯著降低樣品流的速度時(shí)， 細(xì)胞的分離和提取需要較長時(shí)間。
本發(fā)明著眼于上述以往的問題點(diǎn)，其目的在于提供一種具有活細(xì)胞分 級分離功能的流式細(xì)胞儀，其使目標(biāo)活細(xì)胞不受到任何損傷，能夠從含有大 量活細(xì)胞的活細(xì)胞群中短時(shí)間內(nèi)且高精度地分級分離出不需要的活細(xì)胞并 進(jìn)行處理。此外，其目的在于提供一種活細(xì)胞分級分離處理方法，通過該方法，能夠從含有大量活細(xì)胞的活細(xì)胞群中僅分級分離出目標(biāo)活細(xì)胞并對其
進(jìn)行回收。此外，其目的在于提供一種活細(xì)胞分級分離處理方法，通過該 方法，能夠從含有大量活細(xì)胞的活細(xì)胞群中僅分級分離出目標(biāo)活細(xì)胞并對其 進(jìn)行培養(yǎng)。
為了解決所述問題，本發(fā)明提供一種活細(xì)胞分級分離處理方法，其特征 在于，包括形成樣品液流的步驟，所述樣品液流中含有由多個(gè)不需要的活 細(xì)胞和多個(gè)目標(biāo)活細(xì)胞混合而形成的活細(xì)胞群，且所述活細(xì)胞群的各個(gè)活細(xì) 胞分別相互隔開而在一條直線上流動；朝向所述樣品液流照射測量光的步 驟；接受所述測量光的照射，并分別獲取由所述樣品液流的各個(gè)活細(xì)胞分別 所發(fā)出的散射光和熒光中的至少 一種光信息的步驟；根據(jù)通過所述獲取步驟 而獲得的光信息，分別判別出與各個(gè)光信息相對應(yīng)的所述活細(xì)胞是所述不需 要的活細(xì)胞還是所述目標(biāo)活細(xì)胞的步驟；根據(jù)所述判別步驟中的判別結(jié)果， 使脈沖電場發(fā)生在與所述樣品液流中所述不需要的活細(xì)胞相對應(yīng)的部分，由 此使所述不需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞的步驟。
此時(shí)，在變?yōu)樗鏊兰?xì)胞的步驟中，優(yōu)選使脈沖電場作用于所述不需要 的活細(xì)胞上，由此使所述不需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞的方式。而 且，此時(shí)，在變?yōu)樗鏊兰?xì)胞的步驟中，作用于所述不需要的活細(xì)胞的脈沖 電場的脈沖寬度優(yōu)選按照下述方式設(shè)定電場施加于所述不需要的活細(xì)胞的 細(xì)胞核，并^f吏所述細(xì)胞核內(nèi)部的DNA受到損傷。此時(shí)，所述脈沖寬度優(yōu)選 比1.0xl(^秒短的脈沖寬度。
此時(shí)，在變?yōu)樗鏊兰?xì)胞的步驟中，優(yōu)選下述方式使脈沖電場作用于 所述不需要的活細(xì)胞，并在所述不需要的活細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脈沖電流，通過由所 述脈沖電流產(chǎn)生的焦耳熱，在所述不需要的活細(xì)胞上誘發(fā)細(xì)胞凋亡。
此外，在變?yōu)樗鏊兰?xì)胞的步驟中，作用于所述不需要的活細(xì)胞的脈沖 電場的脈沖寬度和峰值電壓優(yōu)選4要照下述方式設(shè)定施加在所述不需要的活 細(xì)胞細(xì)胞膜的電場大于施加在所述不需要的活細(xì)胞細(xì)胞核的電場，且所述細(xì) 胞膜不可逆地被破壞。此時(shí)，所述脈沖寬度優(yōu)選與l.Oxl(T6秒相等或比 1.0xl(^秒長的脈沖寬度。優(yōu)選施加在所述不需要的活細(xì)胞細(xì)胞膜上的電場 為lkV/cm以上，且所述峰值電壓為IOV以上。
另外，優(yōu)選還包括將含有因所述脈沖電壓的施加而受到損傷的所述死細(xì)胞和所述目標(biāo)細(xì)胞的、^皮施加了所述脈沖電壓后的所述樣品液回收在回收 容器內(nèi)的步驟；在所述樣品液中，將附著在所述回收容器內(nèi)壁面上的細(xì)胞作 為所述目標(biāo)活細(xì)胞來回收，且將沒有附著在所述回收容器的內(nèi)壁面上而是浮 游在所述樣品液上的細(xì)胞作為所述死細(xì)胞來進(jìn)行分級分離并回收的步驟。
另夕卜，優(yōu)選還包括將含有因所述脈沖電壓的施加而受到損傷的所述死 細(xì)胞和所述目標(biāo)細(xì)胞的、^皮施加了所述脈沖電壓后的所述樣品液回收在回收 容器內(nèi)的步驟；通過對所述回收容器中的所述樣品液實(shí)施可培養(yǎng)出活細(xì)胞的 培養(yǎng)處理，且僅培養(yǎng)出所述樣品液中的所述目標(biāo)活細(xì)胞，使所述樣品液中的 所述死細(xì)胞的比例減少的步驟。
此外，本發(fā)明提供一種具有細(xì)胞分級分離處理功能的流式細(xì)胞儀，其特 征在于，包括流動池，樣品液在其內(nèi)部流動，其中所述樣品液含有由多個(gè) 不需要的活細(xì)胞和目標(biāo)活細(xì)胞混合而形成的活細(xì)胞群；電場發(fā)生部，在所述 流動池內(nèi)的特定區(qū)域產(chǎn)生脈沖電場；測量光照射部，朝向所述流動池內(nèi)的所 述樣品液流照射測量光；光信息獲取部，接受所述測量光的照射，并分別獲 取由所述樣品液流的各個(gè)活細(xì)胞分別所發(fā)出的散射光和熒光中的至少 一 種 光信息；活細(xì)胞判別部，根據(jù)通過所述光信息獲取裝置而獲得的光信息，分 別判別出與各個(gè)光信息相對應(yīng)的所述活細(xì)胞是所述不需要的活細(xì)胞還是所 述目標(biāo)活細(xì)胞；控制部，根據(jù)上述所述活細(xì)胞判別裝置中的判別結(jié)果，通過 上述所述電場發(fā)生裝置來控制上述所述脈沖電場的發(fā)生時(shí)間；其中，上述所 述控制部在上述所述不需要的活細(xì)胞經(jīng)過上述所述流動池內(nèi)的上述所述特
所述不需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞。
此時(shí)，所述電場發(fā)生部優(yōu)選包括兩個(gè)電極，其按照夾著所述流動池的 特定區(qū)域的方式布置；脈沖電壓施加部，其在所述兩個(gè)電才及之間施加脈沖電 壓。
本發(fā)明的具有細(xì)胞分級分離處理功能的流式細(xì)胞儀，能夠使作為目標(biāo)的活 細(xì)胞不受到任何損傷，且從含有大量活細(xì)胞的細(xì)胞群中短時(shí)間內(nèi)且高精度地分 級分離出不需要的活細(xì)胞，并使該不需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞。此 外，本發(fā)明的活細(xì)胞分級分離處理方法，能夠使作為目標(biāo)的活細(xì)胞不受到任何 損傷，且從含有大量活細(xì)胞的細(xì)胞群中短時(shí)間內(nèi)且高精度地分級分離出目標(biāo)活
9細(xì)胞并對其進(jìn)行回收。此外，本發(fā)明的活細(xì)胞分級分離處理方法，能夠使作為 目標(biāo)的活細(xì)胞不受到任何損傷，且從含有大量活細(xì)胞的細(xì)胞群中短時(shí)間內(nèi)且高 精度地分級分離出目標(biāo)活細(xì)胞并對其進(jìn)行培養(yǎng)。


圖1為對本發(fā)明的具有細(xì)胞分離分級處理功能的流式細(xì)胞儀中的一例進(jìn)行
說明的概略立體圖2為表示對圖1所示的流式細(xì)胞儀的光學(xué)單元和電壓施加單元的結(jié)構(gòu)及 動作進(jìn)行更詳細(xì)說明的概略側(cè)視圖3(a)和圖3(b)為表示對設(shè)置在圖1中的流式細(xì)胞儀的流動池上的電極和 其附近部分進(jìn)行放大的概略側(cè)視圖4為對作為現(xiàn)有的具有細(xì)胞分級分離功能的流式細(xì)胞儀的一例的細(xì)胞分 選器進(jìn)行說明的概略構(gòu)成圖。
符號說明
10流式細(xì)胞4義
11活細(xì)胞群
12分析樣品
12a干細(xì)胞
12b不需要的活細(xì)胞
13死細(xì)月包
15鞘流
17樣品液流
20液流形成單元
22液體供給裝置
25分析樣品液槽
27鞘液槽
32流動池
34外部管道
36樣品液流管40光學(xué)單元
42測量激光照射部
44、 46受光部
50分析單元
52數(shù)據(jù)獲取部
54數(shù)據(jù)處理和判別部
60電壓施加單元
62脈沖電壓發(fā)生器
64a、 64b電極
70控制裝置
72供電時(shí)間控制部
82細(xì)胞膜
84細(xì)胞質(zhì)
86核膜
88核質(zhì)
100細(xì)胞分選器 102細(xì)胞樣品 103噴嘴 104噴射流 106激光
108、 110光電增倍管 112液滴
114、 116電場形成電核j反 120試管
具體實(shí)施例方式
以下，基于附圖所示的優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明的具有細(xì)胞分級分離處理功能 的流式細(xì)胞儀以及細(xì)胞分級分離處理方法進(jìn)行詳細(xì)說明。圖l是對作為本發(fā)明 的具有細(xì)胞分離分級處理功能的流式細(xì)胞儀的一例的流式細(xì)胞儀10進(jìn)行說明 的概略立體圖。流式細(xì)胞儀10包括液流形成單元20、光學(xué)單元40、分析單元50、電壓 施加單元60、控制各部動作順序的控制裝置70、回收容器80。流式細(xì)胞4義10 是按照下述方式構(gòu)成的裝置在大量不需要的活細(xì)胞(干細(xì)胞之外的細(xì)胞)中，
干細(xì)胞的判別，且僅對判別為不是干細(xì)胞(即，不需要的活細(xì)胞)的活細(xì)胞施加 脈沖電壓以使不需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞。流式細(xì)胞儀IO還包括用 于對施加了脈沖電壓之后的、含有死細(xì)胞和干細(xì)胞的樣品液進(jìn)行回收的回收容 器80，且具有如下功能其將沒有附著在回收容器80的內(nèi)壁面而是浮游在樣 品液上的細(xì)胞作為死細(xì)胞來進(jìn)行分級分離并將其進(jìn)行回收；通過對回收容器80 中的樣品液實(shí)施可培養(yǎng)出活細(xì)胞的培養(yǎng)處理，且僅分級分離出樣品液中的干細(xì) 胞并進(jìn)行培養(yǎng)，由此減少樣品液中死細(xì)胞的比例。
流式細(xì)胞儀10是例如從下述活細(xì)胞群中，即在由人的骨髓中提取的活細(xì)胞 群等的大量活細(xì)胞中比例雖然為極小但含有干細(xì)胞(含有的可能性高)的活細(xì)胞 群中分級分離出干細(xì)胞的、具有所謂分選功能的裝置(分選系統(tǒng))。在本實(shí)施方 式中，如此通過使用流式細(xì)胞儀IO例如從下述活細(xì)胞群中，即在由人的骨髓中 提取的活細(xì)胞群等的大量活細(xì)胞中比例雖然為極小但含有干細(xì)胞(含有的可能 性高)的活細(xì)胞群中分級分離出干細(xì)胞以實(shí)施各種處理。另外，本發(fā)明中的目標(biāo) 活細(xì)胞并不限定在干細(xì)胞。
如上所述，人的骨髓中被稱為間葉系干細(xì)胞的細(xì)胞僅以十萬分之一的比例 存在。在利用流式細(xì)胞儀IO來進(jìn)行的細(xì)胞分級分離處理中，通過預(yù)先對這樣的 活細(xì)胞群利用熒光色素實(shí)施均勻的染色處理(熒光標(biāo)簽)來賦予能夠識別出干細(xì) 胞與其他不需要的活細(xì)胞的特點(diǎn)。干細(xì)胞在所謂的MDR(Multi Drug Resistance) 作用下具有將獲^^到細(xì)胞內(nèi)的色素排出的性質(zhì)。在特定條件下通過使用特定的 熒光色素對活細(xì)胞群進(jìn)行染色處理時(shí)，通過該MDR的功能使得干細(xì)胞處在幾 乎無法染色(排出色素)的狀態(tài)。在流式細(xì)胞4義10所進(jìn)行的細(xì)胞分級分離處理中， 如此使用根據(jù)細(xì)胞中的熒光色素的不同的染色狀態(tài)而賦予能夠識別出干細(xì)胞 12a與其他不需要的活細(xì)胞12b特點(diǎn)的活細(xì)胞群11。將活細(xì)胞群11導(dǎo)入流式細(xì) 胞儀10的時(shí)刻，理所當(dāng)然地不清楚活細(xì)胞群11中的每個(gè)細(xì)胞是干細(xì)胞12a還 是不需要的活細(xì)胞12b。本說明書中，將干細(xì)胞12a和不需要的活細(xì)胞12b(特 別是，在不知其是干細(xì)胞還是不需要的細(xì)胞的狀態(tài)中)均以分析樣品12來記載。另外，在本實(shí)施方式中，是通過干細(xì)胞所具有的MDR功能賦予了可識別出干 細(xì)胞與其他不需要的活細(xì)胞的特點(diǎn)，但在本發(fā)明中，對通過熒光色素賦予可識 別出目標(biāo)細(xì)胞和其他不需要的活細(xì)胞的特點(diǎn)的方式并沒有特別的限定。
液流形成單元20包括液體供給裝置22和流管部30。液體供給裝置22和 流管部30是通過配管24來連接的。在液體供給裝置22內(nèi)包括蓄留分析樣品液 的分析樣品液槽25和蓄留鞘液的鞘液槽27。流管部30包括流動池32，樣品 液被鞘液包圍而在其內(nèi)部流動；外部管道34，其向流動池32供給鞘液且與流 動池32相連；樣品液流管36,其凈皮設(shè)置在外部管道34的內(nèi)部，向流動池32 供給樣品液。液體供給裝置22的樣品液槽25和鞘液槽27通過配管24分別與 樣品液流管36和外部管道34相連接，在流動池32的出口處設(shè)置有回收容器 80。
該液體供給裝置22中每一個(gè)槽均包括未圖示的氣泵。在流式細(xì)胞4義10中， 通過利用未圖示的氣泵向鞘液槽27內(nèi)部加壓來朝向外部管道34內(nèi)部供^^鞘液， 從而形成在外部管道34和流動池32內(nèi)從圖1的上側(cè)朝向下側(cè)流動的鞘流15(參 照圖2)。另外，通過利用未圖示的氣泵向樣品液槽25加壓來朝向樣品液流管 36內(nèi)部供給樣品液，并將樣品液從位于樣品液流管36的圖中下側(cè)的開口端的 排出口 38朝向鞘流15排出。
在流動池32中，樣品液形成下述樣品液流17:在^皮排出到鞘流15的階賴二 發(fā)生流體力學(xué)性聚焦，被鞘流15包圍的樣品液的流動變得非常細(xì)，且每個(gè)分析 樣品12沿流動方向相間隔而排成一列。在本實(shí)施方式的流式細(xì)胞儀10中，液 體供給裝置22等的動作(氣泵的壓力等)按照樣品液流等分析樣品12分別以大 致均等且按規(guī)定間隔(例如10]Ltm)流動的方式進(jìn)行調(diào)整。即，在流動池32中， 分析樣品12呈一列并逐一地按照纟見定速度Vm/秒依次通過流動池32。在該流 動池32中，分析樣品12通過光學(xué)單元40的測量激光照射部42被照射激光， 且以4黃切該〖敫光的方式逐一i也依次通過流動池。
光學(xué)單元40包括測量激光照射部42，其朝向流動池32照射測量用激光； 受光部44，接受通過流動池32(包含在樣品液流17中流動)的分析樣品12所發(fā) 出的散射光，并輸出與接受的散射光相對應(yīng)的信號；受光部46,接受通過流動 池32的分析樣品12所發(fā)出的熒光，并輸出與接受的熒光相對應(yīng)的信號。受光 部44、 46分別與分析單元50相連4妄，輸出的光信號^f皮傳輸?shù)椒治鰡卧?0。
13圖2為對光學(xué)單元40和電壓施力。單元60的構(gòu)成和動作進(jìn)行更詳細(xì)說明的 概略側(cè)視圖。測量激光照射部42包括測量激光照射部42,其朝向通過流動 池32的樣品液流17射出特定波長的激光；激光整形和調(diào)整部64,其由透鏡等 構(gòu)成，對從測量激光照射部42所射出的測量用激光進(jìn)行整形并將其導(dǎo)入流動池 32內(nèi)的樣品液流17上。測量激光照射部42與未圖示的激光電源連接并在控制 裝置10的控制下，朝向通過流動池32內(nèi)的、分析樣品12排成一列的樣品液流 17連續(xù)射出測量用激光。從測量激光照射部42所射出的測量用激光是使附著 在分析樣品12上(特別是被不需要的活細(xì)胞12b吸收而附著)的熒光色素得到激 發(fā)而產(chǎn)生特定波長范圍的熒光的、特定波長的激光。作為測量激光照射部42 可以使用固體激光器或半導(dǎo)體激光器等公知的激光裝置。
受光部44按照夾著流動池32且與測量激光照射部42相對而置的方式進(jìn)行 布置，連續(xù)接受基于通過流動池32的分析樣品12的激光的前向散射光，并輸 出與所接受的前向散射光的強(qiáng)度相對應(yīng)的模擬電信號。另一方面，受光部46 相對于激光照射部42所射出的激光的射出方向呈垂直且相對于外部管道30中 的分析樣品12的移動方向呈垂直地布置，由此接受由分析樣品12接受激光后 所發(fā)出的熒光，并輸出與接受的熒光強(qiáng)度相對應(yīng)的模擬電信號。在受光部44 和受光部46中的光檢測和模擬電信號的輸出中，例如可以使用 PMT(photomultiplier tube)。
分析單元50包括數(shù)據(jù)獲取部52和數(shù)據(jù)處理和判別部54。數(shù)據(jù)獲取部52 收到由受光部44和受光部46所輸出的模擬信號后將該模擬信號變換成AD， 并以數(shù)字信號的方式輸出。數(shù)據(jù)處理和判別部54處理由數(shù)據(jù)獲取部52所輸出 的數(shù)據(jù)信息，例如導(dǎo)出表示各個(gè)分^f樣品12的染色狀態(tài)(活細(xì)胞中的熒光色素 量的程度)的信息(染色量信息)。數(shù)據(jù)處理和判別部54還才艮據(jù)該染色量信息判別 出對應(yīng)于染色量信息的分析樣品12是不需要的活細(xì)胞還是干細(xì)胞。在本實(shí)施方 式中，如上所述，由于干細(xì)胞12a與不需要的活細(xì)胞12b相比其染色狀態(tài)(活細(xì) 胞中的熒光色素量的程度)較低，因此將與表示染色狀態(tài)較低的染色量信息(例 如，表示染色量的值在規(guī)定的閾值以下)相對應(yīng)的分析樣品12判別為干細(xì)胞 12a。
數(shù)據(jù)處理和判別部54將判別結(jié)果發(fā)送到控制裝置70的供電時(shí)間控制部 72(時(shí)間控制部72)上。另外，分析單元50與顯示器或打印機(jī)等的未圖示的輸出裝置相連，可以顯示和輸出數(shù)據(jù)處理部54中的分析結(jié)果。另外，在本實(shí)施方式
中，通過從光信息導(dǎo)出細(xì)胞的染色狀態(tài)程度，由此判別出其為干細(xì)胞還是不需 要的活細(xì)胞，但對本發(fā)明中的活細(xì)胞進(jìn)行判別時(shí)所使用的、目標(biāo)活細(xì)胞和不需 要的活細(xì)胞之間的判別標(biāo)準(zhǔn)并沒有特別的限定。對本發(fā)明中的活細(xì)胞進(jìn)行判別 時(shí)所使用的、對所獲得的熒光信息等光信息實(shí)施的處理內(nèi)容和為了特定目標(biāo)細(xì) 胞而實(shí)施的算法等并沒有特別的限定。
電壓施加單元60的構(gòu)成包括脈沖電壓發(fā)生器62;電極64a和電極64b， 它們分別以相對而置的方式被設(shè)置在流動池32的管壁上且分別與脈沖電壓發(fā) 生器62的輸出端相連。脈沖電壓發(fā)生器62在控制單元70的供電時(shí)間控制部 72的控制下，在電極64a和電極64b之間施加脈沖電壓。脈沖電壓發(fā)生器62 是能夠以例如，1.0><10-9秒~ 1.0xlO-G秒程度的脈沖寬度來輸出脈沖電壓的、公 知的脈沖電壓發(fā)生裝置。
電極64a和電極64b布置在從測量激光的照射位置A(參照圖2)向樣品液流 17的流動方向的下游側(cè)充分相隔開的位置(例如，相隔l.Oimn以上的位置)上。 例如，假設(shè)對應(yīng)于電極64a和電極64b的中央部分的電極位置B(參照圖2)與測 量激光的照射位置A之間相隔開預(yù)先設(shè)定好的距離Dm，且樣品液流17的速度 即分析樣品12的移動速度為Vm/秒，則一個(gè)分析樣品12從接受測量激光照射 的時(shí)刻開始經(jīng)過T二D/V秒后能夠通過電4及位置B。在分析單元50中，獲得光 信息之后至少在經(jīng)過該T秒前判別出與所獲取的光信息相對應(yīng)的分析樣品是不 需要的活細(xì)胞還是干細(xì)胞，并將判別結(jié)果發(fā)送到供電時(shí)間控制部72。
當(dāng)供電時(shí)間控制部72從分析單元50的數(shù)據(jù)處理和判別部54處所收到的判 別結(jié)果為，被測量激光照射的分析樣品12為不需要的活細(xì)胞12b時(shí)，控制脈沖 電壓發(fā)生器62的動作使得脈沖電壓施加在該不需要的活細(xì)胞12b上。相反地， 當(dāng)從分析單元50的數(shù)據(jù)處理和判別部54處所收到的判別結(jié)果為，凈皮測量激光 照射的分析樣品12為干細(xì)胞12a時(shí)，控制脈沖電壓發(fā)生器62的動作使得脈沖 電壓無法施加在干細(xì)力包12a上。
具體來講，當(dāng)供電時(shí)間控制部72從分析單元50的數(shù)據(jù)處理和判別部54 處所收到的判別結(jié)果為，被測量激光照射的分析樣品12為不需要的活細(xì)胞12b 時(shí)，在規(guī)定的時(shí)間范圍(所對應(yīng)的分析樣品12可靠地通過后述的有效電場區(qū)域 E的時(shí)間范圍)內(nèi)使電壓施加在脈沖電壓發(fā)生器62上(即，在電極64a和電極64b
15供電時(shí)間控制部72從分析單元50的凄t據(jù)處理和 判別部54處所收到的判別結(jié)果為，被測量激光照射的分析樣品12為千細(xì)胞12a 時(shí)，在規(guī)定的時(shí)間范圍(所對應(yīng)的分析樣品12可靠地通過有效電場區(qū)域E的時(shí) 間范圍)內(nèi)脈沖電壓發(fā)生器62按照不施加脈沖電壓的方式進(jìn)行控制。
對于上述規(guī)定的時(shí)間范圍可以預(yù)先進(jìn)行設(shè)定，例如，在供電時(shí)間控制部72 中可以設(shè)定上述T=D/V秒的信息或也可以設(shè)定后述的有效電場區(qū)域E(參照圖 3)的大小信息，當(dāng)供電時(shí)間控制部72具有比較高的處理能力的情況等時(shí)，也可 以按照如下方式對脈沖電壓的施加進(jìn)行控制。例如，供電時(shí)間控制部72從接收 所發(fā)送過來的判別結(jié)果的時(shí)刻開始，加上分析單元50中各處理時(shí)間的影響，確 定與該判別結(jié)果相對應(yīng)的分析樣品12(即，干細(xì)胞12a)通過測量激光的照射位 置A的時(shí)間。另外，當(dāng)供電時(shí)間控制部72收到其為干細(xì)胞12a的判別結(jié)果時(shí)， 至少確定出從該確定的時(shí)刻到經(jīng)過T=D/V秒的時(shí)刻(即，上述相應(yīng)的分析樣品 12通過電才及位置B的時(shí)刻)。而且，根據(jù)有效電場區(qū)域E的大小可求出含有通 過電極位置B時(shí)刻的規(guī)定的時(shí)間范圍(所對應(yīng)的一個(gè)分析樣品12通過有效電場 區(qū)域E的時(shí)間范圍)。當(dāng)供電時(shí)間控制部72收到其為干細(xì)胞12a的判別結(jié)果時(shí)， 按照至少在該規(guī)定的時(shí)間范圍(所對應(yīng)的分析樣品12可靠地通過后述的有效電 場區(qū)域E的時(shí)間范圍)之內(nèi)脈沖電壓發(fā)生器62不施加脈沖電壓的方式進(jìn)行控制。
圖3(a)和圖3(b)是在流動池32內(nèi)移動的不需要的活細(xì)胞12b所實(shí)施的脈沖 電壓的施加進(jìn)行說明的圖，且為對圖2所示的流動池32的電極64a和64b附近 進(jìn)行放大的圖。電極64a和64b被固定在流動池32的管壁上。電極64a和64b 例如若接觸到鞘流15的鞘液，則鞘液或樣品液發(fā)生激烈的電解，有可能連流動 池32內(nèi)的所需活細(xì)胞(即，千細(xì)胞12a)也受到損傷，因此電極64a和64b不直 接接觸鞘液或樣品液，而是通過絕緣物來進(jìn)行接觸。圖3(a)和圖3(b)中，電極 64a和64b的一部分以嵌入在流動池32的管壁上的方式4皮固定，且在鞘液與電 極64a、 64b之間布置例如由石英等絕緣物構(gòu)成的流動池32的管壁的一部分。
在本實(shí)施方式中，如圖3(a)所示，用來施加脈沖電壓的電極呈所謂的偶極 結(jié)構(gòu)，且由相對而置的兩個(gè)電極64a和64b來構(gòu)成。若利用脈沖電壓發(fā)生器62 對電才及64a和64b之間施加脈沖電壓，則電才及64a和64b之間產(chǎn)生電場。鞘流 15的鞘液和樣品液流17的樣品液均具有導(dǎo)電性，且在流動池32內(nèi)部產(chǎn)生電場。 例如，如果為了使電極64a的電位更高、電極64b的電位更低，以l.Oxl(X9秒~i.oxio-6秒程度的脈沖寬度施加脈沖電壓，則產(chǎn)生脈沖寬度為1.0xl0"秒 1 .Oxl(T6秒左右且可用從電極64a到電極64b的電力線來表示的電場(脈沖電 場)。
例如，在圖3(a)所示的偶極結(jié)構(gòu)的電極之間施加有電場的情況下，在將活 細(xì)胞變?yōu)樗兰?xì)胞方面具有足夠強(qiáng)度的有效電場區(qū)域E按照以電極位置B為中心 具有一定程度擴(kuò)展的方式形成于流動池32內(nèi)。有效電場區(qū)域E形成為非常小 的區(qū)域，使得一個(gè)分析樣品12在通過該有效電場區(qū)域E時(shí)，其他的分析樣品 12不存在于有效電場區(qū)域E內(nèi)。例如，將分析樣品12的移動速度，即樣品液 流17的流速設(shè)定為5.0m/秒、將一秒鐘內(nèi)通過的分析樣品12的數(shù)量i殳定為5000 個(gè)時(shí)，樣品液流17中分析樣品12之間的平均距離約為1.0xl(T3m。此時(shí)，通過 調(diào)整電極64a和64b的大小、外加電場的大小，使得有效電場區(qū)域E的、沿樣 品液的流動方向擴(kuò)展的距離充分小于1.0xl(T3m。另外，在本發(fā)明中，為了抑制 有效電場區(qū)域E中沿樣品液的流動方向的擴(kuò)展，如圖3(b)所示，也可以形成在 用來施加脈沖電壓的電極64a和64b的基礎(chǔ)上再設(shè)置電場調(diào)整用電極66a和66b 的、所謂的多電極結(jié)構(gòu)。
若非常大強(qiáng)度的脈沖電壓作用在移動于流動池32內(nèi)的不需要的活細(xì)胞上， 則不需要的活細(xì)胞12b受到損傷而變成死細(xì)胞。通過脈沖電場作用在不需要的 活細(xì)胞12b上(即，通過施加脈沖電壓)，使不需要的活細(xì)胞變?yōu)樗兰?xì)胞的方式 主要有兩種。第一方式為通過施加脈沖寬度為1.0xlO-s秒以上的、具有比4支 寬的脈沖寬度的脈沖電壓，使電場集中在不需要的活細(xì)胞12b的細(xì)胞膜82上， 并在該細(xì)胞膜82上產(chǎn)生無法修復(fù)的孔，由此使不需要的活細(xì)胞12b變?yōu)樗兰?xì)胞。 如果在細(xì)胞膜82上產(chǎn)生無法修復(fù)的孔，則細(xì)胞質(zhì)84向細(xì)胞外流出，不需要的 活細(xì)胞12b被致死。另夕卜，第二方式為通過施加脈沖寬度比1.0xlO"秒短的、 具有比較窄的脈沖寬度的脈沖電壓，使電場作用至不需要的活細(xì)胞12b的細(xì)胞 核88上(換句話講，使電場進(jìn)入)，使細(xì)胞核88所含有的DNA(deoxyribonucleic acid)受到損傷，由此使不需要的活細(xì)胞12b變?yōu)樗兰?xì)胞。根據(jù)第二方式，例如 會誘發(fā)在DNA上最初被程序化了的細(xì)胞凋亡，由此使不需要的活細(xì)胞12b變 為死細(xì)胞。此時(shí)，由于非常大強(qiáng)度的脈沖電場作用在不需要的活細(xì)胞12b上， 因此對應(yīng)于脈沖電場的脈沖電流進(jìn)入到不需要的活細(xì)胞12內(nèi)特別是進(jìn)入到細(xì) 胞核88內(nèi)，通過脈沖電流所產(chǎn)生的焦耳熱使DNA受到損傷，由此導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
作為一般細(xì)胞的不需要的活細(xì)胞12b和干細(xì)胞12a按照核與細(xì)胞質(zhì)84被細(xì) 胞膜82包圍的方式構(gòu)成，其中核以核質(zhì)88被核膜86包圍的方式構(gòu)成。在核質(zhì) 88中存在含DNA的染色體。若將這樣的不需要的活細(xì)胞12b用等效電路來表 示，則細(xì)胞膜82和核膜88部分可以用電阻和電容器來表示，且電容器的介電 常數(shù)較高。即，在這樣的不需要的活細(xì)胞12b的等效電路中，細(xì)胞膜82和核膜 88部分主要是起電容器的作用。若在這樣的整個(gè)等效電路上所施加的脈沖寬度 大(即，外加電壓的頻率低)，則電容器存儲電荷且比較大的電壓作用于等效電 路中。另一方面，脈沖寬度越小(即，外加電壓的頻率高)電荷越不會存儲在電 容器內(nèi)，且電壓作用于整個(gè)等效電路上。不需要的活細(xì)胞12b的情況也與上述 相同，若施加脈沖寬度為1.0xl(^秒以上的、具有比較寬的脈沖寬度的脈沖電 壓，則如上述第一方式所述，電場集中在不需要的活細(xì)胞12b的細(xì)胞膜82上。 相反地，若施加脈沖寬度比1.0xl04秒短的、具有比較窄的脈沖寬度的脈沖電 壓，則如上述第二方式所述，電場還作用到不需要的活細(xì)胞12b的細(xì)胞核88 上(換句話講，使電能進(jìn)入)。
在此，如第一方式所述，即使是將電場集中在細(xì)胞膜82上形成孔的情況下， 若電場比較小，則細(xì)胞膜82通過自己所具有的自我修復(fù)功能，在短時(shí)間內(nèi)修復(fù) 所形成的孔。即，如第一方式所述，在細(xì)胞膜82上形成孔的情況下，若作用于 細(xì)胞膜82上的電場比較小，則無法使不需要的細(xì)胞12b變?yōu)樗兰?xì)胞。如第一方 式所述，當(dāng)在細(xì)胞膜82形成孔以使不需要的細(xì)胞12b變?yōu)樗兰?xì)胞時(shí)，必須形成 通過細(xì)胞的自我修復(fù)功能無法進(jìn)行修復(fù)的孔。為了形成這樣的孔，必須施加能 夠達(dá)到充分破壞細(xì)胞膜82組織的、非常強(qiáng)的電場。在本發(fā)明中，當(dāng)施加脈沖寬 度為1.0xl(^秒以上的、具有比較寬的脈沖寬度的脈沖電壓時(shí)，優(yōu)選作用于細(xì) 胞膜82的電場為lkV/cm以上的、足夠強(qiáng)的電場。通常的流動池的直徑為100~ 400/mi，用來施加脈沖電壓的電極間距離也可以是100~400/mi,因此脈沖電壓 的峰值，例如優(yōu)選為10V以上。另外，如果施加在樣品液或鞘液的電場過強(qiáng)， 則會引起沖擊波，或者樣品液或鞘液突然沸騰，流動池有可能被石皮壞掉。為了 防止這種裝置的損壞，脈沖電壓的峰值優(yōu)選為IOOOV以下。即，在本發(fā)明中， 當(dāng)施加脈沖寬度為1.0xlO"秒以上的、具有比較寬的脈沖寬度的脈沖電壓時(shí)， 脈沖電壓的峰^f直例如優(yōu)選為1OV以上且1OOOV以下。如上所述，在第二方式中，例如誘發(fā)在DNA上最初被程序化了的細(xì)月包凋 亡，使不需要的活細(xì)胞12b變?yōu)樗兰?xì)胞。細(xì)胞凋亡是指構(gòu)成多細(xì)胞生物體的細(xì) 胞的一種死亡方式，是一種為了使個(gè)體更好地保持良好的狀態(tài)而積極誘導(dǎo)的、 受管理和調(diào)節(jié)的細(xì)胞的自殺方式。相對于該細(xì)胞凋亡，因基于血液循環(huán)不良、
外傷等細(xì)胞內(nèi)外的環(huán)境惡化而引起的細(xì)胞死亡被稱為細(xì)胞壞死(necrosis)或壞 死。如上所述的第一方式，因在細(xì)胞膜上形成不可逆的孔而引起的細(xì)胞死亡屬 于上述細(xì)胞壞死。
為了使細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡必須使DNA受到損傷。在第二方式中，通過施 加脈沖寬度比1.0xl04秒短的、具有比較窄的脈沖寬度的脈沖電壓，使電場作 用至不需要的活細(xì)胞12b的細(xì)胞核88(換句話講，使電場進(jìn)入)上，由此佳j皮細(xì) 胞核88所含有的DNA受到損傷。在第二方式中，為了盡量給細(xì)胞核88施加 大的電場，換句話講，為了使電能盡量侵入到不需要的活細(xì)胞12b的較深部分， 優(yōu)選盡量使用脈沖寬度短的脈沖電壓，例如低于1,OxlO,秒。
在通過脈沖電壓使活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞的本發(fā)明中，例如，通過 施加一個(gè)1.0xl0"秒 1.0xl0"秒程度的、具有極其短的脈沖寬度的脈沖電壓， 能夠使一個(gè)細(xì)胞變?yōu)樗兰?xì)胞。即，每一個(gè)脈沖能夠使一個(gè)細(xì)胞變?yōu)樗兰?xì)胞。例 如，以l.Oxl(T9秒的脈沖寬度施加脈沖電壓的情況下，最多在一秒鐘內(nèi)可使 1.0xl(^個(gè)細(xì)胞變成死細(xì)胞。通過脈沖電壓發(fā)生裝置連續(xù)輸出脈沖電壓時(shí)，脈沖 寬度越短，即，頻率越高，每個(gè)脈沖電壓越低地一皮抑制。如上所述，在流式細(xì) 胞儀10中，在直徑為100/rni 400]imi的非常細(xì)的流動池32的管壁上設(shè)置有電 極64a和64b,且在電極間距離為100/xm~ 400jwn的非?？拷碾姌O64a和電 極64b之間施加脈沖電壓。由此，即使每個(gè)電壓被抑制得較低，產(chǎn)生在電才及間 的電場強(qiáng)度也足夠大得能夠使細(xì)胞變?yōu)樗兰?xì)胞。
在流式細(xì)胞儀10中，當(dāng)供電時(shí)間控制部72從分析單元50的數(shù)據(jù)處理和判 別部54處接收到被測量激光照射的分析樣品12為不需要的活細(xì)胞12b的判別 結(jié)果時(shí)，通過控制脈沖電壓發(fā)生器62的動作，使脈沖電壓被施加在該不需要的 活細(xì)胞12b上，由此樣品群12中的不需要的活細(xì)胞12b能可靠地變?yōu)樗兰?xì)胞。 此外，相反地，當(dāng)從分析單元50的數(shù)據(jù)處理和判別部54處接收到被測量激光 照射的分析樣品12為干細(xì)胞12a的判別結(jié)果時(shí)，通過控制脈沖電壓發(fā)生器62 的動作，使脈沖電壓不施加在干細(xì)胞12a上，由此樣品群12中的干細(xì)胞12a不受到任何損傷，可靠地通過有效電場區(qū)域E。
通過了有效電場區(qū)域E的分析樣品12落入到回收容器80內(nèi)。例如，活細(xì) 胞通常具有附著(著床)在所接觸的物體上的性質(zhì)。因此，回收容器80的壁面呈 現(xiàn)出4又附著有通過力永沖電壓的施加并沒有變?yōu)樗兰?xì)胞13的分析樣品12即干細(xì) 胞12a的狀態(tài)。通過脈沖電壓的施加而變?yōu)樗兰?xì)胞13的細(xì)胞呈現(xiàn)出浮游在回收 容器80內(nèi)的樣品液上的狀態(tài)。通過將該浮游狀態(tài)的死細(xì)胞13(曾經(jīng)為不需要的 活細(xì)胞12b的細(xì)胞)除去，能夠在回收容器80內(nèi)僅分離出作為目標(biāo)活細(xì)胞的干 細(xì)胞12a以進(jìn)行回收。流式細(xì)胞儀10優(yōu)選具有這種的、將沒有附著在回收容器 80的內(nèi)壁面而是浮游在樣品液上的細(xì)胞作為死細(xì)胞13以進(jìn)行分級分離并回收， 且在回收容器80內(nèi)僅分離和回收作為目標(biāo)活細(xì)胞的干細(xì)胞12a的分離和回收才幾 構(gòu)。
此外，若對回收容器80中的樣品液實(shí)施可培養(yǎng)出活細(xì)胞的培養(yǎng)處理，則不 能培養(yǎng)(增殖)出樣品液中的死細(xì)胞(曾經(jīng)為不需要的活細(xì)胞12b的細(xì)胞)，而是僅 培養(yǎng)(增殖)出樣品液中的活細(xì)胞。這樣，由于通過脈沖電壓將樣品群11中的不 需要的活細(xì)胞12b可靠地變?yōu)樗兰?xì)胞，因此通過對樣品液實(shí)施培養(yǎng)處理，能夠 僅分級分離出樣品群11中的干細(xì)胞12a，并能夠減少在樣品液中的死亡細(xì)胞13 的比例。通過這樣的培養(yǎng)處理，能夠得到幾乎所有的細(xì)胞由干細(xì)胞12a構(gòu)成的 細(xì)胞群。流式細(xì)胞儀IO優(yōu)選具有這樣的、能夠?qū)厥杖萜?0中的樣品液實(shí)施 可培養(yǎng)出活細(xì)胞的培養(yǎng)處理的培養(yǎng)裝置。流式細(xì)胞儀IO具有如上所述的構(gòu)成。
根據(jù)本發(fā)明的具有細(xì)胞分級分離處理功能的流式細(xì)胞儀，能夠使作為目標(biāo) 的活細(xì)胞不受到任何損傷，且從含有大量活細(xì)胞的細(xì)胞群中短時(shí)間內(nèi)且高精度 地分級分離出不需要的活細(xì)胞，并使該不需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞。 此外，根據(jù)本發(fā)明的活細(xì)胞分級分離處理方法的另一種方式，能夠使作為目標(biāo) 的活細(xì)胞不受到任何損傷，且從含有大量活細(xì)胞的細(xì)胞群中短時(shí)間內(nèi)且高精度 地分級分離出目標(biāo)活細(xì)胞并對其進(jìn)行回收。此外，根據(jù)本發(fā)明的活細(xì)胞分級分 離處理方法的其他方式，能夠使作為目標(biāo)的活細(xì)胞不受到任何損傷，且乂人含有 大量活細(xì)胞的細(xì)胞群中短時(shí)間內(nèi)且高精度地分級分離出目標(biāo)活細(xì)胞并對其進(jìn)行 培養(yǎng)。
上述實(shí)施方式中，通過在電極間施加脈沖電壓，使脈沖電場作用于細(xì)胞而 使其變?yōu)樗兰?xì)胞。在本發(fā)明中，也可以在與樣品液流中的不需要的活細(xì)胞相對應(yīng)的部分產(chǎn)生脈沖電場，例如使電場作用于樣品液自身。例如，在上述流式細(xì)
胞儀10中，當(dāng)將在電極64a和64b之間產(chǎn)生的電場強(qiáng)度極大地設(shè)為1.0xl03V~ 1.0xl(yV時(shí)，在鞘液或樣品液內(nèi)發(fā)生》文電，例如在樣品液內(nèi)發(fā)生沖擊波。如果 不需要的活細(xì)胞12b的細(xì)胞膜因該沖擊波而被破壞(不可逆破壞)，則不需要的 活細(xì)胞12b將變?yōu)樗兰?xì)胞。此外，若極大的電場作用于樣品液，則樣品液呈等 離子狀態(tài)而產(chǎn)生紫外線。該紫外線導(dǎo)致不需要的活細(xì)胞12b的細(xì)胞核88、甚至 DNA也受到損傷。在本發(fā)明中，由此通過使脈沖電場作用于樣品液自身，也可 以使不需要的活細(xì)胞變?yōu)樗兰?xì)胞。
如上所述，對具有細(xì)胞分級分離處理功能的流式細(xì)胞儀和細(xì)胞分級分離方 法進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限定在上述實(shí)施例，在不脫離本發(fā)明主題 的范圍內(nèi)所進(jìn)行的各種改良或改變均包括在本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.一種活細(xì)胞分級分離處理方法，其特征在于，包括形成樣品液流的步驟，所述樣品液流中含有由多個(gè)不需要的活細(xì)胞和多個(gè)目標(biāo)活細(xì)胞混合而形成的活細(xì)胞群，且所述活細(xì)胞群的各個(gè)活細(xì)胞分別相互隔開而在一條直線上流動；朝向所述樣品液流照射測量光的步驟；接受所述測量光的照射，并分別獲取由所述樣品液流的各個(gè)活細(xì)胞分別所發(fā)出的散射光和熒光中的至少一種光信息的步驟；根據(jù)通過所述獲取步驟而獲得的光信息，分別判別出與各個(gè)光信息相對應(yīng)的所述活細(xì)胞是所述不需要的活細(xì)胞還是所述目標(biāo)活細(xì)胞的步驟；根據(jù)所述判別步驟中的判別結(jié)果，使脈沖電場發(fā)生在與所述樣品液流中所述不需要的活細(xì)胞相對應(yīng)的部分，由此使所述不需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞的步驟。
2. 如權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞分級分離處理方法，其中，在變?yōu)樗?死細(xì)胞的步驟中，使脈沖電場作用于所述不需要的活細(xì)胞上，由此使所述不 需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞。
3. 如權(quán)利要求2所述的活細(xì)胞分級分離處理方法，其中，在變?yōu)樗?死細(xì)胞的步驟中，作用于所述不需要的活細(xì)胞的脈沖電場的脈沖寬度按照下 述方式設(shè)定電場施加于所述不需要的活細(xì)胞的細(xì)胞核，并使所述細(xì)胞核內(nèi) 部的DNA受到損傷。
4. 如權(quán)利要求3所述的活細(xì)胞分級分離處理方法，其中，所述脈沖寬 度比1.0xl0"秒短。
5. 如權(quán)利要求4所述的活細(xì)胞分級分離處理方法，其中，在變?yōu)樗?死細(xì)胞的步驟中，使脈沖電場作用于所述不需要的活細(xì)胞，并在所述不需要 的活細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脈沖電流，通過由所述脈沖電流產(chǎn)生的焦耳熱，在所述不需要的活細(xì)胞上誘發(fā)細(xì)胞凋亡。
6. 如權(quán)利要求2所述的活細(xì)胞分級分離處理方法，其中，在變?yōu)樗?死細(xì)胞的步驟中，作用于所述不需要的活細(xì)胞的脈沖電場的脈沖寬度和峰值電壓按照下述方式設(shè)定施加在所述不需要的活細(xì)胞細(xì)胞膜的電場大于施加 在所述不需要的活細(xì)胞細(xì)胞核的電場，且所述細(xì)胞膜不可逆地纟皮破壞。
7. 如權(quán)利要求6所述的活細(xì)胞分級分離處理方法，其中，所述脈沖寬 度與1.0xl0"秒相等或比1.0xl0-6秒長。
8. 如權(quán)利要7所述的活細(xì)胞分級分離處理方法，其中，施加在所述不 需要的活細(xì)胞細(xì)胞膜上的電場為lkV/cm以上，且所述峰值電壓為IOV以上。
9. 如權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的活細(xì)胞分級分離處理方法，還包括 將含有因所述脈沖電壓的施加而受到損傷的所述死細(xì)胞和所述目標(biāo)細(xì)胞的、被施加了所述脈沖電壓后的所述樣品液回收在回收容器內(nèi)的步驟；在所述樣品液中，將附著在所述回收容器內(nèi)壁面上的細(xì)胞作為所述目標(biāo) 活細(xì)胞來回收，且將沒有附著在所述回收容器的內(nèi)壁面上而是浮游在所述樣 品液上的細(xì)胞作為所述死細(xì)胞來進(jìn)行分級分離并回收的步驟。
10. 如權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的活細(xì)胞分級分離處理方法，還包括 將含有因所述脈沖電壓的施加而受到損傷的所述死細(xì)胞和所述目標(biāo)細(xì)胞的、被施加了所述脈沖電壓后的所述樣品液回收在回收容器內(nèi)的步驟；通過對所述回收容器中的所述樣品液實(shí)施可培養(yǎng)出活細(xì)胞的培養(yǎng)處理， 且僅培養(yǎng)出所述樣品液中的所述目標(biāo)活細(xì)胞， -使所述樣品液中的所述死細(xì)胞 的比例減少的步驟。
11. 一種具有細(xì)胞分級分離處理功能的流式細(xì)胞儀，其特征在于，包括 流動池，樣品液在其內(nèi)部流動，其中所述樣品液含有由多個(gè)不需要的活細(xì)胞和目標(biāo)活細(xì)胞混合而形成的活細(xì)胞群；電場發(fā)生部，在所述流動池內(nèi)的特定區(qū)域產(chǎn)生^C沖電場； 測量光照射部，朝向所述流動池內(nèi)的所述樣品液流照射測量光； 光信息獲取部，接受所述測量光的照射，并分別獲取由所述樣品液流的各個(gè)活細(xì)胞分別所發(fā)出的散射光和熒光中的至少 一種光信息；活細(xì)胞判別部，根據(jù)通過所述光信息獲取裝置而獲得的光信息，分別判 別出與各個(gè)光信息相對應(yīng)的所述活細(xì)胞是所述不需要的活細(xì)胞還是所述目標(biāo)活細(xì)月包；控制部，根據(jù)所述活細(xì)胞判別裝置中的判別結(jié)果，通過所述電場發(fā)生裝 置來控制所述脈沖電場的發(fā)生時(shí)間；其中，所述控制部在所述不需要的活細(xì)胞經(jīng)過所述流動池內(nèi)的所述特定 區(qū)域的時(shí)刻，通過所述電場發(fā)生部在所述特定區(qū)域產(chǎn)生所述電場，使所述不 需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所記載的具有細(xì)胞分級分離處理功能的流式細(xì)胞儀， 其中，所述電場發(fā)生部包括兩個(gè)電極，其按照夾著所述流動池的特定區(qū)域的方式布置； 脈沖電壓施加部，其在所述兩個(gè)電才及之間施加脈沖電壓。
全文摘要
一種具有細(xì)胞分級分離處理功能的流式細(xì)胞儀和活細(xì)胞分級分離處理方法，其中，朝向含有活細(xì)胞群的樣品液流照射測量用激光，接受測量用激光的照射，分別獲取由樣品液流的各個(gè)活細(xì)胞分別所發(fā)出的散射光和熒光中的至少一種光信息，根據(jù)所獲取的光信息，分別判別出與各個(gè)光信息相對應(yīng)的活細(xì)胞是不需要的活細(xì)胞還是目標(biāo)活細(xì)胞，根據(jù)判別結(jié)果，僅對在樣品液的活細(xì)胞群中被判別為不需要的活細(xì)胞的活細(xì)胞施加脈沖電壓，使不需要的活細(xì)胞受到損傷而變?yōu)樗兰?xì)胞。
文檔編號C12N5/00GK101622339SQ200880006269
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月14日
發(fā)明者中田成幸, 伊藤彰英, 安田賢二, 木村憲明 申請人:三井造船株式會社