專利名稱：修飾微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生有用的蛋白質(zhì)或多肽的微生物，以及產(chǎn)生該 蛋白質(zhì)或多肽的方法。
背景技術(shù)：
微生物用于工業(yè)生產(chǎn)多種有用物質(zhì)，包括食品，如酒精飲料、味 噌、和醬油，還包括氨基酸、有機(jī)酸、核酸相關(guān)物質(zhì)、抗生素、糖類、 脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。這些物質(zhì)具有廣泛的應(yīng)用，諸如食品、藥物、洗滌劑、 化妝品和其他日用品、以及作為多種化學(xué)產(chǎn)品的原料。
在微生物中，革蘭氏陽性細(xì)菌如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌和巨大 芽孢桿菌具有非常高的分泌多種胞外酶的能力，諸如淀粉酶、蛋白酶 和脂肪酶。實(shí)際上，目前在工業(yè)中應(yīng)用許多由桿菌產(chǎn)生的胞外酶。由 細(xì)菌作為分泌物產(chǎn)生某些蛋白質(zhì)的有用之處在于，例如，分泌的蛋白 質(zhì)通常具有其天然結(jié)構(gòu)，并且因此分泌的蛋白質(zhì)可很容易被純化。因 此，改善此類細(xì)菌株以便增加特定分泌性蛋白質(zhì)的分泌和產(chǎn)生量是非 常有意義的。
位于原核生物的外膜和周質(zhì)間隙的許多蛋白質(zhì)通過See轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu) 介導(dǎo)而通過細(xì)胞質(zhì)膜。建立了一種由SecY/SecE/SecG組成的異三聚體 膜蛋白復(fù)合體、和與SecD/SecF/YajD異三聚體膜蛋白復(fù)合體弱結(jié)合的 外周結(jié)合的二聚SecA制成的跨膜通道，并且該蛋白借助于來自SecA 的ATP水解產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)位而通過膜。已知如果細(xì)菌是大腸埃希氏桿 菌，則通過分子伴侶SecB識(shí)別前分泌蛋白質(zhì)，并且傳遞至細(xì)胞質(zhì)膜表 面上的SecA。在枯草桿菌中仍然沒有識(shí)別出與分子伴侶SecB同源的 因子，但相信枯草桿菌具有SRP (信號(hào)識(shí)別粒子)，特征性地參與跨 真核生物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)位、以及分泌蛋白質(zhì)從SRP向SecA的移交。 己經(jīng)顯示枯草桿菌的SecA由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域， N結(jié)構(gòu)域具有ATP結(jié)合位點(diǎn)I (ABS I)和信號(hào)肽結(jié)合位點(diǎn)，C結(jié)構(gòu)域具有參與SecA二聚作用并且與SecY相互作用的位點(diǎn)、以及與大腸埃 希氏桿菌的SecB結(jié)合位點(diǎn)同源的區(qū)域，并且ATP結(jié)合位點(diǎn)II(ABS II) 以與兩個(gè)結(jié)構(gòu)域排列的方式存在。
到目前為止，已有報(bào)道遺傳修飾，諸如蛋白酶的刪除(非專利文 件l)、 PrsA產(chǎn)生的增加(非專利文件2)、 SecD/SecE/SecDF的過度表 達(dá)(專利文件l)、以及SecG的過度表達(dá)(專利文件2)，作為用于增 加蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn)生的技術(shù)。
然而，對(duì)于使SecA的一些氨基酸殘基缺失以增加蛋白質(zhì)的分泌產(chǎn) 生還沒有報(bào)道。 Olmos-Soto J, Contreras-Flores R. Genetic system constructed to overproduce and secrete proinsulin in Bacillus subtilis (構(gòu)建 為在枯草桿菌中過度產(chǎn)生和分泌胰島素原的遺傳系統(tǒng)).Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 Sep; 62 (4): 369-73。 Vitikainen M， Hyyrylainen HL, Kivimaki A， Kontinen VP， Sarvas M. Secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis can be improved by engineering cell components affecting post-translocational protein folding and degradation(通過設(shè)計(jì)影卩向轉(zhuǎn)位后 蛋白質(zhì)折疊和降解的細(xì)胞成分能夠改善在枯草桿菌中分泌異源蛋白 質(zhì)) J Appl Microbiol.2005; 99 (2): 363-75。 WO99/04007 WO99/0400
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明具有下列1)至3)方面。
1) 一種微生物，其被基因修飾以使secA的60-80個(gè)羧基末端氨 基酸缺失；
2) —種重組體微生物，其通過將編碼異源蛋白質(zhì)或多肽的基因 導(dǎo)入修飾微生物株中而構(gòu)建；以及
3) —種使用重組體微生物產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽的方法。


圖la是SAN819和SAN780株的secA基因位點(diǎn)周圍的基因組結(jié) 構(gòu)的視圖lb是確認(rèn)在SAN819和SAN780株中表達(dá)的SecA的大小的電 泳圖譜；
圖2a是構(gòu)建干擾素表達(dá)載體的方法的視圖2b是被導(dǎo)入干擾素表達(dá)載體pHKK3201中的枯草桿菌淀粉酶 AmyE信號(hào)肽和pro序列、以及干擾素-(x成熟區(qū)的融合蛋白的結(jié)構(gòu)的視 圖3a是顯示通過Western印跡，在將pHKK3201導(dǎo)入宿主株 SAN780和SAN819中后產(chǎn)生的干擾素-cc的檢測(cè)結(jié)果的視圖；1道當(dāng) 親代168株為宿主時(shí)；2道當(dāng)ASN780株為宿主時(shí)；3道當(dāng)ASN819 株為宿主時(shí)；
圖3b是圖3a的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖解形式；基于Western印跡的條帶強(qiáng) 度比較相對(duì)的IFNa蛋白質(zhì)量。野生型株中IFNa的量設(shè)定為100%， 誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)偏差；以及
圖4是顯示通過Western印跡，在將pHKK3202導(dǎo)入宿主株SAN780 和SAN819中后產(chǎn)生的干擾素-卩的檢測(cè)結(jié)果的視圖；l道當(dāng)親代168 株為宿主時(shí)；2道當(dāng)ASN780株為宿主時(shí)；3道當(dāng)ASN819株為宿 主時(shí)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及提供具有較高的蛋白質(zhì)或多肽分泌產(chǎn)生能力的微生 物、以及使用該微生物產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽的方法。
本發(fā)明人檢驗(yàn)了桿菌中分泌性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)位機(jī)構(gòu)的組成，并且發(fā)現(xiàn) 當(dāng)基因被修飾以使20-30或60-80、特別是60-80個(gè)SecA的羧基末端 氨基酸缺失時(shí)，分泌產(chǎn)生的能力提高，并且此基因修飾的微生物可用 于產(chǎn)生蛋白質(zhì)和多肽。
SecA是涉及分泌性蛋白質(zhì)分泌至細(xì)菌細(xì)胞外部的因子。當(dāng)使SecA 缺失時(shí)，不僅蛋白質(zhì)的產(chǎn)生減少，而且細(xì)胞本身也會(huì)死亡。因此，SecA 被認(rèn)為是分泌機(jī)制的基本因子。因此，當(dāng)使SecA的一些氨基酸殘基缺失時(shí)，細(xì)菌分泌產(chǎn)生蛋白質(zhì)的能力提高這一發(fā)現(xiàn)是非常出人意料的。 通過使用本發(fā)明的修飾微生物可有效地產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽， 并且蛋白質(zhì)或多肽可以很容易地從培養(yǎng)液中回收。因此，本發(fā)明可用 于工業(yè)生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽。
在本發(fā)明中，使用Lipman-Pearson法(Science, 227， 1435 (1985))
來測(cè)定氨基酸序列和堿基序列的同一性。為了更具特異性，使用遺傳 信息處理軟件Genetyx-Win (Software Devel叩ment)的同源性搜索程 序，并且進(jìn)行分析，采用單位大小來比較為2的(ktup)參數(shù)，以計(jì)算同 源性。
本發(fā)明的微生物(宿主微生物)可以是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性 細(xì)菌，只要它具有編碼SecA的基因，但優(yōu)選革蘭氏陽性細(xì)菌，因?yàn)樗?們具有通過分泌向細(xì)胞外產(chǎn)生蛋白質(zhì)的能力。其中，優(yōu)選桿菌屬，并 且特別優(yōu)選枯草桿菌，因?yàn)槠淙炕蚪M信息是可獲得的，并且遺傳 工程和基因組工程技術(shù)已經(jīng)被很好地建立。
在本發(fā)明的修飾微生物中，要修飾的目標(biāo)基因是編碼SecA的基因。
SecA是涉及細(xì)菌中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通路的因子(蛋白質(zhì))之一。其 連同跨膜通道(SecY/SecE/SecG)具有向細(xì)菌細(xì)胞外分泌分泌性蛋白 質(zhì)的功能?？莶輻U菌SecA (841個(gè)氨基酸，分子量95.3KDa)由兩個(gè) 結(jié)構(gòu)域組成，N結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域。N結(jié)構(gòu)域具有ATP結(jié)合位點(diǎn)I (ABS I)和信號(hào)肽結(jié)合位點(diǎn)。C結(jié)構(gòu)域具有參與SecA二聚作用并且與SecY 相互作用的位點(diǎn)，以及與大腸埃希氏桿菌的SecB結(jié)合位點(diǎn)同源的區(qū)域， 并且ATP結(jié)合位點(diǎn)II (ABSII)已知以與兩個(gè)結(jié)構(gòu)域排列的方式存在。
枯草桿菌SecA和功能上與其等價(jià)的蛋白質(zhì)可以被列舉為本發(fā)明 中適于修飾的SecA的實(shí)例，并且編碼枯草桿菌SecA或功能上與其等 價(jià)的蛋白質(zhì)的基因可以被列舉為編碼SecA的基因的實(shí)例。
更具體地，"枯草桿菌SecA或功能上與其等價(jià)的蛋白質(zhì)"是指下 面(A)至(C)中所述的蛋白質(zhì)。
(A) 具有SEQIDNO:2所代表的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(B) 具有SEQ ID NO: 2所代表的氨基酸序列中缺失、取代或添 加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且其還具有與SecA相同的功能；禾口
(C)具有與SEQ ID NO: 2所代表的氨基酸序列具有80%或更高 同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且其還具有與SecA相同的功能。
在此，"SEQIDNO:2所代表的氨基酸序列中缺失、取代或添加一 個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸"包括缺失、取代或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)，優(yōu)選1-10個(gè)氨 基酸的氨基酸序列，并且此處"添加"包括在兩個(gè)末端添加1至數(shù)個(gè) 氨基酸。
在此，"與SEQ ID NO: 2所代表的氨基酸序列具有80%或更高同 一性的氨基酸序列"優(yōu)選是具有90%或更高同一性、更優(yōu)選95%或更 高同一性、并且甚至更優(yōu)選99%或更高同一性的氨基酸序列。
此外，"具有與SecA相同的功能"是指具有實(shí)際上與SecA的功能 相同的功能，諸如與SecA類似的ATP酶活性、以及與SecY/SecE復(fù) 合體結(jié)合的能力。
在此，"編碼枯草桿菌SecA或功能上與其等價(jià)的蛋白質(zhì)的基因" 是指編碼上面(A)至(C)中所述的蛋白質(zhì)的基因。但更優(yōu)選地，它 代表下面(a)至(c)所述的基因。
(a) 具有SEQIDNO: 1所代表的堿基序列的DNA;
(b) 在嚴(yán)格條件下與具有與SEQ ID NO: 1所代表的堿基序列互 補(bǔ)的堿基序列的DNA雜交，并且還編碼與SecA具有相同功能的蛋白 質(zhì)的DNA;禾口
(c) 具有與SEQ ID NO: 1所代表的堿基序列具有80%或更高同 一性的堿基序列，并且還編碼與SecA具有相同功能的蛋白質(zhì)的DNA。
在此，在分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第三版(Molecular Cloning畫A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION) [Joseph Sambrook， David W. Russell, Cold Spring Harbor LaboratoryPress]中描述的方法可被引用 為"嚴(yán)格條件"的實(shí)例。例如，其可以是使用探針在含有6xSSC(lxSSC 的組成0.15M氯化鈉、0.015 M檸檬酸鈉，pH7.0)、 0.5% SDS和5x Denhardt溶液、禾tl 100 mg/mL鯡魚精DNA的溶液中，在65°C的恒溫 下進(jìn)行8-16h雜交的條件。
在此，"與SEQ ID NO: 1所代表的堿基序列具有80%或更高同一 性的堿基序列"優(yōu)選地是具有90%或更高同一性、更優(yōu)選95%或更高同一性、并且甚至更優(yōu)選99%或更高同一性的堿基序列。
DNA可從天然來源獲得。但有可能使用已知的技術(shù)來制備，諸如 定點(diǎn)突變誘導(dǎo)。例如，其可通過使用突變誘導(dǎo)試劑盒[Mutant-super Express Km Kit (Takara)]，使用定點(diǎn)突變誘導(dǎo)的方法導(dǎo)入突變來制備。
編碼枯草桿菌SecA的基因序列(SEQ ID NO: 1)已經(jīng)登載在 JAFAN (Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (曰本枯 草桿菌功能分析網(wǎng)絡(luò))(BSORF DB)， http:〃bacillus.ge醒e.ad.ip/， 2006 年1月18日更新)，且編碼非枯草桿菌SecA的基因，諸如大腸埃希氏 桿菌，列舉在Colibri (http:〃genolist.pasteur.fr/Colibri/)數(shù)據(jù)庫(kù)中。大 量的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的基因組登載在TIGER (http:〃cmr.tigr.org/tigr-scri。ts/CMR/CmrHomePage.cgi)。
在本發(fā)明中要缺失的SecA的羧基末端氨基酸的數(shù)目為20-30或 60-80。優(yōu)選使60-80個(gè)氨基酸缺失。
在枯草桿菌中，SecA由841個(gè)氨基酸組成(SEQIDNO: 2)。優(yōu)選 從SEQIDNO:2刪除氨基酸820 (含)至841 (含)(也稱為N819)， 或刪除氨基酸781 (含)至841 (含)(也稱為N780)。更優(yōu)選刪除氨 基酸781 (含)至841 (含)(N780)。
枯草桿菌SecA在其羧基末端具有CTD區(qū)(C-末端區(qū)結(jié)構(gòu)域；見 J.B.C. (2004) 279 (21)， p22490-22497)。 CTD區(qū)的22個(gè)C-末端氨基酸 構(gòu)成與大腸埃希氏桿菌的SecB結(jié)合位點(diǎn)同源的區(qū)域，并且CTD區(qū)在 其N-末端具有由61個(gè)氨基酸組成的區(qū)域，稱為CTL區(qū)(C-末端末端 連接子；見Science (2002) 297 (5589), p2018-2026)。在枯草桿菌中，在 此區(qū)中發(fā)生與Ffh (54同源物，SRP54同源物)的結(jié)合，F(xiàn)fh是信號(hào)識(shí) 別粒子(SRP)的組分。附帶地，CTL的與Ffh結(jié)合的區(qū)域?qū)?yīng)的區(qū)域 位于氨基酸781-819的區(qū)域中。
因此，本發(fā)明的基因修飾包括單一地或組合地刪除上述區(qū)域或與 其同源的區(qū)域，并且優(yōu)選基因修飾刪除Ffh結(jié)合區(qū)域或與該Ffh結(jié)合區(qū) 域同源的區(qū)域。
在本發(fā)明中，可使用例如同源重組的方法作為修飾編碼SecA的基 因的方法。換句話說，含部分目標(biāo)基因的DNA片段可在適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載 體中克隆，并且由此獲得的環(huán)狀重組體質(zhì)粒可隨后被摻入進(jìn)親代微生物的細(xì)胞中。然后，通過在作為目標(biāo)基因的一部分的區(qū)域處的同源重
組，親代微生物的基因組中secA基因的目標(biāo)片段可被切掉而缺失。
尤其當(dāng)使用枯草桿菌作為構(gòu)建本發(fā)明的微生物的親代微生物時(shí)， 因?yàn)橛袔追N已報(bào)道的通過同源重組刪除目標(biāo)基因的方法(Mol. Gen. Genet., 223， 268, 1990等)，因此任一此類方法可用來產(chǎn)生本發(fā)明的宿 主微生物。
在以下部分，我們更具體地描述使用通過重組DNA技術(shù)制備的 DNA片段刪除一部分SecA的方法。
用于刪除部分SecA的DNA片段是其中secA基因的3'端的基因區(qū) 被部分修飾的基因序列。在各端至少有一個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。 使用這些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和含這些限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物通過標(biāo) 準(zhǔn)方法可制備DNA片段，例如，通過PCR擴(kuò)增使用枯草桿菌基因組 DNA作為模板。而且，DNA片段的3'端引物具有在編碼作為缺失目標(biāo) 的SecA蛋白C-末端區(qū)的基因上游緊接的編碼終止密碼子的插入基因 序列。
為了構(gòu)建質(zhì)粒，此片段在例如pDH88等的整合載體的多克隆位點(diǎn) 處插入，使得能夠通過可遺傳轉(zhuǎn)化的革蘭氏陽性細(xì)菌樣枯草桿菌的遺 傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行同源重組。
通過將質(zhì)粒導(dǎo)入枯草桿菌或類似物，并且進(jìn)行同源重組，我們可 獲得其中質(zhì)粒被插入染色體中的菌株(SecA部分缺失的菌株)。由此 獲得的菌株的染色體上的基因組結(jié)構(gòu)圖示在圖la中。在具有插入物的 菌株中，由于位于待刪除的區(qū)域之前的終止密碼子，在染色體上表達(dá) 的SecA蛋白的翻譯中途停止。因此，只有缺少SecA的C-末端區(qū)的所 需蛋白可被表達(dá)。
可通過將編碼所需異源蛋白質(zhì)或多肽的基因?qū)胗纱双@得的修飾 微生物的菌株中，獲得本發(fā)明的重組體微生物。
對(duì)要通過本發(fā)明的重組體微生物產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽沒有特 別的限制。例如，其可以是生理學(xué)活性肽，或用于洗滌劑、食品、纖 維、飼料、化學(xué)產(chǎn)品、醫(yī)用和診斷產(chǎn)品等中的工業(yè)酶。
生理學(xué)活性肽的實(shí)例包括由例如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、 HIV、和流感病毒的致病病毒的基因組編碼的蛋白質(zhì)，禾B G-蛋白結(jié)合
9受體、生長(zhǎng)因子(血小板生長(zhǎng)因子、血液干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)/營(yíng)養(yǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 胰島素樣生長(zhǎng)因子等)、腫瘤壞死因子、干擾素、白介素、促紅細(xì)胞生 成素、粒細(xì)胞集落剌激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白蛋白和人生 長(zhǎng)激素。
工業(yè)用酶包括氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、
和連接酶/合成酶，且更適合地，水解酶如纖維素酶、a-淀粉酶和蛋白 酶。
被導(dǎo)入進(jìn)本發(fā)明的微生物中的目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的基因優(yōu)選地在 其上游側(cè)具有與基因的轉(zhuǎn)錄以及隨后的翻譯和分泌有關(guān)的控制區(qū)。換 句話說，其優(yōu)選具有選自包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)、 包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)和起始密碼子的翻譯起始區(qū)、和分泌信號(hào)肽區(qū)的 一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)亟M合的區(qū)。
在此，轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)是包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的區(qū)，并且核 糖體結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)應(yīng)于Shine-Dalgamo (SD)序列的位點(diǎn)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74， 5463 (1974))，該位點(diǎn)與起始密碼子一起形成翻譯起 始控制區(qū)。
含有所需異源蛋白質(zhì)或多肽的基因的上述DNA片段、和適當(dāng)?shù)馁|(zhì) 粒載體組合以形成重組質(zhì)粒。本發(fā)明的重組體微生物可通過將此重組 質(zhì)粒通過普通的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入進(jìn)宿主微生物細(xì)胞中而獲得。本發(fā) 明的重組體微生物也可通過直接將結(jié)合有與宿主微生物的基因組同源 的適當(dāng)區(qū)域的上述DNA片段引入至宿主微生物的基因組中來獲得。
使用本發(fā)明的重組體微生物產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)或多肽可采取以下步 驟將細(xì)菌菌株接種在含有可同化碳和氮源以及其他必需組分的培養(yǎng) 基中，通過普通的微生物培養(yǎng)方法培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)后收獲并純化蛋 白質(zhì)或多肽。如在后面所述的實(shí)施例中所證明的，與使用具有未基因 修飾的SecA的微生物的情況相比，目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的生產(chǎn)率增加。
下面，我們將更詳細(xì)地描述構(gòu)建本發(fā)明的重組體微生物的方法、 以及使用該重組體微生物產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。實(shí)施例
使用的細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基
(1) 使用的細(xì)菌菌株
枯草桿菌株Marburg 168trpC2 (Kunst等人，Nature 1997) 枯草桿菌株SAN819 (N819);抗性標(biāo)記(氯霉素) 枯草桿菌株SAN780 (N780);抗性標(biāo)記(氯霉素) 大腸埃希氏桿菌株C600 (TakaraBio) 大腸埃希氏桿菌株JM109 (TakaraBio)
(2) 質(zhì)粒
pDH88; Henner等人(Proc Natl Acad Sci USA. 1984 Jan 81 (2 ): 439-43 ),
抗性標(biāo)記(氨芐青霉素和氯霉素)
pHKK1101;抗性標(biāo)記(氨節(jié)青霉素和氯霉素)，用于產(chǎn)生部分刪除SecA 的菌株的重組載體(SAN819株)
pHKK1002;抗性標(biāo)記(氨節(jié)青霉素和氯霉素)，用于產(chǎn)生部分刪除SecA 的菌株的重組載體(SAN780株)
pWH1520; MoBiTec，抗性標(biāo)記(氨節(jié)青霉素和四環(huán)素)
pHKK3200;抗性標(biāo)記(氨節(jié)青霉素和四環(huán)素)，插入基因(淀粉酶AmyE
信號(hào)肽和pro區(qū))
pHKK3201;抗性標(biāo)記(氨芐青霉素和四環(huán)素)，插入基因(淀粉酶AmyE 信號(hào)肽和pro區(qū)以及IFN a成熟區(qū)的融合蛋白)
pHKK3202;抗性標(biāo)記(氨節(jié)青霉素和四環(huán)素)，插入基因(淀粉酶AmyE 信號(hào)肽和pro區(qū)以及IFN卩成熟區(qū)的融合蛋白)
(3) 培養(yǎng)基
L培養(yǎng)基；細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco) 1%，酵母提取物(Difco) 0.5%， NaCl (Wako) 0.5%
2xL培養(yǎng)基細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco) 2%，酵母提取物(Difco) 1%， NaCl (Wako) 1%
使用的抗生素的濃度為15昭氯霉素和50嗎氨芐青霉素。使用終 濃度為0.6%的木糖用于誘導(dǎo)pWH1520中存在的木糖啟動(dòng)子。以100
的終濃度使用異丙基-卩-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)。
i實(shí)施例1
構(gòu)建部分刪除SecA的質(zhì)粒和菌株
(1) 用于產(chǎn)生部分刪除SecA的菌株的重組載體 為了產(chǎn)生枯草桿菌SAN819株，首先，secA基因的3'端的360 bp
片段使用枯草桿菌168株的染色體作為模板，secAC-Ol (gatcAAGCTT cccgggagaagagcgatatcttcgg (SEQIDN0:3)，大寫字母代表HindIII)和 secAC-02 (gatcagaTCTAGAttaaatctcagctttcatcacaaa (SEQIDNO:4)，大 寫字母代表XbaI，下劃線字母代表插入的終止密碼子)作為引物，通 過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。隨后，擴(kuò)增的片段在pDH88的HindIII-XbaI位點(diǎn)插 入以構(gòu)建pHKK1001。類似地，為了產(chǎn)生枯草桿菌SAN780株，使用 引物secAC-03 (gatcAAGCTTcccgggagaagagcgatatcttcgg (SEQ ID NO: 5 )，大寫字母代表HindIII)禾卩secAC-04 (gatcagaTCTAGAttagatatcaaccac tttgcgaac (SEQ ID NO: 6)，大寫字母代表XbaI，下劃線字母代表插入 的終止密碼子)構(gòu)建pHKK1002。
(2) 產(chǎn)生部分刪除SecA的菌株
枯草桿菌SAN819株通過將質(zhì)粒pHKKlOOl Campbell插入進(jìn)枯草 桿菌168株的染色體中而獲得(圖la)。也通過類似方法使用質(zhì)粒 pHKK1002獲得SAN780株。通過Southern雜交分析確認(rèn)這些質(zhì)粒正 確地分別插入進(jìn)SAN819和SAN780的染色體中。在SAN819株和 SAN780株中表達(dá)的SecA的大小也使用抗SecA抗體進(jìn)行確認(rèn)(圖lb)。
(3) 對(duì)部分刪除SecA的菌株的生長(zhǎng)的作用
在(2)中產(chǎn)生的SAN819株和SAN780株中觀察對(duì)生長(zhǎng)的作用。 L液體培養(yǎng)基、L平板培養(yǎng)基和2xL液體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)(在所有情 況中均加入IPTG至100 nM的終濃度)。在30。C、 37。C和47。C下進(jìn) 行培養(yǎng)。
結(jié)果顯示在所有的檢測(cè)條件下，枯草桿菌SAN819株和SAN780 株的生長(zhǎng)與親代菌株，即枯草桿菌168株相當(dāng)。
當(dāng)不加入IPTG時(shí)，由于位于secA下游的prffi基因(其與secA 形成操縱子)的作用，生長(zhǎng)被抑制。
這些事實(shí)表明作為SecA的C-末端區(qū)的CTD (C-末端區(qū)結(jié)構(gòu)域) 對(duì)枯草桿菌的生長(zhǎng)不是必不可少的。實(shí)施例2
異源蛋白質(zhì)的表達(dá)
(1) 構(gòu)建用于表達(dá)異源蛋白質(zhì)的載體 異源蛋白質(zhì)分泌至細(xì)胞外需要信號(hào)序列。因此，產(chǎn)生具有枯草桿
菌淀粉酶(amyE)蛋白質(zhì)的信號(hào)序列和pro序列的、用于表達(dá)分泌性 蛋白質(zhì)的基本載體pHKK3200。為了產(chǎn)生pHKK3200， amyE基因信號(hào) 序列的175 bp編碼區(qū)和pro序列使用枯草桿菌168株的染色體作為模 板，以及amyESF-l (ggccACTAGTcttcaaaaaatcaaa (SEQ ID NO: 7)， 大寫字母代表Spel)和amyESR-2 (ggccGGTACCctcattcgatttgttcgc (SEQ ID NO: 8)，大寫字母代表KpnI)作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且擴(kuò) 增產(chǎn)物被插入進(jìn)pWH1520的Spel-Kpnl位點(diǎn)中。
為了產(chǎn)生干擾素-oi表達(dá)質(zhì)粒，含ifna基因成熟區(qū)的521 bp片段使 用pORF5-hlFN-a(InvivoGen)作為模板，以及ifnaF(ggccGGTACCctcct ggtgctcagctgc(SEQ ID NO: 9)，大寫字母代表Kpnl)和ifnaR(ggccGGAT CCttttcattccttacttct (SEQ ID NO: 10)，大寫字母代表BamHI)作為引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且插入至pHKK3200的KpnI-BamHI位點(diǎn)中，從而 構(gòu)建pHKK3201 (圖2a)和b))。
通過類似的步驟，使用pORF-hIFN-|3 (InvivoGen)作為模板，以 及ifobF (ggccGGTACCatgagctacaactt (SEQ ID NO: 11)，大寫字母代 表KpnI)禾卩ifnbR (ggccGGATCCagctcagtttcggaggta (SEQ ID NO: 12)， 大寫字母代表BamHI)作為引物，產(chǎn)生干擾素-|3表達(dá)質(zhì)粒pHKK3202。
(2) 產(chǎn)生其中已插入異源蛋白質(zhì)表達(dá)載體的菌株
在(1)中產(chǎn)生的干擾素-a表達(dá)載體pHKK3201和干擾素-P表達(dá)質(zhì) 粒pHKK3202，通過遺傳轉(zhuǎn)化法分別插入至SAN780株和SAN819株 中，以獲得插入干擾素表達(dá)載體的菌株。
通過感受態(tài)法(competent method)使用SPI和SPII培養(yǎng)基進(jìn)行遺 傳轉(zhuǎn)化，并且取在含15 pg/mL氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌 菌株作為轉(zhuǎn)化株。
(3) 培養(yǎng)
使用2xL培養(yǎng)基(2%胰蛋白胨(Difco)、 1%酵母提取物(Difco)、 l%NaCl)。當(dāng)需要時(shí)加入四環(huán)素(Wako)至15 pg/mL的終濃度。培
13養(yǎng)基中接種2%預(yù)培養(yǎng)物，并且在30°C下培養(yǎng)直至細(xì)胞增殖的中期 (OD660=0.3)，加入木糖至0.6%的終濃度，并繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。開始培 養(yǎng)后24h分離細(xì)菌細(xì)胞并獲得培養(yǎng)液。
含干擾素的樣品通過Western印跡進(jìn)行分析，并且測(cè)定檢測(cè)到的條 帶的密度，并用于比較。
(4) 分泌性蛋白質(zhì)(干擾素(IFN))的確認(rèn)
1) Western印跡
使用半干系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行Western印跡。通過SDS-PAGE分 離蛋白質(zhì)后，它們轉(zhuǎn)移至Immobilon PVDF膜(Millipore)上。使用 ECL檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham，現(xiàn)在為GE Healthcare)檢測(cè)蛋白質(zhì)。
使用的抗干擾素-a和抗干擾素-P抗體是PeproTech EC LTD的產(chǎn) 品。使用的HRP-標(biāo)記的二抗是Amersham (現(xiàn)在是GE Healthcare)的
口
廣叩o
2) 測(cè)定干擾素活性
培養(yǎng)24h后已通過離心去除細(xì)胞的培養(yǎng)液用作含干擾素的樣品。 在開始培養(yǎng)后，當(dāng)OD660變?yōu)?.3時(shí)加入木糖至0.6。/。的終濃度，用于 誘導(dǎo)干擾素。使用動(dòng)物細(xì)胞測(cè)定培養(yǎng)液中干擾素的生理學(xué)活性。此實(shí) 驗(yàn)測(cè)定委托給Mitsubishi BCL進(jìn)行。通過此實(shí)驗(yàn)中使用的干擾素表達(dá) 載體的作用所分泌的干擾素具有生理學(xué)活性。
(5) 評(píng)價(jià)分泌量的方法
培養(yǎng)液通過SDS-PAGE進(jìn)行開發(fā)(develop )，蛋白質(zhì)被印跡在PVDF 膜上，并且使用IFNa抗體(PeproTech EC LTD)通過Western印跡法 進(jìn)行檢測(cè)。通過Western印跡獲得的條帶的密度使用NIH Image (國(guó)立 衛(wèi)生研究院，美國(guó))轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)值，用于測(cè)定分泌量。相對(duì)于對(duì)照，艮P， 當(dāng)野生株為宿主時(shí)產(chǎn)生的量，當(dāng)突變株為宿主時(shí)產(chǎn)生的量評(píng)價(jià)為相對(duì) 值。
(6) 結(jié)果
由SAN780株和SAN819株產(chǎn)生的干擾素-a的量高于由親代168 株產(chǎn)生的量(圖3)。在干擾素-P的產(chǎn)生中也見到類似的提高(圖4)。
(7) 評(píng)價(jià)纖維素酶的產(chǎn)生
重組質(zhì)粒pHY-S237通過原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入至SAN780株以及作為對(duì)照的枯草桿菌168株中。該重組質(zhì)粒已經(jīng)通過將編碼來源 于枯草桿菌KSM-S237株(FERMBP-7875 )(見日本專利公開第 2000-210081號(hào))的堿性纖維素酶基因的DNA片段(3.1 kb)插入至往 復(fù)載體pHY300PLK的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamHI中而產(chǎn)生。
由此獲得的遺傳轉(zhuǎn)化株在30°C下在5 mL LB培養(yǎng)基中經(jīng)受震蕩培 養(yǎng)15 h。 0.6 mL此培養(yǎng)液接種在30 mL2xL麥芽糖培養(yǎng)基(2%胰蛋白 胨、1%酵母提取物、1°/。氯化鈉、7.5%麥芽糖、7.5 ppm硫酸錳4-5水 合物、以及15ppm四環(huán)素)中，并在30。C下震蕩培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后， 通過離心去除細(xì)菌細(xì)胞，并通過上述專利文獻(xiàn)中給出的方法或通過使 用p-硝基苯基-p-纖維三糖苷(Seikagaku Corp.)作為底物測(cè)定在pH 7.0 和30。C溫度下的吸光度(420 nm)變化，來測(cè)定培養(yǎng)液上清液的堿性 纖維素酶活性，并且測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞外產(chǎn)生的分泌的堿性纖維素酶的量。 結(jié)果在表l中給出。
細(xì)菌菌株SecA分泌和產(chǎn)生的堿性纖 維素酶的量(相對(duì)值)
168株野生型(1-841)100
SAN780株1-780125
如表1中所示，與168株(野生型)為宿主的對(duì)照相比，當(dāng)SAN780 株為宿主時(shí)，堿性纖維素酶的分泌產(chǎn)量較高。
1權(quán)利要求
1.一種修飾微生物，其被基因修飾以使SecA的60-80個(gè)羧基末端氨基酸缺失。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾微生物，其中所述羧基末端氨基酸 的缺失是Ffh結(jié)合區(qū)域或與所述Ffh結(jié)合區(qū)域同源的區(qū)域的缺失。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的修飾微生物，其中所述SecA是在下 面(A)至(C)中所述的蛋白質(zhì)(A) 通過SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列所代表的蛋白質(zhì)；(B) 由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一 個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列所代表且進(jìn)一步具有與SecA相 同的功能的蛋白質(zhì)；禾口(C) 與由SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列具有80%或更高的同 一性的氨基酸序列所代表且進(jìn)一步具有與SecA相同的功能的蛋白質(zhì)。
4. 一種重組體微生物，其通過將編碼異源蛋白質(zhì)或多肽的基因?qū)?入根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的修飾微生物的菌株中而構(gòu)建。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的修飾微生物或根據(jù)權(quán)利 要求4所述的重組體微生物，其中所述微生物是屬于桿菌屬的細(xì)菌。
6. —種使用根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組體微生物產(chǎn)生蛋白質(zhì) 或多肽的方法。
全文摘要
本發(fā)明提供具有較高的蛋白質(zhì)或多肽分泌生產(chǎn)能力的微生物以及使用該微生物產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽的方法。本發(fā)明涉及一種修飾微生物，其已經(jīng)被基因修飾以使SecA的60-80個(gè)羧基末端氨基酸缺失。
文檔編號(hào)C12N15/75GK101631862SQ20088000770
公開日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2008年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月2日
發(fā)明者中村幸治, 掛下大視, 荒勝俊 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社