專利名稱：：改良型鹵代醇環(huán)氧酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及改良型囟代醇環(huán)氧酶及其制造方法等。
背景技術(shù)：
：卣代醇環(huán)氧酶也被稱作卣代醇?xì)湄樟押厦?、卣代醇脫卣?HalohydrinDehalogenase)或者卣代醇脫囟酶(HaloalcoholDehalogenase),其是具有將1,3-二卣代-2-丙醇轉(zhuǎn)化成表閨代醇的活性和催化其逆反應(yīng)的活性的酶(ECnumber:4.5丄-)。已知卣代醇環(huán)氧酶根據(jù)氨基酸序列的同源性等，大致被分為3組(組A、組B、組C)(非專利文獻(xiàn)1:J.Bacteriology,183(17),5058隱5066,2001)。作為分類于組A的鹵代醇環(huán)氧酶，可以舉出來(lái)自^^奉狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074株的HheA(非專利文獻(xiàn)2:Biosci.Biotechnol.Biochem.，58(8)，1451-1457,1994)、來(lái)自節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)AD2林的HheAAD2(非專利文獻(xiàn)1)、來(lái)自節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)PY1抹的Deh-PY1(非專利文獻(xiàn)3:J.Health.Sci.,50(6)，605-612，2004)等。作為分類于組B的卣代醇環(huán)氧酶，可以舉出來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074株的HheB(非專利文獻(xiàn)2)、來(lái)自分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)GP1林的HheBGP1(非專利文獻(xiàn)1)、來(lái)自節(jié)桿菌erithii(Arthrobactererithii)H10a抹的DehA(非專利文獻(xiàn)4:Enz.Microbiol.Technol.,22,568-574，1998)等。作為分類于組C的囟代醇環(huán)氧酶，可以舉出來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)DH094抹的HheC(專利文獻(xiàn)1:特開平10-210981號(hào)公報(bào))、來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC(非專利文獻(xiàn))、來(lái)自才艮癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的HalB(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgidb=protein&val=4960076#feature4960076)(非專利文獻(xiàn)5:Thesis(1996)UniversityofWales,Cardiff,UnitedKingdom)等。作為各種醫(yī)藥品和生理活性物質(zhì)的合成原料，表卣代醇是有用的物質(zhì)。已知的是，例如，由(R)-表卣代醇的開環(huán)氰化所得到的(R)-(-)-4-鹵代-3-羥基丁腈作為L(zhǎng)-肉堿的合成原料是有用的(專利文獻(xiàn)2:日本特開昭57-165352號(hào)公報(bào))。對(duì)于至少一部分卣代醇環(huán)氧酶來(lái)說(shuō)，除了具有上述將l，3-二卣代-2-丙醇轉(zhuǎn)換為表離代醇的活性和催化其逆反應(yīng)的活性以外，還了解到可催化如下反應(yīng)，即，在氰化物的存在下使表卣代醇開環(huán)氰化來(lái)生成4-卣代-3-羥基丁腈，作為利用該反應(yīng)的例子，已知有由1,3-二卣代-2-丙醇制造光學(xué)活性4-卣代-3-羥基丁腈的方法(專利文獻(xiàn)3:日本特開平3-053889號(hào)公報(bào)，專利文獻(xiàn)4:日本特開2001-25397號(hào)公報(bào))以及由表鹵代醇制造4-鹵代-3-羥基丁基的方法(專利文獻(xiàn)5:日本特開平3-053890號(hào)公報(bào))。可是，從自然界中分離的微生物的每個(gè)菌體的面代醇環(huán)氧酶活性，從工業(yè)利用的角度來(lái)說(shuō)，未必足夠高。為了解決這個(gè)技術(shù)問(wèn)題，有人嘗試?yán)没蛑亟M技術(shù)來(lái)提高每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性。有文獻(xiàn)例示出如下例子，例如，利用通過(guò)導(dǎo)入克隆有基因的各種表達(dá)質(zhì)粒所得到的各種轉(zhuǎn)化體，可以有效地制造光學(xué)活性4-卣代-3-羥基丁腈，所述基因?yàn)榫幋a來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074林的卣代醇環(huán)氧酶HheB的基因(專利文獻(xiàn)6:日本特開平4-278089號(hào)公報(bào)，專利文獻(xiàn)7:日本特開平5-317066號(hào)公報(bào)以及專利文獻(xiàn)8:日本特開2007-049932號(hào)公報(bào))。就這些轉(zhuǎn)化體而言，通過(guò)使菌體內(nèi)保有多拷貝的卣代醇環(huán)氧酶基因，成功地大幅度提高每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性。另一方面，由于近年的基因工程學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，使得有意識(shí)地制作變異體成為可能，所述變異體通過(guò)使酶蛋白質(zhì)的1個(gè)以上的構(gòu)成氨基酸缺失、或添加、插入1個(gè)以上的構(gòu)成氨基酸或者用其他氨基酸取代1個(gè)以上的構(gòu)成氨基酸來(lái)獲得。已知這些變異體根據(jù)該變異的種類，與未導(dǎo)入變異的酶相比，其活性、穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐性、耐熱性、耐酸性、耐堿性、底物特異性等性能得到提高。這些性能的提高，通過(guò)每單元活性的酶催化劑制造成本降低、酶催化劑的穩(wěn)定化、反應(yīng)工序的簡(jiǎn)化、反應(yīng)收率的提高等，有時(shí)為利用酶反應(yīng)的工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)生產(chǎn)成本的大幅降低。因而，就多種酶而言，進(jìn)行著提高各種性能的有用的改良酶的研制。就囟代醇環(huán)氧酶而言，也有人報(bào)道了使一個(gè)以上的構(gòu)成氨基酸缺失，或添加、插入一個(gè)以上的構(gòu)成氨基酸或者用其他氨基酸取代一個(gè)以上的構(gòu)成氨基酸的變異體。例如，專利文獻(xiàn)9(國(guó)際公開第2005/017141號(hào)小冊(cè)子)6記載了來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1株的HheC的369種變異體以及來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB的1種變異體。另夕卜，專利文獻(xiàn)10(美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2005/0272064號(hào)說(shuō)明書)記載了來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的570種變異體以及來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB的1種變異體。此外，專利文獻(xiàn)11(美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2006/0099700號(hào)說(shuō)明書)記載了來(lái)自放射形土;襄桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的1422種變異體以及來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB的1種變異體。對(duì)于這些變異體之中的幾種變異體而言，顯示出由乙基(R)-4-氯-3-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)換為乙基(S)-4-氰基-3-羥基丁酸酯的轉(zhuǎn)換反應(yīng)的活性得以提高。另夕卜，非專利文獻(xiàn)6(J.Bacteriol.,183(17),5058-5066,2001)記載了來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的變異體Serl32Ala、Serl32Cys、Tyrl45Phe、Argl49Lys、Argl49Glu以及Argl49Gln。非專利文獻(xiàn)7(Enz.Microbiol.Technol.,30，251-258，2002)記載了來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1林的HheC的變異體C30A、C153S、C229A以及C153S/C229A,顯示出變異體C30A以及C153S的穩(wěn)定性相比于野生型卣代醇環(huán)氧酶得到了提高。非專利文獻(xiàn)8(EMBOJ.，22(19),4933-4944，2003)記載了來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的變異體Asp80Asn以及Asp80Ala。非專利文獻(xiàn)9(Biochemistry,42(47),14057-14065,2003)記載了來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1株的HheC的變異體W139F、W192F、W238F以及W249F。非專利文獻(xiàn)10(Biochemistry,44(17)，6609-6618，2005)記載了來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的HheC的變異體N176A、N176D以及Y187F。這些都與來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1抹的面代醇環(huán)氧酶HheC的變異體相關(guān)。專利文獻(xiàn)1:日本特開平10-210981號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本特開昭57-165352號(hào)公l艮專利文獻(xiàn)3:日本特開平3-053889號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4:日本特開2001-25397號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5:日本特開平3-0538卯號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6:日本特開平4-278089號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7:日本特開平5-317066號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)8:日本特開2007-049932號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)9:國(guó)際公開第2005/017141號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)10:美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2005/0272064號(hào)說(shuō)明書專利文獻(xiàn)11:美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2006/0099700號(hào)說(shuō)明書非專利文獻(xiàn)l:J.Bacteriol.，183(17)，5058-5066，2001非專利文獻(xiàn)2:Biosci.Biotechnol.Biochem.,58(8),1451-1457,1994非專利文獻(xiàn)3:J.Health.Sci.，50(6),605-612，2004非專利文獻(xiàn)4:Enz.Microbiol.Technol.,22,568-574,1998非專利文獻(xiàn)5:Thesis(1996)UniversityofWales,Cardiff,UnitedKingdom非專利文獻(xiàn)6:J.Bacteriol.,183(17)，5058-5066，2001非專利文獻(xiàn)7:Enz.Microbiol.Technol.30，251-258,2002非專利文獻(xiàn)8:EMBOJ.，22(19),4933-4944，2003非專利文獻(xiàn)9:Biochemistry,42(47),14057-14065,2003非專利文獻(xiàn)10:Biochemistry,44(17),6609-6618,2005
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明要解決的課題工業(yè)利用面代醇環(huán)氧酶的情況下，被期望作為酶催化劑的更加高度化。例如，如上所述通過(guò)使轉(zhuǎn)化體內(nèi)的卣代醇環(huán)氧酶基因的高拷貝化，可以將每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性提高到某個(gè)程度，但從經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性的角度考慮，期望活性進(jìn)一步地提高。因而，期待著能帶來(lái)每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性提高的鹵代醇環(huán)氧酶。另外，為了制造具有光學(xué)活性的4-鹵代-3-羥基丁腈的情況下，通過(guò)已知的鹵代醇環(huán)氧酶所制造的4-鹵代-3-羥基丁腈的光學(xué)純度未必足夠高。因而，期待著提高了立體選擇性的鹵代醇環(huán)氧酶，其可生成光學(xué)純度更高的4-卣代-3-羥基丁腈。另外，以1,3-二鹵代-2-丙醇為起始原料，利用閨代醇環(huán)氧酶制造4-囟代-3-羥基丁腈的情況下，會(huì)產(chǎn)生因生成物(氯化物離子以及4-卣代-3-羥基丁腈)的阻礙而導(dǎo)致的反應(yīng)速度的降低。因而，期待著難以受到生成物阻礙的囟代醇環(huán)氧酶。另外，為.了廉價(jià)地制造4-卣代-3-羥基丁腈，通常，優(yōu)選增高反應(yīng)體系內(nèi)的底物和/或生成物(4-卣代-3-羥基丁腈)濃度來(lái)提高每個(gè)裝置的生產(chǎn)率，但是，由已知的卣代醇環(huán)氧酶所得到的生成物積累濃度未必足夠高。因而，期待著可以積累高濃度的生成物的卣代醇環(huán)氧酶。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種可以解決這些技術(shù)問(wèn)題的卣代醇環(huán)氧酶及其制造方法，并提供使用該酶的表面代醇或者4-卣代-3-羥基丁腈的制造方法。解決問(wèn)題的手段本發(fā)明人等為了解決上述技術(shù)問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，就野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列，尤其是分類于組B的野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列而言，通過(guò)將特定的氨基酸殘基取代成其他氨基酸，可以制作出每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性、立體選"^性、生成物阻礙耐性、生成物積累能力等屬性得到提高的改良型鹵代醇環(huán)氧酶，從而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明如下。(1)一種改良型囟代醇環(huán)氧酶，其特征在于，其包含對(duì)野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入從以下的(A)(D)中選擇的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基酸序列，其中，所述野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列包含以下的氨基I踏列I:S-al-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-(x9畫al0-all-al2隱Y-al3-al4-A-R畫a15(序歹'J號(hào)74)(S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基,R表示精氨酸殘基，alal5分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基)以及以下的氨基晚亭列II:L-卩16-R-L-卩17-卩18-卩19畫卩20國(guó)E-卩21(序列號(hào)75)(L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示谷氨酸殘基，卩16-(321分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基)，(A)比起始氨基酸殘基(通常為甲硫氨酸殘基)離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(B)a14殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(C)a15殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；9(D)(321殘基被:取代成其他氨基酸的氨基酸變異。(2)—種改良型卣代醇環(huán)氧酶，其特征在于，其包含對(duì)野生型閨代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入從以下的(E)(H)中選擇的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異的氨基酸序列，其中，所述野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列包含以下的氨基^列I:S-al-a2-a3-a4-a5-ct6-a7-a8-a9-alO-all畫al2-Y-al3陽(yáng)al4-A-R畫a15(序歹11號(hào)74)(S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，alal5分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基)以及以下的氨基酸序列II:L-f316-R-L-卩17-(318-卩19-卩20-E-(321(序列號(hào)75)(L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示谷氨酸殘基，卩16-p21分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基)，(E)比起始氨基酸殘基(通常為曱硫氨酸殘基)離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基被取代成賴氨酸或天冬酰胺的氨基酸變異；(F)a14殘基被取代成丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的氨基酸變異；(G)a15殘基被取代成丙氨酸、絲氨酸或色氨酸的氨基酸變異；(H)(321殘基被取代成谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或曱硫氨酸的氨基酸變異。就上述(1)和(2)所記載的改良型卣代醇環(huán)氧酶而言，作為野生型鹵代醇環(huán)氧酶，可以舉出例如分類于組B的酶。就上述(1)和(2)所記載的改良型卣代醇環(huán)氧酶而言，作為野生型鹵代醇環(huán)氧酶，可以舉出例如來(lái)自棒狀桿菌(Corynebacterium)屬細(xì)菌或分枝桿菌(Mycobacterium)屬細(xì)菌的酶等。就上述(1)和(2)所記載的改良型卣代醇環(huán)氧酶而言，作為野生型鹵代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列，可以舉出例如序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的氨基酸序列等。作為上述(1)和(2)所記載的改良型鹵代醇環(huán)氧酶，可以舉出例如包含對(duì)野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入從以下的(i)~(iii)中選擇的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基S交序列的酶等。(i)從除了比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基、a14殘基、a15殘基以及p21殘基以外的氨基酸殘基中選擇的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(ii)從除了比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基、氨基酸序列I所含的氨基酸殘基以及氨基酸序列II所含的氨基酸殘基以外的氨基酸殘基中選擇的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失的氨基酸變異；(iii)在比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近兩個(gè)以上殘基的氨基酸殘基構(gòu)成的區(qū)域中的由氨基酸序列I和氨基酸序列II構(gòu)成的區(qū)域以外的區(qū)域中，插入1個(gè)或數(shù)個(gè)任意氨基酸殘基的氨基酸變異。(3)編碼上述(1)或(2)所記載的改良型卣代醇環(huán)氧酶的基因。(4)含有上述(3)所記載的基因的重組載體。(5)將上述(4)所記載的重組載體導(dǎo)入宿主而得到的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體。(6)培養(yǎng)上述(5)所記載的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體所得到的培養(yǎng)物。(7)從上述(6)所記載的培養(yǎng)物中提取的改良型卣代醇環(huán)氧酶。(8)—種改良型卣代醇環(huán)氧酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)上述(5)所記載的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體，從得到的培養(yǎng)物中提取改良型鹵代醇環(huán)氧酶。(9)一種表囟代醇的制造方法，其特征在于，通過(guò)使上述(1)、(2)或(7)所記載的改良型卣代醇環(huán)氧酶和/或上述(6)所記載的培養(yǎng)物與1,3-二卣代-2-丙醇接觸，來(lái)生成表面代醇。(10)—種4-卣代-3-羥基丁腈的制造方法，其特征在于，通過(guò)使上述(l)、(2)或(7)所記載的改良型卣代醇環(huán)氧酶和/或上述(6)所記載的培養(yǎng)物在氰化物的存在下，與1,3-二鹵代-2-丙醇或表鹵代醇接觸，來(lái)生成4-鹵代-3-羥基丁腈。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以得到每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性、立體選擇性、生成物阻礙耐性、生成物積累能力等提高了的改良型鹵代醇環(huán)氧酶，同時(shí)，可以利用這些酶來(lái)高效地制造表卣代醇或4-鹵代-3-羥基丁腈。圖1是表示將來(lái)自表達(dá)野生型鹵代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體(JM109/pST111、iiJM109/pSTK001和JM109/pSTT001)以及表達(dá)改良型囟代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體(JM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT002以及JM109/pSTT003)的粗酶液用SDS-PSGE進(jìn)行分析的結(jié)果的圖。具體實(shí)施例方式下面，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明，但本實(shí)施方式是用于說(shuō)明本發(fā)明的例示，并不是要將本發(fā)明僅限于該實(shí)施方式。只要本發(fā)明不脫離其要點(diǎn)，就可以以各種方式來(lái)實(shí)施。本說(shuō)明書包含作為主張本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本特愿2007-057854號(hào)說(shuō)明書的全部?jī)?nèi)容。另外，本說(shuō)明書中引用的全部的刊物，例如現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)和公開公報(bào)、特許公報(bào)及其他專利文獻(xiàn)，作為參考被納入本說(shuō)明書中。(I)卣代醇環(huán)氧酶活性在本發(fā)明中，所說(shuō)的"卣代醇環(huán)氧酶活性"是指將1，3-二離代-2-丙醇轉(zhuǎn)化為表卣代醇的活性和催化其逆反應(yīng)的活性。1,3-二卣代-2-丙醇是用下述通式(1)表示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(式中，X，和X2分別獨(dú)立地表示相同或不同的卣原子。)作為卣原子，優(yōu)選為氟、氯、溴、碘，特別優(yōu)選為氯、溴。具體來(lái)講，可以舉出1，3-二氟-2-丙醇、1,3-二氯-2-丙醇(以下，有時(shí)稱為"DCP，，)、1,3-二溴-2-丙醇、1，3-二碘-2-丙醇等，優(yōu)選為1，3-二氯-2-丙醇、1，3-二溴-2-丙醇。表卣代醇是用下述通式(2)表示的化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(式中，x表示鹵原子)作為卣原子，優(yōu)選為氟、氯、溴、碘，特別優(yōu)選為氯、溴。具體來(lái)講，可以舉出表氟代醇、表氯代醇(以下，有時(shí)稱為"EHC")、表溴代醇、表碘代醇等，特別優(yōu)選為表氯代醇、表溴代醇。在本發(fā)明中，"鹵代醇環(huán)氧酶活性"通過(guò)對(duì)每小時(shí)由1,3-二鹵代-2-丙醇生成表卣代醇的生成量或氯化物離子生成量進(jìn)行測(cè)定來(lái)求得。表卣代醇生成量可以通過(guò)例如液相色譜或氣相色譜等進(jìn)行定量。另外，氯化物離子生成量可以通過(guò)例如連續(xù)地或間斷地添加堿溶液使得伴隨著該氯化物離子的生成而降低的pH值保持在一定的值，由每小時(shí)所需要的堿量來(lái)方便地求出。有時(shí)將通過(guò)該方法算出的卣代醇環(huán)氧酶活性特別地稱作"脫氯活性"。另外，也可以制作針對(duì)于改良型卣代醇環(huán)氧酶的抗體，通過(guò)免疫印跡或ELISA法等免疫學(xué)方法來(lái)算出。另外，假定囟代醇環(huán)氧酶活性與轉(zhuǎn)化體內(nèi)的表達(dá)量成正比的情況下，通過(guò)與囟代醇環(huán)氧酶活性已知的樣品相比較，利用SDS-PAGE等分析手段也可以間接求得。只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員使用公知的方法就可以進(jìn)行SDS-PAGE。對(duì)于至少一部分卣代醇環(huán)氧酶來(lái)說(shuō)，除了上述的"卣代醇環(huán)氧酶活性，，以外，還具有催化如下反應(yīng)的活性，即，在氰化物的存在下，將表卣代醇開環(huán)氰化來(lái)生成4-卣代-3-羥基丁腈的反應(yīng)。作為此時(shí)的氰化物，可以舉出氰化氫、氰化鉀(以下，有時(shí)稱作"KCN")、氰化鈉、氰酸或者丙酮氰醇等在添加于反應(yīng)液中時(shí)生成氰離子(CN-)或氰化氬的化合物或其溶液等。另外，4-囟代-3-羥基丁腈是用下述通式(3)表示的化合物。(式中，x表示鹵原子)作為卣原子，優(yōu)選為氟、氯、溴、碘，特別優(yōu)選為氯、溴。具體來(lái)講，可以舉出4-氟-3-羥基丁腈、4-氯-3-羥基丁腈(以下，有時(shí)稱作"CHBN")、4-溴-3-羥基丁腈、4-碘-3-羥基丁腈等，優(yōu)選為4-氯-3-羥基丁腈、4-溴-3-羥基丁腈。(II)卣代醇環(huán)氧酶(II-l)野生型囟代醇環(huán)氧酶本發(fā)明的改良型囟代醇環(huán)氧酶是通過(guò)在野生型卣代醇環(huán)氧酶(特別優(yōu)選分類于組B的酶)中導(dǎo)入變異(氨基酸變異)來(lái)改良而得到的酶，其來(lái)源并無(wú)特別限制。這里，所說(shuō)的"野生型卣代醇環(huán)氧酶"是指可以從自然界的生物分離的囟代醇環(huán)氧酶，就構(gòu)成該酶的氨基酸序列而言，不存在有意或無(wú)意的氨基酸缺失或由其他氨基酸所導(dǎo)致的取代或者插入，意味著保持有來(lái)自天然的屬性的卣^C醇環(huán)氧酶。此外，本發(fā)明中使用的野生型卣代醇環(huán)氧酶具有包含以下的氨基酸序列I(19氨基酸殘基)以及以下的氨基酸序列II(IO氨基酸殘基)的氨基酸序列，所述氨基酸序列I(19氨基酸殘基)S-al畫a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-al0-all-al2-Y-al3-(xl4-A-R-a15(序列號(hào)74)(S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，alal5分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基)，所述氨基酸序列II(10氨基酸殘基)L-卩16-R畫L-卩17-pi8-(319-p20-E匿卩21(序列號(hào)75)(L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示谷氨酰胺殘基，|316-(321分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基)。野生型卣代醇環(huán)氧酶是否是具有包含氨基酸序列I以及氨基酸序列II的氨基酸序列的酶，只要在公共的序列數(shù)據(jù)庫(kù)，例如由美國(guó)生物工程學(xué)信息中心(NCBI;NationalCenterforBiotechnologyInformation)提供6勺GenBank凄史4居庫(kù)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=proterin)中，檢索作為卣代醇環(huán)氧酶注冊(cè)的酶，調(diào)查該酶的氨基酸序列中是否含有上述氨基酸序列I和氨基酸II即可。根據(jù)需要，可以使用基因信息解析用軟件進(jìn)行。另外，如果在公知文獻(xiàn)中有對(duì)于野生型卣代醇環(huán)氧酶氨基酸序列的記載，也可以以其為參考。例如，通過(guò)以在J.Bacteriology,183(17),5058-5066,2001中記載的各種野生型囟代醇環(huán)氧酶氨基酸序列的比對(duì)信息為參考，可知是否含有氨基酸序列I和氨基酸序列II以及包含于整個(gè)氨基酸序列中的哪個(gè)位置上。氨基酸序列I中的絲氨酸殘基、酪氨酸殘基、精氨酸殘基和丙氨酸殘基，以及氨基酸序列II中的亮氨酸殘基、精氨酸殘基和谷氨酸殘基，在已知的各種野生型鹵代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列中被高度地保存。已知野生型卣代醇環(huán)氧酶根據(jù)氨基酸序列的同源性等，被大致分成3個(gè)組14(組A，組B,組C)(J.Bacteriology,183(17),5058-5066,2001)。其中，作為本發(fā)明中使用的野生型卣代醇環(huán)氧酶，特別優(yōu)選屬于組B的酶。作為分類于組A的囟代醇環(huán)氧酶，可以舉出來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074才朱的HheA(Biosci.Biotechnol.Biochem.，58(8)，1451-1457,1994)、來(lái)自節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)AD2抹的HheAA^(J.Bacteriology,183(17)，5058-5066,2001)以及來(lái)自節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)PYl抹的Deh-PYl(J.Health.Sci.，50(6)，605-612，2004)等。作為分類于組B的卣代醇環(huán)氧酶，可以舉出來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074才朱^JHheB(Biosci.Biotechnol.Biochem.,58(8)，1451，1994)、來(lái)自分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)GP1抹的HheBGP1(J.Bacteriology,183(17),5058-5066，2001)、來(lái)自節(jié)桿菌erithii(Arthrobactererithii)HI0a抹的DehA(Enz.Microbiol.Technol.，22，568-574,1998)等。作為分類于組C的卣代醇環(huán)氧酶，可以舉出來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)DH094抹的HheC(日本特開平10-210981號(hào)公報(bào))、來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)ADl才朱的HheC(J.Bacteriology,183(17),5058-5066,2001)、來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的HalB(Thesis(1996)UniversityofWales,Cardiff,UnitedKingdom)等。這些囟代醇環(huán)氧酶之中，對(duì)于氨基酸序列已知的酶，在美國(guó)生物工程學(xué)信息中心(NCBI;NationalCenterforBiotechnologyInformation)提供的GenBank凄史才居庫(kù)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=proterin)中,通過(guò)以下的AccessionNo.來(lái)注冊(cè)。"AccessionNo.BAA14361":來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheA的氨基斷列"AccessionNo.AAK92100":來(lái)自節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)AD2抹的HheAAD2的氛基,列"AccessionNo.BAA14362，，來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB的氨基i餅列"AccessionNo.AAK73175，，來(lái)自分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)GP1"AccessionNo.AAK92099":來(lái)自放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)AD1林的HheC的氨基酸序列"AccessionNo.AAD34609":來(lái)自才艮癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ha舊的氨基酸序列對(duì)于在本發(fā)明中主要例示的來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的卣代醇環(huán)氧酶HheB而言，有人報(bào)道了如下內(nèi)容，由于其基因(HheB)有2個(gè)起始密碼子，因而存在2種卣代醇環(huán)氧酶，這兩種酶的區(qū)別僅在于N末端附近的8個(gè)氨基酸殘基的有無(wú)(Biosci.Biotechnol.Biochem.,58(8),1451-1457,1994)。在本發(fā)明中，將兩者(上述2種囟代醇環(huán)氧酶)區(qū)別稱呼時(shí)，將包含由最初的起始密碼子翻譯出來(lái)的氨基酸序列(序列號(hào)1)的HheB稱作"HheB(lst)"，將包含由第2個(gè)起始密碼子翻譯出來(lái)的氨基酸序列(序列號(hào)2)稱作"HheB(2nd)"，這些都是野生型卣代醇環(huán)氧酶。這里，就包含用序列號(hào)1表示的氨基酸序列的HheB(1st)而言，氨基酸序列I相當(dāng)于包含第126號(hào)第144號(hào)的氨基酸殘基的序列，氨基酸序列II相當(dāng)于包含第198號(hào)第207號(hào)的氨基酸殘基的序列。同樣地，就包含用序列號(hào)2表示的氨基酸序列的HheB(2nd)而言，氨基酸序列I相當(dāng)于包含第118號(hào)~第136號(hào)的氨基酸殘基的序列，氨基酸序列II相當(dāng)于包含第l卯號(hào)第199號(hào)的氨基酸殘基的序列。另外，HheB(2nd)的氨基酸序列因受前述的兩個(gè)起始密碼子的影響，是包含缺失HheB(Ist)的氨基酸序列中的N末端附近的8個(gè)氨基酸殘基(具體來(lái)講，用序列號(hào)1表示的氨基酸序列中的第1號(hào)~第8號(hào)的氨基酸殘基)的狀態(tài)的氨基酸序列。在本說(shuō)明書中，主要以來(lái)自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074林的野生型卣代醇環(huán)氧酶HheB為例進(jìn)行說(shuō)明，但如前所述，并不限定卣代醇環(huán)氧酶的由來(lái)，即使是HheB以外的卣代醇環(huán)氧酶，只要是具有包含前述氨基酸序列i和氨基酸序列n的氨基酸序列的酶，也可以應(yīng)用同樣的說(shuō)明。另外，通過(guò)對(duì)本發(fā)明所示的變異的位置或變異的氨基酸種類或者堿基序列進(jìn)行操作，也可以得到任一種改良型卣代醇環(huán)氧酶。在本發(fā)明中，說(shuō)到"高同源性"時(shí)，是指例如60%以上的同源性，優(yōu)選為75%以上的同源性，特別優(yōu)選為90%以上的同源性。(II-2)改良型卣代醇環(huán)氧酶本發(fā)明中的"改良型卣代醇環(huán)氧酶"是包含如下的氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列是主要利用基因重組技術(shù)，對(duì)野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入至少一個(gè)氨基酸取代變異而得到的氨基酸序列，是每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性、立體選棒性、生成物阻礙耐性、生成物積累能力等得到提高的囟代醇環(huán)氧酶。本發(fā)明中的改良型卣代醇環(huán)氧酶包括每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性比野生型囟代醇環(huán)氧酶高的酶。作為這里所說(shuō)的每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性的提高的本質(zhì)的原因，可以A^因于氨基酸取代變異的任何原因，可以舉出例如每個(gè)酶蛋白質(zhì)的比活性自身的提高、活性型構(gòu)象形成能力的提高、轉(zhuǎn)化體內(nèi)的表達(dá)量增加、轉(zhuǎn)化體內(nèi)的酶的穩(wěn)定性提高、對(duì)底物耐性的提高、生成物阻礙感受性的降低等。所說(shuō)的"每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性"是指"每單位重量轉(zhuǎn)化體干燥菌體的卣代醇環(huán)氧酶活性"，也稱"菌體比活性"(本說(shuō)明書中，有時(shí)將干燥菌體稱作"DC")。另外，所說(shuō)的"每個(gè)可溶性蛋白質(zhì)的卣代醇環(huán)氧酶活性"是指"每單位重量可溶性蛋白質(zhì)的卣代醇環(huán)氧酶活性"，也稱作"蛋白質(zhì)比活性"。此外，在本發(fā)明中，可以由一定量的轉(zhuǎn)化體方便地得到一定量的可溶性蛋白質(zhì)，"每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性"("菌體比活性")與"每個(gè)可溶性蛋白質(zhì)的卣代醇環(huán)氧酶活性"("蛋白質(zhì)比活性")成正比。即，如果"每個(gè)可溶性蛋白質(zhì)的囟代醇環(huán)氧酶活性，，("蛋白質(zhì)比活性")高(如果低)，則"每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性"("菌體比活性")高(低)。另外，在本發(fā)明中，所說(shuō)的"液活性"是指每單位溶液量的卣代醇環(huán)氧酶活性。作為該溶液，可以舉出含有能從培養(yǎng)生產(chǎn)卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體而得到的"培養(yǎng)物"所得到的物質(zhì)的溶液。具體來(lái)講，可以舉出培養(yǎng)液、培養(yǎng)液上清液、細(xì)胞或菌體懸濁液、細(xì)胞或菌體破碎液、粗酶液以及它們的處理物等。通過(guò)將"液活性"除以其溶液的菌濃度或者可溶性蛋白質(zhì)濃度，可以算出"每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性"("菌體比活性")或者"每個(gè)可溶性蛋白質(zhì)的卣代醇環(huán)氧酶活性"("蛋白質(zhì)比活性")。另外，本發(fā)明中所說(shuō)的"活性回收率"是指以一定的操作前的活性17為100%,操作后回收的活性的相對(duì)比(％)。本發(fā)明的改良型卣代醇環(huán)氧酶中包含具有如下屬性的酶，即，從底物l，3-二卣代-2-丙醇或者表卣代醇生成表卣代醇或4-面代-3-羥基丁腈的情況的該生成物的光學(xué)純度比利用野生型卣代醇環(huán)氧酶從相同底物生成相同生成物的情況的該生成物的光學(xué)純度高。即，包含對(duì)作為底物的1，3-二卣代-2-丙醇和/或表由代醇的立體選擇性比野生型卣代醇環(huán)氧酶得到提高的酶。作為立體選擇性提高的本質(zhì)的原因，可以是起因于氨基酸取代變異的任何原因。在本發(fā)明中，所說(shuō)的"光學(xué)活性"是指含有的一種鏡像異構(gòu)體多于另外的鏡像異構(gòu)體的物質(zhì)的狀態(tài)，或者僅由任一種鏡像異構(gòu)體構(gòu)成的物質(zhì)的狀態(tài)。另外，所說(shuō)的"光學(xué)純度"大致等同于"鏡像異構(gòu)體過(guò)剩率(％ee)"，用下式定義。光學(xué)純度—鏡像異構(gòu)體過(guò)剩率-100x([R]-[S])/([R]+[S])(%ee)這里，[R]和[S]表示試樣中的鏡像異構(gòu)體的各自濃度。另外，本發(fā)明中，所說(shuō)的"立體選擇性"是指由底物生成生成物時(shí)，卣代醇環(huán)氧酶優(yōu)先催化生成其中一種鏡像異構(gòu)體的反應(yīng)的性質(zhì)。另外，本發(fā)明的改良型囟代醇環(huán)氧酶包括生成物阻礙性提高的酶，即，包含對(duì)反應(yīng)阻礙的耐性比野生型卣代醇環(huán)氧酶得到提高的酶，所述反應(yīng)阻礙是由來(lái)自1，3-二卣代-2-丙醇或者表卣代醇的生成物即氯化物離子或4-卣代-3-羥基丁腈所引起的。作為生成物阻礙耐性提高的本質(zhì)的原因，可以是起因于氨基酸取代變異的任何原因。另外，本發(fā)明的改良型鹵代醇環(huán)氧酶包括生成物積累能力得到提高的酶，即，包含具有如下屬性的酶，在由底物1,3-二卣代-2-丙醇或表卣代醇生成表鹵代醇或4-卣代-3-羥基丁腈的情況下，可以使生成物高濃度生成并積累的屬性。作為生成物積累能力提高的本質(zhì)的原因，可以是起因于氨基酸取代變異的任何原因。就本發(fā)明的"改良型面代醇環(huán)氧酶"而言，具體來(lái)講，包括這樣的氨基酸序列，即，對(duì)前述的包含氨基Sl/f列I和氨基S拼列II的野生型鹵代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入選自以下的(A)(D)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基*列。(A)比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(B)a14殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(C)a15殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(D)|321殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異。.上述(A)中所說(shuō)的"起始氨基酸殘基"是指與基因(DNA或mRNA)中翻譯起始密碼子編碼的野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基，即，是指翻譯后的野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列中的N末端氨基酸殘基(通常為甲硫氨酸殘基)。上述(A)(D)的氨基酸變異，也可以通過(guò)將位于野生型卣代醇的氨基酸序列的最N末端側(cè)的起始氨基酸殘基(通常為曱硫氨酸殘基)定義為第1號(hào)時(shí)，是從該起始氨基酸殘基至C末端側(cè)的第幾號(hào)氨基酸殘基的氨基酸變異的方式來(lái)指明。例如，在野生型卣代醇環(huán)氧酶為包^^序列號(hào)1所示的氨基酸序列的來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(1st)的情況下，(A)中的"比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基"、(B)中的"al4殘基"、(C)中的"al5殘基"和(D)中的"(321殘基"分別相當(dāng)于(A)第2號(hào)的氨基酸殘基(丙氨酸殘基)、(B)第141號(hào)的氨基酸殘基(蘇氨酸殘基)、(C)第144號(hào)的氨基酸殘基(苯丙氨酸殘基)以及(D)第207號(hào)的氨基酸殘基(天冬氨酸殘基)。另外，在野生型卣代醇環(huán)氧酶為包括序列號(hào)2所示的氨基酸序列的來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074株的HheB(2nd)的情況下，(A)中的"比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基"、(B)中的"al4殘基"、(C)中的"al5殘基"和(D)中的"卩21殘基"分別相當(dāng)于(A)第2號(hào)的氨基酸殘基(丙氨酸殘基)、(B)第133號(hào)的氨基酸殘基(蘇氨酸殘基)、(C)第136號(hào)的氨基酸殘基(苯丙氨酸殘基)以及(D)第199號(hào)的氨基酸殘基(天冬氨酸殘基)。但是，HheB(2nd)如前所述，不過(guò)是包含缺失了HheB(1st)的氨基S吏序列中的N末端附近的8個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，HheB(1st)和HheB(2nd)這兩個(gè)氨基酸序列中的各氨基酸殘基的絕對(duì)的作用實(shí)質(zhì)上是相同的。作為本發(fā)明的"改良型鹵代醇環(huán)氧酶"的優(yōu)選的方式，可以舉出例如包含導(dǎo)入了選自以下的(E)(H)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基酸序列的酶。(E)比起始氨基酸殘基(通常為曱硫氨酸殘基)離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基被取代成作為其他氨基酸的賴氨酸或天冬酰胺的氨基酸變異；(F)氨基酸序列I中的a14殘基被取代成作為其他氨基酸的丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的氨基酸變異；(G)氨基酸序列I中的a15殘基被取代成作為其他氨基酸的丙氨酸、絲氨酸或色氨酸的氨基酸變異；(H)氨基S交序列II中的(321殘基被取代成作為其他氨基酸的谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或曱硫氨酸的氨基酸變異。這里，上述(E)(H)的氨基酸變異是對(duì)前述的(A)(D)的氨基酸酸"的具體例子的變異)。因此，與前述的(A)~(D)的情況相同，上述(E)中的"比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基"、(F)中的"al4殘基"、(G)中的"al5殘基，，和(H)中的"(321殘基"，也可以分別通過(guò)將位于野生型鹵代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列的最N末端側(cè)的起始氨基酸殘基(通常為甲硫氨酸殘基)定義為第1號(hào)時(shí)，是從該起始氨基酸殘基至C末端側(cè)的第幾號(hào)氨基酸殘基的氨基酸變異的方式來(lái)指明。即，例如在野生型鹵代醇環(huán)氧酶為包含序列號(hào)1所示的氨基酸序列的來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(Ist)的情況下，上述(E)~(H)的氨基酸變異的方式可以如下指明。(E)第2號(hào)的氨基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代成賴氨酸或天冬酰胺的氨基酸變異；(F)第141號(hào)的氨基酸殘基(蘇氨酸殘基)被取代成丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的氨基酸變異；(G)第144號(hào)的氨基酸殘基(苯丙氨酸殘基)被取代成丙氨酸、絲氨酸或色氨酸的氨基酸變異；(H)第207號(hào)的氨基酸殘基(天冬氨酸殘基)被取代成谷氨酰胺、谷氨20酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或甲硫氨酸的氨基酸變異。另夕卜，在野生型囟代醇環(huán)氧酶為包括序列號(hào)2所示的氨基酸序列的來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB(2nd)的情況下，上述(E)~(H)的氨基酸變異的方式可以如下來(lái)指明。(E)第2號(hào)的氨基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代成賴氨酸或天冬酰胺的氨基酸變異；(F)第133號(hào)的氨基酸殘基(蘇氨酸殘基)被:取代成丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的氨基酸變異；(G)第136號(hào)的氨基酸殘基(苯丙氨酸殘基)被取代成丙氨酸或絲氨酸的氨基酸變異；(H)第199號(hào)的氨基酸殘基(天冬氨酸殘基)被取代成谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸或酪氨酸的氨基酸變異。作為本發(fā)明的"改良型鹵代醇環(huán)氧酶"的更具體和優(yōu)選的方式，在野生型面代醇環(huán)氧酶為具有序列號(hào)1所示的氨基酸序列的來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1(H4林的HheB(Ist)的情況下，可以舉出具有序列號(hào)315和7679所示的氨基酸序列的改良型卣代醇環(huán)氧酶。另外，在野生型面代醇環(huán)氧酶為包括序列號(hào)2所示的氨基酸序列的來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(2nd)的情況下，可以舉出具有序列號(hào)1628和8083所示的氨基酸序列的改良型卣代醇環(huán)氧酶。以下，將序列號(hào)315和7679所示的氨基酸序列中的氨基酸變異(氨基酸取代)的方式示于表A中，將序列號(hào)16-28和8083所示的氨基S交序列中的氨基酸變異(氨基酸取代)的方式示于表B中。這里，表A中的"Ala2"、"Thrl41"、"Phel44"和"Asp207"的標(biāo)記表示序列號(hào)1的氨基酸序列中的作為氨基酸取代的對(duì)象的氨基酸殘基的位置和種類(3個(gè)字母標(biāo)記)，例如，"Thrl41"意味著第141號(hào)的蘇氨酸殘基。另外，這些"Ala2"等下欄中的標(biāo)記表示序列號(hào)3~15和76~79的各氨基酸序列的氨基酸取代后的氨基酸殘基，例如，如果是序列號(hào)3的氨基酸序列，則由于在"Ala2"的下欄標(biāo)記"Lys"，因此意味著是第2號(hào)的丙氨酸殘基被取代成賴氨酸殘基的氨基酸序列。這里，標(biāo)記"-"意味著沒(méi)有氨基酸取代。此外，將編碼氨基酸取代后的各氨基酸序列的堿基序列(后述)的序列號(hào)一并標(biāo)記于表的最右欄。以上的表A中的標(biāo)記的說(shuō)明同樣也適用于表B中。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>[表B]<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>本發(fā)明的改良型囟代醇環(huán)氧酶只要是包含具有一個(gè)以上選自上述(A)(D),優(yōu)選為(E)(H)的氨基酸變異的氨基酸序列的酶即可。因而，本發(fā)明的改良型卣代醇環(huán)氧酶中也包括具有如下氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列將多個(gè)上述(A)(H)的特征(即，(A)~(H)的氨基酸變異)以組合的方式來(lái)具有。另外，本發(fā)明中的改良型卣代醇環(huán)氧酶的范圍中也包含如下的改良型鹵代醇環(huán)氧酶，該酶在維持著上述(A)~(H)的氨基酸變異的方式的同時(shí)，進(jìn)一步包括對(duì)作為改良型卣代醇環(huán)氧酶基礎(chǔ)的野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入選自以下(i)~(iii)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基酸序列。(i)從除了比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基、氨基酸序列I中的a14殘基、氨基酸序列中的a15殘基以及氨基酸序列中的卩21殘基以外的氨基酸殘基中選擇的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(ii)從除了比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基、氨基酸序列I所含的氨基酸殘基以及氨基酸序列II所含的氨基酸殘基以外的氨基酸殘基中選擇的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失的氨基酸變異；(iii)在比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近兩個(gè)以上殘基的氨基酸殘基構(gòu)成的區(qū)域中的由氨基酸序列I和氨基酸序列II構(gòu)成的區(qū)域以外的區(qū)域中，插入l個(gè)或數(shù)個(gè)任意氨基酸殘基的氨基酸變異。就上述(i)~(iii)的方式而言，所說(shuō)的"1個(gè)或多個(gè)"是指例如1個(gè)~10左右，優(yōu)選1個(gè)5個(gè)。在本發(fā)明中，有時(shí)用3個(gè)字母或1個(gè)字母標(biāo)記來(lái)表示氨基酸的種類。此外，有時(shí)在數(shù)字之前或之后配以3個(gè)字母或1個(gè)字母來(lái)標(biāo)記，此時(shí)，表示氨基酸殘基的位置和取代前后的氨基酸的種類。即，只要沒(méi)有特別說(shuō)明，數(shù)字表示，如上所述，將利用翻譯起始密碼子編碼的氨基酸殘基(通常，為曱硫氨酸)定義為第1號(hào)的情況下是第幾號(hào)的氨基酸殘基。另夕卜，數(shù)字之前表示的3個(gè)字母或1個(gè)字母表示氨基酸取代前的氨基酸的3個(gè)字母或1個(gè)字母標(biāo)記，數(shù)字之后表示的3個(gè)或1個(gè)字母表示發(fā)生氨基酸取代情況下的取代后的氨基酸的3個(gè)或1個(gè)字母標(biāo)記。例如，第207號(hào)的天冬氨酸殘基有時(shí)標(biāo)記成"Asp207"或"D207"，第207號(hào)的天冬氨酸殘基被取代成組氨酸的情況下，有時(shí)標(biāo)記成"Asp207His"或"D207H"。(III)卣代醇環(huán)氧酶基因(in-i)野生型卣代醇環(huán)氧酶基因?qū)τ谝吧拓沾辑h(huán)氧酶之中已知其基因序列(堿基序列)的酶而言，在通過(guò)美國(guó)生物工程學(xué)信息中心(NCBI;NationalCenterforBiotechnologyInformation)4是供^fGenBank凄史才居庫(kù)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgiCMD=search&DB=proterin)中，通過(guò)以下的AccessionNo.進(jìn)行注冊(cè)。24"AccessionNo.D90349":編碼來(lái)自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheA的基因的堿基序列；"AccessionNo.AF397297，，編碼來(lái)自節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)AD2抹的HheAAD2的基因的堿基序列；"AccessionNo.D90350":編碼來(lái)自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB的基因的堿基序列；"AccessionNo.AY044094":編碼來(lái)自分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)GP1林的他eB(jp,的基因的石威基序列；"AccessionNo.AF397296，，編碼來(lái)自放射形土i襄斥干菌(Agrobacteriummdiobacter)AD1株的HheC的基因的堿基序列；"AccessionNo.AF149769":編碼來(lái)自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ha舊的基因的堿基序列；在本發(fā)明中，將這些稱作"野生型面代醇環(huán)氧酶基因"。這里，該"野生型卣代醇環(huán)氧酶基因"中的"野生型"這個(gè)詞是與"囟代醇環(huán)氧酶"有關(guān)的詞，意味著卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列是"野生型"。構(gòu)成本發(fā)明的"野生型鹵代醇環(huán)氧酶基因"的堿基序列只要是編碼能在轉(zhuǎn)化體宿主中利用的密碼子的序列即可，未必限于來(lái)源生物基因組DNA上所編碼的野生型卣代醇基因的堿基序列。將編碼(II-l)野生型卣代醇環(huán)氧酶中描述的HheB(1st)的野生型囟代醇環(huán)氧酶基因稱作HheB(1st),將編碼HheB(2nd)的基因稱作HheB(2nd)。HheB(1st)的堿基序列由序列號(hào)29表示，HheB(2nd)的堿基序列由序列號(hào)30表示。作為取得已知石咸基序列的野生型卣代醇環(huán)氧酶基因的方法，可以舉出如下方法，即，由來(lái)源生物制備基因組DNA,以已知的野生型卣代醇環(huán)氧酶基因序列信息為基礎(chǔ)來(lái)設(shè)計(jì)引物，使用該引物用PCR法將編碼鹵代醇環(huán)氧酶的基因進(jìn)行擴(kuò)增。作為來(lái)源生物，可以舉出例如N-1074抹，該抹以保藏號(hào)"FERMBP-2643",在昭和63年11月10日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1-1-1中央第6(以下，在本說(shuō)明書中相同))。另夕卜，也可以以公知的基因序列信息為基礎(chǔ)，利用組合有合成寡聚DNA的PCR法(assemblyPCR)等，化學(xué)合成野生型卣代醇環(huán)氧酶基因的全長(zhǎng)。例如，將野生型卣代醇環(huán)氧酶基因分割成幾個(gè)區(qū)域(例如，50個(gè)堿基左右)，設(shè)計(jì)并合成多個(gè)在兩端具有與相鄰的區(qū)域重疊堿基(例如，20個(gè)堿基左右)的寡核苷酸。可以通過(guò)用PCR法使該寡核苷酸互相退火，來(lái)擴(kuò)增野生型卣代醇環(huán)氧酶基因。另外，根據(jù)需要，也可以變更野生型卣代醇環(huán)氧酶基因的密碼子。作為變更密碼子的手段，可以使用例如MolecularCloning,ALabroatoryManual2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)、CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(1987-1997)等記載的利用部位特異變異誘導(dǎo)法或部位特異突變誘導(dǎo)法的變異導(dǎo)入用試劑盒(例如，QuickChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(stratagene公司制造)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystem(invitrogen公司制造)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm等寶生物公司制造)等來(lái)進(jìn)行。此外，如上所述，進(jìn)行組合有合成寡聚DNA的PCR法(assemblyPCR)時(shí)，也可以通過(guò)^f吏用變更密碼子的引物來(lái)變更密碼子。(III-2)改良型卣代醇環(huán)氧酶基因所說(shuō)的本發(fā)明的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因是指編碼(II-2)中所述的改良型離代醇環(huán)氧酶酶蛋白的基因。所說(shuō)的本發(fā)明的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因是編碼具有如下氨基^列的改良型囟代醇環(huán)氧酶的基因，所述氨基S臾序列例如是對(duì)包含序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的氨基酸序列的野生型鹵代醇環(huán)氧酶導(dǎo)入選自所述(II-2)的(A)~(D)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的序列，更優(yōu)選為編碼具有導(dǎo)入選自所述(II-2)的(E)~(H)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基S^f列的改良型卣代醇環(huán)氧酶的基因。構(gòu)成野生型卣代醇環(huán)氧酶基因和上述氨基酸變異導(dǎo)入后的氨基酸殘基的堿基序列，只要是編碼可在轉(zhuǎn)化體宿主中利用的密碼子的堿基序列即可，未必限于來(lái)源生物基因組DNA上所編碼的野生型卣代醇環(huán)氧酶基因的堿基序列。對(duì)前述(II-l)的野生型卣代醇環(huán)氧酶中敘述的HheB(1st)進(jìn)行編碼的野生型面代醇環(huán)氧酶基因即HheB(lst)、以及編碼HheB(2nd)的野生型卣代醇環(huán)氧酶基因即HheB(2nd),也都可以用作野生型卣代醇環(huán)氧酶基因，該野生型卣代醇環(huán)氧酶作為用于得到改良型囟代醇環(huán)氧酶基因的基礎(chǔ)。作為本發(fā)明中的"改良型鹵代醇環(huán)氧酶基因"26的更具體也是優(yōu)選的方式，在野生型卣代醇環(huán)氧酶為具有序列號(hào)1所示的氨基酸序列的來(lái)自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074林的HheB(1st)的情況下，可以舉出具有序列號(hào)31~43以及8487所示的堿基序列的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因。另外，在野生型囟代醇環(huán)氧酶為具有序列號(hào)2所示的氨基酸序列的來(lái)自棒狀桿菌屬(corynebacteriumsp.)N-1074抹的HheB(2nd)的情況下，可以舉出具有序列號(hào)44~56以及88~91所示的堿基序列的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因。本發(fā)明的改良型面代醇環(huán)氧酶基因只要是編碼導(dǎo)入有1個(gè)以上選自前述的(II-2)的(A)~(H)的氨基酸變異的改良型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列的基因即可，因而，也包括編碼將多個(gè)前述(II-2)的(A)(H)的特征(即(A)(H)的氨基酸變異)以組合方式來(lái)具有的改良型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列的基因。另夕卜，本發(fā)明中的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因的范圍中也包含編碼如下的改良型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列的基因，該酶在維持著前述(II-2)的(A)(H)的氨基酸取代的方式的同時(shí)，進(jìn)一步在作為改良型鹵代醇環(huán)氧酶基礎(chǔ)的野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入選自前述(II-2)的(i)~(iii)的任一個(gè)氨基酸變異。進(jìn)而，作為本發(fā)明的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因，也包括具有與編碼改良型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的DNA，所述改良型鹵代醇環(huán)氧酶導(dǎo)入有選自前述(II-2)的(A)~(H)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異；在嚴(yán)格條件下雜交的DNA。這樣的DNA可通過(guò)如下方法獲得，例如，以包含對(duì)導(dǎo)入有選自上述(A)(H)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異的氨基S吏序列進(jìn)行編碼的堿基序列的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因DNA或其互補(bǔ)序列或者它們的片段作為探針，通過(guò)菌落雜交、噬斑雜交、DNA印記法等公知的雜交法來(lái)獲得cDNA文庫(kù)以及基因組文庫(kù)。文庫(kù)可以利用由^^知的方法制作的文庫(kù)，也可以利用市售的cDNA文庫(kù)以及基因組文庫(kù)。所說(shuō)的"嚴(yán)格的條件"是指雜交后的洗滌時(shí)的條件，即，鹽濃度為3002000mM、溫度為4075。C的條件，優(yōu)選為鹽濃度600900mM、溫度為65。C的條件?？梢耘e出例如2xSSC且50。C等的條件。如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員，除了這樣的緩沖液的鹽濃度、溫度等條件以外，還可以加入其他的探針濃度、探針的長(zhǎng)度、反應(yīng)時(shí)間等諸條件，來(lái)設(shè)定出用于得到具有與編碼改良型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列相互補(bǔ)的堿基序列的DNA和在嚴(yán)格條件下雜交的DNA的條件，所述改良型囟代醇環(huán)氧酶導(dǎo)入有選自前述(II-2)的(A)~(H)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異。對(duì)于雜交法的詳細(xì)步驟，可以參照MolecularCloning,ALaboratoryManual2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))等。作為雜交的DNA，可以舉出包含以下堿基序列的DNA或者其部分片段，所述堿基序列相對(duì)于編碼導(dǎo)入有選自前述(n-2)的(A)(H)的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基S吏序列的堿基序列至少具有40%以上、優(yōu)選60%、更優(yōu)選90%以上的同源性。在本發(fā)明中，制備改良型卣代醇環(huán)氧酶基因的方法可以是導(dǎo)入變異的已知的任一種方法，通常，可以用公知的方法來(lái)進(jìn)行。例如，可以舉出以野生型卣代醇環(huán)氧酶基因?yàn)榛A(chǔ)，利用市售的試劑盒來(lái)產(chǎn)生部位特異性取代的方法，或者選擇性地開裂基因DNA,接著除去或添加所選擇的寡聚核苦酸并進(jìn)行連接的方法等。這些部位特異變異誘導(dǎo)法記載于"MolecularCloning,ALabroatoiyManual2nded.，，(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))、"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(JohnWiley&Sons(1987-1997))、Kunkel,Proc.Natl.Sci.USA,82:488-492(1985)、KramerandFritzMethod.Enzymol.，154:350-367(1987)、Kunkel，Method.Enzymol.,85:2763-2766(1988)等。近年，可以使用利用了基于Kunkel法或Gappedduplex的部位特異的突變誘導(dǎo)法的變異導(dǎo)入用試劑盒來(lái)進(jìn)行，所述試劑盒例如有QuickChangeTMSite-DirectedMutagenesisKit(stratagene公司制造)、GeneTailorTMSite-DirectedMutagenesisSystem(invitrogen公司制造)、TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem(Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm等寶生物株式會(huì)社制造)等。另夕卜，作為目的的變異導(dǎo)入位置存在于對(duì)象基因序列中容易消化、連接的限制性內(nèi)切酶部位的附近的情況下，通過(guò)使用導(dǎo)入了目的變異的引物(合成寡聚DNA)進(jìn)行PCR，可以容易地得到導(dǎo)入了目的變異的基因DNA片段。此外，也可以用組合有合成寡聚DNA的PCR法(assemblyPCR)進(jìn)行延伸來(lái)得到合成基因。另外，通過(guò)使其與羥胺、亞硝酸等作為變異源的藥劑進(jìn)行接觸、作用的方法、利用紫外線照射誘導(dǎo)變異的方法、使用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))隨機(jī)導(dǎo)入變異的方法等隨機(jī)變異導(dǎo)入法，也可以由野生型卣代醇環(huán)氧酶基因得到改良型卣代醇環(huán)氧酶基因。(IV)重組載體、轉(zhuǎn)化體(IV-1)重組載體為了使通過(guò)上述方法得到的本發(fā)明的改良型囟代醇環(huán)氧酶基因在宿主中表達(dá)，可以在基因的上游插入轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，在下游插入終止子，從而構(gòu)建表達(dá)盒，將該盒插入表達(dá)載體?；蛘?，在該改良型卣代醇環(huán)氧酶基因的表達(dá)載體中已經(jīng)存在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子的情況下，可以不構(gòu)建表達(dá)盒，只要利用載體中的啟動(dòng)子和終止子在其間插入該變異基因即可。為了在載體中插入該改良型卣代醇環(huán)氧酶基因，可以利用使用限制性內(nèi)切酶的方法、使用拓樸異構(gòu)酶的方法等。另外，如果在插入時(shí)有必要的話，也可以添加適當(dāng)?shù)慕宇^。在本發(fā)明中，也可以在進(jìn)行改良型卣代醇環(huán)氧酶基因的制備操作的同時(shí)，進(jìn)行這樣的重組操作。即，可以使用具有取代成編碼其他氨基酸的堿基序列的堿基序列的引物，以克隆有野生型閨代醇環(huán)氧酶基因的重組載體為模板，進(jìn)行PCR，將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物組入載體中。啟動(dòng)子的種類只要是能在宿主中適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)的啟動(dòng)子就沒(méi)有特別限制，例如，作為可在大腸桿菌宿主中利用的啟動(dòng)子，可以舉出色氨酸操縱子的trp啟動(dòng)子、乳糖操縱子的lac啟動(dòng)子、來(lái)自入噬菌體的PL啟動(dòng)子以及PR啟動(dòng)子等，也可以利用被改變、設(shè)計(jì)成tac啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子這樣的序列。作為可在枯草菌宿主中利用的啟動(dòng)子，可以舉出葡糖酸合成酶啟動(dòng)子(gnt)、堿性蛋白酶啟動(dòng)子(apr)、中性蛋白酶啟動(dòng)子(npr)、a-淀粉酶(amy)等。作為可在紅球菌屬細(xì)菌宿主中利用的啟動(dòng)子，可以舉出表達(dá)載體pSJ034中所含有的來(lái)自灰暗諾卡氏菌諾卡氏菌(Rhodococcuserythropolis)SK92-B1林的腈水解酶表達(dá)調(diào)節(jié)基因所涉及的啟動(dòng)子。pSJ034是在紅球菌(Rhodococcus)屬細(xì)菌中表達(dá)腈水合酶的質(zhì)粒，可以用日本特開平10-337185號(hào)公報(bào)所示的方法由pSJ023來(lái)制作。pSJ023作為轉(zhuǎn)化體ATCC12674/pSJ023(保藏號(hào)"FERMBP-6232")的形態(tài)，于平成9年3月4日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)。29終止子未必是必要的，其種類并不特別限定，可以舉出例如p因子非依賴性終止子，例如有脂蛋白終止子、trp操縱子終止子、miB終止子等。另外，作為對(duì)于翻譯成氨基酸重要的》成基序列，已知有SD序列和Kozak序列等核糖體結(jié)合序列，可以將這些序列插入變異基因的上游。將原核生物用作宿主時(shí)，可通過(guò)PCR法等添加SD序列，將真核細(xì)胞用作宿主時(shí)，可通過(guò)PCR法等添加Kozak序列。作為SD序列，可以舉出來(lái)自大腸桿菌或者來(lái)自枯草桿菌的序列等，但只要是在大腸桿菌或枯草桿菌等理想的宿主內(nèi)起作用的序列即可，并無(wú)特別限制。例如，可以通過(guò)DNA合成來(lái)制作共有序列并進(jìn)行利用，所述共有序列是與16S核糖體RNA的3，末端區(qū)域相互補(bǔ)的序列為4個(gè)堿基以上相連續(xù)的堿基的序列。通常，載體中包含用于篩選作為目的的轉(zhuǎn)化體的因子(選擇標(biāo)記)。作為選擇標(biāo)記，可以舉出耐藥性基因或營(yíng)養(yǎng)要求性互補(bǔ)基因、同化性賦予基因等，可以根據(jù)目的或宿主進(jìn)行選擇。例如，作為在大腸桿菌中用作選擇標(biāo)記的耐藥性基因，可以舉出抗氨爺西林基因、卡那霉素基因、二氫葉酸還原酶基因、抗新霉素基因等。本發(fā)明中使用的載體，只要是保持上述變異基因的載體即可，并無(wú)特別限制，可以使用適于各宿主的載體。作為載體，可以舉出例如質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、逆轉(zhuǎn)座子DNA、人工染色體DNA等。例如，以大腸桿菌作為宿主的情況下，可以使用具有可在大腸桿菌內(nèi)自我復(fù)制的區(qū)域的pTrc99A(CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)、荷蘭；http:〃www.cbs.knaw.n1/)、pUC19(寶生物，日本)、pKK233-2(CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)、荷蘭；http:〃www.cbs.knaw.n1/)、pET-12(Novagen公司，德國(guó))、pET-26b(Novagen公司，德國(guó))等。另外，也可以根據(jù)需要，使用改變了這些載體的物質(zhì)。另外，也可以使用表達(dá)效率高的表達(dá)載體，例如具有trc啟動(dòng)子、lac操縱子的表達(dá)載體pTrc99A或者pKK233-2等。含有上述改良型囟代醇環(huán)氧酶基因的重組載體，被包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為含有改良型卣代醇環(huán)氧酶基因的重組載體的具體例子，可以舉出例如本發(fā)明中例示的pSTK002、pSTK003、pSTT002、pSTT003、pSTT002-T133A、pSTT002-T136C、pSTT002-T133S、pSTT002-F136A、pSTT002-F136S、pSTT002-F136W、pSTT002-D199Q、pSTT002-D199E、pSTT002-D199H、pSTT002-D199S、pSTT002-D199T、pSTT002-D199Y、pSTT002-D199L、pSTT002-D199M、pSTT002-D199I等。(IV-1)轉(zhuǎn)化體通過(guò)將本發(fā)明的重組載體對(duì)宿主進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換或形質(zhì)導(dǎo)入，制作轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體(以下，將它們統(tǒng)稱為"轉(zhuǎn)化體")。該轉(zhuǎn)化體也被包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明中使用的宿主，只要在導(dǎo)入上述重組載體后，能夠表達(dá)目的改良型鹵代醇環(huán)氧酶，就沒(méi)有特別限制。作為宿主，可以舉出例如大腸桿菌、枯草桿菌、紅球菌屬細(xì)菌等細(xì)菌、酵母(Pichia,Saccharomyces)、曲霉菌(Aspergillus)、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等。以細(xì)菌作為宿主的情況下，在本發(fā)明中，可以優(yōu)選使用大腸桿菌、紅球菌屬細(xì)菌作為宿主。作為大腸桿菌，可以舉出例如大腸桿菌K12林和B林、或者來(lái)自它們的野生林的派生林即JM109株、XL1-Blue株、C600林等。特別是，將上述乳糖操縱子的lac啟動(dòng)子及其派生啟動(dòng)子用作表達(dá)啟動(dòng)子的情況下，如果使用具有l(wèi)acI阻遏物基因的宿主，則表達(dá)就是誘導(dǎo)型(用IPTG等誘導(dǎo))，如果使用沒(méi)有l(wèi)acl阻遏物基因的宿主，則表達(dá)就是構(gòu)成型，因此，可以利用適應(yīng)需要的宿主。這些菌林可以從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC)等容易地獲得。作為枯草桿菌，可以舉出例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等。作為紅球菌(Rhodococcus)屬細(xì)菌，可以舉出例如紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)ATCC999抹、ATCC12674抹、ATCC17895株、ATCC15998抹、ATCC33275抹、ATCC184、ATCC4001林、ATCC4273株、ATCC4276抹、ATCC9356林、ATCC12483抹、ATCC14341抹、ATCC14347株、ATCC14350抹、ATCC15905抹、ATCC15998抹、ATCC17041林、ATCC19149株、ATCC19150林、ATCC21243林、ATCC29670株、ATCC29672抹、ATCC29675抹、ATCC33258抹、ATCC13808抹、ATCC17043抹、ATCC1卯67林、ATCC21999抹、ATCC21291抹、ATCC21785株、ATCC21924抹、IF014894林、IF03338林、NCIMB11215抹、NCIMB11216抹、JCM3202株、紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)Jl林(保藏號(hào)"FERMBP-1478")、球狀紅球菌(Rhodococcusgloberulus)IF014531抹、藤黃紅球菌(Rhodococcusluteus)JCM6162抹、JCM6164株、灰暗諾卡氏菌諾卡氏菌(Rhodococcuserythropolis)IF012538抹、IFO12320抹、馬紅球菌(Rhodococcus叫ui)IFO3730抹、JCM1313抹。優(yōu)選的舉出紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)Jl林(保藏號(hào)"FERMBP-1478")。上述ATCC株可以從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所獲得，IFO林可以從獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)生物科技本部生物遺傳資源部門(NBRC)獲得，JCM抹可以從獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所生物資源中心微生物材料開發(fā)室獲得，F(xiàn)ERM抹可以從獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心獲得。作為向細(xì)菌導(dǎo)入重組載體的方法，只要是向細(xì)菌中導(dǎo)入DNA的方法就沒(méi)有特別限制。可以舉出例如使用4丐離子的方法、電穿孔法等。以酵母作為宿主的情況下，可以-使用例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂歹直酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)等。作為向酵母導(dǎo)入重組載體的方法，只要是向酵母中導(dǎo)入DNA的方法就沒(méi)有特別限制，可以舉出例如電穿孔法、原生質(zhì)球法、醋酸鋰法等。以動(dòng)物細(xì)胞為宿主的情況下，可以使用猴細(xì)胞COS-7、Vero、CHO細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠GH3、人FL細(xì)胞等。作為向動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入重組載體的方法，可以舉出例如電穿孔法、磷酸鈞法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法等。以昆蟲細(xì)胞為宿主的情況下，可以使用Sf9細(xì)胞、Sf21細(xì)胞等。作為向昆蟲細(xì)胞中導(dǎo)入重組載體的方法，可以使用例如磷酸鈣法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等。以植物細(xì)胞為宿主的情況下，可以舉出煙草BY-2細(xì)胞等，但并不限于這些。作為向植物細(xì)胞中導(dǎo)入重組載體的方法，可以使用例如土壤桿菌法、基因槍法、PEG法、電穿孔法等。上述通過(guò)含有改良型卣代醇環(huán)氧酶基因的重組載體所得到的轉(zhuǎn)化體被包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為通過(guò)含有改良型鹵代醇環(huán)氧酶基因的重組載體所得到的轉(zhuǎn)化體的具體例子，可以舉出例如本發(fā)明中所例示的JM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT002、JM109/pSTT003、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T133C、JM109/pSTT002-T133S、JM109/pSTT002-F136A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-F136W、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002畫D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199Y、JM109/pSTT002曙D199L、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199I等。(V.)改良型卣代醇環(huán)氧酶的制造方法在本發(fā)明中，改良型卣代醇環(huán)氧酶可以是培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體得到的培養(yǎng)物自身或者從培養(yǎng)物中提取來(lái)制造。在本發(fā)明中，所說(shuō)的"培養(yǎng)物，，是指包括培養(yǎng)液、培養(yǎng)液上清液、細(xì)胞或菌體、細(xì)胞或菌體懸濁液、細(xì)胞或菌體破碎液、粗酶液及它們的處理物等通過(guò)培養(yǎng)生產(chǎn)改良型離代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體所得到的物質(zhì)以及源于它們的物質(zhì)中的任一種。培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體而得到的培養(yǎng)物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的方法，可以按照宿主的培養(yǎng)中所使用的通常的方法來(lái)進(jìn)行。目的改良型卣代醇環(huán)氧酶在上述培養(yǎng)物中的任一種中被積累。本發(fā)明的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，只要是含有宿主能夠同化的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類等，可有效地培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基即可，可以使用天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基中的任一種。作為碳源，可以舉出葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖、淀粉等碳水化合物、醋酸、丙酸等有機(jī)酸、乙醇、丙醇等醇類。作為氮源，可以舉出氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽或其他的含氮化合物。另外，可以使用蛋白胨、酵母粉、肉膏、玉米漿、各種氨基酸等。作為無(wú)機(jī)物，可以舉出亞磷酸鉀、磷酸鉀、磷酸錳、硫酸錳、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、碳酸鈣等。另外，根據(jù)需要，為了防止培養(yǎng)中產(chǎn)生發(fā)泡，也可以添加消泡劑。另外，根據(jù)需要，也可以適當(dāng)?shù)靥砑泳S他命。培養(yǎng)中，根據(jù)需要，可以向培養(yǎng)基中添加氨節(jié)西林或四環(huán)素等抗生素。培養(yǎng)過(guò)程中，為了防止載體和目的基因的脫落，可以以施加選擇壓的狀態(tài)來(lái)培養(yǎng)。即，在選擇標(biāo)記為耐藥性基因的情況下，可以向培養(yǎng)基中添加與^目應(yīng)的藥劑，在選擇標(biāo)記為營(yíng)養(yǎng)要求性互補(bǔ)基因的情況下，可以從培養(yǎng)基中除去與之相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)因子。另外，在選擇標(biāo)記為同化性賦予基因的情況下，可以根據(jù)需要添加與^目應(yīng)的同化因子作為唯一的因子。例如，在培養(yǎng)用含有耐氨芐基因的載體進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換的大腸桿菌的情況下，在培養(yǎng)中，可以根據(jù)需要向培養(yǎng)基中添加氨節(jié)西林。化體的情況下，可以根據(jù)需要在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑。例如，培養(yǎng)用具有可由異丙基-P-D-硫代半乳糖香(IPTG)來(lái)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的表達(dá)載體進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)化體時(shí)，可以在培養(yǎng)基中添加IPTG等。另外，培養(yǎng)用具有可由吲哚乙酸(IAA)來(lái)誘導(dǎo)的trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)化體時(shí)，可以在培養(yǎng)基中添加IAA等。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)條件，只要是不妨礙目的改良型卣代醇環(huán)氧酶的生產(chǎn)率和宿主的繁育的條件即可，并無(wú)特別限制，通常，培養(yǎng)溫度為10。C45。C，優(yōu)選為10°C~40°C,更優(yōu)選為15°C~40°C,進(jìn)一步優(yōu)選為20°C~37°C，根據(jù)需要，可以在培養(yǎng)過(guò)程中變更溫度。培養(yǎng)溫度為5~120小時(shí)，優(yōu)選為5~100小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選為10~100小時(shí)，更優(yōu)選為15~80小時(shí)左右。使用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液等來(lái)進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，如果是大腸桿菌則通常調(diào)節(jié)為6~9。作為培養(yǎng)方法，可以舉出固體培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)等。特別是培養(yǎng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的情況下，優(yōu)選通過(guò)振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)(發(fā)酵罐)在好氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，此時(shí)，也可以用通常的固體培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，但如果可能的話，優(yōu)選采用液體培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。作為培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，優(yōu)選使用如下培養(yǎng)基，其是在例如酵母粉、胰蛋白胨、多聚蛋白胨、玉米漿、大豆或小麥麩的浸出液等1種以上氮源中添加氯化鈉、亞磷酸鉀、磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鎂、氯化鐵、硫酸鐵或硫酸錳等無(wú)機(jī)鹽類的l種以上，進(jìn)一步根據(jù)需要適當(dāng)?shù)靥砑犹琴|(zhì)原料、維他命等而得到的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的初始pH值最好調(diào)節(jié)至7~9。另外，培養(yǎng)在5。C40。C進(jìn)行5100小時(shí)，優(yōu)選在10°C~37。C進(jìn)行5100小時(shí)。優(yōu)選通過(guò)通氣攪拌深部培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、流加培養(yǎng)等來(lái)實(shí)施。尤其是，以工業(yè)規(guī)模來(lái)生產(chǎn)改良型卣代醇環(huán)氧酶的情況下，可以利用通氣攪拌培養(yǎng)。此外，作為通氣攪拌培養(yǎng)的操作方式并無(wú)限制，可以選用分糸匕培養(yǎng)(batchculture)、半分糸匕培養(yǎng)(fed-batchculture,semi-batchculture)以及連續(xù)培養(yǎng)(continuousculture)中的任一種方式來(lái)進(jìn)行。尤其是，在想通過(guò)高濃度培養(yǎng)來(lái)提高每個(gè)裝置、每小時(shí)、每筆費(fèi)用或每次操作的生產(chǎn)率的情況下，可以進(jìn)行半分批式培養(yǎng)。在半分批式培養(yǎng)中使用的流加(fed)培養(yǎng)基成分，可以使用與初批(batch)培養(yǎng)基成分的組成相同的培養(yǎng)基，也可以變更組成，但優(yōu)選培養(yǎng)基成分的濃度高于初批培養(yǎng)基的濃度。流加培養(yǎng)基的體積并無(wú)特別限制，通常，可以添加初始培養(yǎng)基的1/2以下的體積。作為添加流加培養(yǎng)基的方法(feedingmode),可以舉出例如定流流加法(constant)、指凄t流力口法(exponential)、階IS:增力口流力口法(stepwiseincrease)、比增歹直速度4空制;克力口法(specificgrowth-ratecontrol)、pH,爭(zhēng)il力口';去(pH陽(yáng)stat)、DO,爭(zhēng)力充力口'法(DO-stat)、葡萄糖濃度控制流加法(glucoseconcentrationcontrol)、醋酸濃度監(jiān)觀'K危力口法(acetateconcentrationmonitoring)、才莫浙月3申經(jīng)電i各;克力口法(fuzzyneuralnetwork)等(TrendsinBiotechnology(1996),14，98-105)，但只要能得到所希望的卣代醇環(huán)氧酶活性即可，并無(wú)特別限制。實(shí)施半分批式培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)期，沒(méi)有必要限定于流化培養(yǎng)基的投入結(jié)束后，可以根據(jù)需要繼續(xù)培養(yǎng)，在每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。作為對(duì)以動(dòng)物細(xì)胞為宿主所得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可以舉出通常使用的RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基或者在這些培養(yǎng)基中添加有小牛血清等的培養(yǎng)基等。通常在存在5。/。C02的條件下，在37。C培養(yǎng)1~30天。在培養(yǎng)過(guò)程中，可以根據(jù)需要，在培養(yǎng)基中添加卡那霉素和盤尼西林等抗生素。在轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)導(dǎo))體為植物細(xì)胞或植物組織的情況下，可通過(guò)使用通常的植物培養(yǎng)用培養(yǎng)基，例如MS基本培養(yǎng)基、LS基本培養(yǎng)基等來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)方法可以釆用通常的固體培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法中的任一種。在轉(zhuǎn)化體為植物細(xì)胞或植物組織的情況下，可通過(guò)使用通常的植物培養(yǎng)用培養(yǎng)基，例如MS基本培養(yǎng)基、LS基本培養(yǎng)基等來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)方法可以采用通常的固體培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法中的任一種。在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，可以使本發(fā)明的改良型卣代醇環(huán)氧酶積累于上述培養(yǎng)物中，即，積累于培養(yǎng)液、培養(yǎng)液上清液、細(xì)胞、菌體或者細(xì)胞或者菌體的破碎物的至少一種。培養(yǎng)后，在改良型卣代醇環(huán)氧酶生產(chǎn)于菌體內(nèi)或者細(xì)胞內(nèi)的情況下，可以直接將菌體或者細(xì)胞用作物質(zhì)生產(chǎn)的催化劑，或者，也可以通過(guò)破碎菌體或者細(xì)胞，來(lái)提取目的改良型卣代醇環(huán)氧酶。任何一種情況，如果有必要的話，可以通過(guò)離心分離或者膜過(guò)濾等固液分離操作來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)基的除去和洗滌。離心分離只要能夠提供使菌體或者細(xì)胞沉降的離心力即可，并無(wú)特別限制，可以利用圓筒形和分離^1型等。作為離心力，可以以例如500G20000G左右進(jìn)行。另外，可用于本工序的膜過(guò)濾，只要是能夠?qū)崿F(xiàn)作為目的的固液分離即可，可以是微濾(MF)膜、超濾'(UF)膜中的任一種，通常，優(yōu)選使用微濾(MF)膜。就微濾而言，例如，如果基于流動(dòng)方向，可以分類成死端或4晉流(切向流)方式，如果基于壓力的施加方式，可以分類成重力式、加壓式、真空式、離心力式等，如果基于操作方式，可以分類成分批式和連續(xù)式等，但只要能夠進(jìn)行固液分離操作即可，可以利用其中的任一種。作為MF膜的材質(zhì)，可以大致分為高分子膜、陶瓷膜、金屬膜以及它們的復(fù)合型，只要不使改良型鹵代醇環(huán)氧酶活性和固液分離操作時(shí)的該活性回收率降低，就沒(méi)有特別限制，但特別優(yōu)選高分子膜，例如聚砜、聚醚砜、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚烯烴、聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯腈、混合纖維素酯、銅氨法再生纖維素酯、聚酰亞胺、尼龍、特氟龍(注冊(cè)商標(biāo))等。作為膜的孔徑，只要能夠捕捉菌體或細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)濃縮操作即可，通常可以使用0.10.5pm左右的膜。由上述離心分離和膜過(guò)濾所進(jìn)行的固液分離操作時(shí)，可以添加水或者根據(jù)需要添加緩沖液、等滲液進(jìn)行稀釋洗滌。就使用的緩沖液而言，只要是不使改良型卣代醇環(huán)氧酶活性和固液分離操作時(shí)的該活性回收率降低的緩沖液即可，并無(wú)特別限制，例如，鹽濃度最好是5-500mM,優(yōu)選為5~150mM左右，pH最好是59左右。作為緩沖液成分，可以舉出例如三羥曱基氨基曱烷(Tris)磷酸鈉鹽或鉀鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽等。具體來(lái)講，可以舉出例如20mMTris-硫酸緩沖液(pH8)、20mM磷酸鈉緩沖液(pH7)等。另外，作為等滲液，可以舉出例如0.7~0.9%氯化鈉溶液等。此外，如果有能夠穩(wěn)定改良型鹵代醇環(huán)氧酶的物質(zhì)等，則可以添加它們。進(jìn)行上述的培養(yǎng)基除去和洗滌后，可以將菌體或細(xì)胞再度懸浮于水或者根據(jù)需要懸浮于緩沖液、等滲液中，可以制備菌體或細(xì)胞懸浮液。菌體或細(xì)胞懸濁液也可以直接用作物質(zhì)生產(chǎn)中的催化劑，也可根據(jù)需要在進(jìn)行處理后使用。作為處理方法，例如，在由上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物中加入表面活性劑，使得終濃度達(dá)到0.01%~10%,最好在鹵代醇環(huán)氧酶不失活的溫度下進(jìn)行攪拌。表面活性劑的終濃度優(yōu)選為0.05%~1%,特別優(yōu)選為0.1%0.5°/。。處理溫度優(yōu)選為0。C40。C,特別優(yōu)選為4。C20。C。處理時(shí)間只要在可確認(rèn)菌體處理的效果的時(shí)間內(nèi)即可，優(yōu)選為15分鐘24小時(shí)，特別優(yōu)選為30分鐘2小時(shí)。作為表面活性，可以使用陰離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性或非離子表面活性劑。作為陰離子表面活性劑，可以使用十二烷基硫酸鈉等。作為陽(yáng)離子表面活性劑，可以使用千索氯銨等。作為非離子表面活性劑，可以使用曲通X100等。用表面活性劑進(jìn)行處理的菌，可以用緩沖液洗滌來(lái)使用，也可以不洗滌而直接使用。另外，也可以不進(jìn)行上述培養(yǎng)基的除去和洗滌操作，而直接進(jìn)行菌體或細(xì)胞的表面活性劑等的處理。另外，菌體或細(xì)胞也可以固定化來(lái)使用。具體來(lái)講，可以舉出例如將培養(yǎng)后的細(xì)胞或菌體用丙烯酰胺等凝膠包含而得到的物質(zhì)、負(fù)載于氧化鋁、氧化硅、沸石、硅藻土等無(wú)機(jī)載體而得到的物質(zhì)等。另一方面，通過(guò)破碎菌體或細(xì)胞，也可以提取目的改良型卣代醇環(huán)氧酶。作為菌體或細(xì)胞的破碎方法，可以舉出超聲波處理、由弗氏壓碎器或勻漿器所進(jìn)行的高壓處理、由珠磨機(jī)所進(jìn)行的磨碎處理、由沖擊波破碎裝置所進(jìn)行的沖撞處理、使用溶菌酶、纖維素酶、果膠酶等的酶處理、凍結(jié)溶解處理、低滲液處理、由噬菌體所進(jìn)行的溶菌誘導(dǎo)處理等，可以單獨(dú)使用任一種方法或者根據(jù)需要組合利用。以工業(yè)的規(guī)模進(jìn)行菌體或細(xì)胞的破碎的情況下，考慮到操作性、回收率、成本等，優(yōu)選主要利用高壓處理或磨碎處理、沖突處理，也可以根據(jù)情況在物理破碎操作中組合酶處理等。就各破碎處理方法而言，只要是由菌體或細(xì)胞得到的改良型面代醇環(huán)氧酶回收率足夠高的方法，則操作條件就沒(méi)有特別限制。所說(shuō)的足夠高的改良型鹵代醇環(huán)氧酶回收率，例如優(yōu)選為85%以上，更優(yōu)選為90%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為95%，最優(yōu)選為99%以上。利用珠磨機(jī)進(jìn)行磨碎處理的情況下，就使用的微珠而言，可以通過(guò)例如將密度2.56.0g/cm3、尺寸0.11.0mm的微珠通常填充8085。/o左右，進(jìn)行破碎，作為運(yùn)轉(zhuǎn)方式，也可以采用分批式、連續(xù)式中的任一種。菌體或細(xì)胞濃度也沒(méi)有特別限制，例如，如果是細(xì)菌的話，最好是6~12%左右，如果是酵母的話，最好是14~18%左右。進(jìn)行高壓處理的情況下，就處理壓力而言，只要來(lái)自菌體或細(xì)胞的改良型卣代醇環(huán)氧酶回收率足夠高即可，并無(wú)特別限制，例如，可以在40150MPa左右的壓力下進(jìn)行破碎。菌體或細(xì)胞濃度也沒(méi)有特別限制，例如，可以是20%以下左右。也可以根據(jù)需要，通過(guò)將裝置串聯(lián)地配置，或者使用多級(jí)結(jié)構(gòu)的裝置，進(jìn)行多級(jí)處理，提高破碎和操作效率。通常，由于每lOMPa的處理壓力會(huì)產(chǎn)生2~3。C的溫度上升，因此優(yōu)選根據(jù)需要進(jìn)行冷卻處理。沖撞處理情況下，例如，可以預(yù)先利用噴霧急速凍結(jié)處理(凍結(jié)速度例如每分鐘數(shù)千攝氏度)等將被破碎菌體或細(xì)胞漿液制成凍結(jié)微粒(例如，50fim以下)，通過(guò)高速(例如約300m/s)的輸送氣體使其沖撞于沖撞板，從而破碎菌體或細(xì)胞。上述菌體或細(xì)胞破^5f處理的結(jié)果為，在因細(xì)胞內(nèi)的核酸流出而使得處理液的粘度上升，操作困難的情況下，或者對(duì)于后續(xù)的殘?jiān)蛛x工序下的活性回收率提高有效果的情況下，可以根據(jù)需要通過(guò)核酸除去或核酸分解，期待處理液的粘度降低或殘?jiān)蛛x工序下的活性回收率的提高。作為除去或分解細(xì)胞破碎液中的核酸的方法，只要是不使改良型囟代醇環(huán)氧酶活性或該活性回收率降低，并且能夠除去或分解核酸的方法即可，可以是任一種方法，可舉出如生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座5巻200~201頁(yè)中所記載的方法通過(guò)在細(xì)胞破碎液中添加魚精蛋白硫酸或者鏈霉素來(lái)沉淀核酸的方法；用核酸分解酶來(lái)分解核酸的方法；使用葡聚糖-聚乙二醇進(jìn)行液液分離的方法等。另外，有時(shí)進(jìn)一步追加物理破碎處理也是有效的。這些方法中，尤其是想既避免繁雜的工序又迅速分解核酸的情況下，也可以釆用用核酸分解酶來(lái)分解核酸的方法。就用于核酸分解酶處理的核酸分解酶而言，只要是至少作用于脫氧核糖核酸(DNA),具有核酸分解反應(yīng)催化能力，降低DNA聚合度的酶即可，可以是任何酶，也可以利用本來(lái)就存在于該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞內(nèi)的核酸分解酶，但也可以另外添加外因性的核酸分解酶。作為另外添加的核酸分解酶，可以舉出來(lái)自牛脾臟的DNaseI(和光純藥，曰本)、來(lái)自豬脾臟的DNaseII(和光純藥，日本)、來(lái)自粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)的核酸分解酶Benzonase(注冊(cè)商標(biāo))核酸酶(Nuclease)(寶生物，曰本)、來(lái)自金黃葡萄球菌的核酸酶(NucleasefromStaphylococcusaureus)(和光純藥，日本)等。添加的酶量，因酶的種類和單位數(shù)(U)的定義而不同，如果是本領(lǐng)域技術(shù)人員則可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)定。根據(jù)需要，可以在該酶溶液中添加核酸分解酶所要求的鎂等輔助因子。處理溫度根據(jù)使用的核酸分解酶而不同，但只要是來(lái)自常溫生物種類的核酸分解酶，則通常設(shè)定于2040。C的溫度即可。在需要從得到的破碎液中除去菌體或細(xì)胞破碎殘?jiān)那闆r下，可以通過(guò)例如離心分離或過(guò)濾(死端方式或4晉流方式)等來(lái)除去。離心分離操作可以如前所述地進(jìn)行。在菌體或細(xì)胞破碎殘?jiān)小，且難以容易地沉降的情況下，可以根據(jù)需要使用凝集劑來(lái)提高殘?jiān)恋硇省＞陀袡C(jī)高分子凝集劑而言，如果基于離子性，則可以舉出陽(yáng)離子系凝集劑、陰離子系凝集劑、兩性系凝集劑、非離子系凝集劑，如果基于成分，則可以舉出丙烯酸系、聚乙烯亞胺、縮合系聚陽(yáng)離子(聚胺)、二甲基二烯丙基氯化銨、殼聚糖等，就本發(fā)明中使用的凝集劑而言，只要是不使改良型閨代醇環(huán)氧酶活性或該活性回收率降低，并且能夠提高殘?jiān)蛛x效率的凝集劑，就可以是任一種凝集劑。作為構(gòu)成丙烯酸系凝集劑成分的丙烯酸系水溶性單體，可以舉出例如丙烯酰胺、丙烯酸鈉、丙烯酰胺2-曱基-丙烷磺酸鈉、二甲基氨乙基-曱基丙烯酸酯、甲基丙烯酰氧基乙基-三曱基氯化銨、曱基丙烯酰氧基乙基-節(jié)基二曱基-氯化銨、二甲基氨乙基-丙烯酸酯、丙烯酰氧基乙基-三曱基氯化銨、二曱基氨基丙基-丙烯酰胺、丙烯酰胺丙基-三曱基氯化銨、聚氯脒等，可以舉出這些單體的均聚物、由多種組合所形成的共聚物或者高分子改性物作為丙烯酸系凝集劑。作為極具代表性的陽(yáng)離子系高分子凝集劑，可以舉出聚氨基烷基曱基丙烯酸酯類、聚氨基烷基曱基丙烯酸酯和丙烯酰胺的共聚物類、聚丙烯酰胺的曼尼希改性物類、聚二曱基二烯丙基銨鹽類、聚乙烯基咪唑啉類、聚丙烯酰胺類、胺系縮聚物類等，多數(shù)商品已經(jīng)在市場(chǎng)上銷售。作為其主要商品，可以舉出例如Sanpoly-K-601,K-602(主成分聚胺，三共化成)、KuriflockLC-599(主成分聚胺和聚酰胺，栗田工業(yè))、HymolockM-166，M-566,M-966,(主成分丙烯酰胺改性物，協(xié)立有機(jī)工業(yè))、Uniflocker-UF-301,UF-304，UF-305，(主成分聚丙烯酰胺，尤尼吉可)、UF-330,UF-340，(主成分氨基曱基丙烯酸酯，尤尼吉可)、UF-505(主成分二氰胺(dicyanoamine),尤尼吉可)、RyuflocC-110(主成分聚胺，大日本油墨化學(xué))、PuriflocC-31(主成分聚胺，陶氏化學(xué))。另夕卜，也可以舉出Dia-Nitrix公司(曰本)制造的K-400系列、KM-200系列、KM-1200系列、KAM-200系列、KD-200系列、KP-000系列、KP-100系列、KP-200系列、KP-300系列、KP-500系列、KP-1200系列、KA-000系列、KA-200系列、KA-300系列、KA-400系列、KA-600系列、KA-700系列、KA-800系列等。這些凝集劑可以單獨(dú)使用或者將2種以上并用來(lái)使用。就本發(fā)明中使用的凝集劑而言，只要是不使改良型鹵代醇環(huán)氧酶活性或該活性回收率降低，并且可提高殘?jiān)蛛x效率提高的凝集劑，就可以是上述任一種凝集劑，具體來(lái)講,可以舉出例如Dia-Nitrix公司(日本)制造的K-403B、K-408、K-415等。作為凝集劑的添加量，才艮據(jù)凝集劑的種類、菌體或石皮^淬液的液狀而有所不同，例如，破碎后的微生物干燥重量％濃度的1/200-1/5的濃度，優(yōu)選為1/100~1/10濃度。作為添加方法，例如將凝集劑預(yù)先溶解于水中后，添加于菌體或細(xì)胞破碎液，靜置或攪拌至少5分鐘24小時(shí)即可，優(yōu)逸靜置或攪拌30分鐘10小時(shí)左右。作為此時(shí)的溫度，優(yōu)選例如為0。C60。C,特別優(yōu)選為0。C50。C,進(jìn)一步優(yōu)選為0。C40。C。另外，在需要調(diào)節(jié)pH的情況下，也可以適當(dāng)?shù)靥砑映蔁o(wú)機(jī)鹽終濃度為5~200mM,進(jìn)行緩沖液化，根據(jù)需要，還可以添加使改良型卣代醇環(huán)氧酶穩(wěn)定的物質(zhì)。利用過(guò)濾進(jìn)行殘?jiān)蛛x時(shí)，如果能實(shí)現(xiàn)目的的殘?jiān)蛛x，就可以使用微濾(MF)膜、超濾(UF)膜中的任一種膜，通常，優(yōu)選使用微濾(MF)膜。微濾膜如前所述，只要是能夠進(jìn)行殘?jiān)蛛x操作的膜，就可以利用任一種膜。作為膜的孔徑，只要是可捕捉菌體或細(xì)胞殘?jiān)?，并且在濾液側(cè)回收改良型卣代醇環(huán)氧酶活性的孔徑即可，例如，可以使用0.1-0.5iim左右的膜。此外，如果使用過(guò)濾助劑、根據(jù)需要的凝集劑的話，也可以使用孔徑0，5pm以上的膜或者濾紙。作為過(guò)濾助劑，可以舉出硅藻土、纖維素粉末、活性炭等。凝集劑如上所述。除去殘?jiān)笏玫降纳锨逡?，是?xì)胞提取液可溶性級(jí)分，可以作為含有改良型卣代醇環(huán)氧酶的粗酶溶液。然后，根據(jù)需要，通過(guò)使用在蛋白質(zhì)的分離純化中使用的通常的生物化學(xué)方法，可以從所述培養(yǎng)物中分離純化鹵代醇環(huán)氧酶，其中所述生物化學(xué)方法包括例如硫酸銨沉淀、各種色譜(例如凝膠過(guò)濾色i普(例如Sephadex色譜柱)、離子交換色譜(例如DEAE-Toyopearl)、親和色譜、疏水色鐠(例如butylToyopearl)、陰離子色譜(例如MonoQ色譜柱)等)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等，這些方法可以單獨(dú)使用或者適當(dāng)?shù)亟M合使用。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是基因重組體，并且，擔(dān)心由于轉(zhuǎn)化體在制造工序中向環(huán)境中泄露、混入制品中或者使用后的處理等而可能引起二次微生物污染的情況下，可以根據(jù)需要進(jìn)行滅活處理。作為滅活方法，只要是不使改良型鹵代醇環(huán)氧酶活性或該活性回收率降低，并且可滅活轉(zhuǎn)化體的方法，就可以是任何方法，例如可以單獨(dú)或者組合利用熱處理、菌體破碎處理、藥劑處理等方法。例如，通過(guò)在菌體破碎處理之前或之后進(jìn)行藥劑處理，可以進(jìn)行滅活。作為所使用的藥劑，根據(jù)轉(zhuǎn)化體的宿主種類而異，可以舉出例如千索氯銨、氯化十六烷吡啶、甲基硬脂酰氯、十六烷基三甲基氯化銨等陽(yáng)離子表面活性劑、鹽酸烷基二氨基乙基甘氨酸等兩性離子表面活性劑等。另外，也可以舉出乙醇等醇類、2-巰基乙醇等硫醇類、乙二胺等胺類、半胱氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸等氨基酸類等。就藥劑的濃度而言，只要是不降低改良型鹵代醇環(huán)氧酶活性或該活性回收率，并且可以滅活的濃度即可，例如，優(yōu)選為微生物干燥重量％濃度的1/1001/2的濃度，更優(yōu)選為1/101/5濃度左右。處理溫度為050。C,優(yōu)選為04(TC。另夕卜，pH為5~9左右，優(yōu)選為68左右。另一方面，在改良型卣代醇環(huán)氧酶生產(chǎn)于菌體外或細(xì)胞外的情況下，直接使用培養(yǎng)液，或者通過(guò)上述的離心分離或過(guò)濾等來(lái)除去菌體或細(xì)胞。然后，根據(jù)需要，通過(guò)利用硫酸銨沉淀進(jìn)行萃取等，來(lái)從所述培養(yǎng)物中提取改良型鹵代醇環(huán)氧酶，進(jìn)一步根據(jù)需要，將透析、各種色譜(凝膠過(guò)濾、離子交換色譜、親和色i普等)單獨(dú)或適當(dāng)組合來(lái)使用，從而也可以進(jìn)行純化。在轉(zhuǎn)化體為植物細(xì)胞或植物組織的情況下，通過(guò)使用纖維二糖酶、果膠酶等酶的細(xì)胞溶解處理、超聲波破碎處理、磨碎處理等來(lái)破壞細(xì)胞。然后，如果需要的話，通過(guò)使用在蛋白質(zhì)的分離純化中使用的通常的生物化學(xué)方法，可以從所述培養(yǎng)物中分離純化卣代醇環(huán)氧酶，其中所述生物化學(xué)方法包括例如^5克酸銨沉淀、各種色譜(例如凝膠過(guò)濾色譜(例如Sephadex色譜柱)、離子交換色i普(例如DEAE-Toyopearl)、親和色"i普、疏水色i普(例如butylToyopearl)、陰離子色譜(例如MonoQ色譜柱)等)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等，這些方法可以單獨(dú)使用或者適當(dāng)?shù)亟M合使用。分離的卣代醇環(huán)氧酶與上述細(xì)胞或菌體同樣地，可以保持于適當(dāng)?shù)妮d體上，作為固定化酶來(lái)使用。按以上方法得到的培養(yǎng)物和改良型卣代醇環(huán)氧酶，被包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。得到的培養(yǎng)物和改良型卣代醇環(huán)氧酶的生產(chǎn)收率，可以通過(guò)測(cè)定(I)記載的卣代醇環(huán)氧酶活性，算出每個(gè)培養(yǎng)裝置、—每個(gè)培養(yǎng)液、每單位菌體(轉(zhuǎn)化體)濕重量或干燥重量、每單位酶液中蛋白質(zhì)重量等的活性來(lái)求出。另夕卜，在本發(fā)明中，也可以從上述改良型鹵代醇環(huán)氧酶基因或含有改良型卣代醇基因的重組載體中提取改良型鹵代醇環(huán)氧酶。即，在本發(fā)明中，可以完全不使用生細(xì)胞而采用無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系，來(lái)產(chǎn)生改良型卣代醇環(huán)氧酶。所說(shuō)的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系，是使用細(xì)胞提取液在試管等人工容器內(nèi)合成蛋白質(zhì)的體系。在本發(fā)明中使用的無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成體系中，也包含以DNA為模板來(lái)合成RNA的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體系。此時(shí)，與上述宿主對(duì)應(yīng)的生物相當(dāng)于下述的細(xì)胞提取液的來(lái)源生物。這里，上述細(xì)胞提取液可以使用來(lái)自真核細(xì)胞或來(lái)自原核細(xì)胞的提取液，例如可以使用小麥胚芽、大腸桿菌等的提取液。這些細(xì)胞提取液可以是濃縮的也可以是未濃縮的。細(xì)胞提取液可以通過(guò)例如超濾、透析、聚乙二醇(PEG)沉淀等來(lái)得到。此外，在本發(fā)明中，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成也可以使用市售的試劑盒來(lái)進(jìn)行。作為這樣的試劑盒，可以舉出例如試劑盒PROTEIOS(東洋紡)、TNTTMSystem(promega)、合成裝置的PG-MateTM(東洋紡)、RTS(roche-diagnostics)等。如上述那樣通過(guò)無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成而得到的改良型卣代醇環(huán)氧酶，可以如前所述選擇適當(dāng)?shù)纳V來(lái)進(jìn)行純化。(VI)表囟代醇和4-卣代-3-羥基丁腈的制造方法如上述方法制造的改良型面代醇環(huán)氧酶可以作為酶催化劑來(lái)用于物質(zhì)生產(chǎn)。即，可以供于以下的(VI-1)(VI-3)所示的反應(yīng)。(VI-1)1，3-二卣代-2-丙醇向表卣代醇的轉(zhuǎn)換本轉(zhuǎn)換反應(yīng)可以通過(guò)使1,3-二卣代-2-丙醇與上述的改良型鹵代醇環(huán)氧酶和/或由上述培養(yǎng)所得到的培養(yǎng)物相接觸來(lái)進(jìn)行。作為底物的1,3-二卣代-2-丙醇是用前述通式(1)表示的化合物。作為鹵原子，優(yōu)選為氟、氯、溴、碘，特別優(yōu)選為氯、溴。具體來(lái)講，可以舉出1,3-二氟-2-丙醇、1，3-二氯-2-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇、1,3-二碘-2-丙醇等，優(yōu)選為1，3-二氯-2-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇。轉(zhuǎn)換反應(yīng)液中的底物濃度優(yōu)選為0.01-15(W/V)%。從酶穩(wěn)定性的觀點(diǎn)出發(fā)，底物濃度在該范圍內(nèi)時(shí)是理想的，特別優(yōu)選為0.0110%。底物可以一次性添加于反應(yīng)液中或者分次添加。從積累性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選通過(guò)分次添加而使底物濃度恒定。作為反應(yīng)液的溶劑，優(yōu)選酶活性的最適值pH4~10的附近的水或緩沖液。作為緩沖液，優(yōu)選例如由磷酸、硼酸、檸檬酸、戊二酸、蘋果酸、丙二酸、鄰苯二曱酸、琥珀酸或醋酸等的鹽等構(gòu)成的緩沖液、Tris緩沖液或者good緩沖液等。反應(yīng)溫度優(yōu)選為5~50°C,反應(yīng)pH值優(yōu)選為4~10的范圍。反應(yīng)溫度更優(yōu)選為10~40°C。反應(yīng)pH更優(yōu)選為pH6~9。反應(yīng)時(shí)間才艮據(jù)底物等的濃度、菌體濃度或者其他的反應(yīng)條件等進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇，優(yōu)選設(shè)定成在1-120小時(shí)內(nèi)結(jié)束的條件。另外，在本反應(yīng)中，通過(guò)乂人反應(yīng)體系內(nèi)除去伴隨著反應(yīng)的進(jìn)行所生成的氯離子，可以進(jìn)一步提高光學(xué)濃度。優(yōu)選通過(guò)添加硝酸銀等來(lái)除去該氯離子。在反應(yīng)液中生成、積累的表卣代醇可以釆用公知的方法來(lái)提取和純化。例如，用醋酸乙酯等溶劑進(jìn)行萃取，在減壓下除去溶劑，從而可以得到表面代醇的漿液。另外，可以通過(guò)在減壓下蒸餾這些漿液來(lái)進(jìn)一步純化。(VI-2)1，3-二卣代-2-丙醇向4-卣代-3-羥基丁腈的轉(zhuǎn)換本轉(zhuǎn)換反應(yīng)可以通過(guò)使1,3-二囟代-2-丙醇與上述改良型卣代醇環(huán)氧酶和/或由上述的培養(yǎng)所得到的培養(yǎng)物接觸來(lái)進(jìn)行。作為底物的1,3-二卣代-2-丙醇是用前述通式(1)表示的化合物，優(yōu)選為1，3-二氯-2-丙醇、1,3-二溴-2-丙醇。另外，作為氰化物，可以使用氰化氫、氰化鉀、氰化鈉、氰酸或丙酮氰醇等在添加于反應(yīng)液中時(shí)生成氰離子(CN-)或氰化氫的化合物或其溶液。反應(yīng)液中的底物濃度從酶穩(wěn)定性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為0.01~15(W/V)%,特別優(yōu)選為0.0110%。另夕卜，氰化物的使用量從酶穩(wěn)定性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為底物的1~3倍量(摩爾)。反應(yīng)條件可以與上述(VI-1)相同。反應(yīng)液中生成、積累的4-卣代-3-羥基丁腈可以使用公知的方法來(lái)提取和純化。例如，可以通過(guò)使用離心分離等方法從反應(yīng)液除去菌體后，用醋酸乙酯等溶劑進(jìn)行萃取，減壓下除去溶劑，可以得到4-鹵代-3-羥基丁腈的漿液。另外，也可通過(guò)減壓下蒸餾這些漿液來(lái)進(jìn)一步純化。(VI-3)表卣代醇向4-卣代-3-羥基丁腈的轉(zhuǎn)換本轉(zhuǎn)換反應(yīng)通過(guò)使表面代醇與上述改良型卣代醇環(huán)氧酶和/或由上述培養(yǎng)所得到的培養(yǎng)物相接觸來(lái)進(jìn)行。作為底物的表囟代醇是用前述通式(2)表示的化合物。作為囟原子，優(yōu)選為氟、氯、溴、碘，特別優(yōu)選為氯、溴。具體來(lái)講，可以舉出表氟代醇、表氯代醇、表溴代醇、表硪代醇等，特別優(yōu)選為表氯代醇、表溴代醇。另外，氰化物可以使用氰化氬、氰化鉀、氰化鈉、氰酸或丙酮氰醇等添加于反應(yīng)也中時(shí)生成氰離子(CN-)或者氰化氬的化合物或其溶液。反應(yīng)條件、提取和純化方法可以與上述(VI-2)相同。以下，利用實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體地說(shuō)明。但是，本發(fā)明并不因這些實(shí)施例而受到任何限制。實(shí)施例1比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基被取代成其他氨基酸的改良型卣代醇環(huán)氧酶的獲得及其評(píng)價(jià)(1)表達(dá)改良型囟代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體的制作(表達(dá)載體pKK233-2)按以下所述制作出表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的表達(dá)質(zhì)粒(表達(dá)載體pKK233-2)以及含有該表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體，所述改良型卣代醇環(huán)氧酶是，來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的野生型卣代醇環(huán)氧酶即HheB(2nd)中，由翻譯起始密碼子編碼的氨基酸殘基的下游的1個(gè)氨基酸殘基(第2個(gè)氨基酸殘基)分別被取代成賴氨酸和天冬酰胺的酶。首先，通過(guò)PCR擴(kuò)增卣代醇環(huán)氧酶基因HheB(2nd)。PCR反應(yīng)液的組成(總量50ial)如下表所示，制備出3個(gè)系列(3個(gè)系列的不同在于正義引物各不相同)。44<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>用作引物的寡聚核苷酸的序列如下所示。DH-08:GGCCATGGCTAACGGAAGACTGGCAGGC(序列號(hào)57:由28個(gè)核苷酸構(gòu)成，該序列中具有限制性內(nèi)切酶Ncol識(shí)別部位(CCATGG)和鹵代醇環(huán)氧酶基因HheB(2nd)的翻譯起始密碼子以后的序列，與第2個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子是GCT編碼丙氨酸)由33個(gè)核苷酸構(gòu)成，該序列中具有限制性內(nèi)切酶BspHI識(shí)別部位(TCATGA)和卣代醇環(huán)氧酶基因HheB(2nd)的翻譯起始密碼子以后的序列，與第2個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子是AAA編碼賴氨酸)由33個(gè)核苷酸構(gòu)成，該序列中具有限制性內(nèi)切酶BspHI識(shí)別部位(TCATGA)和卣代醇環(huán)氧酶基因HheB(2nd)的翻譯起始密碼子以后的序列，與第2個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子是AAC編碼天冬酰胺)DH畫07:CGCCTGCAGGCTACAACGACGACGAGCGCCTG(序列號(hào)60:由32個(gè)核苷酸構(gòu)成，該序列中具有限制性內(nèi)切酶Sse8387I兼PstI識(shí)別部位(CCTGCAGG)以及卣代醇環(huán)氧酶.基因HheB(2nd)終止密碼子下游區(qū)域)另外，用作模板的pSTlll記載于日本特公平5-317066公報(bào)，由含有pSTlll的重組載體所得到的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體JM109/pST111以保藏號(hào)"FERMBP-10922",在平成3年3月1日保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>利用GFXPCRDNAbandGelBand純化試劑盒(GE保健生物科學(xué))分別對(duì)進(jìn)行了熱處理的3個(gè)系列的PCR反應(yīng)液進(jìn)行純化，然后，對(duì)系列1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NcoI和PstI進(jìn)行雙酶切消化，對(duì)系列2和系列3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BspHI和PstI進(jìn)行雙酶切消化。用瓊脂糖凝膠電泳分離各消化產(chǎn)物后，用QIAquickGelExtraction試劑盒(QIAGEN)對(duì)含有卣代醇環(huán)氧酶基因全長(zhǎng)的帶(約0.8kb)進(jìn)行純化。另一方面，將作為pKK233-2(CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS),荷蘭；http://www.cbs.knaw.nl/)的衍生物的，可通過(guò)WO2006/41226號(hào)小冊(cè)子記載的方法來(lái)制備的表達(dá)載體pKK233-2(+Sse)用限制性內(nèi)切酶NcoI和PstI消化后，通過(guò)苯酚萃取、氯仿萃取、乙醇沉淀(MolecularCloning,ALaboratoryManual,2nded.(ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))來(lái)純化。將其與含有上述囟代醇環(huán)氧酶基因全長(zhǎng)的3種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別混合后，向該混合液添加溶液I(SolutionI)(DNALigation試劑盒ver.2(寶生物)，制作出連接混合物。通過(guò)將該混合物在16。C孵育12小時(shí)，從而使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pKK233-2(+Sse)結(jié)合。將200jil預(yù)先制備好的大腸桿菌JM109林感受態(tài)細(xì)胞(將大腸桿菌JM109抹接種于lml的LB培養(yǎng)基(1%蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl)中，在37°C好氧預(yù)培養(yǎng)5小時(shí)，然后將預(yù)培養(yǎng)液0.4ml加入SOB培養(yǎng)基40ml(2%蛋白胨，0.5%酵母粉，10mMNaCl，2.5mMKCl，lmMMgS04，lmMMgCl2)，在18°C培養(yǎng)20小時(shí)，將得到的培養(yǎng)物通過(guò)離心分離(3700xg，10分鐘，4。C)進(jìn)行集菌后，加入13ml冷TF溶液(20mMPIPES-KOH(pH6.0),200mMKC1,10mMCaCl2，40mMMnCl2)，在0。C放置10分鐘，再次離心分離(3700xg,10分鐘，4°C)來(lái)除去上清液，將得到的大腸桿菌菌體懸浮于冷TF溶液3.2ml,加入0.22ml的二曱基亞砜，在0。C放置10分鐘，然后，使用液氮來(lái)保存于-80°C),加入IOjxI的上述連接產(chǎn)物中，在0。C放置30分鐘。接著，對(duì)該感受態(tài)細(xì)胞在42。C給予30秒鐘的熱激處理，在0。C冷卻2小時(shí)。然后，添加lml的SOC培養(yǎng)基(20mM葡萄糖，2%蛋白胨，0,5%酵母粉，lOmMNaCl,2.5mMKC1,lmMMgS04，lmMMgCl2),在37。C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液以各自200|il的量，涂布于LBAmp瓊脂培養(yǎng)基(氨千100mg/L,含有1.5%瓊脂的LB培養(yǎng)基)，在37。C培養(yǎng)1夜。將在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的多個(gè)轉(zhuǎn)化體菌落，用1.5ml的LBAmp培養(yǎng)基(含有100mg/L氨芐的LB培養(yǎng)基)在37。C培養(yǎng)1夜。將得到的培養(yǎng)液分別集菌后，采用FlexiPrep(GE保健生物科學(xué))回收重組質(zhì)粒。使用毛細(xì)管DNA測(cè)序儀CEQ2000(貝克曼庫(kù)爾特)，按照附加的操作手冊(cè)，對(duì)被克隆于3種質(zhì)粒中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列進(jìn)行解析，確認(rèn)在PCR反應(yīng)中沒(méi)有產(chǎn)生錯(cuò)誤變異。將克隆有來(lái)自系列1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段的質(zhì)粒命名為pSTKOOl，將克隆有來(lái)自系列2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段的質(zhì)粒命名為pSTK002，將克隆有來(lái)自系列3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA片段的質(zhì)粒命名為pSTK003，另夕卜，將含有這些質(zhì)粒的大腸桿菌JM109抹轉(zhuǎn)化體分別命名為JM109/pSTK001、JM109/pSTK002和JM109/pSTK003。下述各質(zhì)粒的特征如下。pSTK001:對(duì)第2氨基酸殘基為丙氨酸殘基的野生型卣代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)進(jìn)行編碼的野生型閨代醇環(huán)氧酶基因被克隆于表達(dá)載體pKK233-2上；pSTK002:對(duì)第2氨基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代為賴氨酸的改良型卣代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)進(jìn)行編碼的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因被克隆于表達(dá)載體pKK233-2上；pSTK003:對(duì)第2氨基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代為天冬酰胺的改良型卣代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)進(jìn)行編碼的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因被克隆于表達(dá)載體pKK233-2上。(2)表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體的制作(表達(dá)載體pTrc99A)制作出表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的表達(dá)質(zhì)粒(表達(dá)載體pTrc99A)以及含有該表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體，所述改良型卣代醇環(huán)氧酶是，在來(lái)自棒狀桿菌屬(Corynebacteriumsp.)N-1074抹的野生型卣代醇環(huán)氧酶即HheB(2nd)中，比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近1個(gè)殘基(第2個(gè)氨基酸殘基)分別被取代成賴氨酸和天冬酰胺的酶。就制作而言，使用pTrc99A來(lái)代替在實(shí)施例1(1)中使用的表達(dá)載體pkk233-2，其他與實(shí)施例1(1)同樣地進(jìn)行。將克隆有來(lái)自系列1的PCR擴(kuò)增物的DNA片段的質(zhì)粒命名為pSTTOOl,將克隆有來(lái)自系列2的PCR擴(kuò)增物的DNA片段的質(zhì)粒命名為pSTT002,將克隆有來(lái)自系列3的PCR擴(kuò)增物的DNA片^:的質(zhì)粒命名為pSTT003,另外，將含有這些質(zhì)粒的大腸桿菌JM109抹轉(zhuǎn)化體分別命名為JM109/pSTT001、JM109/pSTT002和JM109/pSTT003。上述各質(zhì)粒的特征如下。pSTT001:對(duì)第2個(gè)氨基酸殘基為丙氨酸殘基的野生型卣代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)進(jìn)行編碼的野生型鹵代醇環(huán)氧酶基因被克隆在表達(dá)載體pTrc99A上。pSTT002:對(duì)第2個(gè)氨基S爽殘基(丙氨酸殘基)被取代成賴氨酸的改良型鹵代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)進(jìn)行編碼的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因被克隆在表達(dá)載體pTrc99A上。pSTT003:對(duì)第2個(gè)氨基酸殘基(丙氨酸殘基)被取代成天冬酰胺的改良型鹵代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)進(jìn)行編碼的改良型卣代醇環(huán)氧酶基因被克隆在表達(dá)載體pTrc99A上。(3)表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體的評(píng)價(jià)對(duì)于在實(shí)施例1(1)和(2)中制作的6株轉(zhuǎn)化體(JM109/pSTK001、JM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT001、JM109/pSTT002、JM109/pSTT003)和日本特公平5-317066號(hào)公l艮記載的JM109/pST111共計(jì)7抹，按如下方式進(jìn)行IPTG(異丙基-l-硫代-D-p-D-半乳糖苷)的評(píng)價(jià)。在各沃色曼氏試驗(yàn)管中分注lml的LBAmp培養(yǎng)基，在各試驗(yàn)管中分別接種二次評(píng)價(jià)選拔林6株以及JM109/pST111的菌落。在37。C、210rpm的條件下，培養(yǎng)約8培養(yǎng)基(500ml容積的三角燒瓶中的100ml)，在37。C、210rpm的條件下，培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)離心分離(3700xg,IO分鐘，4°C)從得到的培養(yǎng)液中回收各菌體，用20mMTris-硫酸緩沖液(pH8.0)進(jìn)行洗滌后，懸浮于相同緩沖液中使得菌濃度為12.5gDC/L。使用超聲波破碎機(jī)VP-15S(taitec，日本)，在輸出控制4、DUTYCYCLE40%、PULS、TIMER=B模式10s的條件下，對(duì)得到的lml的菌體懸濁液進(jìn)行冰浴，同時(shí)進(jìn)行3分鐘破碎。將破碎的菌體懸濁液供于離心分離(23000xg,5分鐘，4°C)，采用上清液作為粗酶液。用20mMTris-硫酸緩沖液(pH8.0)對(duì)得到的粗酶液進(jìn)行稀釋，使得各破碎前的(在菌體懸法液時(shí)刻的)菌體濃度達(dá)到6.25gDC/L。將稀釋了的來(lái)自各轉(zhuǎn)化體的粗酶液與等量的聚丙烯酰胺凝膠電泳用樣品緩沖液(0.1MTris-HCl(pH6.8)，4%w/vSDS，12。/。v/v卩巰基乙醇，20。/。v/v甘油，微量溴酚藍(lán))進(jìn)行混合，煮沸5分鐘來(lái)進(jìn)行變性處理。制作出10%聚丙烯酰胺凝膠，每1道供應(yīng)5|il的變性處理完的樣品，進(jìn)行電泳分析(圖1)。作為30kDa強(qiáng)的帶分別觀察到卣代醇環(huán)氧酶(圖1中的箭頭)。與來(lái)自表達(dá)野生型鹵代醇環(huán)氧酶HheB(l"的JM109/pST111的粗酶液比較，確認(rèn)出來(lái)自表達(dá)相同野生型面代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK001的粗酶液和來(lái)自JM109/pSTT001的粗酶液的表達(dá)量增加(認(rèn)49為這是因?yàn)楸磉_(dá)載體的不同所引起的)。另一方面，與來(lái)自JM109/pSTK001的粗酶液和來(lái)自JM109/pSTT001的粗酶液相比較，來(lái)自表達(dá)第2個(gè)氨基酸殘基被取代成天冬酰胺的改良型卣代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK003的粗酶液和來(lái)自JM109/pSTT003的粗酶液的表達(dá)量分別進(jìn)一步增加，另外，來(lái)自表達(dá)第2個(gè)氨基酸殘基被取代成賴氨酸的改良型卣代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK002的粗酶液和來(lái)自JM109/pSTT002的粗酶液的表達(dá)量分別進(jìn)一步大幅增加。接著，使用上述粗酶液，通過(guò)以下方法測(cè)定卣代醇環(huán)氧酶活性(脫氯活性)。制備100ml的活性測(cè)定用反應(yīng)液(50mMDCP,50mMTris-硫酸(pH8)),將溫度調(diào)節(jié)為20°C。向該反應(yīng)液中添加稀釋好的來(lái)自各轉(zhuǎn)化體的粗酶液，開始反應(yīng)。使用pH自動(dòng)控制器，用0.01當(dāng)量的氫氧化鈉水溶液，來(lái)調(diào)節(jié)伴隨著因卣代醇環(huán)氧酶活性所導(dǎo)致的氯化物離子的游離的pH的降低，使得pH保持在8。在10分鐘的反應(yīng)期間內(nèi)，由為了將pH保持在8而投入的0.01當(dāng)量的氬氧化鈉水溶液的量，來(lái)算出氯化物離子生成量，算出卣代醇環(huán)氧酶活性(脫氯活性)(U)。1U的定義為相當(dāng)于在上述條件下每分鐘由DCP脫離l)imol氯化物離子的酶量，通過(guò)用在活性測(cè)定中使用的各粗酶液的活性和該活性除以在活性測(cè)定中使用的各粗酶液的液量，來(lái)算出各粗酶溶液的液活性。此外，假設(shè)通過(guò)上述超聲波處理使得菌體被完全破碎，通過(guò)用該液活性除以破碎前的(菌體懸濁液時(shí)刻的)菌濃度，算出菌體比活性。將對(duì)于各轉(zhuǎn)化體的菌體比活性的結(jié)果示于表1中。與表達(dá)野生型鹵代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK001和JM109/pSTT001相比較，表達(dá)第2個(gè)氨基酸殘基被取代成天冬酰胺的改良型鹵代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK003和JM109/pSTT003的各自的菌體比活性提高至大約12倍和大約5倍，此外，表達(dá)第2個(gè)氨基酸殘基被取代成賴氨酸的改良型鹵代醇環(huán)氧酶HheB(2nd)的JM109/pSTK002和JM109/pSTT002的各自的菌體比活性提高至大約25倍和大約17倍。即，就比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基(用序列號(hào)2表示的氨基酸序列的第2個(gè)氨基酸殘基)被取代成其他氨基酸的表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體而言，每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性比野生型卣代醇環(huán)氧酶高。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*JM109/pSTK002和JM109/pSTK003以JM109/pSTK001的菌體比活性為1來(lái)分別算出相對(duì)值，JM109/pSTT002和JM109/pSTT003以JM109/pSTT001的菌體比活性為1來(lái)分別算出相對(duì)值。實(shí)施例2由隨機(jī)變異所得到的改良型卣代醇環(huán)氧酶的篩選(1)面代醇環(huán)氧酶變異體文庫(kù)的制作為了獲得更有用的改良型卣代醇環(huán)氧酶，制作通過(guò)錯(cuò)配誘導(dǎo)PCR導(dǎo)入了隨機(jī)變異的卣代醇環(huán)氧酶基因變異體文庫(kù)，進(jìn)行來(lái)自該文庫(kù)的改良型卣代醇環(huán)氧酶及其基因的篩選。將在實(shí)施例1(2)制作的pSTT002用作模板，如下所示，進(jìn)行由錯(cuò)誤誘導(dǎo)PCR所得到卣代醇環(huán)氧酶基因變異體文庫(kù)的制作。制備lOO^il的以下表的組成的PCR反應(yīng)液。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>用作引物的Trc-03的序列如下所示。Trc-03:GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCC(序列號(hào)61:由25個(gè)核苷酸構(gòu)成，與pTrc99A的多克隆位點(diǎn)的下游區(qū)域?qū)?yīng))將制備好的lOO(il的PCR反應(yīng)液以每管lOpl分注于10個(gè)PCR反應(yīng)用管中，然后，分別將其供于以下的熱循環(huán)中。[表d]<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>將進(jìn)行了熱循環(huán)處理的IO管PCR反應(yīng)液混合，與實(shí)施例1(2)同樣地，進(jìn)行PCR反應(yīng)液的純化和限制性內(nèi)切酶消化(由NcoI和PstI進(jìn)行雙酶切消化)以及來(lái)自凝膠的純化、表達(dá)載體pTrc99A的限制性內(nèi)切酶消化(由Nco1和PstI進(jìn)行雙酶切消化)以及純化、連接反應(yīng)以及形質(zhì)轉(zhuǎn)換。將培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的菌落制成卣代醇環(huán)氧酶基因變異體文庫(kù)。(2)改良型卣代醇環(huán)氧酶的篩選(一次評(píng)價(jià))使用在實(shí)施例2(1)中制作的卣代醇環(huán)氧酶基因變異體文庫(kù)，按如下方式進(jìn)行改良型卣代醇環(huán)氧酶的篩選(一次評(píng)價(jià))。將含有終濃度為lmM的IPTG的LBAmp培養(yǎng)基分注于96孔板(深孔)，每個(gè)孔分注500|il,在各孔中接種卣代醇環(huán)氧酶基因變異體文庫(kù)的菌落。對(duì)96孔中的12個(gè)孔，接種用作評(píng)價(jià)對(duì)照的JM109/pSTT002菌落。在37。C、800rpm的條件下，培養(yǎng)大約16小時(shí)，然后，將得到的培養(yǎng)液中的20|il分注于蓋板式96孔板中。使用離心分離機(jī)(佐久間制作所50A-IVD)以及轉(zhuǎn)子(佐久間制作所HM-2HLS),將蓋板式96孔板供于離心分離(3000rpm,5分鐘，4°C)。除去培養(yǎng)液上清液后，將評(píng)價(jià)用反應(yīng)液1(400mMDCP,800mM(R)-CHBN,0.025%溴曱酚紫(BCP),50mMTris-硫酸(pH8))40|il添加于各孔中。懸浮后，在室溫下靜置，隨時(shí)間的變化來(lái)觀察反應(yīng)液所呈的顏色變化(伴隨著由卣代醇環(huán)氧酶活性所導(dǎo)致的氯化物離子的生成，pH值降低，由此，BCP的顏色從紫色變化為黃色)，選出比作為對(duì)照的JM109/pSTT002顯著更早發(fā)現(xiàn)變色的抹。對(duì)大約20000林的菌落進(jìn)行該一次評(píng)價(jià)，選出77抹。(3)改良型卣代醇環(huán)氧酶的篩選(二次評(píng)價(jià))對(duì)于實(shí)施2(2)中選出的一次評(píng)價(jià)選拔抹77才朱，按如下方式進(jìn)行二次評(píng)價(jià)。對(duì)于一次評(píng)價(jià)選拔林77抹，與實(shí)施例2(2)同樣地，進(jìn)行利用96孔板(深孔)的培養(yǎng)后，將得到的各培養(yǎng)液樣品((20^1，15(^1,lO)il，5fi1)x2)分注于蓋板式96孔板中。使用離心分離機(jī)(佐久間制作所50A-IVD)以及轉(zhuǎn)子(佐久間制作所HM-2HLS)，將蓋板式96孔板供于離心分離(3000rpm,5分鐘，4°C)。除去培養(yǎng)液上清液后，對(duì)于各培養(yǎng)液沉淀(菌體)，即實(shí)施例2(2)記載的評(píng)價(jià)用反應(yīng)液1和評(píng)價(jià)用反應(yīng)液2(400mMDCP，0.025%溴曱酚紫(BCP),50mMTris-硫酸(pH8))40|il添加于各孔中。懸浮后，在室溫下靜置，隨時(shí)間的變化來(lái)觀察反應(yīng)液所呈的顏色變化，選擇在添加有評(píng)價(jià)用反應(yīng)液1的體系中比作為對(duì)照的JM109/pSTT002顯著更早地發(fā)現(xiàn)變色的林，以及針對(duì)于各林的添加有評(píng)價(jià)用反應(yīng)液1體系中的呈色速度和添加有評(píng)價(jià)用反應(yīng)液2體系中的呈色速度之差少的林。對(duì)于一次評(píng)價(jià)選拔林77抹進(jìn)行該二次評(píng)價(jià)，選出20株。(4)二次評(píng)價(jià)選拔林的卣代醇環(huán)氧酶基因變異的確認(rèn)對(duì)于在實(shí)施例2(3)中選出的二次評(píng)價(jià)選拔林20林，解析各抹所具有的卣代醇環(huán)氧酶基因的變異。使用FlexiPrep(GE保健生物科學(xué))從實(shí)施例2(3)中得到的各抹培養(yǎng)液回收質(zhì)粒，使用毛細(xì)管DNA測(cè)序儀CEQ2000(貝克曼庫(kù)爾特)，按照附加的操作手冊(cè)，解析各質(zhì)粒中的卣代醇環(huán)氧酶基因的堿基序列。將其結(jié)果示于表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>(*)任一抹的卣代醇環(huán)氧酶都是第2個(gè)氨基酸殘基被取代成賴氨酸。另外，氨基酸變異的位置表示Hheb(2nd)(序列號(hào)2)中的位置。確認(rèn)出在進(jìn)行解析的20抹之中，12抹(#1007,#1009,#1014,#1019，#1023，#1024,#1034,#1037，#1038,#1066,#1068,#1072)表達(dá)了具有氨基S吏取代變異F136S的鹵代醇環(huán)氧酶，2抹(#1002,#1005)表達(dá)了具有氨基S吏取代變異T133A的鹵代醇環(huán)氧酶，2抹(#1020,#1055)表達(dá)了具有氨基酸取代變異V75A的卣代醇環(huán)氧酶，1抹(#1018)表達(dá)了具有氨基酸取代變異D199H的卣代醇環(huán)氧酶，1林(#1029)表達(dá)了具有氨基酸取代變異V25I的卣代醇環(huán)氧酶，1抹(#1057)表達(dá)了具有氨基酸取代變異H57R和87F的卣代醇環(huán)氧酶。各轉(zhuǎn)化體、它們所表達(dá)的囟代醇環(huán)氧酶以及編碼其的卣代醇環(huán)氧酶基因如表2所示命名。(5)改良型卣代醇環(huán)氧酶的篩選(三次評(píng)價(jià))對(duì)于在實(shí)施例2(3)中選拔的，在實(shí)施例2(4)中確認(rèn)出其卣代醇環(huán)氧酶基因變異的6株(JM109/pSTT002-V25I,JM109/pSTT002-H57R+Y87F，JM109/pSTT002-V75A，JM109/pSTT002隱T133A，JM109/pSTT002-F136S以及JM109/pSTT002-D199H)和作為對(duì)照的JM109/pSTT002共計(jì)7林，按如下方式進(jìn)行三次評(píng)價(jià)。在各沃色曼氏試驗(yàn)管中分注lml的LBAmp培養(yǎng)基，在各試驗(yàn)管中分別接種二次評(píng)價(jià)選拔林6林以及JM109/pSTT002的菌落。在37°C、210rpm的條件下，培養(yǎng)約8小時(shí)后，將得到的各培養(yǎng)液lOOfil接種于含有終濃度為lmM的IPTG的LBAmp培養(yǎng)基(500ml容積的三角燒瓶中的100ml),在37。C、210rpm的條件下，培養(yǎng)16小時(shí)。通過(guò)離心分離(3700xg，IO分鐘，4'C)從得到的各培養(yǎng)液100ml中回收各菌體，用20mMTris-硫酸緩沖液(pH8.0)進(jìn)行洗滌后，懸浮于相同緩沖液中使得菌濃度為12.5gDC/L。使用得到的菌體懸濁液，通過(guò)使用在實(shí)施例1(3)記載的方法中反應(yīng)液的DCP濃度為400mM的反應(yīng)液的方法，以及使用在實(shí)施例1(3)記載的方法中反應(yīng)液的DCP濃度為400mM并且添加(R)-CHBN至終濃度800mM的反應(yīng)液的方法，分別測(cè)定在不存在(R)-CHBN的條件下和存在(R)-CHBN的條件下的卣代醇環(huán)氧酶活性(脫氯活性)。將1U定義為相當(dāng)于在上述個(gè)條件下每分鐘由DCP脫離l)imol氯化物離子的酶量，通過(guò)用活性測(cè)定中使用的各菌體懸浮液的活性，除以該活性測(cè)定中所使用的各菌體懸浮液的液量，來(lái)算出各菌體懸浮液的液活性。進(jìn)一步，通過(guò)用該液活性除以菌濃度，算出各林的菌體比活性。將其結(jié)果示于表3中。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>對(duì)于JM109/pSTT002-H57R+Y87F、JM109/pSTT002-V75A、JM109/pSTT002-F136S以及JM109/pSTT002-D199H,確認(rèn)出不存在(R)-CHBN下的菌體比活性高于JM109/pSTT002的菌體比活性。另外，對(duì)于JM109/pSTT002-H57R+Y87F、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S以及JM109/pSTT002-D199H，確認(rèn)出存在(R)-CHBN下的菌體比活性高于JM109/pSTT002的菌體比活性。即，確認(rèn)出這些轉(zhuǎn)化體所表達(dá)的卣代醇環(huán)氧酶是在不存在(R)-CHBN下或存在(R)-CHBN下的帶來(lái)每個(gè)轉(zhuǎn)化體的卣代醇環(huán)氧酶活性提高的改良型卣代醇環(huán)氧酶。實(shí)施例3由部位特異性的隨機(jī)變異所得到的改良型卣代醇環(huán)氧酶的篩選(1)部位特異性的隨機(jī)變異體文庫(kù)的制作在實(shí)施例2(5)中檢測(cè)出的改良型卣代醇環(huán)氧酶之中，作為為每個(gè)轉(zhuǎn)化體帶來(lái)卣代醇環(huán)氧酶活性提高效果的氨基酸變異位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了卣代醇環(huán)氧酶Hheb(2nd)(序列號(hào)2)的第133號(hào)的蘇氨酸殘基(T133)、第136號(hào)的苯丙氨酸殘基(F136)以及第199號(hào)的天冬氨酸殘基(D199)。使這些位點(diǎn)的氨基酸隨機(jī)變異，嘗試獲得更有效的改良型卣代醇環(huán)氧酶。作為使T133、F136和D199變異成20個(gè)必需氨基酸的隨機(jī)引物，制作出以下的引物。MDH-14:CGCTGGCCTACAGCNNNGCGCGTTTCGCT(序列號(hào)62:由29個(gè)核苷酸構(gòu)成，對(duì)卣代醇環(huán)氧酶HheB(Ist)(序列號(hào)1)的第141號(hào)的氨基酸或者HheB(2nd)的第133號(hào)(序列號(hào)2)的氨基酸進(jìn)行編v嗎的密碼子為隨機(jī)堿基(NNN;N是腺噤呤、胸腺嘧咬、鳥噤呤或胞嘧咬中的任一種)的正義引物)MDH畫15:AGCGAAACGCGCNNNGCTGTAGGCCAGCG(序列號(hào)63:由29個(gè)核苷酸構(gòu)成，具有MDH-14的互補(bǔ)序列的反義引物)MDH-16:CAGCACGGCGCGTNNNGCTCAGCGCGGGT(序列號(hào)64:由29個(gè)核苷酸構(gòu)成，對(duì)卣代醇環(huán)氧酶HheB(Ist')(序列號(hào)1)的第144號(hào)的氨基酸或者HheB(2nd)(序列號(hào)2)的第136號(hào)的氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子為隨機(jī)堿基(NNN;N是腺噤呤、胸腺嘧啶、鳥。票呤或胞嘧啶中的任一種)的正義引物)MDH-17:ACCCGCGCTGAGCNNNACGCGCCGTGCTG(序列號(hào)65:由29個(gè)核苷酸構(gòu)成，具有MDH-16的互補(bǔ)序列的反義引物)MDH-18:CGACTGCCCGAGAGNNNGCGCTGCTCGCG(序列號(hào)66:由29個(gè)氨基酸構(gòu)成，對(duì)卣代醇環(huán)氧酶HheB(Ist)(序列號(hào)1)的第207號(hào)的氨基酸或者HheB(2nd)(序列號(hào)2)的第199號(hào)的氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子為隨機(jī)堿基(NNN;N是腺噪呤、胸腺嘧啶、鳥噤呤或胞嘧啶中的任一種)的正義引物)MDH畫19:CGCGAGCAGCGCNNNCTCTCGGGCAGTCG(序列號(hào)67:由29個(gè)核苷酸構(gòu)成，具有MDH-18的互補(bǔ)序列的反義引物)使用上述引物和模板pSTT002，通過(guò)QuickChageSite-DirectedMutagenesis試劑盒(STRATAGENE公司)進(jìn)行部位特異性的變異導(dǎo)入。反應(yīng)液組成(總量50^1)如下表所述(系列1以獲得T133隨機(jī)變異體為目的，系列2以獲得F136隨機(jī)變異體為目的，系列3以獲得D199隨機(jī)變異體為目的)。[表e]<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>各系列中使用的引物的組合如下所示。系列1:正義引物MDH-14，反義引物MDH-15系列2:正義引物MDH-16,反義引物MDH-17系列3:正義引物MDH-17,反義引物MDH-18對(duì)于上述組成的各反應(yīng)液，進(jìn)行下表的熱循環(huán)。[表q<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>按照附加的操作手冊(cè)，在進(jìn)行了熱循環(huán)處理的各反應(yīng)液中添加的DpnI,在37。C孵育1小時(shí)。使用DpnI處理液，與實(shí)施例2(1)同樣地進(jìn)行形質(zhì)轉(zhuǎn)換。將出現(xiàn)在培養(yǎng)i上的菌落制成卣代醇環(huán)氧酶基因部位特異的(T133，F(xiàn)136,D199)變異體文庫(kù)。(2)來(lái)自部位特異的隨機(jī)變異體的改良型卣代醇環(huán)氧酶的篩選由在實(shí)施例3(1)中制作的卣代醇環(huán)氧酶基因部位特異的(T133,F136,D199)變異體文庫(kù)，進(jìn)行更有用的改良型卣代醇環(huán)氧酶的篩選。將含有終濃度為lmM的IPTG的LBAmp培養(yǎng)基分注于96孔板(深孔)，每個(gè)孔分注500fil，對(duì)于實(shí)施例3(1)制作的卣代醇環(huán)氧酶基因部位特異的(T133,F136,D199)變異體文庫(kù)的各系列，將200個(gè)菌落接種于各孔中。與作為評(píng)價(jià)的對(duì)照所使用的JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-D199H以及JM109/pSTT002—并進(jìn)行接種。在37°C、800rpm的條件下培養(yǎng)約16小時(shí)，然后，將得到的培養(yǎng)液中的20pl分注于蓋板式96孔板中。使用離心分離機(jī)(佐久間制作所50A-IVD)以及轉(zhuǎn)子(佐久間制作所HM-2HLS),將蓋板式96孔板供于離心分離(3000rpm,5分鐘，4°C)。除去培養(yǎng)液上清液后，將實(shí)施例2(2)記載的評(píng)價(jià)用反應(yīng)液1和評(píng)價(jià)用反應(yīng)液3(200mM(S)-CHBN,0.025%溴曱酚紫(BCP)，50mMTris-硫酸(pH8))40pl添加于各孔中。懸浮后，在室溫下靜置，隨時(shí)間的變化來(lái)觀察反應(yīng)液所呈的顏色變化，選出在添加有評(píng)價(jià)用反應(yīng)液1的體系中比作為對(duì)照的JM109/pSTT002顯著更早發(fā)現(xiàn)變色的株、在添加有評(píng)價(jià)用反應(yīng)液3的體系中比作為對(duì)照的JM109/pSTT002顯著更早發(fā)現(xiàn)變色的株以及各抹的評(píng)價(jià)用反應(yīng)液1添加系中的呈色速度和評(píng)價(jià)用反應(yīng)液3添加系中的呈色速度的比例與作為對(duì)照的JM109/pSTT002的該比例不同的林。對(duì)各系列200菌落進(jìn)行該評(píng)價(jià)，從系列1'(T133隨機(jī)變異體文庫(kù))選出7林，從系列2(F136隨機(jī)變異體文庫(kù))選出7株，從系列3(D199隨機(jī)變異體文庫(kù))選出194^。(3)部位特異的隨機(jī)變異文庫(kù)選拔林的卣代醇環(huán)氧酶基因變異確認(rèn)對(duì)于來(lái)自在實(shí)施例3(2)中選拔的系列1(T133隨機(jī)變異體文庫(kù))的7抹、來(lái)自系列2(F136隨機(jī)變異體文庫(kù))的7抹、來(lái)自系列3(D199隨機(jī)變異體文庫(kù))的19林共計(jì)33林，對(duì)各林所具有的面代醇環(huán)氧酶基因的變異進(jìn)行59解析。使用FlexiPrep(GE保健生物科學(xué))從在實(shí)施例3(2)中得到的各林培養(yǎng)液回收質(zhì)粒，使用毛細(xì)管DNA測(cè)序儀CEQ2000(貝克曼庫(kù)爾特)，按照附加的操作手冊(cè)，對(duì)各質(zhì)粒中的卣代醇環(huán)氧酶基因的堿基序列進(jìn)行解析。將其結(jié)果示于表4中。[表4]系列轉(zhuǎn)化體氨基酸取代變異(*1)密碼子變異轉(zhuǎn)化體命名(*2)1T133-l,T133-2,T133-3，T133-4,T133-7T133CACG-TGT扁09/pSTT002-T133CT133畫5T133AACG-GCT~~—----—T133-6T133SACG-TCTJM109/pSTT002-T133S2F136-l，F(xiàn)136-6F136STTC-AGTF136曙3，F(xiàn)136-4，F(xiàn)136國(guó)5TTC畫TCAF136-2F136ATTC-GCGJM109/pSTT002-T133AF136-7F136WTTC-GCGJM109/pSTT002-T133W3D199-1，D199曙2，D199-3,D199-4,D199-5D199HGAC-CACD199-7,D199-8，D199-12D199EGAC畫GAGJM109/pSTT002畫D199ED199-11GAC-GAAD199-9D199QGAC-CAA.ivno(〕ps'n'()02-卜)199(、)D199-6,D199-10D199YGAC-TATJM109/pSTT002-D199YD199-9-5D199RGAC-CGC腿09/pSTT002-D199RD199-6-2D199TGAC-ACTJM109/pSTT002-D199TD199-4-3GAC-ACCD199-6-4D199SGAC-TCCJM109/pSTT002-D199SD199-13D199LGAC-CTGJM109/pSTT002-D199LD199-14D199MGAC-ATGJM109/pSTT002-D199MD199-15D199IGAC-ATCJM109/pSTT002-D199I*1任一抹的卣代醇環(huán)氧酶都是第2號(hào)氨基酸殘基都被置換成賴氨酸。另外，表示氨基酸殘基的位置的數(shù)字是表示HheB(2nd)(序列號(hào)2)的氨基^列中的氨基酸殘基的位置的數(shù)字。*2作為氨基酸取代變異體，對(duì)于已經(jīng)在實(shí)施例2或者本表中取得的變異體，不重新命名。60考慮到作為氨基酸取代變異的方式與已經(jīng)取得的酶的重復(fù)，將進(jìn)行了解析的33株所表達(dá)的卣代醇環(huán)氧酶以及對(duì)其進(jìn)行編碼的卣代醇環(huán)氧酶基因如表2所示命名。實(shí)施例4由改良型卣代醇環(huán)氧酶所進(jìn)行的(R)-CHBN合成反應(yīng)(1)改良型卣代醇環(huán)氧酶粗酶液的制備為了調(diào)查通過(guò)在實(shí)施例2和實(shí)施例3中獲得的改良型卣代醇環(huán)氧酶所合成的(R)-CHBN的光學(xué)純度，首先，由表達(dá)各改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體來(lái)制備粗酶液。對(duì)于表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的15林的轉(zhuǎn)化體抹(JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T136C、JM109/pSTT002畫T133S、JM109/pSTT002國(guó)F136A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-F136W、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199I、JM109/pSTT002-D199Y)以及作為對(duì)照的JM109/pSTT002的合計(jì)16林，按如下方式進(jìn)行三次評(píng)價(jià)。在各沃色曼氏試驗(yàn)管中分注lml的LBAmp培養(yǎng)基，在各試驗(yàn)管中分別接種二次評(píng)價(jià)選拔林15抹以及JM109/pST002的菌落。在37。C、210rpm的條件下，培養(yǎng)約8小時(shí)后，將得到的各培養(yǎng)液100^1接種于含有終濃度為lmM的IPTG的LBAmp培養(yǎng)基(500ml容積的三角燒瓶中的100ml)，在37。C、210rpm的條件下，培養(yǎng)16小時(shí)。通過(guò)離心分離(3700xg,IO分鐘，4。C)從得到的各培養(yǎng)液100ml中回收各菌體，用20mMTris-硫酸緩沖液(pH8.0)進(jìn)行洗滌后，懸浮于相同緩沖液中使得菌濃度為12.5gDC/L。使用超聲波破碎機(jī)VP-15S(taitec，日本)，在輸出控制4、DUTYCYCLE40%、PULS、TIMER=B模式10s的條件下，對(duì)得到的3ml的菌體懸濁液進(jìn)行冰浴，同時(shí)進(jìn)行10分鐘破碎。將破碎的菌體懸濁液供于離心分離(23000xg，5分鐘，4°C),提取上清液作為粗酶液。對(duì)于得到的各粗酶液，通過(guò)使用在實(shí)施例1(3)記載的方法中反應(yīng)液的DCP濃度為400mM的反應(yīng)液的方法，分別測(cè)定鹵代醇環(huán)氧酶活性(脫氯活性)。將1U定義為相當(dāng)于在上述個(gè)條件下每分鐘由DCP脫離ljLimol氯化物離子的酶量，通過(guò)用活性測(cè)定中使用的各菌體懸浮液的活性，除以該活性測(cè)61定中所使用的各菌體懸浮液的液量，來(lái)算出各菌體懸浮液的液活性。(2)分析方法在后述的通過(guò)改良型鹵代醇環(huán)氧酶合成(R)-CHBN的合成反應(yīng)中實(shí)施的反應(yīng)液中的DCP、ECH以及CHBN濃度分析以及生成CHBN的光學(xué)純度分析4姿如下方式進(jìn)4亍。<反應(yīng)液中的DCP、ECH以及CHBN濃度分析>反應(yīng)液中的DCP、ECH以及CHBN濃度分析通過(guò)逆相HPLC來(lái)進(jìn)行。逆相HPLC分析條件示于下表中。[表g]<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>將反應(yīng)終止液1OOpl利用上表記載的流動(dòng)相400(il稀釋混合之后，按照上表記載的分析條件進(jìn)行分析。預(yù)先使用濃度已知的DCP、ECH以及CHBN溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用該標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)求得反應(yīng)液中的DCP、ECH以及CHBN濃度。<生成CHBN的光學(xué)純度分析>生成CHBN的光學(xué)純度分析，在將CHBN酯化后，通過(guò)正相HPLC進(jìn)行。將正相HPLC分析條件示于下表。[表h]<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>加入與約400|il的反應(yīng)終止液等量的二異丙基醚(以下，有時(shí)稱作IPE)來(lái)進(jìn)行萃取。取出IPE層，加入少量的無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行攪拌。取出100plIPE,添加10pl的(R)-a-曱氧基-a-(三氟曱基)苯基乙酰氯(以下，有時(shí)稱作(R)-MTPA)以及40ili1的吡啶。在室溫下反應(yīng)一夜，然后，添加IPE,制成約400^1。加入400^1的1當(dāng)量的鹽酸，進(jìn)行2次萃取，然后，向提耳又的IPE層中加入400|Lil的飽和碳酸氫鈉水溶液，進(jìn)行2次萃取。向提取的IPE層中加入少量的無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行攪拌，然后，通過(guò)吸氣器使IPE層揮發(fā)。通過(guò)上表記載的流動(dòng)相使殘存物懸浮后，利用上述記載的分析條件進(jìn)行分析。由(R)-CHBN-(R)-MTPA酯和(S)-CHBN-(S)-MTPA酯的區(qū)域面積比算出各濃度，以本說(shuō)明書中說(shuō)明的要領(lǐng)(前述)算出CHBN的光學(xué)純度。(3)通過(guò)改良型卣代醇環(huán)氧酶進(jìn)行(R)-CHBN的合成使用在實(shí)施例4(1)中制備的來(lái)自各改良型囟代醇環(huán)氧酶表達(dá)轉(zhuǎn)化體的粗酶液，在氰化鉀的存在下，進(jìn)行由DCP合成CHBN的反應(yīng)。反應(yīng)液基本組成^(口下表戶斤示,反應(yīng)才示度(reactionscale)是2ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>反應(yīng)在2(TC進(jìn)行3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)實(shí)施例4(2)記載的分析條件，對(duì)反應(yīng)液中的DCP、ECH以及CHBN濃度和CHBN的光學(xué)純度進(jìn)行分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>在使用來(lái)自表達(dá)野生型面代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體林JM109/pSTT002的粗酶液的反應(yīng)中，CHBN只積累77mM，與此相對(duì)，在使用來(lái)自表達(dá)改良型鹵代醇環(huán)氧酶的各轉(zhuǎn)化體4朱的粗酶液的反應(yīng)中，積累了87149mM的CHBN。因而，顯示出這些改良型卣代醇環(huán)氧酶能夠比野生型囟代醇環(huán)氧酶積累高濃度的生成物。另外，使用來(lái)自表達(dá)野生型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體株JM109/pSTT002的粗酶液來(lái)合成的(R)-(:1忖的光學(xué)純度是91.6°/化6,與此相對(duì)，使用來(lái)自表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體才朱(JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T133C、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199I以及JM109/pSTT002-D199Y)的粗酶液來(lái)合成的(R)-CHBN的光學(xué)純度是93.l%ee~97.8%ee,確認(rèn)出通過(guò)這些改良型卣代醇環(huán)氧酶合成的(R)-CHBN與通過(guò)野生型囟代醇環(huán)氧酶合成的(R)-CHBN相比，光學(xué)純度高。因而，認(rèn)為這些改良型鹵代醇環(huán)氧酶對(duì)于DCP和/或中間體ECH的立體選擇性提高。實(shí)施例5氯化物離子存在下的改良型卣代醇環(huán)氧酶活性的確認(rèn)氯化物離子是通過(guò)囟代醇環(huán)氧酶由1,3-二卣代-2-丙醇和氰化物來(lái)合成4-卣代-3-羥基丁腈時(shí)的生成物，可以阻礙利用囟代醇環(huán)氧酶所進(jìn)行的該合成反應(yīng)。對(duì)在高濃度氯化物離子存在下的野生型卣代醇環(huán)氧酶和改良型商代醇環(huán)氧酶的卣代醇環(huán)氧酶活性進(jìn)行調(diào)查、比較。使用實(shí)施例4中制備的來(lái)自表達(dá)野生型面代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體4朱JM109/pSTT002的粗酶液和來(lái)自表達(dá)改良型鹵代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體林JM109/pSTT002-D199H的粗酶液，通過(guò)使用在實(shí)施例1(3)記載的方法中反應(yīng)液的DCP濃度為400mM的反應(yīng)液的方法，以及使用在實(shí)施例1(3)記載的方法中反應(yīng)液的DCP濃度為400mM并且添加氯化鈉至終濃度100mM或200mM的反應(yīng)液的方法，測(cè)定在不存在氯化鈉的條件下(OmM)以及存在氯化鈉的條件下(100mM和200mM)的卣代醇環(huán)氧酶活性(脫氯活性)，以來(lái)自各轉(zhuǎn)化體的粗酶液在不存在氯化鈉的條件下(OmM)的該活性為100%，算出相對(duì)活性值。將其結(jié)果示于表6中。來(lái)自粗酶液的轉(zhuǎn)化體反應(yīng)液中的氯化鈉濃度[mM]0100200JM109/pSTT002-D199H100%91%78%JM109/pSTT002100%44%德65來(lái)自表達(dá)野生型囟代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體林JM109/pSTT002的粗酶液的卣代醇環(huán)氧酶活性，在存在1OOmM和200mM的氯化物離子的條件下，分別降低至44%和40%,與此相對(duì)，來(lái)自表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體抹JM109/pSTT002-D199H的粗酶液的卣代醇環(huán)氧酶活性，在存在100mM和200mM的氯化物離子的條件下，分別顯示出91%和78%的殘存活性。因而，確認(rèn)出該改良型卣代醇環(huán)氧酶與野生型卣代醇環(huán)氧酶相比，相對(duì)于氯化物離子所引起的反應(yīng)阻礙的耐性得到提高。實(shí)施例6表達(dá)改良型由代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體(紅球菌屬細(xì)菌宿主)的制作及其評(píng)價(jià)(1)表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體(紅球菌屬細(xì)菌宿主)的制作制作表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體(紅球菌屬細(xì)菌宿主)，對(duì)該轉(zhuǎn)化體進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先，以日本特開2007-49932號(hào)記載的表達(dá)質(zhì)粒pJHB057為模板，制作出分別導(dǎo)入有如下變異的改良型卣代醇環(huán)氧酶表達(dá)質(zhì)粒，所述變異為卣代醇環(huán)氧酶HheB(Ist)(序列號(hào)1)的第141號(hào)的蘇氨酸殘基變?yōu)楸彼岬娜〈儺?T141A)，第144號(hào)的苯丙氨酸殘基變?yōu)榻z氨酸的取代變異(F144S)以及第207號(hào)的天冬氨酸殘基變?yōu)榻M氨酸的取代變異(D207H)。作為在變異導(dǎo)入中所使用的引物，制作以下引物。MDH-05:CGCTGGCCTACAGCGCGGCGCGTTTCGCT(序列號(hào)68:由29個(gè)核苷酸構(gòu)成，對(duì)卣代醇環(huán)氧酶HheB(Ist)的第141號(hào)的氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子為GCG(編碼丙氨酸)的正義引物)MDH-06:AGCGAAACGCGCCGCGCTGTAGGCCAGCG(序列號(hào)69:由29個(gè)核苦酸構(gòu)成，具有MDH-05的互補(bǔ)序列的反義引物)MDH-07:CAGCACGGCGCGTTCCGCTCAGCGCGGGT(序列號(hào)70:由29個(gè)核苷酸構(gòu)成，對(duì)鹵代醇環(huán)氧酶HheB(Ist)的第144號(hào)的氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子為TCC(編碼絲氨酸)的正義引物)MDH-08:ACCCGCGCTGAGCGGAACGCGCCGTGCTG(序歹寸號(hào)71:由29個(gè)核苷酸構(gòu)成，具有MDH-07的互補(bǔ)序列的反義引物)MDH-09:CGACTGCCCGAGAGCACGCGCTGCTCGCG(序列號(hào)72:由29個(gè)核苷酸構(gòu)成，對(duì)鹵代醇環(huán)氧酶他eB(Ist)的第207號(hào)的氨基酸進(jìn)行編碼的密碼子為CAC(編碼組氨酸)的正義引物)MDH-10:CGCGAGCAGCGCGTGCTCTCGGGCAGTCG(序列號(hào)73:由29個(gè)核香酸構(gòu)成，具有MDH-09的互補(bǔ)序列的反義引物)4吏用上述引物和沖莫才反pJHB057，通過(guò)QuickChangeSite-DirectedMutagenesis試劑盒(STRATAGEN公司)進(jìn)行部位特異的變異導(dǎo)入。反應(yīng)液組成(總量50^1)如下表所示(系列1以獲得T141A變異體為目的，系列2以獲得F144S變異體為目的，系列3以獲得D207H變異體為目的)。<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>各系列中使用的引物的組合如下所示。系列1:正義引物MDH-05,反義引物MDH-06系列2:正義引物MDH-07,反義？1物MDH-08系列3:正義引物MDH-09,反義引物MDH-IO對(duì)于上述組成的各反應(yīng)液，進(jìn)行下表的熱循環(huán)。<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>Jl/pJHB057畫D207H。(2)表達(dá)改良型卣代醇環(huán)氧酶的轉(zhuǎn)化體(紅球菌屬細(xì)菌宿主)的評(píng)價(jià)在實(shí)施例6中得到的3種轉(zhuǎn)化體(Jl/pJHB057-T141A、Jl/pJHB057-F144S以及Jl/pJHB057-D207H)的評(píng)價(jià)按照如下方式進(jìn)行。將該3抹轉(zhuǎn)化體以及作為對(duì)照的Jl/pJHB057的共計(jì)4抹，分別接種于100ml的GGPK培養(yǎng)基(1.5%葡萄糖，1%谷氨酸鈉，0.1%酵母粉，0.05%K2HPO4,0.05%KH2P04,0.05%MgS(V7H2O,卡那霉素50[ig/ml,pH7.2),在30。C振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。通過(guò)離心分離(3700xg,IO分鐘，4°C)從得到的各培養(yǎng)液100ml中回收各菌體，用20mMTris-硫酸緩沖液(pH8.0)進(jìn)行洗滌后，懸浮于相同緩沖液中使得菌濃度為12.5gDC/L。使用超聲波破碎機(jī)VP-15S(taitec,日本)，在輸出控制4、DUTYCYCLE40%、PULS、TIMER=B模式10s的條件下，對(duì)得到的3ml的菌體懸濁液進(jìn)行冰浴，同時(shí)進(jìn)行10分鐘破碎。將破碎的菌體懸濁液供于離心分離(23000xg,5分鐘，4°C),提取上清液作為粗酶液。對(duì)于得到的各粗酶液，通過(guò)使用在實(shí)施例1(3)記載的方法中反應(yīng)液的DCP濃度為400mM的反應(yīng)液的方法，分別測(cè)定卣代醇環(huán)氧酶活性(脫氯活性)。將1U定義為相當(dāng)于在上述個(gè)條件下每分鐘由DCP脫離l|imol氯化物離子的酶量，通過(guò)用活性測(cè)定中使用的各菌體懸浮液的活性，除以該活性測(cè)定中所使用的各菌體懸浮液的液量，來(lái)算出各菌體懸浮液的液活性。進(jìn)一步，通過(guò)用該液活性除以蛋白質(zhì)濃度，來(lái)算出各株的每單位蛋白質(zhì)的比活性。蛋白質(zhì)濃度使用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析儀(Bio-Rad)來(lái)測(cè)定。將其結(jié)果示于表7中。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>分別導(dǎo)入有如下變異的改良型卣代醇環(huán)氧酶，是即使在以紅球菌屬細(xì)菌為宿主的情況下，也能為每個(gè)轉(zhuǎn)化體帶來(lái)卣代醇環(huán)氧酶活性提高的改良型卣代醇環(huán)氧酶，所述變異為HheB(Ist)(序列號(hào)1)的第141號(hào)的蘇氨酸殘基變?yōu)楸彼岬娜〈儺?T141A),第144號(hào)的苯丙氨酸殘基變?yōu)榻z氨酸的取代變異(F144S)以及第207號(hào)的天冬氨酸殘基變?yōu)榻M氨酸的取代變異(D207H)。序列表自由文字序列號(hào)328:變異肽序列號(hào)3156:變異DNA序列號(hào)5161:合成DNA序列號(hào)62:合成DNA序列號(hào)62:n表示a、c、g或t(存在位置1517)序列號(hào)63:合成DNA序列號(hào)63:n表示a、c、g或t(存在位置13~15)序列號(hào)64:合成DNA序列號(hào)64:n表示a、c、g或t(存在位置14-16)序列號(hào)65:合成DNA序列號(hào)65:n表示a、c、g或t(存在位置1416)序列號(hào)66:合成DNA序列號(hào)66:n表示a、c、g或t(存在位置15~17)序列號(hào)67:合成DNA序列號(hào)67:n表示a、c、g或t(存在位置13~15)序列號(hào)6873:合成DNA序列號(hào)74:Xaa表示任意的氨基酸殘基(存在位置213、15、16、19)序列號(hào)75:Xaa表示任意的氨基酸殘基(存在位置2、58、10)序列號(hào)7683:變異肽序列號(hào)8491:變異DNA權(quán)利要求1.一種改良型鹵代醇環(huán)氧酶，其特征在于，其包含對(duì)野生型鹵代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入從以下的(A)～(D)中選擇的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基酸序列，所述野生型鹵代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列包含以下的氨基酸序列IS-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15(序列號(hào)74)，其中，S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，α1～α15分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基，以及以下的氨基酸序列IIL-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21(序列號(hào)75)，其中，L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示谷氨酸殘基，β16-β21分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基，(A)比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(B)α14殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(C)α15殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(D)β21殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異。2.—種改良型卣代醇環(huán)氧酶，其特征在于，其包含對(duì)野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入從以下的(E)(H)中選擇的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基酸序列，所述野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基S吏序列包含以下的氨基酸序列I:S-al陽(yáng)a2-a3-a4-a5畫a6-a7-a8-a9畫al0-all-al2陽(yáng)Y-al3-al4-A-R-a15(序歹'J號(hào)74),其中，S表示絲氨酸殘基，Y表示酪氨酸殘基，A表示丙氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，alal5分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基，以及以下的氨基酸序列II:L-卩16-R-L-卩17-卩18-卩19-卩20-E-卩21(序列號(hào)75),其中，L表示亮氨酸殘基，R表示精氨酸殘基，E表示谷氨酸殘基，pi6-(321分別獨(dú)立地表示相同或不同的任意氨基酸殘基，(E)比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基被取代成賴氨酸或天冬酰胺的氨基酸變異；(F)al4殘基被取代成丙氨酸、半胱氨酸或絲氨酸的氨基酸變異；(G)al5殘基被取代成丙氨酸、絲氨酸或色氨酸的氨基酸變異；(H)(321殘基被取代成谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或曱硫氨酸的氨基酸變異。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所記載的改良型囟代醇環(huán)氧酶，其中，所述野生型卣代醇環(huán)氧酶是分類于組B的酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所記載的改良型卣代醇環(huán)氧酶，其中，所述野生型卣代醇環(huán)氧酶是來(lái)自棒狀桿菌(Corynebacterium)屬細(xì)菌或分枝桿菌(Mycobacterium)屬纟田菌的酶。5.才艮據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所記載的改良型卣代醇環(huán)氧酶，其中，所述野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列是序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的氨基酸序列。6.根據(jù)權(quán)利要求1~5的任一項(xiàng)所記載的改良型離代醇環(huán)氧酶，其包含對(duì)所述野生型卣代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入從以下的(i)(iii)中選擇的任一個(gè)或多個(gè)氨基酸變異而得到的氨基酸序列，其中，(i)從除了比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基、a14殘基、a15殘基以及P21殘基以外的氨基酸殘基中選擇的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基被取代成其他氨基酸的氨基酸變異；(ii)從除了比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近一個(gè)殘基的氨基酸殘基、氨基酸序列I所含的氨基酸殘基以及氨基酸序列II所含的氨基酸殘基以外的氨基酸殘基中選擇的1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失的氨基酸變異；(iii)在比起始氨基酸殘基離C末端側(cè)近兩個(gè)以上殘基的氨基酸殘基構(gòu)成的區(qū)域中的由氨基酸序列I和氨基酸序列II構(gòu)成的區(qū)域以外的區(qū)域中，插入l個(gè)或數(shù)個(gè)任意氨基酸殘基的氨基酸變異。7.編碼權(quán)利要求16的任一項(xiàng)所記載的改良型卣代醇環(huán)氧酶的基因。8.含有權(quán)利要求7所記載的基因的重組載體。9.將權(quán)利要求8所記載的重組載體導(dǎo)入宿主而得到的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體。10.培養(yǎng)權(quán)利要求9所記載的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體而得到的培養(yǎng)物。11.從權(quán)利要求IO所記載的培養(yǎng)物中提取的改良型囟代醇環(huán)氧酶。12.—種改良型卣代醇環(huán)氧酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求9所記載的轉(zhuǎn)化體或轉(zhuǎn)導(dǎo)體，從得到的培養(yǎng)物中提取改良型卣代醇環(huán)氧酶。13.—種表卣代醇的制造方法，其特征在于，通過(guò)使權(quán)利要求1~6和11的任一項(xiàng)所記載的改良型囟代醇環(huán)氧酶和/或^L利要求10所記載的培養(yǎng)物與1，3-二卣代-2-丙醇接觸，來(lái)生成表卣代醇。14.一種4-面代-3-羥基丁腈的制造方法，其特征在于，在氰化物的存在下，使權(quán)利要求1~6和11的任一項(xiàng)所記載的改良型鹵代醇環(huán)氧酶和/或權(quán)利要求10所記載的培養(yǎng)物與1，3-二卣代-2-丙醇或表卣代醇接觸，從而生成4-卣代-3-羥基丁腈。全文摘要本發(fā)明提供一種工業(yè)上有用的改良型鹵代醇環(huán)氧酶、其制造方法以及使用該酶制造表鹵代醇或4-鹵代-3-羥基丁腈的制造方法。本發(fā)明的改良型鹵代醇環(huán)氧酶是包含對(duì)野生型鹵代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列導(dǎo)入特定的氨基酸取代變異而得到的氨基酸序列的酶，其中，所述野生型鹵代醇環(huán)氧酶的氨基酸序列包括規(guī)定的氨基酸序列I和氨基酸序列II。文檔編號(hào)C12N15/60GK101636497SQ20088000699公開日2010年1月27日申請(qǐng)日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日發(fā)明者佐藤榮治,湯不二夫,瀧川優(yōu)彌,渡邊文昭,秋山卓理申請(qǐng)人:三菱麗陽(yáng)株式會(huì)社