專利名稱：：來(lái)自多藥運(yùn)出蛋白缺損株的轉(zhuǎn)化株以及使用該轉(zhuǎn)化株的微生物轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及在多藥運(yùn)出蛋白缺損的宿主中整合來(lái)自異種生物的基因而得到的轉(zhuǎn)化抹、以及使用該轉(zhuǎn)化抹進(jìn)行的底物化合物的微生物轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：通常制備化合物的方法例如有化學(xué)合成法和酶促合成法。為了制備可作為很多藥物原料的化合物，高效率地進(jìn)行原料化合物的區(qū)域特異性或立體特異性修飾，這是不可缺少的。關(guān)于這些反應(yīng)，已知酶促合成法較為優(yōu)異。但是，以酶作為實(shí)際應(yīng)用的催化劑在工業(yè)規(guī)模中使用時(shí)，必須考慮酶本身所具有的本質(zhì)上的極限。即，酶的壽命短以及催化作用中必須有輔酶的問(wèn)題。目前在使用酶的制備工藝設(shè)計(jì)中，如何延長(zhǎng)酶的壽命、使酶活性持續(xù)的問(wèn)題受到了較多關(guān)注。在酶促合成法中使用的大部分的酶在其催化作用中必須有輔酶，例如在氧化還原的酶促反應(yīng)中，必須有NADH等吡啶核苷酸。這些輔酶通常價(jià)格昂貴，因此進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的酶促反應(yīng)時(shí)輔酶的添加在成本上存在較大的問(wèn)題。作為為了克服這些酶促反應(yīng)的極限的解決對(duì)策，建立了使用微生物、特別是大腸桿菌的細(xì)胞作為酶促反應(yīng)場(chǎng)所的戰(zhàn)略。即，通過(guò)將大腸桿菌用酶的基因轉(zhuǎn)化，可以使目標(biāo)酶在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)。這意味著可以在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)生產(chǎn)酶，只要細(xì)胞存活就可以維持酶活性。并且，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的各種代謝反應(yīng)，可以再生酶促反應(yīng)所必需的輔酶。將上述大腸桿菌的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使底物化合物與培養(yǎng)物接觸，獲得經(jīng)修飾的該化合物，通過(guò)該"微生物轉(zhuǎn)化，，可以嘗試生產(chǎn)可作為各種藥物原料的化學(xué)物質(zhì)。特別是使用由細(xì)胞色素P-450基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌對(duì)疏水性或兩親性的化合物進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的氧化反應(yīng)在藥物制備中很重要。細(xì)胞色素P-450基因所編碼的細(xì)胞色素P-450酶(以下簡(jiǎn)稱為P-450酶)是還原型、結(jié)合有一氧化碳、在450nm附近顯示索雷吸收帶(索雷帶)的一組含血紅素的蛋白質(zhì)的總稱。P-450酶與很多動(dòng)植物組織、霉菌、酵母的微粒體、一部分動(dòng)物組織的線粒體的內(nèi)膜結(jié)合，除此之外在某種細(xì)菌、霉菌中以可溶性的形式存在。P-450酶具有各種底物特異性。是可以以各種各樣的有機(jī)化合物作為底物的、顯示異常廣泛的底物特異性的酶，不過(guò)也存在只與比較有限種類的有機(jī)化合物反應(yīng)的底物特異性非常嚴(yán)格的酶。有時(shí)還顯示對(duì)反應(yīng)部位的立體特異性(stereo-specificity)或區(qū)域特異性(regio-specificity)也優(yōu)異的選擇性。已知P-450酶的具體功能是通過(guò)催化單加氧反應(yīng)，在表達(dá)該P(yáng)-450酶的細(xì)胞內(nèi)參與生物體內(nèi)異物(異生素)的氫氧化、環(huán)氧化、去烷基化、脫氮等各種反應(yīng)。特別是來(lái)自微生物的P-450酶的一部分實(shí)際上已應(yīng)用于有用化合物的工業(yè)生產(chǎn)。代表性的例子之一是放射菌鏈霉菌0Sr印to/^c&sc"a^o//h7w)的P-450酶，將作為底物的密實(shí)菌素(compactin)6々位進(jìn)行氫氧化，作為產(chǎn)物生成高血脂的治療藥物普伐他汀(參照非專利文獻(xiàn)1)。并且利用》文射菌自養(yǎng)#支i若卡氏菌(尸sewobwoc(3ni/aorwto/rap/n'ca)ATCC33795抹的P-450酶，使維生素D3的lcc位和25位進(jìn)行氫氧化，生產(chǎn)活性型維生素D3的方法也已經(jīng)得到實(shí)際應(yīng)用。這些來(lái)自微生物的P-450酶與向其供給電子的電子傳遞系統(tǒng)(鐵氧化還原蛋白和鐵氧化還原蛋白還原酶)共軛才會(huì)催化其單加氧反應(yīng)。使用上述來(lái)自微生物的細(xì)胞色素P-450酶的化合物的微生物轉(zhuǎn)化可使用表達(dá)該酶的微生物的培養(yǎng)液或菌體來(lái)進(jìn)行。也可以使用將編碼來(lái)自微生物的P-450酶的基因?qū)氲竭m合作為宿主的放射菌變青鏈霉菌(5^印to附y(tǒng)c^s/z'v/血ra)中、表達(dá)該酶活性的培養(yǎng)液。但是，由具有上述基因的放射菌進(jìn)行的底物化合物的微生物轉(zhuǎn)化，由于放射菌特有的性質(zhì)，培養(yǎng)和底物化合物向目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化需要很長(zhǎng)時(shí)間。為了有效增加酶的表達(dá)量還必須對(duì)誘導(dǎo)酶表達(dá)的條件進(jìn)行研究。并且，有時(shí)轉(zhuǎn)化所使用的放線菌中存在代謝或分解底物化合物或目標(biāo)產(chǎn)物的反應(yīng)體系，這引起副產(chǎn)物的生成或底物化合物和目標(biāo)產(chǎn)物的減少等，成為目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)性能降低的一個(gè)原因?；谶@些理由，人們希望構(gòu)建培養(yǎng)所需時(shí)間較短、并且以被認(rèn)為代謝或分解底物化合物和目標(biāo)產(chǎn)物的反應(yīng)體系少的大腸桿菌作為宿主的、可功能性表達(dá)來(lái)自微生物的細(xì)胞色素P-450基因的體系。關(guān)于上述體系，有人提出了共表達(dá)編碼P-450cam的電子傳遞系統(tǒng)的camAB基因、功能性表達(dá)各種放射菌的細(xì)胞色素P-450基因的系統(tǒng)(參照專利文獻(xiàn)l)。但是，該系統(tǒng)的微生物轉(zhuǎn)化活性非常低，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí)并不足夠。也就是說(shuō)，為了通過(guò)使用大腸桿菌的微生物轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)際進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，必須進(jìn)一步提高活性，其中所述大腸桿菌表達(dá)編碼來(lái)自微生物的細(xì)胞色素P-450酶的基因。作為上述目的的方法，還對(duì)于使底物主動(dòng)地?cái)z取到細(xì)胞內(nèi)的方法進(jìn)行了研究。例如已知表達(dá)lat基因的大腸桿菌具有將L-賴氨酸轉(zhuǎn)化成L-2-哌啶酸的能力(參照非專利文獻(xiàn)2)，其中，所述Iat基因編碼來(lái)自泥色黃桿菌(F/m;o6a"eWwm/wtescera)IFO3084林的L國(guó)賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶；在使用該轉(zhuǎn)化體的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，為了使底物的L-賴氨酸主動(dòng)地?cái)z取到細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)對(duì)編碼L-賴氨酸特異性透過(guò)酶的lysP基因進(jìn)行擴(kuò)增，可以使該微生物轉(zhuǎn)化活性提高(參照非專利文獻(xiàn)3)。上述微生物轉(zhuǎn)化中，顯示底物分子向細(xì)胞內(nèi)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)是重要的問(wèn)題，在用于藥物制備的微生物轉(zhuǎn)化中，對(duì)于常常作為底物化合物的親水性或兩親性的化合物，大腸桿菌中并不存在使其主動(dòng)地膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的機(jī)制。有報(bào)道指出在破壞了大腸桿菌的藥物運(yùn)出蛋白的株中，所給予的化合物(哺乳類的甾類激素)在細(xì)胞內(nèi)的存在量升高(參照非專利文獻(xiàn)4)。這顯示被動(dòng)地?cái)z入到細(xì)胞內(nèi)的化合物難以運(yùn)出到細(xì)胞外，由此細(xì)胞內(nèi)的存在量升高。另一方面，有一個(gè)專利申請(qǐng)，其主要內(nèi)容是由編碼藥物運(yùn)出蛋白的acrA、acrB或tolG基因的至少一個(gè)基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌對(duì)有機(jī)溶劑產(chǎn)生抗性，可以高效率實(shí)施使用該大腸桿菌的雙層系統(tǒng)(二層系)的微生物轉(zhuǎn)化(專利文獻(xiàn)2)。由此很難推測(cè)破壞宿主微生物的多藥耐藥性蛋白對(duì)于微生物轉(zhuǎn)化會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響。專利文獻(xiàn)1:國(guó)際公開第2003/087381號(hào)小冊(cè)子及其英文家族US2006234337A1專利文獻(xiàn)2:日本申請(qǐng)公開平成11-221080(221080/1999Al)號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1:Cloning,characterizationanduxprcssionofthegeneencodingcytochromeP-450sca-2fromStreptomycescarbophilusinvolvedinproductionofpravastatin,aspec,HMC;-CoAreductaseinhibitor.Gene.1995S印22;163(1):81-85.非專利文獻(xiàn)2:Biotransformationof'L—lysinetoL—pipecolicacidcatalyzedbyL—lysine6-aminotransfcraseandpyrrolinc-5-carboxylatereductase.BiosciBiotechnolBiochem.2002Mar鄰(3):622-627.非專利文獻(xiàn)3:IncreaseintherateofI--pipecolicacidproductionusinglat-expressingEscherichiacolibylysPandyeiEamplification.BiosciBiotechnolBiochem.2002S印;66(9):198卜1984.非專利文獻(xiàn)4:MammaliansteroidhormonesaresubstratesforthemajorRND-andMFS-typetripartitemultidrugeffluxpumpsofEscherichiacoli.JBacteriol.2006Feb;188(3):119卜1195.6非專利文獻(xiàn)5:EntryintoandreleaseofsolventsbyEscherichiacoliinanorganic-aqueoustwo-liquid-phasesystemandsubstratespecificityoftheAcrAB-TolCsolvent-extrudingpump.JBactcriol.2000S印;182(17):4803-10.非專利文獻(xiàn)6:Productionof'a!pha,omega—alkanediolsusingEscherichiacoliexpressingacytochromeP450fromAcinetobactersp.OC4.BiosciBiotechnolBiochem.2006Jun;70(6):J379-1385.上述專利文獻(xiàn)1和2、非專利文獻(xiàn)1~6的全部記載在這里均以公開的形式援引到本說(shuō)明中。本發(fā)明的課題在于提供改善在現(xiàn)有的使用整合來(lái)自異種生物的
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人等為解決上述課題，使用編碼幾種多藥運(yùn)出蛋白的基因中的任意一種的基因缺損的微生物作為宿主，向其中整合來(lái)自異種生物的基因，來(lái)制備轉(zhuǎn)化體。發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化體可以高效率地將疏水性或兩親性的底物化合物轉(zhuǎn)化成其目標(biāo)化合物，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及以下的[1][9]。轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體是向宿主微生物中整合來(lái)自異種生物的基因而得到的，其中，所述宿主微生物是編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因中的任意一種基因缺損的宿主微生物。[l]所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因缺損的宿主微生物是大腸桿菌。[1]或[2]所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因是選自tolC、acrA和acrB的任意一種基因。[1]~[3]中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，來(lái)自異種生物的基因是編碼選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和合成酶的任意一種酶的基因。[1]-[3]中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，來(lái)自異種生物的基因是編碼細(xì)胞色素P-450酶或氨基轉(zhuǎn)移酶的基因。[1]-[3]中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，來(lái)自異種生物的基因是編碼細(xì)胞色素P-450酶的基因。微生物轉(zhuǎn)化方法，其使用[4][6]中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的微生物轉(zhuǎn)化方法。微生物轉(zhuǎn)化方法，其使用[4]~[6]中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的^(數(shù)生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于在底物化合物中單加氧。[8]所述的方法，其中，底物化合物選自維生素D3、4-膽甾烯-3-酮和密實(shí)菌素。以下通過(guò)說(shuō)明本說(shuō)明書中所述的術(shù)語(yǔ)、符號(hào)等的含義來(lái)詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。本說(shuō)明書中使用的"多藥運(yùn)出蛋白，，包含革蘭氏陰性細(xì)菌所具有的、主要使疏水性、兩親性的化合物由菌體內(nèi)向菌體外排出的構(gòu)成耐藥性機(jī)制的全部蛋白。大腸桿菌中，TolC、AcrA、AcrB、EmrA、EmrB等屬于該蛋白，在綠膿桿菌中，OprM、MexA、MexB等屬于該蛋白質(zhì)，但不限于此。本說(shuō)明書中使用的"來(lái)自異種生物的基因，，包含由宿主微生物以外的生物分離或可擴(kuò)增的全部基因。由生物的染色體DNA或質(zhì)粒DNA中分離或擴(kuò)增的基因、由mRNA擴(kuò)增的基因等屬于該基因，但不限于此。本說(shuō)明書中使用的"轉(zhuǎn)化體，，是指采用基因重組技術(shù)，以可表達(dá)的形式將來(lái)自其它生物的基因?qū)氲教囟ǖ奈⑸镏兴玫奈⑸?，在其中所使用的基因?qū)敕椒ú恢皇鞘褂觅|(zhì)粒等載體的基因重組，也包含同源重組等方法。本說(shuō)明書中使用的"微生物轉(zhuǎn)化方法"是指在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，使底物化合物與培養(yǎng)物接觸，修飾該化合物，轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化合物并獲得該目標(biāo)化合物的方法。本發(fā)明中所述的"底物化合物"是指可通過(guò)各種微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)修飾的疏水性或兩親性的化合物。例如，來(lái)自異種生物的基因?yàn)镻-450基因時(shí)，可以是己烷、庚烷、辛烷、壬烷等鏈烷化合物，曱苯、苯酚、枯烯等芳族化合物，膽甾醇、睪丸酮、4-膽甾烯-3-酮、脫氬表雄酮、維生素D2、維生素D3的甾類，亮氨?；涟彼帷⒘涟滨；i氨酸、聚亮氨酸、聚纈氨酸等直鏈肽類，脯氨?；交彼帷⒘涟滨；彼岬榷倪M(jìn)行環(huán)化稠合所得的二酮哌。秦類，環(huán)胞菌素、棘霉素等具有生理活性的環(huán)狀肽類，蒎烯、莰烯、檸檬烯、香葉醇等單萜烯類；豚草烷(Ambrosane)、丁香烷(Caryophyllane)、補(bǔ)身烷(Drimane)等的倍半辟烯類，松香酸、赤霉酸等的二碎烯類，達(dá)瑪烷、何帕烷、羊毛甾烷等的三萜烯類，密實(shí)菌素等的抑制素類，泰洛星、FK-506、紅霉素等的大環(huán)內(nèi)脂類，其它各種藥物，或者它們的前體、代謝產(chǎn)物、衍生物等。本說(shuō)明書中使用的"基因的類似物，，是指與原有的基因?qū)嵸|(zhì)上具有同等功能的、(1)與原有的基因在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸；(2)具有與原有基因的堿基序列同源性為70%以上的堿基序列的多核苷酸；(3)具有與原有的基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的多核苷酸；或者(4)多核苷酸，該多核苷酸具有的堿基序列由于基因密碼的簡(jiǎn)并，與原有的基因在嚴(yán)謹(jǐn)條件下不雜交，但是編碼與(1)~(3)中任一項(xiàng)中定義的多核苷酸所編碼的氨基酸序列相同的序列。"在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸，，是指例如以原有的基因作為探針，通過(guò)使用集落雜交法、噬菌斑雜交法或DNA雜交法等獲得的多核苷酸，具體來(lái)說(shuō)，是使用固定有來(lái)自集落或噬菌斑的多核苷酸的濾器，在0.7~l.OM氯化鈉存在下、在65。C下進(jìn)行雜交，然后使用0.1~2倍濃度的SSC溶液(l倍濃度的SSC溶液的組成包含150mM的氯化鈉、15mM檸檬酸鈉)，在65。C的條件下清洗濾器進(jìn)行鑒定的多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，可以制備以編碼多藥運(yùn)出蛋白基因缺損的微生物作為宿主的、整合來(lái)自異種生物的基因的轉(zhuǎn)化體，使用該轉(zhuǎn)化體，可以高效率地將各種底物化合物轉(zhuǎn)成目標(biāo)化合物。具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)^f亍詳細(xì)說(shuō)明。編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因缺損的宿主本發(fā)明中，首先制備使作為宿主的微生物本來(lái)所具有的多藥運(yùn)出蛋白的功能喪失的宿主。該宿主是編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因的一部分或全部缺失，或者在該基因的內(nèi)部插入其它的DNA進(jìn)行分隔，或者在該基因中引入至少一個(gè)以上的突變，由此使該基因所編碼的多藥運(yùn)出蛋白的功能的一部分或全部喪失(也稱為被破壞)。對(duì)上述基因的功能被破壞的微生物并沒有限定，可以采用公知的Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)法或DNA的同源重組法來(lái)獲得。作為宿主的微生物只要是可培養(yǎng)、并且與質(zhì)?；蚴删wDNA等載體用于插入基因的擴(kuò)增的微生物即可，沒有特別限定，例如有屬于大腸桿菌、黃桿菌屬(F/avo^cfen'ww)、假單胞菌屬(尸化W(iomw7as)、4奉狀4干菌屬(Co^7"e6a"en'wm)的樣吏生物，^f尤選的例子是大腸桿菌。對(duì)編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因并沒有限定，例如來(lái)自大腸桿菌的有SEQIDNO:.22的堿基1~堿基1488的連續(xù)的堿基序列所示的、編碼來(lái)自大腸桿菌K-12抹的多藥運(yùn)出蛋白TolC的基因tolC,SEQIDNO:.23的堿基329~堿基1522的連續(xù)的堿基序列所示的、編碼來(lái)自大腸桿菌K-12林的多藥運(yùn)出蛋白AcrA的基因acrA,SEQIDNO:.23的堿基1545~堿基4694的連續(xù)的堿基序列所示的、編碼來(lái)自大腸桿菌K-12林的多藥運(yùn)出蛋白AcrB的基因acrB或它們的類似物。上述得到的宿主微生物是多藥運(yùn)出蛋白的功能的部分或全部缺損，因此在微生物轉(zhuǎn)化中底物化合物容易停留在微生物內(nèi)，結(jié)果轉(zhuǎn)化10反應(yīng)的效率提高，目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)效率也提高。轉(zhuǎn)化體的制備接著，向所得的宿主中整合來(lái)自異種生物的基因或其類似物(以下也簡(jiǎn)稱為異種基因等)，制備適合微生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。對(duì)將異種基因等整合宿主的方法沒有特別限定，例如可以將該異種基因等插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，通過(guò)原生質(zhì)體法、電穿孔法整合到宿主中。對(duì)可以使用的載體的種類沒有特別限定，例如可以是自主復(fù)制的載體(例如質(zhì)粒等)，或者是導(dǎo)入到宿主中時(shí)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，與整合的染色體一起復(fù)制，優(yōu)選表達(dá)載體。表達(dá)載體中，異種基因等可以功能性連接轉(zhuǎn)錄所必須的要素(例如啟動(dòng)子等)。啟動(dòng)子在宿主細(xì)胞中是顯示轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，可以根據(jù)宿主的種類適當(dāng)選擇。來(lái)自異種生物的基因整合到宿主中的異種基因等只要是參與將底物化合物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)化合物的反應(yīng)即可，沒有特別限定，優(yōu)選編碼直接催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的各種酶的基因，例如有氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或合成酶等。氧化還原酶只要是催化氧化還原反應(yīng)的酶即可，沒有特別限定，例如有細(xì)胞色素P-450酶或醛還原酶等。特別優(yōu)選的是細(xì)胞色素P-450酶，其中有分類為CYP105家族和CYP107家族的細(xì)胞色素P-450。轉(zhuǎn)移酶只要是將原子團(tuán)(官能基團(tuán)等)從某種分子轉(zhuǎn)移到另一種分子上的酶即可，沒有特別限定，可以是氨基轉(zhuǎn)移酶(將底物化合物的a-氨基轉(zhuǎn)移到2-氧化戊二酸上，底物化合物本身催化形成2-氧代酸的反應(yīng))或糖轉(zhuǎn)移酶等。水解酶只要是催化水解反應(yīng)的酶即可，沒有特別限定，有脂酶或淀粉酶等。裂解酶只要是催化原子基團(tuán)的鍵解離的酶即可，沒有特別限定，例如有碳酸水合酶(carbonatehydratase)等。異構(gòu)酶只要是催化將某種異構(gòu)體進(jìn)行底物特異性異構(gòu)化的反應(yīng)的酶即可，沒有特別限定，優(yōu)選葡糖異構(gòu)酶等。合成酶只要是利用ATP的水解能量，使兩個(gè)分子鍵合的酶即可，沒有特別限定，例如有DNA連接酶等。ii轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上述制備的轉(zhuǎn)化體可以根據(jù)需要添加誘導(dǎo)物質(zhì)等，在可以表達(dá)導(dǎo)入的基因的條件下、在適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有適當(dāng)?shù)奶荚?、氮源、無(wú)機(jī)鹽和天然有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物等，碳源可以使用葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、有機(jī)酸類等，氮源可以使用氨、尿素、硫酸胺、硝酸胺、乙酸胺等化合物，它們分別可以使用一種或兩種以上。無(wú)機(jī)鹽可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵等的鹽類。并且，對(duì)使用菌具有生長(zhǎng)發(fā)育促進(jìn)效果的天然有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物可以使用蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、水解酪蛋白氨基酸等，進(jìn)一步可以少量含有維生素類、核酸類。使用轉(zhuǎn)化體的微生物轉(zhuǎn)化接著，使表達(dá)這些基因的菌體與底物化合物接觸，進(jìn)行轉(zhuǎn)換反應(yīng)。轉(zhuǎn)換反應(yīng)的溫度可考慮轉(zhuǎn)化體的最佳溫度而適當(dāng)決定。反應(yīng)時(shí)間也可考慮目標(biāo)化合物的轉(zhuǎn)化率(反應(yīng)的進(jìn)行程度)等而適當(dāng)決定。宿主為大腸桿菌時(shí)，例如優(yōu)選在2037。C下、1~5天。并且反應(yīng)方式可以是間歇式或連續(xù)式，也可以以任何形式實(shí)施。生成的目標(biāo)產(chǎn)物的分離和純化通?？梢岳脤⑽⑸锎x產(chǎn)物從其培養(yǎng)液中分離時(shí)所使用的分離、純化的方法。例如使用曱醇、乙醇、丙酮、丁醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、氯仿、曱苯等的有機(jī)溶劑萃取，使用夕'4X4才7HP-20等疏水性吸附樹脂的吸附脫吸附處理，使用七77亍、;/夕義LH-20等的凝膠過(guò)濾色譜、活性碳、硅膠等的吸附色鐠、或薄層色鐠的吸附脫吸附處理，或者使用反相柱等的高效液相色譜等公知的所有方法均符合。另外，不特別限于這里所述的方法?？梢詫⑦@些方法單獨(dú)或組合成任意的順序、還可以反復(fù)使用，由此可以分離、純化目標(biāo)化合物。實(shí)施例以下給出具體例子，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但并不是將本發(fā)明限定為這些例子。需要說(shuō)明的是，下述例子中的百分號(hào)(％)在培養(yǎng)基的說(shuō)明中表示重量百分號(hào)，在HPLC的流動(dòng)相說(shuō)明中表示容量百分號(hào)。實(shí)施例l:大腸桿菌tolC破壞抹的構(gòu)建通過(guò)Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)法，將購(gòu)自E.coliGeneticStockCenter(耶魯大學(xué))的大腸桿菌CAG12184(tolC::TnlO)抹轉(zhuǎn)移至BL21star(DE3)抹上。即，在含有2.5mM氯化鉤的L-培養(yǎng)基(l。/。聚胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉，pH7.2)上培養(yǎng)大腸桿菌CAG12184林，向0.2mL該培養(yǎng)液中添加Pl噬菌體，在37。C下培養(yǎng)10分鐘。將該反應(yīng)液添加到加溫至45。C的軟瓊脂(l。/。聚胨、0.5%酵母提取物、0.5°/。氯化鈉、0.3%瓊脂、2.5mM氯化鈣、pH7.2)中，鋪于含有2.5mM氯化鈣的L-瓊脂培養(yǎng)基(1%聚胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉、1.8%瓊脂，pH7.2)上。將其在37。C下培養(yǎng)18小時(shí)，然后加入3mLL-培養(yǎng)基，破碎軟瓊脂，回收上清，制成tolC-噬菌體液。接著，將大腸桿菌BL21star(DE3)株H;/匕'卜口，-工》公司)用含有2.5mM氯化鈣的L-培養(yǎng)基培養(yǎng)，向0.1mL該培養(yǎng)液中添加tolC-噬菌體液，在37。C下培養(yǎng)IO分鐘。然后將菌體離心并回收，向其中加入1mLL-培養(yǎng)基，在37。C下培養(yǎng)1小時(shí)，然后鋪于含有10/^g/mL四環(huán)素的L-瓊脂培養(yǎng)基中。在37。C下培養(yǎng)18小時(shí)，將出現(xiàn)的集落作為BLstarTolC林。BLstarTolC林是TolC功能缺損的tolC破壞抹。實(shí)施例2:大腸桿菌acrAB破壞林的構(gòu)建同樣，通過(guò)P1轉(zhuǎn)導(dǎo)法，從具有非專利文獻(xiàn)5所述大腸桿菌JA300A(acrAB::cat)的大腸桿菌JA300A林轉(zhuǎn)移至BL21star(DE"林，將用含有5Ag/mL氯霉素的L-瓊脂培養(yǎng)基選擇的林作為BLstarAcrAB抹。另夕卜，將acrAB::cat也轉(zhuǎn)移至BLstarTolC抹，將該抹作為BLstarTolCAcrAB抹。BLstarAcrAB林是AcrA功能和AcrB功能缺損的acrAB破壞抹。13BLstarTolCAcrAB抹是TolC功能進(jìn)一步缺損的TolC、acrAB破壞林。實(shí)施例3:各種質(zhì)粒的構(gòu)建(1)pETAciBC-SD載體以下，所有的PCR反應(yīng)均使用KOD#PLUS-DNA聚合酶(東洋紡公司)進(jìn)行。將質(zhì)粒pDolABC(參照非專利文獻(xiàn)6)用限制酶Ncol和BamHI處理，得到含有基因aciB(參照SEQIDNO:,3的堿基1~堿基321)的DNA片段，其中基因aciB編碼來(lái)自不動(dòng)桿菌(」"'"eto6acfer^.)OC4林的鐵氧化還原蛋白。將該片段通過(guò)T4DNA連接酶與大腸桿菌質(zhì)粒載體pETduet-l(Novagen公司)的Ncol和BamHI位點(diǎn)連接，將該質(zhì)粒作為質(zhì)粒A。進(jìn)一步以pDolABC為模板，使用引物A(參照SEQIDNO:力)和引物B(參照SEQIDNO:."進(jìn)行PCR,擴(kuò)增含有基因aciC(參照SEQIDNO:.3的堿基1978~堿基3192)的DNA片段，然后用限制酶BamHI和HindIII處理，其中基因aciC編碼來(lái)自不動(dòng)桿菌OC4株的鐵氧化還原蛋白還原酶。將該片段通過(guò)T4DNA連接酶與質(zhì)粒A的BamHI和HindIII位點(diǎn)連接，將所得質(zhì)粒作為質(zhì)粒B。接著，為了除去質(zhì)粒B的兩個(gè)T7啟動(dòng)子中后面一側(cè)的一個(gè)，將質(zhì)粒B用限制酶EcoRV和NotI處理，使用BKL試劑盒(寶酒造公司)使其平滑化，然后通過(guò)T4DNA連接酶連接，將所得質(zhì)粒作為質(zhì)粒C。另一方面，以自養(yǎng)假諾卡氏菌ATCC33795林的基因組DNA作為模板，使用引物C(參照SEQIDNO:.8)和引物D(參照SEQIDNO:,9)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增作為間隔DNA序列的DNA片段，用限制酶BglII和BamHI處理。將該片段通過(guò)T4DNA連接酶與質(zhì)粒C的BglII和BamHI位點(diǎn)連接，將所得質(zhì)粒作為pETAciBC-SD載體。(2)質(zhì)粒pETAciBC畫50AABP195以不動(dòng)桿菌OC4林的基因組DNA作為模板、使用引物E(參照SEQIDNO:.10)和引物F(參照SEQIDNO:.ll)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增編碼來(lái)自不動(dòng)桿菌OC4抹的鏈烷氧化性P-450酶AciA的N末端部分的DNA片段(SEQIDNO:.3的堿基398~堿基541的DNA片段)，用限制酶Ndel和Spel處理。另一方面，以指孢嚢菌/6^/訓(xùn)vw/as/wn/m)IFO14104抹的基因組DNA為模板，使用引物BP195F(參照SEQIDNO:.12)和引物BP195R(參照SEQIDNO:.13)進(jìn)行PCR,擴(kuò)增編碼P-450酶的BP195基因(參照SEQIDNO:.2的堿基1~堿基1203),用限制酶Spel和BamHI處理。將這些DNA片段通過(guò)T4DNA連接酶與pETAciBC-SD載體的Ndel和BamHI位點(diǎn)連接，將所得質(zhì)粒稱作pETAdBC-50AABP195。(3)質(zhì)粒pETAciBC-50AAvdh以自養(yǎng)假諾卡氏菌ATCC33795抹的基因組DNA作為模板，使用引物vbhF(參照SEQIDNO:.14)和引物vbhR(參照SEQIDNO:,15)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增編碼P-450酶的vdh基因(參照SEQIDNO:.l的堿基320~堿基1531)，用限制酶Spel和BglII處理。將這些DNA片段通過(guò)T4DNA連接酶與pETAciBC-50AABP195的Spel和BamHI位點(diǎn)連接，將所得質(zhì)粒稱作pETAciBC-50AAvdh。(4)質(zhì)粒pETduet-boxA將質(zhì)粒pETAciBC-SD載體用限制酶BamHI和HindIII處理，將含有基因aciC的DNA片段通過(guò)T4DNA連接酶連接，其中基因aciC編碼與鐵氧化還原蛋白還原酶具有同源性的蛋白，將所得質(zhì)粒稱作pETduetaciC。接著，使用引物boxBNcoF(參照SEQIDNO:.16)、boxBBamR(參照SEQIDNO:.17)和鏈霉菌(5^印tom;/c"s/.)TM-7林的基因組DNA,擴(kuò)增含有boxB基因(參照SEQIDNO:.4的堿基l782~堿基1973)的DNA片段，用限制酶Ncol和BamHI處理，其中boxB基因編碼附隨在密實(shí)菌素氧化性P-450酶上的鐵氧化還原蛋白。將該DNA片段通過(guò)T4DNA連接酶與用限制酶Ncol和BamHI處理的pETduetaciC連接，將所得質(zhì)粒稱為pETduetboxB。進(jìn)一步使用引物boxANdeF(參照SEQIDNO:.18)、boxAXhoR(參照SEQIDNO:.19)和鏈霉菌TM-7林的基因組DNA，擴(kuò)增含有boxA基因(參照SEQIDNO:.4的堿基544~堿基1761)的DNA片段，用限制酶Ndel和Xhol處理，其中boxA基因編碼密實(shí)菌素氧化性P-450酶。將該DNA片段通過(guò)T4DNA連接酶與用限制酶Ndel和Xhol處理的pETduetboxB連接，將所得質(zhì)粒稱為pETduet-boxA。(5)質(zhì)粒pTrcRat以洋蔥伯克霍爾德氏菌(SwA/zoWen'ac印acz'a)895-3抹的基因組DNA作為模板，使用引物ExratF(參照SEQIDNO:.20)和引物ExratR(參照SEQIDNO:.21)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增編碼(R)-a-曱基色胺氨基轉(zhuǎn)移酶的ratA基因(參照SEQIDNO:.5的堿基序列230~堿基1330)，用限制酶Pstl和EcoRI處理。將該DNA片段通過(guò)T4DNA連接酶與pTrcHisA(>f:x匕'卜口'-工》公司)的Pstl和EcoRI位點(diǎn)連接，將所得質(zhì)粒稱作pTrcRat。(6)質(zhì)粒pHSG-ZAR以泥色黃桿菌IFO3084抹的基因組DNA作為模板，使用引物latSacF(參照SEQIDNO:.24)和引物latXhoR(參照SEQIDNO:.25)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增編碼賴氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的lat基因(參照SEQIDNO:.30),用限制酶Sacl和Xhol處理。另外，以泥色黃桿菌IFO3084抹的基因組DNA為模板，使用引物ZARXhoF(參照SEQIDNO:.26)和引物ZARBamR(參照SEQIDNO:.27)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增編碼N-芐氧基羰基-L-氨基己二酸-^半醛還原酶的zar基因(參照SEQIDNO:.31)，用限制酶Xhol和BamHI處理。進(jìn)一步以枯草芽孢桿菌(5ad〃wsra^'fc)str.l68ATCC23857抹的基因組DNA作為模板，使用引物rocGBamF(參照SEQIDNO:.28)和引物rocGXbaR(參照SEQIDNO:.29)進(jìn)行PCR,擴(kuò)增rocG基因(參照SEQIDNO:.32)，用限制酶Sacl和Xbal處理。將這三個(gè)DNA片段通過(guò)T4DNA連接酶與pHSG298(夕力，"4才公司)的SacI和XbaI位點(diǎn)連接，得到依次整合了lat、zar、rocG的質(zhì)粒pHSG-ZAR。實(shí)施例4:由維生素D3向25-羥基維生素D3的微生物轉(zhuǎn)化使用質(zhì)粒pETAciBC-50AAvdh轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLstarTolCAcrAB抹、BlstarTolC林、BLstarAcrAB林和BL21star(DE3)抹，將所得的菌抹分別稱為BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AAvdh林、BlstarTolC/pETAciBC-50AAvdh抹、BlstarAcrAB/pETAciBC-50AAvdh林和BL21star/pETAciBC-50Aavdh抹。同樣，使用質(zhì)粒pETAciBC-50AABP195轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLstarTolCAcrAB抹、BLstarTolC抹、BLstarAcrAB株和BL21star(DE3)林，將所得菌林分別稱為BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AABP195抹、BLstarTolC/pETAciBC-50AABP195抹、BLstarAcrAB/pETAciBC陽(yáng)50AABP195抹和BL21star/pETAciBC-50AABP195抹。將這些抹接種于含有羧節(jié)西林鈉(IOO〃g/mL)的M9SEED液體培養(yǎng)基(3.39。/。Na2HP04、1.5%KH2P04、0.25%氯化鉤、0.5%氯化銨、1°/。水解酪蛋白氨基酸、0.002%胸腺嘧啶、0.1mM氯化鉤、O.lmM硫酸鐵、0.4%葡萄糖、0.001mM氯化鎂)中，在25。C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將200//L該培養(yǎng)液添加到25mL含有羧千西林鈉(100;Wg/mL)和OvernightExpressAutoinductionSystems(Novagen公司)的M9Main液體培養(yǎng)基(3.39。/oNa2HP04、1.5%KH2P04、0.25。/。氯化鈉、0.5%氯化銨、1。/。水解酪蛋白氨基酸、0.002%胸腺嘧，定、O.lmM氯化鈣、O.lmM硫酸鐵、80//g/mL5-氨基乙酰丙酸)中，然后在25。C下、以220卬m振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)離心回收菌體，懸浮于5mL的CV2緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液、2%甘油、50^g/mL羧千西林、O.IMIPTG)中，得到了相對(duì)于培養(yǎng)液濃縮了5倍的菌體懸浮液。向lmL該菌體懸浮液中添加25^L含r/。維生素D3的DMSO溶液(終濃度250^g/mL)和部分曱基化環(huán)糊精(終濃度0.75%),在28。C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。然后在該反應(yīng)液中加入2mL曱醇，在室溫下渦旋10分鐘，然后通過(guò)Eppendorf離心機(jī)、以15,000rpm離心IO分鐘，將所得上清用HPLC分析，4企測(cè)到17由于底物維生素D3被氬氧化而生成的25-羥基維生素D3。該結(jié)果如表1所示。宿主大腸桿菌微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的基因和VD3氫氧化物蓄積濃度Cwg/mL)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的基因和相對(duì)于野生抹的比活性vdhBP195vdhBP195野生林46.713.01.01.0acrAB破壞林135.123.52.91.8tolC破壞林187.030.24.02.3tolC、acrAB石皮壞才朱216.438.74.63.0需要說(shuō)明的是，HPLC的測(cè)定條件如下。分析裝置Agilent100系列柱J，sphereODS-H80(YMC，Inc.),75mmx4.6mmLD.流動(dòng)相A:乙腈B:離子交換水梯度時(shí)間設(shè)定0分流動(dòng)相A/B=30:7013.00分流動(dòng)相A/B=30:7014.00分流動(dòng)相A/B=100:021.00分流動(dòng)相A/B=100:022.00分流動(dòng)相A/B=70:3025.00分流動(dòng)相A/B=70:30流速1.0mL/分鐘檢測(cè)UV265nm注射容量10//L柱溫40。C分析時(shí)間25分鐘保留時(shí)間25-羥基維生素D38.8分鐘維生素Ds21.0分鐘在使用表達(dá)編碼P-450酶Vdh的vdh基因與編碼電子傳遞系統(tǒng)的基因aciAB的大腸桿菌進(jìn)行的維生素D3的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，與以往的方法一使用野生型大腸桿菌作為表達(dá)宿主的情形比較，25-羥基維生素D3的蓄積是使用acrAB破壞抹時(shí)為2.9倍，使用tolC破壞林時(shí)為4.0倍，使用tolCacrAB破壞抹時(shí)為4.6倍。另外，在使用表達(dá)編碼P-450酶BP195的基因和編碼電子傳遞系統(tǒng)的基因aciAB的大腸桿菌進(jìn)行的維生素D3的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，與以往的方法一使用野生型大腸桿菌作為表達(dá)宿主的情形比較，25-羥基維生素D3的蓄積是使用acrAB破壞林時(shí)為1.8倍，使用tolC破壞抹時(shí)為2.3倍，使用tolCacrAB破壞抹時(shí)為3.0倍。實(shí)施例5:由4-膽甾烯-3-酮向25-羥基-4-膽甾烯-3-酮的微生物轉(zhuǎn)化使用上述的大腸桿菌BlstarTolCAcrAB/pETAciBC-50AABP195抹、BLstarTolC/pETAciBC-50AABP195抹、BLstarAcrAB/pETAciBC-50AABP195林和BL21star/pETAciBC-50AABP195林，與實(shí)施例4同樣制備菌體懸浮液。向111^該菌體懸浮液中添加25;1^1%4-膽甾烯-3-酮曱醇溶液(終濃度250pg/mL)和部分曱基化環(huán)糊精(終濃度0.75%),在28。C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。然后向該反應(yīng)液中加入2mL曱醇，在室溫下渦旋10分鐘，然后通過(guò)Eppendorf離心機(jī)、以15,000rpm離心10分鐘，將由此得到的上清進(jìn)行HPLC分析，檢測(cè)到由于底物4-膽甾烯-3-酮被氫氧化而生成的25-羥基-4-膽甾烯-3-酮。結(jié)果如表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>需要說(shuō)明的是，HPLC的測(cè)定條件如下。分析裝置Agilent100系列柱InertsilODS/350mmx4.6mml.D.流動(dòng)相A:乙腈B:0.85%磷酸水溶液梯度時(shí)間設(shè)定0分流動(dòng)相A/B=40:605.00分流動(dòng)相A/B=100:08.00分流動(dòng)相A/B=100:08.30分流動(dòng)相A/B=40:6011.00分流動(dòng)相A/B=40:60流速1.2mL/分鐘檢測(cè)UV235nm注射容量40柱溫40°C分析時(shí)間11分鐘保留時(shí)間25-羥基-4-膽甾烯-3-酮4,97分鐘4-膽甾烯-3-酮7.45分鐘在4-膽甾烯-3-酮的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，與以往方法一使用野生型大腸桿菌作為表達(dá)宿主的情形比較，25-羥基-4-膽甾烯-3-酮的蓄積是:使用acrAB破壞抹時(shí)為1.4倍、使用tolC破壞林時(shí)為10.5倍，使用tolCacrAB破壞林時(shí)為11.0倍。實(shí)施例6:由密實(shí)菌素向普伐他汀的微生物轉(zhuǎn)化使用上述的質(zhì)粒pETduet-boxA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLstarTolCAcrAB抹和BL21star(DE3)林，將所得菌抹分別稱為BLstarTolCAcrAB/pETduet-boxA抹和BL21star/pETduet-boxA株。使用這些菌抹，與實(shí)施例4同樣制備菌體懸浮液。向1mL該菌體懸浮液中添加30//L的25mg/mL密實(shí)菌素(終濃度750^g/mL)，在28°C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。進(jìn)一步追加添加30^L的25mg/mL密實(shí)菌素(終濃度1500〃g/mL)，在28。C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。然后向該反應(yīng)液中加入1mL曱醇和1mL乙腈，在室溫下渦旋10分鐘，然后通過(guò)Eppendorf離心機(jī)、以15,000rpm離心10分鐘，將所得上清用HPLC分析，檢測(cè)到由于底物密實(shí)菌素被氫氧化而生成的普伐他汀。該結(jié)果如表3所示。宿主大腸桿菌微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的基因和密實(shí)菌素氫氧化物蓄積濃度C"g/mL)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的基因和相對(duì)于野生林的比活性boxAboxA野生林acrAB破壞林tolC破壞林tolC、acrAB破壞抹51.11.0NTNTNTNT1689.033.1HPLC的測(cè)定條件如下。分析裝置Agilent100系列才主ChromolithPerformanceRP-18e100mmx4.6mml.D.流動(dòng)相A:曱醇:三乙胺:乙酸=100:0.1:0.1B:水:三乙胺:乙酸=100:0.1:0.1梯度時(shí)間設(shè)定0分流動(dòng)相A/B=50:50213.00分流動(dòng)相A/B=90:103.50分流動(dòng)相A/B=90:103.51分流動(dòng)相A/B=50:505.00分流動(dòng)相A/B=50:50流速2.0mL/分鐘沖企測(cè)UV238nm注射容量15^L柱溫40°C分析時(shí)間6分鐘保留時(shí)間普伐他汀1.77分鐘密實(shí)菌素3.23分鐘在使用表達(dá)編碼P-450酶BoxA的基因和編碼該電子傳遞系統(tǒng)的基因boxD及acrC的大腸桿菌進(jìn)行的密實(shí)菌素的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，與以往的方法^使用野生型大腸桿菌作為表達(dá)宿主的情形比較，使用tolCacrAB破壞林時(shí)蓄積了33.1倍的普伐他汀。實(shí)施例7:由(R)-a-曱基色胺向吲哚-3-丙酮的微生物轉(zhuǎn)化使用上述的質(zhì)粒pTrcRat轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLstarTolCAcrAB林和BL21star(DE3)林，將所得菌抹分別稱為BLstarTolCAcrAB/pTrcRat株和BL21star/pTrcRat林。將這些抹接種于含有羧千西林鈉(100^wg/mL)的L液體培養(yǎng)基(1.0%聚胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉、pH7.2)中，在37。C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。將50/^L該培養(yǎng)液添加到25mL含有羧千西林鈉(100//g/mL)和OvernightExpressAutoinductionSystems(Novagen,>司)的L液體培養(yǎng)基中，然后在30°C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。通過(guò)離心回收菌體，懸浮于2.5mL硼酸緩沖液(200mM、pH9.0)中，得到相對(duì)于培養(yǎng)液濃縮了IO倍的菌體懸浮液。向0.5mL該菌體懸浮液中添加0.5mLL液體培養(yǎng)基、25//L50%甘油溶液、1.2550mg/mL羧爺西林鈉、10/^L100mMIPTG、以及250^L"mM(R)-a-曱基色胺，在30。C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)18小時(shí)。然后向該反應(yīng)液中加入50,L5N氫氧化鈉溶液和2mL乙酸乙酯，在室溫下渦旋10分鐘，然后通過(guò)Eppendorf離心機(jī)、以15,000rpm離心IO分鐘，將所得上清濃縮干燥，溶解于300甲醇中。將其用HPLC進(jìn)行分析，檢測(cè)到從底物(R)-a-曱基色胺(R-MT)中游離出氨基而生成的吲哚-3-丙酮。該結(jié)果如表4所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>保留時(shí)間(R)-a-曱基色胺6.5分鐘巧l咮-3-丙酮11.4分鐘在使用表達(dá)編碼(R)-a-曱基色胺氨基轉(zhuǎn)移酶RatA的基因的大腸桿菌進(jìn)行的(R)-a-曱基色胺的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，與以往的方法一使用野生型大腸桿菌作為表達(dá)宿主的情形比較，使用tolCacrAB破壞林時(shí)蓄積了1.2倍的。引咮-3-丙酮。實(shí)施例8:由N-千氧基羰基-L-賴氨酸(Z-Lys)向N-千氧基羰基-6-羥基-L-正亮氨酸(Z-HNL)的微生物轉(zhuǎn)化通過(guò)質(zhì)粒pHSG-ZAR的lat基因所編碼的賴氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，使Z-Lys轉(zhuǎn)化為N-千氧基羰基-L-氨基己二酸J-半醛(Z-ASA)，通過(guò)zar基因所編碼的Z-ASA還原酶將Z-ASA轉(zhuǎn)化為Z-HNL，進(jìn)一步通過(guò)rocG基因所編碼的谷氨酸脫氫酶再生輔酶NADPH。使用上述質(zhì)粒pHSG-ZAR轉(zhuǎn)化大腸桿菌BLstarTolCAcrAB林和BL21star(DE3)林，將所得抹分另'J稱為BLstarTolCAcrAB/pHSG-ZAR抹和BL21star/pHSG-ZAR抹。將這些抹接種于含有卡那霉素硫酸鹽(25^g/mL)的M9SEED液體培養(yǎng)基(3.39。/。Na2HP04、1.5%KH2P04、0.25%氯化釣、0.5%氯化銨、1%水解酪蛋白氨基酸、0.002%胸腺嘧啶、0.1mM氯化釣、O.lmM硫酸鐵、0.4%葡萄糖、0.001mM氯化鎂)中，在25。C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將200//L該培養(yǎng)液添加到25mL含有卡刃卩霉素石危酉吏鹽(80^g/mL)和OvernightExpressAutoinductionSystems(Novagen公司)的M9ZAR液體培養(yǎng)基(3.39。/。Na2HP04、1.5%KH2P04、0.25%氯化鈉、0.5%氯化銨、1%水解酪蛋白氨基酸、0.002%胸腺嘧啶、O.lmM氯化鈣)中，然后在30。C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)7小時(shí)，然后在25。C下、以140rpm振蕩培養(yǎng)17小時(shí)。通過(guò)離心回收菌體，懸浮于5mL的CV3緩沖液(50mM磷酸鉀緩沖液、2%甘油、20/^g/niL卡那霉素硫酸鹽、0.1MIPTG)中，得到相對(duì)于培養(yǎng)液濃縮了5倍的菌體懸浮液。向1mL該菌體懸浮液中添加40^L25mg/mLZ-Lys溶液(終濃度1000^g/mL)和y-環(huán)糊精(終濃度2%),在28。C下、以220rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。然后向該反應(yīng)液中加入2mL曱醇，在室溫下渦旋10分鐘，然后通過(guò)Eppendorf離心機(jī)、以l5,000rpm離心10分鐘，將所得上清用HPLC分析，；險(xiǎn)測(cè)到由底物Z-Lys24[表5]宿主大腸桿菌微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的基因和Z-HML蓄積濃度Cg/mL)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中使用的基因和相對(duì)于野生抹的比活性lat、zar、rocGlat、zar、rocG野生抹2881acrAB破壞抹N.T.N.T.tolC破壞林N.T.N.T.tolC、acrAB破壞抹4201.5HPLC的測(cè)定條件如下。分析裝置Agilent100系列柱J，sphereODS-H80(YMC，Inc.),75mmx4.6mml.D.流動(dòng)相A:乙腈B:0.85%磷酸水溶液梯度時(shí)間設(shè)定0分流動(dòng)相A/B-20:806.00分流動(dòng)相A/B=20:808.00分流動(dòng)相A/B=60:4010.00分流動(dòng)相A/B-20:80流速1.5mL/分鐘檢測(cè)UV220nm注射容量10pL柱溫40。C分析時(shí)間10分鐘保留時(shí)間Z-HNL3.1分鐘在使用表達(dá)分別編碼賴氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、N-千氧基羰基-L-氨基己二酸-3-半醛還原酶和谷氨酸脫氫酶的基因的大腸桿菌進(jìn)行的Z-Lys的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，與以往的方法一使用野生型大腸桿菌作為表達(dá)宿主的情形比較，使用tolCacrAB破壞株時(shí)蓄積了1.5倍的Z-HNL。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明應(yīng)用于利用微生物轉(zhuǎn)化法的化合物的制備領(lǐng)域。權(quán)利要求1.轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體是向宿主微生物中整合來(lái)自異種生物的基因而得到的，其中，所述宿主微生物是編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因中的任意一種基因缺損的宿主微生物。2.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因缺損的宿主微生物是大腸桿菌。3.權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)化體，其中，編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因是選自tolC、acrA和acrB的任意一種基因。4.權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，來(lái)自異種生物的基因是編碼選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶和合成酶的任意一種酶的基因。5.權(quán)利要求13中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，來(lái)自異種生物的基因是編碼細(xì)胞色素P-450酶或氨基轉(zhuǎn)移酶的基因。6.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，來(lái)自異種生物的基因是編碼細(xì)胞色素P-450酶的基因。7.微生物轉(zhuǎn)化方法，其是使用權(quán)利要求4~6中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的微生物轉(zhuǎn)化方法。8.微生物轉(zhuǎn)化方法，其是使用權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的^t生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于在底物化合物中單加氧。9.權(quán)利要求8所述的方法，其中，底物化合物選自維生素D3、4-膽甾烯-3-酮和密實(shí)菌素。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供改善在現(xiàn)有的使用整合來(lái)自異種生物的基因的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行的微生物轉(zhuǎn)化中可見的轉(zhuǎn)化效率低的方法。使用編碼多藥運(yùn)出蛋白的基因缺損的微生物作為宿主，向其中整合來(lái)自異種生物的基因來(lái)制備轉(zhuǎn)化體，將其應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化，由此可以非常高效率地將疏水性或兩親性的底物化合物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化合物。以大腸桿菌作為宿主時(shí)，編碼缺損的多藥運(yùn)出蛋白的基因例如有tolC、acrA、acrB等。文檔編號(hào)C12N15/09GK101675157SQ20088000674公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2008年2月28日優(yōu)先權(quán)日2007年3月1日發(fā)明者伊藤將士,株本浩樹,町田和弘,落合淳,藤井匡,藤井良和申請(qǐng)人:美露香株式會(huì)社