專(zhuān)利名稱(chēng)：用于豬繁殖與呼吸綜合征(prrs)病毒生長(zhǎng)的非猿猴細(xì)胞的制作方法
用于豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)病毒生長(zhǎng)的非猿猴細(xì)胞
相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求以2007年1月12日提交的流水號(hào)為US 60884782和2007年8月17日提交的流水號(hào)為US 60956597的申請(qǐng)為優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)，這些申請(qǐng)中不與本文矛盾的內(nèi)容均通過(guò)引用的方式納入本文。
政府資助的研究和開(kāi)發(fā)的聲明
無(wú)
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是豬的一種病毒疾病，該疾病與曾經(jīng)重創(chuàng)豬肉產(chǎn)業(yè)的任何現(xiàn)有的或以前的感染性疾病相比，每年都備造成最大的經(jīng)濟(jì)損失。還被稱(chēng)為"神秘豬病(Mystery Swine Disease)，，、豬不育與呼吸綜合征(SIRS)及"藍(lán)耳病"的PRRS最初于1987年在北美及于1990年在歐洲被首次檢測(cè)到。從那時(shí)起，PRRS開(kāi)始在4^界除澳大利亞外的豬生產(chǎn)區(qū)成為豬產(chǎn)業(yè)的一個(gè)主要威脅。PRRS對(duì)幼仔和新生小豬的影響最顯著。在感染的母豬的一窩幼仔中有多達(dá)20-30%的小豬為死胎，在感染的獸群中多達(dá)80%的小豬會(huì)在斷奶前死亡。因此，該疾病會(huì)對(duì)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生破壞性的后果(見(jiàn)Chladek等人的美國(guó)專(zhuān)利5476778)。 一項(xiàng)部分由國(guó)家豬肉委員會(huì)(National Pork Board)資助的研究中指出，僅在美國(guó)由PRRS造成的損失就超過(guò)5.6億美元(Neumann EJ et al.， 2005 )。
對(duì)PRRS的研究及診斷和治療方法的開(kāi)發(fā)(包M疫苗和疫苗生產(chǎn)技術(shù))受到體外培養(yǎng)PRRS病毒的選擇方案的有限可用性的限制。以前，現(xiàn)有技術(shù)已知猿猴細(xì)胞是用于維持PRRS生長(zhǎng)以進(jìn)行疫苗生產(chǎn)的僅一可用細(xì)胞系類(lèi)型。猿猴細(xì)胞系MA-104及相關(guān)衍生物(如MARC-145)可能代表迄今為止實(shí)際應(yīng)用于支持PRRS病毒體外復(fù)制的唯一選擇。
本發(fā)明對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)在于，提供用于操作PRRS病毒的其他選擇，例如可支持PRRS生長(zhǎng)的非猿猴細(xì)胞的實(shí)施方案。
其他的結(jié)果不如意的方法已經(jīng)被用于開(kāi)發(fā)用于PRRSV生長(zhǎng)的可選
4方案。在一種方法中，豬肺泡巨噬細(xì)胞可用于PRRSV生長(zhǎng)；然而，分離自不同豬的細(xì)胞中高水平的固有變異性被認(rèn)為是一個(gè)缺點(diǎn)(見(jiàn)Vincent etal.， 2005; Bautista et al.， 1993 )。在另 一種方法中，Weingartl等A^將從12周齡豬獲得的原代豬肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染后建立了豬單骨髓細(xì)胞系。經(jīng)測(cè)試這些細(xì)胞不能支持PRRSV的復(fù)制(Weingartl et al.， 2002， Journal ofVirological Methods 104:203-216 )。相反，本發(fā)明令人吃驚地尤其公開(kāi)了這樣的發(fā)現(xiàn)，即來(lái)自胎豬的某些細(xì)胞確實(shí)能夠支持PRRSV生長(zhǎng)。
利用本發(fā)明所惠及的技術(shù)應(yīng)用包括應(yīng)用研究方面，例如除了能夠在基礎(chǔ)研究水平研究PRRS病毒的生長(zhǎng)之外，還有獸醫(yī)疫苗的生產(chǎn)。PRRSV疫苗(其為改良的活疫苗或滅活的死疫苗)可通過(guò)本發(fā)明的細(xì)胞和細(xì)胞系產(chǎn)生。用于培養(yǎng)這種具體病毒的工具和相關(guān)的方法在生成用于診斷應(yīng)用的材料的情形中也是重要。在意欲強(qiáng)調(diào)科學(xué)突破的類(lèi)似歷史情形中，由于體外培養(yǎng)病毒困難及缺乏可選方案，操作人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)的能力普遍受到限制。在研究及生成HIV的診斷及潛在疫苗的能力方面的關(guān)鍵進(jìn)步歸因于這樣的轉(zhuǎn)折性事件，即能夠在體外成功地培養(yǎng)該病毒；見(jiàn)Gallo RC， 2002， Historical essay. The early years ofHIV/AIDS; Science 298(5599):1728-30。
控制PRRS疾病的主要局限被認(rèn)為是在于疫苗技術(shù)的可用性和有效性。因此用于PRRS病毒生長(zhǎng)的創(chuàng)新細(xì)胞和方法的貢獻(xiàn)可表示以下能力方面的顯著進(jìn)步即操作PRRS病毒，開(kāi)發(fā)其他的及/或改良的疫苗技術(shù)，以及解決PRRS疾病的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在廣義上涉及能夠繁殖PRRS病毒的非猿猴細(xì)胞及使用這種細(xì)胞繁殖PRRS病毒的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 一種能夠繁殖PRRS病毒的分離的非猿猴細(xì)胞，其中所述非猿猴細(xì)胞獲自動(dòng)物個(gè)體并被培養(yǎng)至少5個(gè)傳代。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種能夠被PRRS病毒感染和/或繁殖PRRS病毒的分離的豬胎肺細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為肺泡巨噬細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在培養(yǎng)基中繁殖至少5個(gè)傳代。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在培養(yǎng)物中繁殖至少10個(gè)傳代。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在培養(yǎng)物中繁殖至少20和/或50個(gè)傳代。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了獲自豬胎肺的分離的原代細(xì)胞或細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述胎兒具有約30天至約90天的妊娠齡。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為肺泡巨噬細(xì)胞或包含至少一種肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為巨噬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞系或其祖細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在本文中被命名為ZMAC的細(xì)胞或細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在本文中被命名為FBAL-A的細(xì)胞或細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection)指定為ATCC專(zhuān)利保藏編號(hào)PTA-8764的保藏物為代表的細(xì)胞或其衍生物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有支持PRRSV生長(zhǎng)能力的本文所述細(xì)胞的永生化細(xì)胞變體或衍生物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種生成PRRS病毒子代的方法，包括
a) 提供一種能夠復(fù)制PRRS病毒的分離或純化非猿猴細(xì)胞，其中所述非猿猴細(xì)胞被培養(yǎng)至少5個(gè)傳代；
b) 將所述非猿猴細(xì)胞暴露于所述PRRS病毒；并且
c) 使得所述PRRS病毒在所述細(xì)胞中復(fù)制；
從而生成PRRS病毒的子代。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非猿猴細(xì)胞獲自一個(gè)動(dòng)物個(gè)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括收獲所述培養(yǎng)的PRRSV。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生PRRS疫苗的方法，包括提供PRRSV的一種改良活病毒(MLV)毒林，并且在一種能夠復(fù)制所述PRRSVMLV林的分離或純化非猿猴細(xì)胞中培養(yǎng)所述MLV毒林。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非猿猴細(xì)胞為巨噬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞系或其祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非猿猴細(xì)胞為豬細(xì)胞或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非猿猴細(xì)胞為豬肺泡巨噬細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非猿猴細(xì)胞為豬肺泡巨噬細(xì)胞原代細(xì)胞、細(xì)胞群、其變體或衍生物。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞以被^命名為ZMAC-l、 FBAL-A的細(xì)胞或者以美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心指定為ATCC專(zhuān)利保藏編號(hào)PTA-8764的保藏物或其衍生物為代表。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，包括被命名為
ZMAC-1或者以美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心指定為ATCC專(zhuān)利保藏編號(hào) PTA-8764的保藏物或其衍生物為代表的細(xì)胞或細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供了一種包含被命名為FBAL-A的細(xì)胞或細(xì)胞系的組合物。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種從豬胎肺中分離細(xì)胞的方法， 包括提供一個(gè)豬胎兒受試材料；從所迷受試材料中獲得包含細(xì)胞的支氣管 肺泡灌洗樣品；并且從所述樣品中分離細(xì)胞組分；從而分離所述細(xì)胞。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含細(xì)胞的樣品為支氣管肺泡灌洗樣品。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述樣品為任選地被浸軟及/或勻漿化處理的經(jīng)切割的組織樣
口
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)病毒的方法，包括(a) 從豬胎肺中分離細(xì)胞；(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞；并且(c)將所述細(xì)胞與所述 病毒接觸以使病毒復(fù)制；從而培養(yǎng)所述病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病 毒為PRRS病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒為減毒的PRRS病毒或 者PRRS病毒野分離林。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述野分離林是強(qiáng)毒的或者 天然低毒或無(wú)毒的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)包括傳代所述細(xì)胞至少 5個(gè)傳代并且/或者連續(xù)培養(yǎng)所述細(xì)胞至少10天。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)并分離PRRSV的方法， 所述方法包括將所述病毒接種于含有血清的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的非猿猴 細(xì)胞培養(yǎng)物上，并且孵育所述經(jīng)接種的細(xì)胞直至生成PRRSV子代病毒材 料。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述PRRSV為ATCC-VR2332。在一個(gè) 具體的實(shí)施方案中，所述非猿猴細(xì)胞在之前已經(jīng)在培養(yǎng)基中被培養(yǎng)至少5 個(gè)傳代。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述非猿猴細(xì)胞在之前已經(jīng)被培養(yǎng) 至少10、 20和/或50個(gè)傳代。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 一種培養(yǎng)PRRSV的方法，包括(a) 將PRRSV接種于在之前已經(jīng)被培養(yǎng)至少10、 20和/或50個(gè)傳代的非猿猴 細(xì)胞上；并且(b)孵育所述經(jīng)接種的非猿猴細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述非猿猴細(xì)胞為豬肺泡巨噬細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非猿猴細(xì)胞 獲自豬胎肺樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述PRRSV來(lái)自感染該病毒的豬 組織勻漿。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括孵育所述培養(yǎng)物直至一個(gè)固 定的時(shí)間段及/或直至出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述固定 的時(shí)間段為約16小時(shí)-約72小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 一種包含滅活PRRSV的免疫原性 組合物，其中所述滅活病毒通過(guò)這樣的方法形成，即所述方法包括在非猿 猴細(xì)胞上培養(yǎng)PRRSV，之后滅活所述病毒，其中所述非猿猴細(xì)胞在之前 已經(jīng)凈皮培養(yǎng)至少10、 20和/或50個(gè)傳代。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)病毒 包括(a)將豬不育與呼吸綜合征病毒接種于所述細(xì)胞上；并且(b)在 約34。C-約37'C下孵育所述接種的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)所述病 毒涉及一種包含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述滅活病毒為 滅活的PRRSV毒株ATCCVR-2332。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫原性 組合物還包括佐劑和/或可藥用的載體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含培養(yǎng)于本發(fā)明細(xì)胞中的病 毒的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒為PRRS病毒(其可包括來(lái)自 PRRS病毒的病毒)。
在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的細(xì)胞與生長(zhǎng)因子組合 物相接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)因子組合物包含巨噬細(xì)胞集落刺 激因子(MCSF)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生長(zhǎng)因子組合物包含粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 一種包含非猿猴細(xì)胞培養(yǎng)物中的或 來(lái)自非猿猴細(xì)胞培養(yǎng)物的PRRSV的組合物；其中所述非猿猴細(xì)胞在之前 已經(jīng)^皮培養(yǎng)至少5、 10、 20和/或50個(gè)傳代，并且/或者來(lái)自于源自胎豬肺 樣品的豬肺泡巨噬細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，PRRSV為難養(yǎng)的、非紅細(xì) 胞凝聚的包膜RNA病毒，并且能夠使豬感染PRRS。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述組合物的病毒滴度為約103-約107 TCIDs。 /ml。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述病毒滴度的上限至約109 TCIDs。 /ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述 PRRSV為MLV毒林。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述PRRSV來(lái)自包含來(lái)自 于感染PRRS的豬的組織勻漿的接種物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接種物 來(lái)自中和的組織勻漿，并且所述中和的組織勻漿的獲得是通過(guò)以針對(duì)選自 以下豬病的抗體血清中和所述組織勻漿嗜血桿菌(hemophilus )、布氏 菌病(brucellosis )、鉤端螺旋體病(leptospira )、細(xì)小病毒病(parvovirus )、 偽狂犬病(pseudorabies )、腦心肌炎(encephalomyocarditis )、腸道病毒、 豬流感或它們的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接種物來(lái)自所述組織勻 漿的過(guò)濾勻漿，所述過(guò)濾的勻漿包含大小不大于約0.45微米的顆粒。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種非猿猴細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為
8豬細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞來(lái)自豬肺。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述細(xì)胞來(lái)自豬胎肺。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述豬胎肺
來(lái)自約20日至約80日孕齡的豬胎。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述 豬胎具有約SO日至約70日孕齡。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞獲自豬胎 的肺灌洗液樣品。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為豬肺泡巨噬細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選地選擇非粘附細(xì)胞;S7或相對(duì)低粘附的細(xì)胞。 在一個(gè)實(shí)施方案中，從豬胎肺獲得混合的細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方案中，在 所述混合細(xì)胞群中有至少兩種細(xì)胞類(lèi)型，包括巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞系的前
體細(xì)胞，這種細(xì)胞是自我更新的并且是相對(duì)低分化的或未分化的；以及巨
噬細(xì)胞/單核細(xì)胞系的分化細(xì)胞，這種細(xì)胞是相對(duì)高分化的。在一個(gè)實(shí)施 方案中，在所述混合細(xì)胞群中有至少第三種細(xì)胞類(lèi)型，該類(lèi)型為飼養(yǎng)細(xì)胞 類(lèi)型/輔助細(xì)胞類(lèi)型。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三種細(xì)胞類(lèi)型來(lái)自?xún)?nèi)源 性樣品，或者是外源添加的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞和/或細(xì)胞群可以被描述為具有內(nèi) 皮細(xì)胞前體的群，即所述內(nèi)皮細(xì)胞前體可在合適的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì) 胞。例如，所述培養(yǎng)條件可以包括塑料器皿的類(lèi)型;^/或表面處理。 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以有一部分細(xì)胞表達(dá)CD90和CD117。在一個(gè) 具體的實(shí)施方案中，該部分為約30%或至少30%。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的非猿猴細(xì)胞被用于產(chǎn)生抗豬繁殖與呼吸 綜合征病毒(PRRSV)的疫苗。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞或細(xì)胞系能夠支持野生型或?qū)嶒?yàn)室 毒抹型的PRRS病毒的生長(zhǎng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明支持PRRS 改良的活病毒的生長(zhǎng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述病毒抹對(duì)應(yīng)于或來(lái) 自 Boehringer Ingelheim的產(chǎn)品系列，例如Ingelvac PRRS和 R印roCyc⑧PRRS豬疫苗。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述病毒林對(duì)應(yīng) 于或來(lái)自Schehng-Ploug產(chǎn)品系列的Prime-Pac PRRS疫苗。在一個(gè)具 體的實(shí)施方案中，所述病毒是用于美國(guó)獸醫(yī)生物產(chǎn)品許可的代碼為 19S5.20的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗(繁殖型、滅活病毒)的(United States Veterinary Biological Product License (03/29/96) for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vaccine, Reproductive Form, Killed Virus, Code 19S5.20) (1996年3月29 )的分離林。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述PRRS病毒為減毒病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述PRRS病毒為野分離林。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述野分離株是強(qiáng)毒毒抹或者天然低 毒或無(wú)毒的毒林。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法適合于被用
于制造活疫苗、減毒疫苗或滅活疫苗的PRRS病毒材料的生長(zhǎng)。
在本發(fā)明細(xì)胞或細(xì)胞系的一個(gè)實(shí)施方案中，用非永生的或已經(jīng)永生化
的細(xì)胞或細(xì)胞系的起始材料可建立永生化的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，
使用一種或多種本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化技術(shù)或其他永生化技術(shù)可建立永生化
的細(xì)胞系或細(xì)胞系。
在本發(fā)明細(xì)胞或細(xì)胞系的一個(gè)實(shí)施方案中，可建立一個(gè)或多個(gè)亞克
隆。例如，依照常規(guī)技術(shù)例如通過(guò)對(duì)培養(yǎng)物的有限稀釋來(lái)分離并繁殖亞克隆。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將原代細(xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)至少5個(gè)傳 代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將原代細(xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)至少10個(gè)傳代、至 少20個(gè)傳代t或至少50個(gè)傳代。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將原代 細(xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)至少l周。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將原代細(xì)胞或 細(xì)胞系培養(yǎng)至少2周。在其他實(shí)施方案中，將原代細(xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)至少 4周、至少8周及或至少16周。
在一個(gè)實(shí)施方案中， 一種組合物例如細(xì)胞或細(xì)胞系-故分離或被純化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)的方法，所述方法通過(guò)在組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)所述病毒，至其 量足以保護(hù)動(dòng)物免受PRRS、以診斷PRRS或者以識(shí)別PRRSV亞基或重 組體產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，包括將PRRSV接種于非猿猴細(xì)胞或細(xì)胞系的組織 培養(yǎng)物上并收獲所培養(yǎng)的病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞或細(xì)胞系是 豬的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞或細(xì)胞系為豬肺泡巨噬細(xì)胞。在一個(gè) 實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含依照所述方法產(chǎn)生的PRRSV的組織 培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備用于保護(hù)豬免受 PRRS的有效疫苗的方法，包括提供如本文所述的PRRSV，從所述組織 培養(yǎng)細(xì)胞釋放PRRSV，并且通過(guò)稀釋、濃縮或提取來(lái)調(diào)節(jié)抗原量以產(chǎn)生 免疫有效量的抗原量，用于相對(duì)完整的產(chǎn)品、亞基產(chǎn)品或重組產(chǎn)品。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的非猿猴細(xì)胞或細(xì)胞系被用于產(chǎn)生活 PRRSV或滅活的(inactivated/killed) PRRSV。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了來(lái)自胎豬的巨噬細(xì)胞系的經(jīng)純化非 猿猴細(xì)胞或細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生來(lái)自胎豬
10的巨噬細(xì)胞系的經(jīng)純化非猿猴細(xì)胞或細(xì)胞系的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，
所述細(xì)胞或細(xì)胞系在體外培養(yǎng)至少3個(gè)、5個(gè)或10個(gè)傳代。
不希望拘囿于任何具體理論，本文對(duì)涉及本發(fā)明的基本原理或機(jī)制的 意見(jiàn)或認(rèn)識(shí)進(jìn)行了討論。應(yīng)認(rèn)識(shí)到不管任何解釋或假設(shè)最后是否正確，但 本發(fā)明的實(shí)施方案都是可實(shí)施的和可用的。


圖1顯示了兩種PRRSV減毒毒抹(PrimePac和Syva)在非猿猴細(xì) 胞UIMAC FBAL-A的培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)。
圖2顯示了 UIMAC-FBAL-A細(xì)胞的表型，包括特征性巨噬細(xì)胞表 面才示i己物的表達(dá)。
圖3顯示了使用顯微技術(shù)的FBAL-A細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征A)吉姆 薩染色，以顯示形態(tài)學(xué)表觀(cytospin); B)染色CD14的FBAL-A的共 聚焦顯微鏡檢查；C)染色CD172的共聚焦熒光顯微染色；以及D)染色 核殼抗原的PRRSV感染的FBAL-A，表明了 N抗原至核的并且與核仁關(guān) 聯(lián)的特征性定位。圖3B和圖3C顯示了染色CD14或CD172的新鮮細(xì)胞 的真實(shí)形態(tài)，具有特征性的絲狀偽足或板狀偽足。
圖4顯示了 ZMAC細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(圖4A)和使用該細(xì)胞 的PPRSV生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(圖4B)。
圖5顯示了以1 MOI (圖5A)和0.1 MOI (圖5B )的PRRS病毒 毒林NADC20感染20小時(shí)后的ZMAC細(xì)胞。將細(xì)胞固定并以對(duì)核殼(N) 蛋白特異的FITC標(biāo)記的SDOW17 mAb染色。
圖6顯示了在暴露于野生型PRRS病毒后豬體重變化的結(jié)果。
圖7顯示了在暴露于野生型PRRS病毒后豬病毒血癥的程度和頻率。
圖8顯示了在暴露于野生型PRRS病毒后來(lái)自豬支氣管肺泡灌洗樣品 中的病毒載量測(cè)量結(jié)果。
圖9顯示了 ZMAC-1細(xì)胞在存在生長(zhǎng)因子的條件下的生長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式
應(yīng)用以下縮寫(xiě)PRRS,豬繁殖與呼吸綜合征；PRRSV， PRRS病毒； TCID別，50%水平的組織培養(yǎng)感染劑量；ATCC，美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中 心；MOI,感染復(fù)數(shù)。
ii一般而言，本文使用的術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)具有本領(lǐng)域公認(rèn)的舍義，其可通過(guò) 參考本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)、期刊文獻(xiàn)和背景而理解。下列定
義用于闡明其在本發(fā)明上下文中的具體用法。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"可以指一種本領(lǐng)域所理解的生物學(xué)實(shí)體， 該術(shù)語(yǔ)意在涵蓋可以被描述為原代細(xì)胞或細(xì)胞系的具體實(shí)體。如果本文 中使用了多個(gè)這些術(shù)語(yǔ)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解這種用法僅僅是出 于強(qiáng)調(diào)熟知區(qū)別之目的。例如，短語(yǔ)"細(xì)胞或細(xì)胞系"可以強(qiáng)調(diào)原始的 原代分離抹和永生化形式之間的差別，所述永生化形式可能是所述原始 的原代分離林的直接衍生物。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"分離的"是指這樣的操作狀態(tài)，即該狀態(tài)不同于 其天然狀態(tài)以及/或者相對(duì)于起始材料是被改變的，在該情況下所述術(shù)語(yǔ) 的意義與概念"被純化的" 一致。例如，分離的原代細(xì)胞被從宿主生物 體的天然組織或其他來(lái)源剝離，并與原始的來(lái)源保持分開(kāi)。又例如，細(xì) 胞組分可以被置于培養(yǎng)物中或者被進(jìn)一步從基于肺灌洗液的樣品中分 開(kāi)，因此得到相對(duì)分離的細(xì)胞。
本文使用的術(shù)語(yǔ)"純化的"是指這樣的狀態(tài)，即其中相對(duì)于起始材 料存在一種物質(zhì)的相對(duì)的富集、分開(kāi)以及/或者取出。該術(shù)語(yǔ)涵蓋至少部 分純化的狀態(tài)，而不必指絕對(duì)的純化態(tài)。例如，該術(shù)語(yǔ)可適用于能夠繁
殖PRRS病毒并存在于混合的培養(yǎng)物中的細(xì)胞，并且可獨(dú)立地應(yīng)用于通 常所認(rèn)為純的培養(yǎng)物。該術(shù)語(yǔ)可適用于任選地為混合培養(yǎng)物的原代細(xì)胞 培養(yǎng)物。該術(shù)語(yǔ)可適用于細(xì)胞系。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)能夠支持PRRSV生長(zhǎng)的豬肺泡 巨噬細(xì)胞系。本發(fā)明的一種示例性組合物為一種非猿猴細(xì)胞系。本發(fā)明的 具體組合物包括獲自豬胎肺樣品的細(xì)胞或細(xì)胞群。另 一個(gè)具體的組合物包 括胎豬肺泡巨噬細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在非猿猴細(xì)胞或 細(xì)胞系中培養(yǎng)PRRSV的方法。
通過(guò)以下非限制性實(shí)施例可進(jìn)一步理解本發(fā)明。
實(shí)施例1.非猿猴細(xì)胞分離林UIMAC FBAL-A能夠支持PRRSV生長(zhǎng)。
豬肺泡巨噬細(xì)胞系UIMAC FBAL-A是通過(guò)以培養(yǎng)lJ^45日齡豬胎 的肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗而獲得。最初的培養(yǎng)物在體外經(jīng)過(guò)6個(gè)月的時(shí)間 從最初的數(shù)千細(xì)胞擴(kuò)大至數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞。在此時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)量PRRS病毒的生長(zhǎng)。這些實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)BAL-A細(xì)胞可支持該病毒的復(fù)制。該分離 林沒(méi)有被特意地轉(zhuǎn)化還證明了在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)并增殖的能力以及具有支 持PRRS病毒侵染性及生長(zhǎng)的能力的表型。
細(xì)胞培養(yǎng)條件如下。培養(yǎng)基補(bǔ)充L-谷酰胺和25 mM HEPES的 RPMI1640。該培養(yǎng)基補(bǔ)充有非必需氨基酸、丙酮酸鈉、艮他霉素和10% 胎牛血清。將細(xì)胞在37。C下于5。/。CO2中在100。/。濕度下孵育。將組織培 養(yǎng)級(jí)6孔板用于培養(yǎng)物表面。使用4-6 ml培養(yǎng)基/孔的培養(yǎng)物體積。選擇 非粘附的或弱粘附的細(xì)胞用于進(jìn)行傳代。借助巴斯德吸管和橡膠球通過(guò) 在培養(yǎng)物流體中輕輕懸浮細(xì)胞并將1/3的孔體積轉(zhuǎn)移至一個(gè)新孔中，每 3-4天將部分細(xì)胞從培養(yǎng)物中取出。向新孔和原孔進(jìn)料新鮮培養(yǎng)基。
圖1顯示了兩個(gè)PRRSV減毒毒株P(guān)rimePac和Syva在UIMAC FBAL-A中的生長(zhǎng)。結(jié)果證明，所述豬細(xì)胞可用于產(chǎn)生其量足夠進(jìn)行疫 苗生產(chǎn)的PRRS疫苗病毒。
分離的豬細(xì)胞可以是通過(guò)表達(dá)某些表面分子而被識(shí)別并且/或者被 分離。所述表達(dá)的表面分子模式可作為針對(duì)支持PRRSV生長(zhǎng)的能力的 潛在指示物，用于分離其他獨(dú)立的豬細(xì)胞或者用于篩查細(xì)胞系。例如， 任選地篩查細(xì)胞CD163的表達(dá)。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，借助細(xì)胞表 面分子對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞系施以染色以及/或者分離技術(shù)。
圖2顯示了 UIMAC-FBAL-A細(xì)胞的表型，包括特征的巨噬細(xì)胞表 面標(biāo)記物的表達(dá)。FBAL-A細(xì)胞表達(dá)CD14、 CD163和CD172。蛋白分 子CD163為單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞系的指示物，并與非洲豬瘟病毒感染的容 許性(permissiveness)有關(guān)。這些細(xì)胞還表達(dá)低水平的MHC II類(lèi)分子。 朝向左側(cè)的紅線(xiàn)代表陰性對(duì)照樣品的染色結(jié)果?？勺⒁獾?，特定標(biāo)記物(包 括本文中描述的這種)的表達(dá)可用于表征所述細(xì)胞，但還可以獨(dú)立地用于 富集、分離(如通過(guò)分揀)及其他目的。在一個(gè)實(shí)施方案中，雖然本發(fā)明 的細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞可能會(huì)不必表達(dá)一種或多種給定的特定標(biāo)記物或者 其表，式可能隨時(shí)間變化，但是仍然能夠復(fù)制PRRSV。
圖3顯示了使用顯微技術(shù)觀察到的FBAL-A細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征:A) 吉姆薩染色，以顯示形態(tài)學(xué)表觀(cytospin); B)染色CD14的FBAL-A 的共聚焦顯微鏡檢查；C)染色CD172的共聚焦焚光顯微染色；以及D) 染色核殼抗原的PRRSV感染的FBAL-A,表明了 N抗原至核并與核仁關(guān) 聯(lián)的特征性定位。圖3B和圖3C顯示了染色CD14或CD172的新鮮細(xì)胞的真實(shí)形態(tài)，具有特征性的絲狀偽足或板狀偽足。
在鏡檢實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞離心至載玻片上并用吉姆薩染色法染色。將未
固定的細(xì)胞與對(duì)SWC3或CD14特異的單克隆抗體孵育，然后暴露于 FITC-標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig。對(duì)于PRRSV核殼的檢測(cè)，以PRRS病毒(毒 抹VR-2332)感染細(xì)胞。在18h后，將細(xì)胞離心至栽玻片上、以丙酮固 定并且與FITC-標(biāo)記的抗PRRS病毒N蛋白mAb SDOW17孵育。未感 染的細(xì)胞不與mAb SDOW17反應(yīng)。在生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究中，PRRSV分離 林VR2332被用于UIMAC-FBAL-A細(xì)胞中。在MARC-145細(xì)胞中滴定 獲自巨噬細(xì)胞系的病毒產(chǎn)量。
不希望拘囿于理論的解釋?zhuān)瑢?duì)于某些組合物而言，本發(fā)明人認(rèn)為本文 描述的來(lái)自豬胎肺的細(xì)胞可以包含自我再生的祖細(xì)胞。這些自我再生的祖 細(xì)胞可產(chǎn)生后代巨噬細(xì)胞，這些后代巨噬細(xì)胞抗原可以進(jìn)一步分化；而且 所述自我再生的祖細(xì)胞可以具有產(chǎn)生另外的祖細(xì)胞使得增殖繼續(xù)的能力。 實(shí)施例2.非猿猴細(xì)胞分離林ZMAC能夠支持PRRSV生長(zhǎng)。 除了形成FBAL-A細(xì)胞外， 一項(xiàng)獨(dú)立的成果形成了被命名為ZMAC 的第二細(xì)胞分離林。ZMAC細(xì)胞被表征并且被發(fā)現(xiàn)具有支持PRRSV侵染 及生長(zhǎng)的能力。
在該獨(dú)立的嘗試中，在無(wú)菌條件下從母豬9688的子宮獲取6只58日 齡胎豬，該母豬獲自伊利諾伊大學(xué)獸醫(yī)研究農(nóng)場(chǎng)(University of Illinois Veterinary Medicine Research Farm)的豬群。這只母豬是具有以下血統(tǒng) 成份的雜種豬17/32長(zhǎng)白豬(Landrace)、 13/32約克夏豬(Yorkshire) 和2/32杜洛克豬(Duroc )。將這些胎豬運(yùn)輸至細(xì)胞培育實(shí)驗(yàn)室，在生物 安全的櫥柜內(nèi)于無(wú)菌條件下將它們的肺切割。
將6只胎豬中每只肺氣道中的細(xì)胞分別地通過(guò)支氣管肺泡灌洗分離。 從每只胎豬的肺獲得約100，000個(gè)細(xì)胞。來(lái)自每只胎豬的細(xì)胞4皮分開(kāi)地培 養(yǎng)于6-孔組織培養(yǎng)板的不同孔中。在最初4天培養(yǎng)后，將細(xì)胞經(jīng) Ficoll-Hypaque密度梯度純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在分離當(dāng)天或者 在以后的時(shí)間，例如1周、2周或3周后通過(guò)Ficoll-Hypaque純化細(xì)胞(公 認(rèn)這可有利于除去存在于原始制品中的某些組分例如紅細(xì)胞及可能的其 他材料)。在最初的培養(yǎng)物建立后20天內(nèi)，細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)勁的生長(zhǎng)，將其 傳代培養(yǎng)(split )至另外的6-孔板中。這些細(xì)胞被命名為ZMAC/FBAL-n ， 并且被進(jìn)一步指定為亞系l-6以標(biāo)識(shí)從6個(gè)不同豬胎分離的細(xì)胞。隨后大
14約每4-5天將細(xì)胞傳代培養(yǎng)。細(xì)胞強(qiáng)勁生長(zhǎng)的證據(jù)在于存在這樣的細(xì)胞蔟， 即每簇中的細(xì)胞約每2.5天-3天出現(xiàn)倍增。至開(kāi)始培養(yǎng)后60天時(shí)， ZMAC/FBAL- II .1和ZMAC/FBAL- II .2細(xì)胞呈現(xiàn)了比其他4個(gè)系更好的 生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步傳代，ZMAC/FBAL-II.1和ZMAC/FBAL-II.2系生長(zhǎng) 得足夠好，以至于可轉(zhuǎn)移至75 cm"且織培養(yǎng)燒瓶中。培養(yǎng)條件一般如上 述。在該實(shí)驗(yàn)中，使用Sarstedt燒瓶用于懸浮培養(yǎng)。
經(jīng)過(guò)多次傳代，所述細(xì)胞呈現(xiàn)了旺盛的生長(zhǎng)；每10-12天能夠收獲數(shù) 百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。生長(zhǎng)曲線(xiàn)表明，所述細(xì)胞和FBAL-1 (FBAL-A)細(xì)胞均能 夠復(fù)制PRRS病毒。在一項(xiàng)測(cè)定中，病毒的產(chǎn)量為約0.2 TCIDso/細(xì)胞。 在這些細(xì)胞中測(cè)試了兩種類(lèi)型的改良活PRRS病毒分離林的生長(zhǎng) (Schering-Plough的PrimePac毒抹和歐洲Syva的西班牙疫苗分離林)。
五批細(xì)胞被冷凍并保存在液氮中。每批至少有10瓶，每瓶有2百萬(wàn) 個(gè)細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)來(lái)自每批的代表性瓶在融化后具有>80%的生存力，并在培 養(yǎng)起始后4天內(nèi)呈現(xiàn)旺盛的生長(zhǎng)。ZMAC群被已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)PRRS病毒的 感染是70%易感的，這通過(guò)在以0.01 MOI感染后18小時(shí)內(nèi)對(duì)病毒蛋白 進(jìn)行免疫熒光染色確定。在另一項(xiàng)評(píng)估中，本發(fā)明人已確定，ZMAC細(xì) 胞系對(duì)PRRS病毒的感染是100%易感的，這通過(guò)在以IOMOI感染后12 小時(shí)內(nèi)對(duì)病毒蛋白進(jìn)4亍免疫熒光染色確定。
本發(fā)明人通過(guò)以0.02 MOI的PRRS病毒(PrimePac)感染ZMAC 細(xì)胞，還繪制了多步驟生長(zhǎng)曲線(xiàn)?；趯?duì)感染細(xì)胞中病毒基因組表達(dá)的實(shí) 時(shí)PCR分析并且通過(guò)滴定所產(chǎn)生的病毒后代的量，本發(fā)明人已經(jīng)確定 PRRS病毒的首輪復(fù)制在感染后9小時(shí)完成，并且病毒后代的產(chǎn)量的峰值 是在感染后18小時(shí)的第二輪復(fù)制時(shí)達(dá)到(圖4B)。
在圖4中，圖4A示出ZMAC細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果。將確立的 ZMAC細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)于75 112培養(yǎng)燒瓶中，包含密度為2-3.2 x 105 細(xì)胞/ml的15 ml細(xì)胞；向細(xì)胞進(jìn)料等體積的新鮮培養(yǎng)基以得到1-1. 6 x 1(f細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。在提供新鮮培養(yǎng)基后0天、3天和6天時(shí)計(jì)數(shù)細(xì) 胞。每個(gè)燒瓶每4天能夠產(chǎn)生2-3 x 106個(gè)細(xì)胞。
圖4B顯示了 PRRS病毒在ZMAC細(xì)胞上的多步驟生長(zhǎng)曲線(xiàn)。在這 些實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示了 PRRSV在ZMAC細(xì)胞上生長(zhǎng)的病毒產(chǎn)量和動(dòng)力 學(xué)。將lxl0Vml的ZMAC細(xì)胞懸浮物用減毒PRRS病毒分離林PrimePac 以0.02的MOI感染。在37。C下孵育1小時(shí)后，通過(guò)離心除去接種物，將細(xì)胞以lxl0Vml懸浮。在感染后的指定時(shí)間取出0.1 ml的體積，并且在 MARC-145細(xì)胞中確定TCID鄰單位的數(shù)目。減毒的PRRS病毒林 PrimePac (可能適合作為疫苗材料)在ZMAC細(xì)胞系中生長(zhǎng)良好。
圖5顯示了以1MOI (圖5A)和O.l MOI (圖5B)的PRRS病毒 林NADC20感染20小時(shí)后的ZMAC細(xì)胞。還觀察了模擬感染細(xì)胞的一 個(gè)陰性對(duì)照(未顯示)。細(xì)胞被固定并以對(duì)核殼(N)蛋白特異的FITC標(biāo) 記的SDOW17mAb染色。還進(jìn)行了相差顯微鏡檢查來(lái)觀察細(xì)胞。這些細(xì) 胞通常在感染后約28-36小時(shí)之前不出現(xiàn)CPE。然而，大量的病毒材料從 細(xì)胞中釋放的時(shí)間要早得多，例如在感染后約18-20小時(shí)。
為了將病毒效價(jià)最大化;sj或最優(yōu)化，將細(xì)胞樣品用于調(diào)整細(xì)胞生長(zhǎng)
條件及病毒生長(zhǎng)條件。PRRS病毒原種因此被產(chǎn)生，并可以被用于疫苗開(kāi)
發(fā)及疫苗接種。
實(shí)施例3.能夠支持PRRSV生長(zhǎng)的永生化非猿猴細(xì)胞系 本發(fā)明的細(xì)胞或細(xì)胞系襪建立為一種或多種自發(fā)的永生化變體、特意
轉(zhuǎn)化的衍生物、其他變體或衍生物以及本文描述的原代細(xì)胞或細(xì)胞系的其
他7^c生^:形式。
例如，技術(shù)被以本領(lǐng)域中理解的方式應(yīng)用，例如涉及病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)； 與永生化配偶物融合；暴露于化學(xué)的/物理的條件，包括例如輻照；以及 與端粒酶功能操作相關(guān)的技術(shù)。在一種優(yōu)選的方法中，tert系統(tǒng)(tert system)被用來(lái)確立能夠避免、延遲或改變衰老的細(xì)胞或細(xì)胞系。見(jiàn)例如 Carrillo et al" Veterinary Immunology and lmmunopathology 89 (2002) 91-98; Kwak S et al" 2006 Animal Biotechnology, 17: 51-58; http:〃www.atcc.org/common/products/CellIminortProducts.cfm。
在永生化細(xì)胞的初步分離努力或下游開(kāi)發(fā)中，諸如純化及/或亞克隆 這樣的方面得益于熒光活化細(xì)胞分揀技術(shù)或其他流式細(xì)胞分離或分析技 術(shù)的促進(jìn)作用。其他技術(shù)如磁性細(xì)胞分離適合與本文的細(xì)胞和方法一塊使 用。
實(shí)施例4. PRRS改良活疫苗的免疫原性及效力的測(cè)定 在該實(shí)施例中，使用豬巨噬細(xì)胞系產(chǎn)生的PRRS改良活疫苗的免疫原 性及效力被測(cè)定。 一個(gè)豬肺泡巨噬細(xì)胞系被測(cè)試。在一種具體的情況下， 使用豬巨噬細(xì)胞原代細(xì)胞系UIMAC-FBAL-A和/或ZMAC?；蛘?，可以 產(chǎn)生獨(dú)立的起始材料和/或衍生物，例如根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的轉(zhuǎn)化體。選擇PRRSMLV候選物并用本文描述的細(xì)胞或細(xì)胞系進(jìn)行生產(chǎn)，以 產(chǎn)生PRRS MLV材料用于臨床試驗(yàn)評(píng)估。以32只4周齡豬進(jìn)行疫苗接種 和^t^研究，這些豬被隨機(jī)分配至4組中，每組11=8。這些豬獲自伊利諾 伊大學(xué)獸醫(yī)研究農(nóng)場(chǎng)的無(wú)PRRS病毒的豬群，并且在開(kāi)始研究之前在隔離 i殳施中適應(yīng)一周。
在組1和2中動(dòng)物的臀部區(qū)域用培養(yǎng)于UIMAC-FBAL-A細(xì)胞或 MARC-145細(xì)胞中的2 ml MLV原種以5 x 104 TCIDS0單位的劑量免疫一 次。將組3中的動(dòng)物以2 ml UIMAC-FBAL-A細(xì)胞的^&培養(yǎng)物上清液 和猿猴MARC-145細(xì)胞的M培養(yǎng)物上清液的50:50混合物注射。組4 中的動(dòng)物不經(jīng)處理，作為對(duì)照。作為病毒特異性免疫的一個(gè)量度，在免疫 后1周、2周、4周、6周和8周從每只動(dòng)物收集外周血樣品。從這些樣 品獲得血清和PBMC，并測(cè)量了體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。分 別抗兩個(gè)親本PRRS病毒分離林FL-12和NEB-1、 一種嵌合病毒(Kwon B， 2006 )及強(qiáng)毒的激發(fā)林VR2385 ( Opriessnig T， 2002 )的血清病毒-中和 抗體的效價(jià)以及PRRS病毒-特異性干擾素(IFN) "7-分泌細(xì)胞(SC)的 頻率。
為了測(cè)量由疫苗材料"i秀導(dǎo)的保護(hù)性免疫的水平，組l-3中的動(dòng)物是在 免疫后6周通過(guò)滴注2 ml的強(qiáng)毒PRRS病毒毒林VR2385 (每2 ml 105 TCID50的劑量，每鼻孔給予1 ml的等份試樣)進(jìn)行激發(fā)。組4中的動(dòng)物 保持不接種并且不被激發(fā)，目的是不僅確定正常肺表觀而且確定正常臨床 參數(shù)。將組3中未感染過(guò)PRRS病毒的動(dòng)物作為激發(fā)對(duì)照，以確定亂良的 嚴(yán)重度。由疫苗所誘發(fā)的保護(hù)性免疫程度的確立是基于以下因素，包括對(duì) 體溫和體重變化的測(cè)量以及對(duì)臨床癥狀例如抑郁和呼吸系統(tǒng)癥狀的觀察。 每天監(jiān)測(cè)這些參數(shù)至14天。病毒血癥的水平、IFN-y反應(yīng)及體重在^l 后0天、4天、7天、10天和14天被確定。在激發(fā)后14天，動(dòng)物^皮處以 安樂(lè)死，肺組織及支氣管肺泡灌洗液中的病毒載量被測(cè)定。在宏觀水平及 微觀水平評(píng)估肺中的病理變化。
在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，從ZMAC生成的生物材料的免疫原性和效力被評(píng) 價(jià)。將該ZMAC材料與相同的、但培養(yǎng)于MARC-145細(xì)胞中的疫苗病毒 比較。為了該目的，本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了 PrimePac病毒毒林在ZMAC 細(xì)胞中的3次連續(xù)傳代。該病毒在ZMAC細(xì)胞中的第3個(gè)傳代被用于進(jìn) 行該生物材料與培養(yǎng)于MARC-145細(xì)胞中的PrimePac病毒的比較疫苗接種研究。培養(yǎng)于ZMAC細(xì)胞或MARC-145細(xì)胞中的PrimePac疫苗原種 被制備成106 TCID5o/ml的效價(jià)。將豬分組用2 ml體積培養(yǎng)于 UIMAC-FBAL-A細(xì)胞或MARC-145細(xì)胞中的MLV原種以5 x io4 TCIDso劑量免疫。
實(shí)施例5.豬肺泡巨噬細(xì)胞系用于產(chǎn)生PRRS改良活病毒疫苗的用途 引言在1994年中期，第 一種PRRS MLV疫苗(Ingelvac PRRS MLV) 面世。自此，使用減毒病毒作為疫苗在北美和歐洲變得很常規(guī)。普遍接受 的是，這些試劑可有效地賦予合適水平的同源保護(hù)性免疫，同時(shí)針對(duì)異源 林的激發(fā)提供不定水平的保護(hù)(Mengeling et al.， 1996; Mengeling et al.， 1999)。因此有這樣的動(dòng)機(jī)及興趣，即進(jìn)一步發(fā)展另外的及改良的策略、 疫苗以及與4L^目關(guān)聯(lián)的方法和工具。
在該研究中，豬肺泡巨噬細(xì)胞系(被命名為ZMAC-l)被用于產(chǎn)生 PRRS改良活病毒(MLV)疫苗。同時(shí)，將培養(yǎng)于這種豬宿主中的疫苗病 毒的效力與僅在起始該研究前已知支持PRRS病毒的生長(zhǎng)的其他細(xì)胞系 (即猿猴細(xì)胞系MA-104 ;5L/或其衍生物MARC-145系)中繁殖的疫苗病 毒比較。
最初，ZMAC-l細(xì)胞,皮發(fā)現(xiàn)對(duì)MLV疫苗Prime Pac PRRS (Schering-Plough Animal Health)是十分易感的。而且，在該病毒在 ZMAC-l細(xì)胞中第3次傳代以后，獲得的產(chǎn)量與使用MARC-145細(xì)胞達(dá) 到的產(chǎn)量是相當(dāng)?shù)?。為了評(píng)估以ZMAC-l細(xì)胞(和MARC-145細(xì)胞)培養(yǎng) 的病毒的疫苗潛力，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的免疫-激發(fā)研究。在這種案例中，將6 只8周齡的豬用培養(yǎng)于ZMAC-l細(xì)胞或MARC-145細(xì)胞中PrimePac疫 苗以等劑量疫苗注射，而另外兩個(gè)3只動(dòng)物的組不被免疫。在4周后，將 所有接種組的及一個(gè)未感染過(guò)PRRS病毒的組以"非典型PRRS流產(chǎn)風(fēng)暴 (atypical PRRS abortion storm)"病毒分離林NADC-20激發(fā)。該研究的 一個(gè)結(jié)果是，培養(yǎng)于兩個(gè)細(xì)胞系中的Prime Pac MLV疫苗對(duì)于防止已于 7天前暴露于異源病毒的未感染過(guò)PRRS病毒的豬的體重減輕是同樣有效 的。然而，與培養(yǎng)于MARC-145中的疫苗病毒相比，培養(yǎng)于ZMAC-l細(xì) 胞中的疫苗病毒對(duì)于分別在M后7天和10天降低病毒血癥的程度及消 除肺中的強(qiáng)毒病毒是顯著更有效的。
觀察到用于培養(yǎng)PRRS MLV疫苗的細(xì)胞系類(lèi)型可提高由相同疫苗病 毒所激發(fā)的抗遺傳分化的強(qiáng)毒PRRS病毒的保護(hù)性免疫水平，這樣的結(jié)果對(duì)于抗這種病原體的高效疫苗的開(kāi)發(fā)前景有重要暗示。也就是說(shuō)，該研究
的結(jié)果表明，PRRS MLV病毒疫苗的有效性不僅是如通常認(rèn)為的由其與激發(fā)病毒的遺傳相似性確定，而是還受它是如何產(chǎn)生的影響。^>研究結(jié)果的重要意義在于證明了豬細(xì)胞可用于生成有效的抗PRRS病毒的MLV疫苗。
摘要豬肺泡巨噬細(xì)胞系(被命名為ZMAC-1)被生成，并且其制造有效的PRRS改良活病毒(MLV)疫苗的實(shí)用性被檢測(cè)。該細(xì)胞系祐JL現(xiàn)對(duì)于PRRS病毒的感染是100%易感的，這通過(guò)在感染20 hr后對(duì)病毒蛋白的成功免疫熒光染色證明。而且，基于多步驟生長(zhǎng)曲線(xiàn)分析，第一輪PRRS病毒復(fù)制被確定是在感染9 hr后完成，并且在感染后19 hr的第2輪復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生病毒后代。
為了比較在ZMAC-1或猿猴細(xì)胞系MARC-145中制備的MLV疫苗Prime Pac PRRS (Schering-Plough Animal Health)原種的效力，進(jìn)4亍了標(biāo)準(zhǔn)的免疫-'^Ut研究。最初將6只8周齡的豬以等劑量的(104TCID50)的培養(yǎng)于ZMAC-1細(xì)胞或MARC-145細(xì)胞中的Prime Pac疫苗通過(guò)肌肉接種，而另外兩個(gè)3只動(dòng)物的組不被免疫。在4周后，將所有這些動(dòng)物及一個(gè)未接種的組以104 TCIDso的"非典型PRRS流產(chǎn)風(fēng)暴"病毒分離林NADC-20激發(fā)。雖然未接種動(dòng)物在強(qiáng)毒病毒激發(fā)7天后表現(xiàn)出5±4 lb的平均體重(BW)降低，但未感染過(guò)PRRS病毒的對(duì)照在該期間平均增加了 19.7±6 Ib。相反，在^L后7天，以培養(yǎng)于ZMAC-1或MARC-145細(xì)胞中的MLV病毒接種的動(dòng)物分別表現(xiàn)出8.2±5.2和9.3±3.6的平均BW增加。因此在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，培養(yǎng)于兩個(gè)細(xì)胞系中的Prime Pac MLV疫苗對(duì)于降低因暴露于高毒的PRRS病毒而對(duì)豬生長(zhǎng)的負(fù)面效應(yīng)是同樣有效的。值得注意的是，對(duì)來(lái)自PRRS病毒免疫并激發(fā)的動(dòng)物的血清和肺灌洗樣品中的病毒載量分析揭示，培養(yǎng)于ZMAC-1細(xì)胞中的疫苗病毒對(duì)于降低激發(fā)后7天時(shí)的病毒血癥的程度以4激發(fā)后10天消除肺的強(qiáng)毒病毒是顯著(P=0.015)更有效的。觀察到用于培養(yǎng)PRRS MLV疫苗的細(xì)胞系類(lèi)型可提高由該產(chǎn)物所誘發(fā)的抗遺傳分化的強(qiáng)毒PRRS病毒的保護(hù)性免疫水平，這樣的結(jié)果對(duì)于抗這種病原體的高效疫苗開(kāi)發(fā)有重要暗示。也就是說(shuō)，該研究的結(jié)果表明，PRRS MLV病毒疫苗的有效性不僅是如通常認(rèn)為的由其與綴l病毒的遺傳相似性確定，而且還受它如何產(chǎn)生的影響。
本研究的目標(biāo)至少部分地包括，確定(1)減毒PRRS病毒林在豬巨細(xì)胞系ZMAC-1中產(chǎn)生的PRRS改良活病毒疫苗的免疫原性及效力。材料和方法
細(xì)胞例如如本文進(jìn)一步描述的，從SPF (無(wú)特定病原體)母豬的58日齡豬胎的肺灌洗液選擇豬肺泡巨噬細(xì)胞。將該細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%胎牛血清、丙酮酸鈉及非必需氬基酸，并在37'C下保持于5% C02的空氣中。被命名為ZMAC-1的細(xì)胞系在2006年5月被建立，并且自此被連續(xù)地培養(yǎng)。代表不同時(shí)間分出的這種細(xì)胞系的原種已經(jīng)被水凍保藏。
病毒將MLV疫苗Prime Pac PRRS ( Schering-Plough AnimalHealth)在ZMAC-1細(xì)胞中連續(xù)傳代3次。雖然在最初兩次傳代后效價(jià)僅為104 TCID50/ml,但該病毒在第3次傳代中明顯已經(jīng)適應(yīng)，因?yàn)樾r(jià)增加至106'25 TCID50/ml。因此將該后代用于接種。Prime Pac疫苗的原種也如前述方法(Osorio et al.， 2006)在MARC-145細(xì)胞中制備，達(dá)到106TCID50/ml的效價(jià)。將"非典型PRRS流產(chǎn)風(fēng)暴"病毒分離林NADC-20(Harms et al.， 2001)在ZMAC-1細(xì)胞中培養(yǎng)，其呈現(xiàn)出107'6 TCID50/ml的最大效價(jià)。
接種和^LiC研究在伊利諾伊大學(xué)的生物防護(hù)設(shè)施(BiocontainmentFacility)中，將18只8周齡SPF豬(無(wú)所有主要豬病原體，包括PRRS病毒、支原體及環(huán)狀病毒)隨機(jī)地分配至一個(gè)套間的6個(gè)隔離隔間內(nèi)(每隔間3只)。將來(lái)自4個(gè)隔間的動(dòng)物在臀部區(qū)域用包含5 x 104 TCIDso的培養(yǎng)于ZMAC-1細(xì)胞或MARC-145細(xì)胞中的Prime Pac病毒的2 ml溶液注射一次，每種疫苗制劑對(duì)應(yīng)共2個(gè)隔間(共6只豬)。其他2個(gè)隔間中剩余的6只豬不被免疫，作為未接種的對(duì)照。在接種后4周，將所有免疫的動(dòng)物以及處于一個(gè)隔間中的3只對(duì)照豬以104 TCIDso的PRRS病^^林NADC-20激發(fā)。未接種的及激發(fā)的動(dòng)物被用作確立NADC-20 PRRS病毒的感染嚴(yán)重度，剩余隔間中未感染過(guò)PRRS病毒的豬被用于提供正常的生長(zhǎng)和健康臨床參數(shù)。由該疫苗誘發(fā)的保護(hù)性免疫的程度是基于對(duì)體重(BW)變化的比較以及抑郁和呼吸系統(tǒng)癥狀的出現(xiàn)來(lái)確定的。在^>后每天監(jiān)測(cè)這些參數(shù)至10天。在^L后0天、4天、7天和10天，通過(guò)測(cè)量MARC-145細(xì)胞中的傳染單元確定病毒血癥水平。在激發(fā)后10天，將動(dòng)物處以安樂(lè)死，并使用實(shí)時(shí)PCR及以前述的病毒學(xué)方法(Zuckermannetal.，2007)確定支氣管肺泡灌洗(BAL )液中的病毒載量。
統(tǒng)計(jì)分析。將方差分析用于確定各豬組之間體重增加的顯著差異。利用Stat View軟件(SAS)通過(guò)費(fèi)舍最小顯著性差異(Fisher's leastsignificant difference)方法比較組平均值。為了使氣復(fù)時(shí)動(dòng)物之間的BW重量差異效應(yīng)最小化，數(shù)據(jù)被計(jì)算為齓t時(shí)及7天后動(dòng)物的BW之間的差異。結(jié)果
目標(biāo)1確定減毒PRRS病毒林在豬巨噬細(xì)胞系ZMAC-1中的生長(zhǎng)特性。該目標(biāo)是為了確定ZMAC-1細(xì)胞系的穩(wěn)健性，以及其對(duì)PRRS病毒感染的易感性。另外，本發(fā)明人試圖確定減毒PRRS病毒在ZMAC-1細(xì)胞中生長(zhǎng)的最佳條件，并且試圖證明在該細(xì)胞系中制備的MLV疫苗原種可能被用于商業(yè)目的。
對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞系ZMAC-1的表征。ZMAC-1巨噬細(xì)胞系已經(jīng)表現(xiàn)出了十分強(qiáng)勁的生長(zhǎng)模式，具有約72小時(shí)的倍增時(shí)間(圖B1; itxt應(yīng)于圖4A)。本發(fā)明人已經(jīng)能夠調(diào)整這些細(xì)胞，以將其培養(yǎng)于75 112燒瓶中并將這種類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)物保持連續(xù)生產(chǎn)達(dá)至少15個(gè)月。迄今為止，本發(fā)明人已經(jīng)從最初的數(shù)千個(gè)的群開(kāi)始生成了超過(guò)10億個(gè)細(xì)胞。為了保證這種有價(jià)值的細(xì)胞的永久保存，已經(jīng)制備了超過(guò)100份冷凍的細(xì)胞原種。每一批具有至少I(mǎi)O個(gè)管，每管包含至少2-3百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。在融化每批的代表性管時(shí)，本發(fā)明人已經(jīng)確定這些管具有>卯％活細(xì)胞，所述活細(xì)胞在從新起始它們的培養(yǎng)后4天內(nèi)呈現(xiàn)出旺盛生長(zhǎng)。通iW中的細(xì)胞與單克隆抗體K252.1E4的100n/。反應(yīng)性，這些細(xì)胞被確定是來(lái)自豬的，所述K252.1 E4對(duì)豬CD45是特異的(Schnitzlein and Zuckermann， 1998;Zuckermann et al.， 2001 )。另外，ZMAC-1細(xì)胞表達(dá)以下細(xì)胞表面標(biāo)記物CD14、 CD163、 CD172、 II類(lèi)MHC，它們的存在是巨噬細(xì)胞的特征(圖2)。
圖Bl(對(duì)應(yīng)于圖4A).ZMAC-1細(xì)胞系的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。將在包含2-3.2x 1()S細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的75cii^燒瓶中確立的ZMAC-1細(xì)胞的培養(yǎng)物與等體積的新鮮培養(yǎng)基合并，以得到1-1.6 x 1()S細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。在新鮮培養(yǎng)基被送遞至培養(yǎng)燒瓶后的第0天、3天和6天時(shí)計(jì)數(shù)細(xì)胞。
PRRS病毒在ZMAC-1細(xì)胞中的生長(zhǎng)。ZMAC-1細(xì)胞系對(duì)PRRS病毒的感染是100%易感的，這可通過(guò)在感染后20 hr時(shí)對(duì)病毒蛋白的成功
21免疫熒光染色證明(圖B2;對(duì)應(yīng)于圖5A)。而且，本發(fā)明人已經(jīng)確定， 第一輪PRRS病毒復(fù)制是在感染后9 hr時(shí)完成(數(shù)據(jù)未顯示)，并且在感 染后19 hr時(shí)笫2輪復(fù)制過(guò)程中達(dá)到病毒后代的峰產(chǎn)量(圖B3;對(duì)應(yīng)于 圖4B )。
圖B2 (對(duì)應(yīng)于圖5A) . PRRS病毒核殼蛋白在ZMAC-1細(xì)胞中的表 達(dá)。在以1 MOI的PRRS病毒林NADC-20感染后20 hr時(shí)，將細(xì)胞固定 并以FITC-標(biāo)記的抗PRRS病毒核殼的mAb SDOW17染色。
圖B3 (對(duì)應(yīng)于圖4B) . PRRS病毒在ZMAC-1細(xì)胞中的多步驟生長(zhǎng) 曲線(xiàn)。將lxl0Vml的ZMAC-1細(xì)胞懸液以0.02 MOI的減毒PRRS病毒 分離林Prime Pac感染。在37'C下孵育1 hr后，通過(guò)離心將接種物取出， 將細(xì)胞以lxl06/ml的濃度懸浮于培養(yǎng)基中。在感染后的指定時(shí)間將0.1 ml 的等分試樣取出，并且用于確定傳染性病毒的存在(MARCM45細(xì)胞中 的TCID50 )。
目標(biāo)2確定豬巨噬細(xì)胞系ZMAC-1中產(chǎn)生的PRRS改良活病毒疫苗 的免疫原性及效力。該目標(biāo)是比較由在ZMAC-1細(xì)胞系或在MARC-145 細(xì)胞中產(chǎn)生的相同PRRS MLV疫苗(在該案例中為Prime Pac PRRS病 毒)誘發(fā)的保護(hù)性免疫的水平。
為了測(cè)試在ZMAC-1細(xì)胞或MARC-145細(xì)胞中制備的Prime Pac PRRS病毒疫苗的效力，將豬分組以來(lái)自?xún)蓚€(gè)細(xì)胞系之一的疫苗病毒免 疫，或者進(jìn)行模擬處理。在免疫4周后進(jìn)行亂良時(shí)，^研究中所有18只 豬的平均體重(BW)為117±8.6 lb。由于在接種動(dòng)物和未接種動(dòng)物的平 均BW之間沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異，所以在ZMAC-1細(xì)胞或MARC-145細(xì)胞 中繁殖的MLV接種對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。相比之下，在以強(qiáng)毒 NADC-20分離林激發(fā)7天后，未接種豬具有的平均-5±4 lb的BW減輕， 而未激發(fā)的動(dòng)物平均增加19.7±6Ib(圖6)。之前已接受在ZMAC-1細(xì)胞 或MARC-145細(xì)胞中制備的MLV病毒疫苗的組分別出現(xiàn)8.2±5.2 lb和 9.3±3.6 Ib的增加，它們之間無(wú)顯著差異。因此，與用于繁殖病毒的細(xì)胞 類(lèi)型無(wú)關(guān)，Prime Pac MLV疫苗對(duì)于減少由強(qiáng)毒PRRS病毒暴露導(dǎo)致的 對(duì)生長(zhǎng)的負(fù)效應(yīng)是同樣有效的，這被7天前已暴露于異源強(qiáng)毒病毒的未感 染過(guò)PRRS病毒豬的BW顯著減輕證明。值得注意的是，對(duì)來(lái)自PRRS 病毒免疫和激發(fā)的動(dòng)物的血清和肺灌洗樣品中病毒載量的分析揭示，培養(yǎng) 于ZMAC-1細(xì)胞中的疫苗病毒對(duì)于降低激發(fā)后7天時(shí)的病毒血癥的程度(圖7)以及在激發(fā)后10天消除肺的強(qiáng)毒病毒(圖8 )是顯著(P=0.015 ) 更有效的。
圖6.在暴露于野生型PRRS病毒后豬的體重變化。就在以野生型 PRRS病毒分離抹NADC-20 ^L之前及在該、M后7天，對(duì)未感染過(guò) PRRS病毒的動(dòng)物(n=3)和被免疫的動(dòng)物(對(duì)于每種類(lèi)型細(xì)胞產(chǎn)生的疫 苗n-6)測(cè)量體重。在這些時(shí)間點(diǎn)還對(duì)未^JL的、未感染過(guò)PRRS病毒的 動(dòng)物(n=3 )進(jìn)行測(cè)量。對(duì)每組的成員在7天的間隔中的體重變化取平均， 這些值士標(biāo)準(zhǔn)差被顯示。星號(hào)r)表示該組平均值與激發(fā)的、未感染過(guò) PRRS病毒的對(duì)照動(dòng)物是顯著不同的(P<0.01)。兩個(gè)星號(hào)r"-故用于表 示該組平均值與未激發(fā)的、未感染過(guò)PRRS病毒的對(duì)照動(dòng)物是顯著不同的 (PO.01 )0
圖7.暴露野生型PRRS病毒后豬病毒血癥的程度及頻率。就在以野 生型PRRS病毒分離林NADC-20激發(fā)之前及在該激發(fā)后指定天數(shù)，從未 感染過(guò)PRRS病毒的動(dòng)物和被免疫的動(dòng)物收集血清樣品。還在這些時(shí)間點(diǎn) 對(duì)未激發(fā)的、未感染過(guò)PRRS病毒的動(dòng)物進(jìn)行采樣。血清中病毒載量的水 平是通過(guò)在MARC-145細(xì)胞中進(jìn)行滴定來(lái)確定，然后取平均。數(shù)據(jù)代表 了每組病毒血癥的平均水平。緊挨著這些符號(hào)的比例表示毒血癥豬 (viremic pigs)的數(shù)目(分子)和每組中豬的總數(shù)(分母)。
圖8.暴露于野生型PRRS病毒后豬支氣管肺泡灌洗液中的病毒載 量。在以野生型PRRS病毒分離抹NADC-20激發(fā)后10天時(shí)，從未感染 過(guò)PRRS病毒的豬和以前免疫過(guò)的豬的肺收集支氣管肺泡灌洗液。在此時(shí) 還從未激發(fā)的、未感染過(guò)PRRS病毒的動(dòng)物獲取樣品。每個(gè)動(dòng)物的BAL 中的病毒載量水平的確定是通過(guò)在MARC-145細(xì)胞中進(jìn)行滴定。
討論
觀察到用于培養(yǎng)相同PRRS MLV疫苗林的細(xì)胞系可以提高由該產(chǎn)物 所誘發(fā)的、抗遺傳分化的強(qiáng)毒PRRS病毒的保護(hù)性免疫水平，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)對(duì) 于開(kāi)發(fā)抗該病原體的高效疫苗具有重要意義。也就是說(shuō)，這項(xiàng)研究的結(jié)果 表明，PRRS MLV病毒疫苗的效力不是如通常認(rèn)為的僅由其與激發(fā)病毒 的遺傳相似性確定，而且還受它如何產(chǎn)生影響。對(duì)于上述發(fā)現(xiàn)的一個(gè)合理 解釋為，通過(guò)簡(jiǎn)單地培養(yǎng)于ZMAC-1細(xì)胞中，該疫苗病毒的生物學(xué)性質(zhì) 被以積極的方式改良。結(jié)果是，在所述接種的動(dòng)物中形成了更加有效的保 護(hù)性免疫反應(yīng)。因此，該研究的結(jié)果可證明，可以創(chuàng)造一種更有效的抗PRRS病毒的MLV疫苗。
實(shí)施例5的參考文獻(xiàn)
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實(shí)施例6.細(xì)胞材料及細(xì)胞的生長(zhǎng)。
細(xì)胞材料被命名為ZMAC-1的細(xì)胞被制備并且被按照布達(dá)佩斯條約 (Budapest Treaty)的要求保藏于公認(rèn)的國(guó)際保藏授權(quán)機(jī)構(gòu)——美國(guó)標(biāo)準(zhǔn) 生物品收藏中心(ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas， Virginia, United States of America )。登記號(hào)為ATCC專(zhuān)利保藏號(hào)PTA-8764的細(xì)胞 的特征為源自S s scra/fl (豬)肺組織。根據(jù)日期為2007年12月7日的 ATCC保藏證書(shū)文件(國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條 約；國(guó)際表格；依照第7.3條發(fā)布原始保藏的接收以及依照第10.2條發(fā)布 存活聲明)，ATCC⑧專(zhuān)利保藏命名為PTA-8764的培養(yǎng)物接收日期為2007 年11月14日。
細(xì)胞生長(zhǎng)在本發(fā)明的實(shí)施方案中，細(xì)胞例如ZMAC-1細(xì)胞被在體外 培養(yǎng)。通常應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的原則。例如，細(xì)胞可以在存在抗生素 的情況下培養(yǎng)；艮他霉素可被使用但不是必需的。
細(xì)胞的制備如下(培養(yǎng)基補(bǔ)充有10。/。胎牛血清、丙酮酸鈉(lmM; Mediatech Cellgro， Cat. No. 25-000-Cl )、非必需JLS^酸(IX; Mediatech Cellgro Cat. No. 25畫(huà)025-Cl)及艮他霉素(50 mcg/ml; Gibco， Cat. No. 15750-060)的RPMI-1640。將細(xì)胞保持在每ml約1 - 5 x 10e5個(gè)細(xì)胞的 細(xì)胞濃度。這些細(xì)胞一般懸浮生長(zhǎng)。可以形成松散粘附細(xì)胞的不連續(xù)菌落， 但大多數(shù)細(xì)胞將懸浮生長(zhǎng)。正常的培養(yǎng)物將產(chǎn)生漂浮的細(xì)胞簇。為了降低 粘附，優(yōu)選類(lèi)型的培養(yǎng)燒瓶為具有PE通氣帽的用于懸浮細(xì)胞的Sarstedt Tissue Culture Flask( Cat. No. 83.1813.502 )。可以每4-5天對(duì)建立的燒瓶 進(jìn)行收獲，取出2/3的液體并添加新鮮培養(yǎng)基。通過(guò)在T25燒瓶中20 ml
25體積中添加至少3百萬(wàn)-6百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞(最低1.5 x 10e5個(gè)細(xì)胞/ml)建立 新的燒瓶。可以通過(guò)添加2-10 ng/ml的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(小鼠； Sigma-Aldrich Product No. M9170 )加強(qiáng)生長(zhǎng)。細(xì)胞冷凍可以通過(guò)將等體 積的每ml中4百萬(wàn)-8百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的冰預(yù)冷細(xì)胞懸液與水預(yù)冷的冰凍培養(yǎng) 基(90%血清，10% DMSO)混合來(lái)實(shí)現(xiàn)。將冷凍的冷凍管中充滿(mǎn)懸浮 于冷凍培養(yǎng)基中的細(xì)胞，在處理過(guò)程中保持在水冷卻的溫度下。
圖9顯示了 ZMAC-1細(xì)胞在存在生長(zhǎng)因子的情況下的生長(zhǎng)。在無(wú)外 源生長(zhǎng)因子或者存在所標(biāo)定濃度巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)或粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)的情況下，將每ml 1.2 x 105個(gè)細(xì) 胞的ZMAC-1細(xì)胞培養(yǎng)8天。在培養(yǎng)的第4天和第8天借助血球計(jì)數(shù)器 確定細(xì)胞濃度。y-軸表示細(xì)胞/ml (xl05)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞以命名為ZMAC-1的細(xì)胞或者美 國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心指定為ATCC專(zhuān)利保藏編號(hào)PTA-8764的保藏物或 其衍生物為代表。
實(shí)施例7.細(xì)胞材料的生成及從胎豬樣品分離的方法
又一些組合物和方法被開(kāi)發(fā)。在一項(xiàng)獨(dú)立的嘗試中，材料源自于伊利 諾伊大學(xué)獸醫(yī)研究農(nóng)場(chǎng)的豬群(標(biāo)識(shí)為母豬編號(hào)5850)的妊娠60天的母 豬。在安樂(lè)死之后，將子宮無(wú)菌地從腹腔中取出，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 室。操作通常是在生物安全的櫥拒內(nèi)于無(wú)菌條件下進(jìn)行。從子宮中無(wú)菌地 收獲6只胎兒，并置于塑料培養(yǎng)亞中。將肺器官與心臟、食管和其他膜分 開(kāi)，保持氣管完整且連接于肺上。以無(wú)菌的Hank's平衡鹽溶液(HBSS) 徹底地沖洗肺的外部，以去除任何可見(jiàn)的血液及其他污染的剩余組織。通 過(guò)將肺置于干凈且無(wú)菌的培養(yǎng)贓中并以10 ml無(wú)菌HBSS充填氣道，通過(guò) 支氣管肺泡灌洗分別從6只胎兒中每只的肺氣道中分離細(xì)胞。借助10 cc 的注射器和插入通過(guò)氣管內(nèi)腔的l英寸18g針頭，將10 ml的HBSS推入 肺中。將液體輕輕地推注通過(guò)氣管，與之同時(shí)以鑷子壓住它，以阻止HBSS 倒流，導(dǎo)致肺明顯地被液體充脹。然后，通過(guò)簡(jiǎn)單地放松對(duì)氣管的按壓， 使包含肺灌洗細(xì)胞的液體從肺中自排出。將在培養(yǎng)虹中收集的細(xì)胞懸浮物 轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的15 ml錐形塑料管中，并以3-4 ml的溫Ficoll-Hypaque 1077 鋪在下面。之后立即將細(xì)胞懸浮物經(jīng)等密度離心純化(室溫下400 g 30分 鐘)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在分離當(dāng)天或者在以后的時(shí)間例如l周、2周或3周后，使用Ficoll-Hypaquel077通過(guò)等密度離心將細(xì)胞純化。應(yīng)了解， 這種純化步驟可能有利于除去某些組分例如紅細(xì)胞及可能存在于原始制 品中的其他材料。收獲離心后在Ficoll-Hypaque 1077和培養(yǎng)基之間的界 面處獲得的細(xì)胞帶，以HBSS洗滌2次并且每次均通過(guò)離心回收細(xì)胞。在 第二次離心后，將來(lái)自每只胎兒肺灌洗液的回收細(xì)胞沉淀懸浮于培養(yǎng)基 中補(bǔ)充有10%胎牛血清、丙酮酸鈉(1 mM; Mediatech Cellgro， Cat. No. 25-000-C1 )、非必需^J^酸(IX; Mediatech Cellgro Cat. No. 25-025-C1) 的RPMI-1640，并獨(dú)立地置于6-孔板(Sarstedt)的一個(gè)孔中用于進(jìn)行懸 浮培養(yǎng)。將每個(gè)孔以l-6進(jìn)行標(biāo)記，以獨(dú)立地標(biāo)識(shí)從6只胎兒的每一只中 純化的細(xì)胞。雖然在該次嘗試中，在等密度離心步驟之后僅回收到很少量 且很小的細(xì)胞(<100)，但是在初始培養(yǎng)物建立后14天內(nèi)，在每個(gè)孔中都 出現(xiàn)了顯著的生長(zhǎng)。由于從胎兒肺中收獲的巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞明顯非常小并 且能夠具有超過(guò)1.077的密度(因此在等密度離心過(guò)程中通過(guò)高密度介質(zhì) 至管底)，在胎兒#1的案例中，在等密度離心后獲得的紅細(xì)胞沉淀也被收 獲，被置于培養(yǎng)物中并標(biāo)記為Pl。在該案例中，雖然在培養(yǎng)起始時(shí)的主 要細(xì)胞類(lèi)型包括紅細(xì)胞，但是出現(xiàn)了少量很小的單核細(xì)胞。在培養(yǎng)起始后 16天和24天時(shí)，來(lái)自胎兒#4的肺灌洗液的細(xì)胞表現(xiàn)出了顯著的生長(zhǎng)，足 以傳代至6孔板的新孔中。來(lái)自該培養(yǎng)物中的細(xì)胞被命名為 ZMAC1107-4。類(lèi)似地，在培養(yǎng)起始后36天時(shí)，來(lái)自紅細(xì)胞沉淀的標(biāo)記 為P1的孔中的生長(zhǎng)是明顯的，并且也被傳代至2個(gè)孔中。來(lái)自該培養(yǎng)物 中的細(xì)胞被命名為ZMAC1107-P1。細(xì)胞生長(zhǎng)明顯存在細(xì)胞簇，每蔟包含 2、 4、 8、 16或更多細(xì)胞。
在ZMAC1107-4培養(yǎng)起始后37天時(shí)，向二個(gè)孔之一的該細(xì)胞系的培 養(yǎng)基中補(bǔ)充10 ng/ml的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(小鼠；Sigma-Aldrich Product No. M9170)。在7天后明顯的是，在該培養(yǎng)的早期階段， ZMAC1107-4細(xì)胞的生長(zhǎng)已經(jīng)因外源的生長(zhǎng)因子補(bǔ)充而得到顯著促進(jìn)，此 后向所有培養(yǎng)物的培養(yǎng)基補(bǔ)充5-10 ng/ml的MCSF。通過(guò)吸出半體積的細(xì) 胞培養(yǎng)物并將其替換為補(bǔ)充生長(zhǎng)因子的新鮮培養(yǎng)基，每4-6天向培養(yǎng)物進(jìn)
料。ZMAC 1107-4系和ZMAC 1107-P1系都強(qiáng)勁生長(zhǎng)的證據(jù)是這樣的細(xì) 胞集落的形成，即該細(xì)胞集落懸浮生長(zhǎng)并柏喻地粘附于培養(yǎng)物表面。
在另一項(xiàng)獨(dú)立的嘗試中，又一些組合物和方法被開(kāi)發(fā)。妊娠54天的 被標(biāo)識(shí)為編號(hào)卯93的母豬獲自伊利諾伊大學(xué)獸醫(yī)研究農(nóng)場(chǎng)的豬群。在安
27樂(lè)死之后，將子宮無(wú)菌地從腹腔中取出，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。從此 刻開(kāi)始的所有操作均在生物安全的櫥拒內(nèi)于無(wú)菌條件下進(jìn)行。從子宮中無(wú)
菌地收獲8只胎兒，并置于塑料培一中，并且將它們的肺和與心臟、食 管和其他膜分開(kāi)，保持氣管完整且連接于肺上。以HBSS徹底地沖洗肺的
外部，以去除任何可見(jiàn)的血液及其他污染的剩余組織。通過(guò)將肺置于干凈 且無(wú)菌的培養(yǎng)臟中并以10 ml無(wú)菌的Hank's平衡鹽溶液(HBSS)充填氣 道，通過(guò)支氣管肺泡灌洗分別從8只胎兒中的每只的肺氣道中分離細(xì)胞。 借助10 cc的注射器和插入通過(guò)氣管內(nèi)腔的1英寸18g針頭，將10 ml的 HBSS推入肺中。將液體輕輕地推注通過(guò)氣管，與之同時(shí)以鑷子壓住它， 以阻止HBSS倒流，導(dǎo)致肺明顯地被液體充脹。然后，通過(guò)簡(jiǎn)單地放松對(duì) 氣管的按壓，使包含肺灌洗細(xì)胞的液體從肺中自排出。在一些案例中，以 剪刀平端輕輕地將肺壓下以協(xié)助剩余灌洗液的排出。將在培養(yǎng)亞中收集的 細(xì)胞懸浮物轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的15ml錐形塑料管中，并在臺(tái)式臨床離心機(jī)中以 1, 500 RPM離心IO分鐘。將來(lái)自每個(gè)胎兒肺灌洗液的回收細(xì)胞沉淀懸浮 于培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10%胎牛血清、丙酮酸鈉(1 mM; Mediatech Cellgro， Cat. No. 25畫(huà)000-Cl)、非必需^J^酸(IX; Mediatech Cellgro Cat. No. 25-025-C1)的RPMI-1640，并獨(dú)立地置于6-孔板(Sarstedt)的一個(gè)孔 中用于進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。將每個(gè)孔以l-8進(jìn)行標(biāo)記，以獨(dú)立地標(biāo)識(shí)從8只胎 兒的每一只中純化的細(xì)胞。最初將來(lái)自每個(gè)胎兒肺灌洗液的大約10,000 個(gè)細(xì)胞置于培養(yǎng)物中。這些培養(yǎng)物的生長(zhǎng)到第5天時(shí)顯現(xiàn)。大塊細(xì)胞出現(xiàn) 于來(lái)自胎兒#1、 3、 6、 7和8的培養(yǎng)物中。
在培養(yǎng)起始后12天時(shí)，通過(guò)輕輕地^v從所有8只胎兒肺灌洗細(xì)胞 培養(yǎng)物收獲非粘附及+>歉粘附的細(xì)胞，并使用Ficoll-Hypaque 1077通過(guò) 等密度離心進(jìn)行純化。這一點(diǎn)的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)，將細(xì)胞懸浮物轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的 15 ml錐形塑料管中，所述錐形塑料管以3-4 ml的溫Ficoll-Hypaque 1077 鋪在下面，然后在室溫下400 g離心30分鐘。收獲離心后在Ficoll-Hypaque 1077和培養(yǎng)基之間的界面處獲得的細(xì)胞帶，以HBSS洗滌2次并且每次 均通過(guò)離心回收細(xì)胞。在第二次離心后，將來(lái)自每只個(gè)體胎兒肺灌洗培養(yǎng) 物的回收細(xì)胞沉淀懸浮于3ml的培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10%胎牛血清、丙酮 酸鈉(1 mM; Mediatech Cellgro, Cat. No. 25誦000畫(huà)C1 )、非必需^J^酸(IX; Mediatech Cellgro Cat. No, 25-025-C1)的RPMI-1640,并獨(dú)立地置于6-孔板(Sarstedt)的一個(gè)孔中以用于進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并標(biāo)記1-8，這直接對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)物的原始標(biāo)記。在5天后向所有細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)料2 cc的新鮮培養(yǎng) 基。在9天后，懸浮細(xì)胞以及粘附細(xì)胞的顯著生長(zhǎng)出現(xiàn)于來(lái)自標(biāo)記為3和 6的胎兒肺灌洗細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)物中，這表現(xiàn)為懸浮液中生長(zhǎng)有顯著數(shù)量的巨噬細(xì)胞集落以及術(shù);*粘附的圓形巨噬細(xì)胞。出現(xiàn)了許多較大的球形合體細(xì)胞，它們被較小的巨噬細(xì)胞包圍形成一種表現(xiàn)為細(xì)胞冠(cellular crown)的結(jié)構(gòu)。在培養(yǎng)開(kāi)始后26天時(shí)，向該細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)料補(bǔ)充5 ng/ml的MCSF (小鼠；Sigma-Aldrich Product No. M9170 )的新鮮培養(yǎng) 基。在5天后，懸浮液中生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞集落以及^^:粘附于培一表面 的巨噬細(xì)胞集落的旺盛生長(zhǎng)出現(xiàn)于源自胎兒約、#6和#8的培養(yǎng)物中。這 些系分別被命名為ZMAC1207-3、 ZMAC1207-6和ZMAC1207-8,并且 通過(guò)轉(zhuǎn)移至T75燒瓶的補(bǔ)充有5-10 ng/ml的MCSF培養(yǎng)基中在數(shù)天后裙: 擴(kuò)大。關(guān)于通過(guò)引用的方式納入及變化方案的聲明本申請(qǐng)通篇所提到的所有參考文獻(xiàn)，例如包括公開(kāi)或授權(quán)的專(zhuān)利或同 等物的專(zhuān)利文獻(xiàn)、專(zhuān)利申請(qǐng)7>布文本、未公布的專(zhuān)利申請(qǐng)和非專(zhuān)利文獻(xiàn)或 其他來(lái)源的資料，全部?jī)?nèi)容都通過(guò)引證的方式納入本文，如它們被通過(guò)引 證的方式逐一納入本文一樣。假如引用的文獻(xiàn)和本申請(qǐng)公開(kāi)內(nèi)容之間存在 任何不一致，則以本文公開(kāi)內(nèi)容為準(zhǔn)。本文所提供的某些參考文獻(xiàn)通過(guò)引 證的方式被納入本文以提供信息，例如關(guān)于本發(fā)明的起始原料來(lái)源、其他 起始原料、其他試劑、其他合成方法、其他分析方法、其他生物材料、其 他細(xì)胞和其他用途的詳細(xì)資料。本文提到的所有專(zhuān)利和公布文本代表了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 的技術(shù)水平。本文引用的參考文獻(xiàn)可顯示出到它們的公布日或提交日為止 的現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)，而且如果需要，本文可意欲使用這一信息以排除處于現(xiàn) 有技術(shù)中的具體實(shí)施方案。例如，當(dāng)本發(fā)明要求保護(hù)物質(zhì)的組合物時(shí)，應(yīng) 理解在本申請(qǐng)人的發(fā)明之前本領(lǐng)域已知的和可得到的化合物，包括本文引 用的文獻(xiàn)中充分公開(kāi)的化合物，不意欲包括在本發(fā)明要求保護(hù)的物質(zhì)的組 合物中。本文的任何附錄都通過(guò)引證的方式作為說(shuō)明書(shū)和/或附圖的一部 分納入本文。本文中使用的詞語(yǔ)"包括"、"包含"、"包含有"或"含有"應(yīng)被理解為說(shuō)明存在所提到的特征、整體、步驟或組分，但不排除一種或多種其 他特征、整體、步驟、組分或其組合的存在或加入。因此本文所用的包括 是包含、含有、具有或特征為的同義詞，而且是包含性的或開(kāi)放式的。本 文所用的"由……組成"不包括權(quán)利要求的描述中未說(shuō)明的任何元素、步 驟或成分等。本文所用的"主要由…組成"不排除對(duì)權(quán)利要求的基本特性 和新特性(如涉及活性成分)不會(huì)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性影響的物質(zhì)或步驟。在本文 的每種情況下，詞語(yǔ)"包括"、"主要由…組成"和"由…組成"中的任一 個(gè)均可被其他兩個(gè)詞語(yǔ)中的任一個(gè)替換，從而公開(kāi)了不同的不必同延的實(shí) 施方案和/或范圍。在適當(dāng)?shù)那闆r下，本文中示例性描述的本發(fā)明可在缺 少本文未具體公開(kāi)的任何一個(gè)或多個(gè)元素或者一個(gè)或多個(gè)限制的情況下 實(shí)施。只要本文公開(kāi)一個(gè)范圍，如溫度范圍、時(shí)間范圍、組分或濃度范圍， 或者其他值的范圍等，則該公開(kāi)中意欲包括所有的居間范圍和子范圍以及 指定范圍內(nèi)的所有單個(gè)值。本發(fā)明不受限于所公開(kāi)的實(shí)施方案，包括任何在附圖中顯示或在說(shuō)明書(shū)中示例的實(shí)施方案；那些所公開(kāi)的實(shí)施方案以實(shí) 例或例證的方式給出，而且沒(méi)有限制作用。應(yīng)理解本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中所包括 的范圍或子范圍內(nèi)的任何子范圍或單個(gè)值均可被排除在本發(fā)明權(quán)利要求 之外。已經(jīng)根據(jù)多種具體的和/或優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描 述。但是，應(yīng)理解只要保持在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)，許多變化和修改 也是允許的。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言將會(huì)清楚的是，除了在本文中具 體指出的以外，還可以采用本文所廣泛公開(kāi)的其他組合物、方法、i殳備、 設(shè)備元件、材料、操作和技術(shù)用于實(shí)施本發(fā)明，而不需借助于過(guò)度實(shí)驗(yàn)； 除了具體示例性的那些以外，這可以延伸到例如，其他起始原料、生物材 料、試劑、合成方法、純化方法、分析方法、試驗(yàn)方法和生物學(xué)方法。本 發(fā)明意欲包括本文前述內(nèi)容(如組合物、方法、設(shè)備、設(shè)備元件、材料、 操作和技術(shù)等)的所有本領(lǐng)域已知功能等效物。所使用的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)用于 描述而不作為限制，并且這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)的使用并不意欲排除所顯示和描 述的特征或其部分的任何等效物，但是應(yīng)認(rèn)識(shí)到可在所要求保護(hù)的本發(fā)明 范圍內(nèi)做多種修改。因此，應(yīng)理解盡管已通過(guò)實(shí)施方案、優(yōu)選實(shí)施方案和 任選特征具體公開(kāi)了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可能采取本文所公開(kāi)概念 的修改和變化；而且這些修改和變化應(yīng)被認(rèn)為是處在所附的權(quán)利要求書(shū)所30限定的本發(fā)明范圍之內(nèi)。 參考文獻(xiàn)美國(guó)專(zhuān)利1996年4月23公布的Sanderson等人發(fā)明的US 5,510,258; 1996年12月24公布的Sanderson等人發(fā)明的美國(guó)專(zhuān)利 5,587,164; Chladek等人發(fā)明的US 5,476,778，公布于1995年12月 19日；US 6241990; US 6110468; 2000年03月28日公布的US6042830; 1999年11月23日公布的US 5989563; US 5846805; US6660513; US7081342;藝806086; US6500662;驅(qū)498008; US6455245; US6251404; US6197310; US 5583053; US 6210963; US 5840563; 1999 年7月20日公布的US 5925359; 1997年12月16日公布的US 5,698,203。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文本20060063151; David等人發(fā)明的 US20030219460A1 (用于病毒培養(yǎng)物的棉鼠肺細(xì)胞；細(xì)胞系A(chǔ)TCC PTA-3930) ; Calvert等人發(fā)明的US 20050271685。公布于1998年8月13日的PCT國(guó)際公布WO9835023A1; 7〉布 于1998年12月10日的W09855626A2。■sz_>-ZLZI-:9_- SL5600UO 9661- -,le 3 JSL500.9寸-8s:(8)62:6nv goz "ul 一o一g 1190 -le 19 -a.90卜9II-0Z9 .d:(9)0z -9661. .6nv ->60|0」！> jo leu」no「rle卄9 乂y xne!ABM■>syyd io s忠elos一 PI9E 1U9。9y`0M1 pue -S9sy> OCUV -(2￡sy> o。lv) 9u!8e> 9￡ i.o u一e」ls 1U9」ed 9￡ -(>,=/\-wyyd C-BAI96U一) 9UP0B> (>syyd) snj!> 9E0JPUAS AJ0:!e」！ds9y pue 9A一pnpo」d9y9L-PJ0d 9>n P9￡P(guān)01Z\- ei.o s。！一s!」9pe」en3 16。！60lo!g pue Jeln。9lolAl j.o uos一JBdE03寸寸8L 1.Ize&I4 .d ,2002 d9a -A60la-!/uo「-.一e 一91 6一uss9一JdoS2-6 -(2-I.HZ -(0002) A60lo!q0」01AJeu!」919> -0」1!> u！ s96BL-doJ0eE」el09A一e 9u!。J0d uo (！，6MJ 9lelos一) snj!> 9E0JPUASAJ0卄eJ!ds9J pue SA!pnpo」d9J 9UPJ0d io Sp①y3 --le 1①1-6U!I/M -nol工ouo J01d909J 9乂一lu!Jed9LI e 01 sn」！> 9LL5JPUAS AJ01e」！ds9」pue 9A!pnpoJd9」3up」0d1L5ELPewe u一 u!9;0」d x!」leE 9￡ io WU9E9AI0AUI .le 一91-d 9Hndl^a95i -S寸CH -(SOS) SPIIA-leo!60IOJ!>;o leu」no「.A一一l!q!ld93sns sn」j> pue uo!lezj」9peJBLP IB!ted .s96BL-do」0BEJe一09Ale Ea4 p9g-0I9A9P S9U!一 1190 9UPJ0d snonu!luoo .le 一9 -_/\IH Ite6u!9MN9T卜卜r -(r)8i4 -(§2) A6。lo」！/u。 SI。JV.sn」一A 9E0JPUAS 9A!pnpoJd①」pue AJ01eJ!ds9」9UPJ0d jo L-0!P9;u！ u！ P9>l0>ujsu!910」dooAI6 96eL-do」oeLU Jel09>le 9u!0Jod io U0jle3!tlu9pl .le卄9 乂u!ss一Ml-CH9-寸606 -(908卜-(寸002) A60lo」！/vio leujn0「，snJ!A 9￡ uo ppe o!le!s Aq P91B!P9Es！ ss6BL-do」oeE JBI09Ale i.o U0jp9iu！ sn」！A!J9te 9L-PJ0d .一e Jd 9Hndl9aM0e:/6S城 ft K- 輯 i .0I寸z-0008800s一9-69_.￡:(2二6卜；9_- un「S61 .poo一g -IB 一9 l一9p!Jg.卜-CH寸s:(OT)e8; 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權(quán)利要求
1.一種能夠繁殖PRRS病毒的分離的非猿猴細(xì)胞，其中所述非猿猴細(xì)胞獲自一個(gè)動(dòng)物個(gè)體并被培養(yǎng)至少5個(gè)傳代。
2. —種能夠,皮PRRS病毒感染及/或繁殖PRRS病毒的分離的豬胎肺細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求2的細(xì)胞，所述細(xì)胞為肺泡巨噬細(xì)胞。
4. 權(quán)利要求2或3的細(xì)胞，所述細(xì)1&^培#^中繁殖至少5個(gè)傳代。
5. 權(quán)利要求2或3的細(xì)胞，所述細(xì)M培養(yǎng)物中繁殖至少10個(gè)傳代、20個(gè)傳代及/或50個(gè)傳代。
6. —種獲自豬胎肺的分離的原代細(xì)胞或細(xì)胞群。
7. 權(quán)利要求6的細(xì)胞或細(xì)胞群，其中所述胎兒有約30天-約90天的孕齡。
8. 權(quán)利要求6的細(xì)胞或細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞為肺泡巨噬細(xì)胞，或者所述細(xì)lfe^包含至少一種肺泡巨噬細(xì)胞。
9. 權(quán)利要求l-8的^項(xiàng)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞以被命名為ZMAC-1的細(xì)胞或者以美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心指定為ATCC專(zhuān)利保藏編號(hào)PTA-8764的保藏物或^#生物為^4。
10. 權(quán)利要求1-3及6-9任一項(xiàng)的細(xì)胞的永生化的細(xì)胞變體或衍生物。
11. 一種生成PRRS病毒子代的方法，包括a) 提#~~種能夠復(fù)制PRRS病毒的分離或純化的非猿猴細(xì)胞，其中所述非猿猴細(xì)l&^培養(yǎng)至少5個(gè)傳代；b) 將所述非猿猴細(xì)J!^露于所述PRRS病毒；并且c) 使得所述PRRS病毒在所述細(xì)胞中復(fù)制；從而生成PRRS病毒的子代。
12. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述非猿猴細(xì)胞獲自一個(gè)動(dòng)物個(gè)體。
13， 一種產(chǎn)生PRRS疫苗的方法，包括提供PRRSV的一種改良的活病毒(MLV)毒株，并JL^一種能夠復(fù)制所述PRRSV MLV毒林的分離或純化的非猿猴細(xì)胞中培養(yǎng)所述MLV毒林。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述非猿猴細(xì)胞為豬肺泡巨噬細(xì)胞。
15. 權(quán)利要求13或14的方法，其中所述非猿猴細(xì)胞為豬肺泡巨噬細(xì)胞原代細(xì)胞、細(xì)lfe^、它們的變體或矛汴生物。
16. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所迷細(xì)胞選自ZMAC和FBAL-A。
17. 權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞選自ZMAC和FBAL-A。
18. 權(quán)利要求11-16任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞以被命名為ZMAC-1的細(xì)胞或者以美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品M中心指定為ATCC專(zhuān)利保藏編號(hào)PTA-8764的保藏物或*#生物為>(&。
19. 一種被命名為ZMAC-1或以美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心指定為ATCC專(zhuān)利保藏編號(hào)PTA-8764的保藏物或其矛;f生物為代表的細(xì)M細(xì)胞系。
20. —種被命名為FBAL-A的細(xì)lfe^細(xì)胞系。
21. —種從豬胎肺中分離細(xì)胞的方法，包括提#-個(gè)豬胎受絲；^J斤述受試者獲得包含細(xì)胞的支氣管肺泡灌洗樣品；并JU^斤述樣品分離細(xì)胞組分；從而分離所述細(xì)胞。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述包含細(xì)胞的樣品為支氣管肺泡灌洗樣品。
23. 權(quán)利要求21的方法，其中所述樣品為任i^M^:^L/或勻漿化處理的切割組織樣品。
24. —種培養(yǎng)病毒的方法，包括(a)從豬胎肺分離細(xì)胞；(b)培養(yǎng)所述細(xì)胞；并且(c)將所述細(xì)胞與所述病4^觸以使病毒復(fù)制；從而培養(yǎng)所述病毒。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中所述病毒為PRRS病毒。
26. 權(quán)利要求24或25的方法，其中所述培養(yǎng)包括將所述細(xì)g代至少5個(gè)傳代并且/或者連續(xù)培養(yǎng)所述細(xì)胞至少10天。
27. 權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的方法，其中所述分離^^OR權(quán)利要求21。
28. —種包含a利要求1-9任一項(xiàng)的細(xì)胞中或者在權(quán)利要求10的永生化細(xì)胞中培養(yǎng)的病毒的組合物。
29. 權(quán)利要求28的組絲，其中所述病毒為PRRS病毒。
30. 權(quán)利要求11-18及24-27任一項(xiàng)的方法，還包括將所述細(xì)胞與一種生長(zhǎng)因子組*相>^觸。
31. ^'J要求30的方法，其中所述生長(zhǎng)因子組#包含巨噬細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了與使用非猿猴細(xì)胞生長(zhǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)相關(guān)的組合物和方法。在一個(gè)具體的實(shí)例中，所公開(kāi)的豬肺泡巨噬細(xì)胞具有支持PRRSV感染及繁殖的能力。本發(fā)明公開(kāi)的細(xì)胞或細(xì)胞系可用于包括疫苗技術(shù)在內(nèi)的與PRRS疾病相關(guān)的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/02GK101668846SQ200880007410
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2008年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月12日
發(fā)明者F·A·祖克曼 申請(qǐng)人:伊利諾伊大學(xué)評(píng)議會(huì)