專利名稱：制備β-內(nèi)酰胺化合物的工藝的制作方法
制備/5-內(nèi)酰胺化合物的工藝
本發(fā)明涉及制備半合成的0-內(nèi)酰胺化合物的工藝，這通過(guò)用?；噭?br> 對(duì)母體氨基/3-內(nèi)酰胺進(jìn)行酶促?；瘉?lái)實(shí)現(xiàn)。
通過(guò)用側(cè)鏈酸衍生物(例如酰胺或酯)對(duì)母體氨基/3-內(nèi)酰胺基元 (moiety)進(jìn)行?；瘉?lái)酶促生產(chǎn)半合成的/5-內(nèi)酰胺抗生素的方法在專利文 獻(xiàn)中已被廣泛描述，例如，EP-A-339751、 EP-A-473008、 W092細(xì)61、 WO93/12250、 W096/02663、 WO96/05318、 W096/23796、 WO97/0權(quán)6、 W098/56946 、 WO99/20786 、 WO2005/00367 、 WO2006/069984 、 US 3,816,253和德國(guó)專利文獻(xiàn)2163792和2621618。該領(lǐng)域中使用的酶很多情 況下是從五w/^nWn'a co//獲得的青霉素酰化酶，其被固定于多種類型的水 不溶性材料上(例如WO97/04086)。
現(xiàn)有技術(shù)工藝的一個(gè)主要缺點(diǎn)在于，必須以固定形式分離側(cè)鏈酯，以 便對(duì)側(cè)鏈酯加以純化，例如，以降低酯中游離側(cè)鏈的量。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別 是在更疏水的側(cè)鏈(例如D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸)的情況下，隨 后的酶促偶聯(lián)反應(yīng)中游離側(cè)鏈的存在對(duì)酶促偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)率有強(qiáng)烈的負(fù)面 影響。這歸因于下述事實(shí)由于游離側(cè)鏈在酶促偶聯(lián)反應(yīng)條件下的低溶解 度，游離側(cè)鏈在酶促偶聯(lián)反應(yīng)中的濃度有上限。該限制是由游離側(cè)鏈不應(yīng) 結(jié)晶或沉淀的要求來(lái)決定的，因?yàn)槌恋砦飼?huì)對(duì)酶促偶聯(lián)反應(yīng)的可進(jìn)行性 (processability)造成負(fù)面影響。此外，在對(duì)半合成的/3-內(nèi)酰胺化合物的 下游加工的最后步驟中，必須除去污染性的游離側(cè)鏈，例如，用半合成的 ^-內(nèi)酰胺化合物的最后結(jié)晶步驟的母液來(lái)進(jìn)行。游離側(cè)鏈水平更高時(shí)，就 需要更多母液來(lái)除去游離側(cè)鏈，這進(jìn)而導(dǎo)致半合成的/3-內(nèi)酰胺化合物損失 更多。使得側(cè)鏈酯以固體形式分離的單元操作使得半合成的抗生素的生產(chǎn) 工藝復(fù)雜，并且明顯提高了成本。
因此，人們急需下述生產(chǎn)工藝，其中，酯化反應(yīng)期間形成的側(cè)鏈酯可用于隨后的酶促偶聯(lián)反應(yīng)，而不用以固體形式分離。
WO98/04732在實(shí)施例1、 3和4中公開了用D-4-羥基-苯甘氨酸的2-羥基乙酯分別從7-PACA、 7-ADCA禾B 6-APA合成頭孢丙烯、頭孢羥氨芐 和阿莫西林，其中，酯在其合成之后直接加入到隨后的酶促偶聯(lián)反應(yīng)中， 而并不以固體形式分離。D-4-羥基-苯甘氨酸在酶促偶聯(lián)反應(yīng)的條件下具有 非常好的溶解度，因此在酶促偶聯(lián)反應(yīng)期間不產(chǎn)生D-苯甘氨酸和D-二氫 苯甘氨酸所遇到的問(wèn)題。為避免其沉淀，因?yàn)樗鼈內(nèi)芙舛鹊?，因此可能僅 以非常低的濃度存在。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸的/3-內(nèi)酰胺 衍生物(例如，氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢克洛和頭孢拉定)的生產(chǎn)工 藝，其中，側(cè)鏈酯的合成的特征在于高產(chǎn)率，并且得到的側(cè)鏈酯僅含低濃 度的游離側(cè)鏈，并且其中，省去了以固體形式分離側(cè)鏈酯以純化側(cè)鏈酯的 步驟。
"核心"在本文中被定義為半合成的/3-內(nèi)酰胺的/3-內(nèi)酰胺基元，其可 以是任何青霉烯(penem)或頭孢烯(cephem)，例如，6-氨基青霉垸酸 (6-APA) 、 7-氨基去乙酰氧頭孢垸酸(7-ADCA) 、 7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)或7-氨基-3-氯-3-頭孢烯-4-羧酸酯(7-ACCA)。
"側(cè)鏈"在本文中被定義為在半合成的/3-內(nèi)酰胺化合物中與本文定義 的核心的6-氨基或7-氨基位置相連結(jié)的基元，例如，氨芐青霉素、頭孢氨 芐和頭孢克洛中的D-苯丙氨酸或者頭孢拉定中的D-二氫苯甘氨酸。
"游離側(cè)鏈"是側(cè)鏈的未經(jīng)衍生形式，例如，D-苯甘氨酸或D-二氫苯 甘氨酸。
"側(cè)鏈酯"是游離側(cè)鏈的酯形式，其中，游離側(cè)鏈的羧基被酯化至 醇，例如D-苯甘氨酸甲酯或D-二氫苯甘氨酸甲酯。側(cè)鏈酯可以以游離堿 的形式或者作為鹽存在，例如，作為HC1鹽存在，側(cè)鏈酯可以是固體形式 的或者溶解于可溶的溶劑中。
"比例"在本文中被定義為
5_[側(cè)鏈酯的量]_[側(cè)鏈酯的量]+ [游離側(cè)鏈的量] 其中，量以摩爾表示。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了從核心和選自D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘 氨酸構(gòu)成的組的側(cè)鏈(以側(cè)鏈酯形式存在)和催化側(cè)鏈酯偶聯(lián)至核心的酶 來(lái)合成半合成的/5-內(nèi)酰胺化合物的工藝，其特征在于，側(cè)鏈酯不作為固體 中間產(chǎn)物分離。該工藝?yán)绨ㄏ率霾襟Ea) 用醇轉(zhuǎn)化選自D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸構(gòu)成的組的游離側(cè) 鏈，以形成包含相應(yīng)的側(cè)鏈酯的混合物；該步驟中側(cè)鏈酯的形成優(yōu)選產(chǎn)生具有被表示為前文定義的"比例"的轉(zhuǎn)化率的混合物，并且，所述比例優(yōu)選^5%，更優(yōu)選^>0%，更優(yōu)選^>5%，更優(yōu)選36%，更優(yōu)選^ 7%，更優(yōu) 選28%，最優(yōu)選29%;b) 通過(guò)如下方法來(lái)形成半合成的/5-內(nèi)酰胺化合物將步驟a)中獲得 的混合物與核心和酶混合以形成半合成的^-內(nèi)酰胺化合物，前提是歩驟(a)中形成的側(cè)鏈酯沒(méi)有作為固體中間產(chǎn)物分離。本發(fā)明的工藝中所用的且在本文中定義過(guò)的核心可選自6-氨基青霉烷 酸(6-APA) 、 7-氨基去乙酰氧頭孢烷酸(7-ADCA) 、 7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-頭孢烯-4-羧酸酯(7-ACCA)構(gòu)成的組，以分 別產(chǎn)生半合成的青霉素(6-APA的衍生物)和半合成的頭孢菌素(7-ADCA、 7-ACA和7-ACCA的衍生物)。本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式是制 備選自氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢克洛構(gòu)成的組的半合成的 /3-內(nèi)酰胺化合物的工藝。在本發(fā)明工藝的轉(zhuǎn)化步驟(步驟(a))中，用醇轉(zhuǎn)化選自D-苯甘氨 酸和D-二氫苯甘氨酸構(gòu)成的組的游離側(cè)鏈，以形成包含相應(yīng)的側(cè)鏈酯的混 合物。本發(fā)明工藝中使用的醇可選自甲醇和乙醇構(gòu)成的組，由此分別形成 側(cè)鏈的甲酯和乙酯。最優(yōu)選的醇是甲醇。步驟(a)可以以多種方式進(jìn) 行。轉(zhuǎn)化步驟(a)的一種實(shí)施方式包括回流下，在20至120。C之間的 溫度下，更優(yōu)選40至100。C之間的溫度下，對(duì)包含選自D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸構(gòu)成的組的游離側(cè)鏈、基于想要形成的酯選擇的醇(例如甲 醇以獲得甲酯，乙醇以獲得乙酯)和強(qiáng)酸(例如硫酸)的混合物進(jìn)行加熱。當(dāng)使用甲醇作為醇時(shí)，溫度優(yōu)選在60至80。C之間。當(dāng)使用乙醇作為 醇時(shí)，溫度優(yōu)選在65至100。C之間。在EP-A-0544205中公開的比較實(shí)施 例l和2中可找到合適的條件。轉(zhuǎn)化步驟(a)的另一實(shí)施方式包含對(duì)前述實(shí)施方式的改進(jìn)，其包括向 反應(yīng)混合物中加入作為液體或氣體的醇，而從反應(yīng)中蒸餾出醇和水(例 如，如EP-A-0544205所述)。轉(zhuǎn)化步驟(a)的一種高度優(yōu)選的實(shí)施方式(其產(chǎn)生了包含側(cè)鏈甲酯的 混合物)包括下述步驟1. 在20至120。C，更優(yōu)選20至100。C，更優(yōu)選40至100。C，最優(yōu)選 60至80。C之間的溫度下，對(duì)包含選自D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸構(gòu)成 的組的游離側(cè)鏈、甲醇和強(qiáng)酸(例如硫酸)的反應(yīng)混合物回流一定時(shí)間， 例如0.5至5小時(shí)之間，優(yōu)選1小時(shí)至3小時(shí)之間，更優(yōu)選1.5至2.5小時(shí) 之間；接著2. 在40至100°C，優(yōu)選60至90°C，更優(yōu)選70至80°C的溫度下對(duì)混 合物加以濃縮。該步驟期間的壓力最初可以是大氣壓，其在濃縮步驟期間 可降低至優(yōu)選50 mbar或更低，更優(yōu)選40 mbar或更低，更優(yōu)選30 mbar或 更低，最優(yōu)選20 mbar或更低。濃縮步驟繼續(xù)進(jìn)行，直到濃縮步驟之前存 在的水超過(guò)30%被除去，更優(yōu)選地，超過(guò)40%的水被除去，優(yōu)選超過(guò)50% 的水被除去，優(yōu)選超過(guò)70%的水被除去，優(yōu)選超過(guò)80%的水被除去，最優(yōu) 選超過(guò)90%的水被除去。3. 加甲醇，優(yōu)選地，加入的量使得獲得濃縮步驟之前反應(yīng)混合物的初 始體積，或者是獲得小于反應(yīng)混合物的初始體積的量，例如，反應(yīng)混合物 的初始體積的《0%或《0%或《0%或《0%或《0%或《0%或20%或 《0%。加入的甲醇的量也可超過(guò)反應(yīng)混合物的初始體積。4. 任選地，重復(fù)步驟1-3 —次或多次，優(yōu)選至少1次，優(yōu)選2次，更 優(yōu)選3次，更優(yōu)選4次，更優(yōu)選5次，更優(yōu)選6次，更優(yōu)選7次，更優(yōu)選 8次，更優(yōu)選9次，更優(yōu)選10次。我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)重復(fù)這些步驟，前文所定義的甲酯形成的"比例"顯著增加。例如，進(jìn)行步驟(a) - (C)僅一次時(shí)，可獲得75-85%之間的"比例"，重復(fù)步驟(a) - (c) 1次后，可獲得 85-95%之間的"比例"，重復(fù)步驟(a) - (c) 2次后，可獲得95-97%之 間的"比例"，重復(fù)步驟(a) - (c) 3次后，可獲得97-98%之間的"比 例"，重復(fù)步驟(a) - (c) 4次后，可獲得98-99%之間的"比例"，重復(fù) 步驟(a) - (c) 5次后，可獲得99-99.5%之間的"比例"，重復(fù)步驟 (a) - (c)超過(guò)5次后，可獲得超過(guò)99.5%的"比例"。轉(zhuǎn)化步驟(a)的另一高度優(yōu)選的實(shí)施方式(其產(chǎn)生了包含側(cè)鏈乙酯的 混合物)包含下述步驟1. 在20至120。C，更優(yōu)選20至100。C，更優(yōu)選40至100。C，最優(yōu)選 65至100。C之間的溫度下，對(duì)包含選自D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸構(gòu) 成的組的游離側(cè)鏈、乙醇和強(qiáng)酸(例如硫酸)的反應(yīng)混合物回流一定時(shí) 間，例如0.5至5小時(shí)之間，優(yōu)選1小時(shí)至3小時(shí)之間，更優(yōu)選1.5至2.5 小時(shí)之間；接著2. 在40至100。C，優(yōu)選60至90°C，更優(yōu)選70至80°C的溫度下對(duì)混 合物加以濃縮。該步驟期間的壓力最初可以是大氣壓，其在濃縮步驟期間 可降低至優(yōu)選50mbar或更低，更優(yōu)選40 mbar或更低，更優(yōu)選30mbar或 更低，最優(yōu)選20 mbar或更低。濃縮步驟繼續(xù)進(jìn)行，直到濃縮步驟之前存 在的水超過(guò)30%被除去，更優(yōu)選地，超過(guò)40%的水被除去，優(yōu)選超過(guò)50% 的水被除去，優(yōu)選超過(guò)70%的水被除去，優(yōu)選超過(guò)80%的水被除去，最優(yōu) 選超過(guò)90%的水被除去。3. 加乙醇，優(yōu)選地，加入的量使得獲得濃縮步驟之前反應(yīng)混合物的初 始體積，或者是獲得小于反應(yīng)混合物的初始體積的量，例如，反應(yīng)混合物 的初始體積的^>0%或《0%或《0%或《0%或《0%或《0%或《0%或 《0%。加入的乙醇的量也可超過(guò)反應(yīng)混合物的初始體積。4. 任選地，重復(fù)步驟1-3 —次或多次，優(yōu)選至少1次，優(yōu)選2次，更 優(yōu)選3次，更優(yōu)選4次，更優(yōu)選5次，更優(yōu)選6次，更優(yōu)選7次，更優(yōu)選 8次，更優(yōu)選9次，更優(yōu)選10次。我們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)重復(fù)這些步驟，前文所 定義的甲酯形成的"比例"顯著增加。例如，進(jìn)行步驟(a) - (c)僅一次時(shí)，可獲得75-85%之間的"比例"，重復(fù)步驟(a) - (c) 1次后，可獲得 85-95%之間的"比例"，重復(fù)步驟(a) - (c) 2次后，可獲得95-97%之 間的"比例"，重復(fù)步驟(a) - (c) 3次后，可獲得97-98%之間的"比 例"，重復(fù)步驟(a) - (c) 4次后，可獲得98-99%之間的"比例"，重復(fù) 步驟(a) - (c) 5次后，可獲得99-99.5%之間的"比例"，重復(fù)步驟(a) - (c)超過(guò)5次后，可獲得超過(guò)99.5%的"比例"。在步驟(a)的所有實(shí)施方式中，優(yōu)選地，使用醇與游離側(cè)鏈的下述摩 爾比3至25之間，更優(yōu)選5至25之間，最優(yōu)選6至10之間。此外，在 步驟(a)的所有實(shí)施方式中，優(yōu)選地，使用強(qiáng)酸(以當(dāng)量計(jì)，例如，一 摩爾氫氯酸是1當(dāng)量， 一摩爾硫酸是2當(dāng)量)與游離側(cè)鏈的下述摩爾比 0.9至10之間，更優(yōu)選1至5之間，最優(yōu)選2至3之間。技術(shù)人員將能根 據(jù)所選用的醇和側(cè)鏈來(lái)優(yōu)化反應(yīng)條件，而無(wú)須進(jìn)行過(guò)多實(shí)驗(yàn)。在步驟(b)中形成半合成的/3-內(nèi)酰胺之前，可對(duì)步驟(a)中獲得的 混合物加以純化，以獲得具有高的前文所定義的"比例"的混合物。將在 本發(fā)明工藝的步驟(b)中使用的混合物的比例優(yōu)選為25%，更優(yōu)選 30%，更優(yōu)選^>5%，更優(yōu)選^6%，更優(yōu)選^7%，更優(yōu)選^8%，最優(yōu)選 蘿/0。純化步驟的一種實(shí)施方式包括沉淀和從側(cè)鏈酯中去除游離側(cè)鏈。這可 通過(guò)用合適的堿(例如NaOH、氨、KOH)將步驟(a)中獲得的混合物 的pH調(diào)節(jié)至2至6.5之間的值，優(yōu)選2.5至5之間的值，最優(yōu)選3至4之 間的值來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方式中，可將步驟(a)中獲得的反應(yīng)混合物 加入適量的水或醇或水和醇的混合物中，接著用合適的堿(例如NaOH、 氨、KOH)將pH調(diào)節(jié)至2至6.5之間，優(yōu)選2.5至5之間，最優(yōu)選3至4 之間。將pH調(diào)節(jié)至想要的值之后，可通過(guò)加入合適的堿將pH保持為想要 的值。在這些條件下，可形成包含游離側(cè)鏈的沉淀。合適的時(shí)間后，使用 已知技術(shù)濾除沉淀。濾液包含側(cè)鏈酯。為直接用于本發(fā)明工藝的步驟(b) ，使濾液的pH為1至6之間，優(yōu)選1至4之間，最優(yōu)選1.5至3之 間，之后使用己知技術(shù)通過(guò)蒸發(fā)來(lái)除去醇。純化步驟的另一實(shí)施方式涉及包含有機(jī)相(含有側(cè)鏈酯 生物和較少以及任選地，鹽)的兩相或多相系統(tǒng)的形成。這可通過(guò)加入合適的堿(例如NaOH、氨、KOH)將步驟(a)中獲得的混合物的pH調(diào)節(jié)至7.5至IO之間，優(yōu)選8.5至9.5之間， 最優(yōu)選8.8至9.2之間來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施方式中，可將步驟(a)中獲得 的反應(yīng)混合物加入適量的水或醇或水和醇的混合物中，接著用合適的堿 (例如NaOH、氨、KOH)將pH調(diào)節(jié)至7.5至10之間，優(yōu)選8.5至9.5之 間，最優(yōu)選8.8至9.2之間。將pH調(diào)節(jié)至想要的值之后，可通過(guò)加入合適 的堿將pH保持為想要的值。任選地，水可以是水性鹽(例如NaCl)溶液 的形式。游離側(cè)鏈也可形成沉淀?？墒褂靡阎夹g(shù)來(lái)分離多相系統(tǒng)中的各 相。任選地，可用水或水性鹽溶液來(lái)洗滌有機(jī)相。洗滌的水相可被循環(huán)進(jìn) 合適的工藝流中，以避免產(chǎn)率損失。該工藝流可以是步驟(a)后或如本 文所述進(jìn)行pH調(diào)節(jié)后獲得的反應(yīng)混合物。純化步驟的一種高度優(yōu)選的實(shí)施方式組合了兩種面前的實(shí)施方式， 即，首先將步驟(a)中獲得的混合物的pH調(diào)節(jié)至2至6.5之間，優(yōu)選2.5 至5之間，最優(yōu)選3至4之間，將形成的沉淀濾去，隨后將獲得的濾液的 pH調(diào)節(jié)至7.5至IO之間，優(yōu)選8.5至9.5之間，最優(yōu)選8.8至9.2之間，并 使用已知的技術(shù)對(duì)獲得的多相系統(tǒng)中的各相加以分離。已經(jīng)吃驚地發(fā)現(xiàn)，在多相系統(tǒng)形成于7.5至10之間，優(yōu)選8.5至9.5 之間，最優(yōu)選8.8至9.2之間的pH下的前面兩種實(shí)施方式中，可產(chǎn)生酯， 優(yōu)選地，選自D-苯甘氨酸甲酯、D-苯甘氨酸乙酯、D-二氫苯甘氨酸甲酯 和D-二氫苯甘氨酸乙酯構(gòu)成的組，其為游離堿形式，其中，所述酯具有下 述性質(zhì)-優(yōu)選等于或大于90%的e.e.(對(duì)映異構(gòu)過(guò)量)，更優(yōu)選等于或大于 95%，優(yōu)選等于或大于96%，優(yōu)選等于或大于97%，優(yōu)選等于或大于 98%，最優(yōu)選等于或大于99%;以及-優(yōu)選20摩爾％或更少的鹽含量，更優(yōu)選10摩爾％或更少，更優(yōu)選5 摩爾％或更少，更優(yōu)選2摩爾％或更少，最優(yōu)選1摩爾％或更少，這作為 鹽的摩爾數(shù)相對(duì)酯的摩爾數(shù)來(lái)表示。-優(yōu)選25%的前文定義的"比例"，更優(yōu)選30%，更優(yōu)選^5%，更優(yōu)選^6%，更優(yōu)選^7%，更優(yōu)選^8%，最優(yōu)選^9%。在本發(fā)明工藝的步驟(b)中，半合成的/3-內(nèi)酰胺化合物是這樣形成 的通過(guò)將步驟(a)中獲得的混合物(任選地，按照前文所述進(jìn)行了純 化)與核心和合適的酶(優(yōu)選地，固定的酶)混合，以形成相應(yīng)的半合成 的/5-內(nèi)酰胺化合物，并且其中，步驟(a)中形成并且任選被純化的側(cè)鏈 酯沒(méi)有作為固體中間產(chǎn)物被分離。步驟(b)可按照本領(lǐng)域已知的以及本 文前文引用的任何工藝來(lái)進(jìn)行。例如，可按照EP-A-339751或 W098/56946所述來(lái)進(jìn)行氨節(jié)青霉素合成。類似地，可按照W096/23796 所述來(lái)進(jìn)行頭孢氨芐合成?？砂凑誛O2005/003367所述來(lái)進(jìn)行頭孢拉定合 成，以及可按照WO2006/069984所述來(lái)進(jìn)行頭孢克洛合成。酶促偶聯(lián)后，可使用已知方法回收半合成的/3-內(nèi)酰胺抗生素。例如， 可使用向上攪拌，使得酶反應(yīng)器經(jīng)底部的篩排出。然后可將得到的半合成 的/3-內(nèi)酰胺抗生素懸浮液濾經(jīng)玻璃過(guò)濾器。由于酶促偶聯(lián)反應(yīng)之后存在的游離側(cè)鏈含量較低，可以在高/5-內(nèi)酰胺 抗生素濃度下來(lái)對(duì)最終半合成/5-內(nèi)酰胺抗生素加以結(jié)晶，這導(dǎo)致獲得高產(chǎn) 率。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了酯，其優(yōu)選選自D-苯甘氨酸甲酯、D-苯 甘氨酸乙酯、D-二氫苯甘氨酸甲酯和D-二氫苯甘氨酸乙酯構(gòu)成的組，其為 游離堿形式，其中，所述酯具有下述性質(zhì)-優(yōu)選等于或大于90%的e.e.(對(duì)映異構(gòu)過(guò)量)，更優(yōu)選等于或大于 95%，優(yōu)選等于或大于96%，優(yōu)選等于或大于97%，優(yōu)選等于或大于 98%，最優(yōu)選等于或大于99%;以及-優(yōu)選20摩爾％或更少的鹽含量，更優(yōu)選10摩爾％或更少，更優(yōu)選5 摩爾％或更少，更優(yōu)選2摩爾％或更少，最優(yōu)選1摩爾％或更少，這作為 鹽的摩爾數(shù)相對(duì)酯的摩爾數(shù)來(lái)表示。-優(yōu)選^5%的前文定義的"比例"，更優(yōu)選^0%，更優(yōu)選35%，更 優(yōu)選^>6%，更優(yōu)選^>7%，更優(yōu)選^>8%，最優(yōu)選^9%。對(duì)技術(shù)人員將顯而易見的是提供的游離堿形式的酯可以具有上面列 出的任何e.e.值、上面列出的任何鹽含量值、、上面列出的任何"比例"值的組合。在第三方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)本發(fā)明的游離堿形式的酯的工藝，所 述酯具有上文定義的性質(zhì)。該工藝可包括在水性環(huán)境中將側(cè)鏈酯的鹽與 堿混合，由此產(chǎn)生兩相系統(tǒng)，以及將游離堿形式的側(cè)鏈酯與水相分開。側(cè)鏈酯的鹽可以是任何合適的鹽，例如HC1鹽。所述鹽可以是固體形 式的或者可以是液體形式的，即，水或其它合適溶劑中的溶液，任選地， 含有其它組分，例如鹽。與側(cè)鏈酯的鹽混合的堿可以是任何堿，例如，強(qiáng) 堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨。在形成的兩相系統(tǒng)中，具有游離堿形式的側(cè)鏈酯的有機(jī)相優(yōu)選不含或 僅含非常低水平的游離側(cè)鏈，即，前文定義的比例優(yōu)選^5%，更優(yōu)選30%，更優(yōu)選^>5%，更優(yōu)選^>6%，更優(yōu)選^7%，更優(yōu)選^ 8%，最優(yōu)選 39%，而含有游離側(cè)鏈以及任選含鹽的水相優(yōu)選不含或僅含非常低水平的 側(cè)鏈酯。兩相系統(tǒng)可按照前文所述在純化步驟(其中，多相系統(tǒng)在7.5至10， 優(yōu)選8.5至9.5，最優(yōu)選8.8至9.2之間的pH下形成)下形成?？墒褂眉褐夹g(shù)來(lái)分離多相系統(tǒng)中的各相。合適的方法是利用各相之 間密度差異的那些方法。取決于規(guī)模，可使用正常重力，或者使用離心 力，以分批模式或者更優(yōu)選地連續(xù)模式來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。在

圖1和實(shí)施例5中 針對(duì)PGM詳細(xì)描述了一種優(yōu)選的連續(xù)離心工藝。該工藝可應(yīng)用于任何 酯，優(yōu)選地，為游離堿形式且選自D-苯甘氨酸甲酯、D-苯甘氨酸乙酯、 D-二氫苯甘氨酸甲酯和D-二氫苯甘氨酸乙酯構(gòu)成的組的酯。圖1A. 含有PGM溶液的容器，可按照實(shí)施例4所述獲得。B. 含有處于水(724 g/kg溶液)中的NaOH (65 g/kg溶液)禾卩NaCl (211g/kg溶液)的溶液的容器。容器的內(nèi)容物保持在3至5。C之間。C. IO升玻璃器皿，其裝備有攪動(dòng)儀、擋板、溫度計(jì)、pH計(jì)、PGM溶 液的進(jìn)口、 NaOH/NaCl溶液的進(jìn)口以及反應(yīng)混合物的出口。該器皿放置在 冷卻浴中。D. 熱交換器(內(nèi)體積l升)，以在引入離心機(jī)之前將反應(yīng)混合物的溫 度增加至30°C。E. 含有25% (w/w) Na2S04溶液的容器。容器的內(nèi)容物被溫?zé)嶂?30。C。F. 兩臺(tái)Robatel BXP130萃取式離心機(jī)(液/液萃取儀，碗徑125 mm， 碗體積1.4升，輕相堰直徑61 mm，重相堰直徑66 mm)。離心機(jī)的進(jìn)口 和出口按照下文所述相連-將來(lái)自IO升器皿的反應(yīng)混合物引入離心機(jī)1的輕相進(jìn)口 -將25% (w/w)的Na2S04溶液引入離心機(jī)2的重相進(jìn)口 -將離心機(jī)l的重出口與接收容器(G)相連。 實(shí)驗(yàn)后棄去內(nèi)容物。-將離心機(jī)1的輕相出口與離心機(jī)2的輕相進(jìn)口相連 -將離心機(jī)2的重相出口與離心機(jī)1的重相進(jìn)口相連 -將離心機(jī)2的輕相出口通過(guò)蠕動(dòng)泵泵經(jīng)熱交換器，以將該工藝流冷 卻至3-5。C。G. 接收容器，以收集來(lái)自離心機(jī)l的水相H. 熱交換器，以將工藝流冷卻至3-5。CI. 器皿，保持3-5。C的冷卻，以收集作為游離堿的PGM。 圖1中沒(méi)有顯示下述蠕動(dòng)泵-蠕動(dòng)泵，將PGM溶液泵至10升器皿-蠕動(dòng)泵，將NaOH/NaCl溶液泵至10升器皿。該泵的流動(dòng)受到pH計(jì) 的控制。-蠕動(dòng)泵，將反應(yīng)混合物經(jīng)由熱交換器泵至離心機(jī)。 -蠕動(dòng)泵，將25% (w/w)的Na2S04溶液泵至離心機(jī)。實(shí)施例1a)合成苯甘氨酸甲酯(PGM)溶液將90 g D-苯甘氨酸懸浮于170 ml甲醇中，加入73.2 g濃硫酸。將混合物在大約73°C下回流下保持2小時(shí)，使用真空泵在減壓下進(jìn)行濃縮。壓力從大氣壓降至20 mBar，同時(shí)反應(yīng)混合物的溫度從40°C升高至 80。C。加入170 ml甲醇，再將反應(yīng)混合物在回流下保持2小時(shí)，以及在減壓 下濃縮。再次加入170ml甲醇，將混合物在回流下保持2小時(shí)，并在減壓 下濃縮。最后，加入125 ml甲醇。在該階段，前文所定義的"比例"為 95%。20。C下1小時(shí)內(nèi)將溶液放進(jìn)第二反應(yīng)器(已預(yù)先裝入20 ml甲醇)。 用氨將pH保持為3.5。形成了固體，通過(guò)過(guò)濾除去固體。用25ml水稀釋 得到的母液，在減壓下(p = 20mmHg， T = 40-45°C)濃縮。最后，獲得 了 207.5 g D-苯甘氨酸甲酯(PGM)溶液。得到的溶液的"比例"為 99%。b) 酶促合成頭孢氨芐向具有175 fim篩底的反應(yīng)器中裝入15 g固定的^c/^n'c/^ co// PenG ?；竿蛔凅wPhe-B24-Ala。隨后，在25°C下加入21.4 g 7-ADCA禾n 95 g 水，用25%的氨將pH調(diào)節(jié)至7.0。在120分鐘內(nèi)，將38g步驟a)(上文)中獲得的PGM溶液以恒定速 率裝入反應(yīng)器。用氨將pH保持為7.0。溫度保持為25°C。 30分鐘后，加 入0.25 g固體頭孢氨芐(晶種)。頭孢氨芐的結(jié)晶從45分鐘時(shí)開始。從 120至150分鐘，用25%的硫酸將pH保持為7.0。隨后用25%的硫酸將 pH降低至5.7。c) 回收頭孢氨芐在向上攪拌下，將反應(yīng)器內(nèi)容物經(jīng)底部的篩排出。將得到的頭孢氨芐 懸浮液濾經(jīng)玻璃過(guò)濾器。將得到的母液轉(zhuǎn)移回反應(yīng)器。該步驟順序重復(fù)5 次。隨后，用2x 10ml的水來(lái)洗酶。以這種方式，將》98%的頭孢氨芐與 固體生物催化劑分離。將頭孢氨芐濕濾渣、母液和洗滌水合并，溫度保持為2°C。用濃硫酸 將合并的濕濾渣和母液的pH降低至1.5，將得到的溶液濾經(jīng)0.45 pm過(guò)濾 器。向結(jié)晶反應(yīng)器中裝入20 g水和1.0 g頭孢氨芐(晶種)。30。C下，在80分鐘內(nèi)，將上文提到的酸性頭孢氨芐溶液加入至結(jié)晶反應(yīng)器中。用氨將 pH保持為5.0。隨后，在20。C對(duì)懸浮液再攪拌30分鐘。將懸浮液濾經(jīng)玻 璃過(guò)濾器，用2 x 15 ml的水和2 x 15 ml的丙酮來(lái)洗濕濾渣。干燥后，獲 得32.6g頭孢氨節(jié)(純度>99.8%)。實(shí)施例2a) 合成D-二氫苯甘氨酸甲酯(DHPGM)溶液將90 g D-二氫苯甘氨酸(DHPG)懸浮于200 ml甲醇中，加入73.2 g 濃硫酸。將混合物在大約73°C下回流下保持2小時(shí)，使用真空泵在減壓 下進(jìn)行濃縮。壓力從大氣壓降至20 mBar，同時(shí)反應(yīng)混合物的溫度從40°C 升高至80°C。加入170 ml甲醇，再將反應(yīng)混合物在回流下保持2小時(shí)，以及在減壓 下濃縮。再次加入170ml甲醇，將混合物在回流下保持2小時(shí)，并在減壓 下濃縮。最后，加入125 ml甲醇。在該階段，前文所定義的"比例"為 94.8%。20。C下1小時(shí)內(nèi)將溶液放進(jìn)第二反應(yīng)器(已預(yù)先裝入20 ml甲醇)。 用氨將pH保持為3.5。形成了固體，通過(guò)過(guò)濾除去固體。用25ml水稀釋 得到的母液，用3g炭(活性碳)脫色，并在減壓下(p = 20mmHg， T = 40-45。C)濃縮。最后，獲得了 217.6 g DHPGM溶液。得到的溶液的"比 例"為99.2%。b) 酶促合成頭孢拉定該步驟按照WO2005/003367所述來(lái)進(jìn)行。實(shí)施例3a)合成D-苯甘氮酸甲酯(PGM)溶液將90 g D-苯甘氨酸懸浮于170 ml甲醇中，加入73.2 g濃硫酸。將混 合物在大約73°C下回流下保持2小時(shí)，使用真空泵在減壓下進(jìn)行濃縮。 壓力從大氣壓降至20 mBar，同時(shí)反應(yīng)混合物的溫度從40°C升高至80。C。加入170 ml甲醇，再將反應(yīng)混合物在回流下保持2小時(shí)，以及在減壓 下濃縮。再次加入170ml甲醇，將混合物在回流下保持2小時(shí)，并在減壓 下濃縮。最后，加入125ml甲醇。該混合物被稱為酯化混合物。25-30°C下1小時(shí)內(nèi)將酯化混合物中的大部分(大約95%)放進(jìn)第二 反應(yīng)器(已預(yù)先裝入40ml水)。用8MNaOH (消耗34g)將pH保持為 3.5。形成了固體，通過(guò)過(guò)濾除去固體。將得到的母液與酯化混合物(大約 5%)混合，以將濾液的pH降低至pH二2。在減壓下(p = 20mmHg， T = 40-45°C)濃縮。最后，獲得了 190g粘性混合物。b) 制備處于5 M NaCl中的2 M NaOH將80 g NaCl溶解于149 ml水中。通過(guò)加入5 M NaCl將溶液稀釋至 1000 ml。將體積調(diào)節(jié)至1000 ml需要大約840 ml 5 M NaCl。c) 合成作為游離堿的PGM將a)中獲得的粘性混合物與120 ml 5 M NaCl在40。C混合。在20分 鐘的過(guò)程內(nèi)，將該混合物加入至50ml5MNaCl中，同時(shí)通過(guò)加入處于5 M NaCl中的2 M NaOH來(lái)將pH保持為pH = 9?；旌衔锏臏囟缺３譃?20°C。將混合物轉(zhuǎn)移至分離漏斗，混合物保持放置20分鐘。隨后，對(duì)各層 加以分離。在室溫下將上層與120ml5MNaCl混合。將混合物轉(zhuǎn)移至分離 漏斗，混合物保持放置20分鐘。對(duì)各層加以分離。在5000 rpm對(duì)上層離 心。形成較少的底層，將其從油狀產(chǎn)物中去除。獲得了 95g作為游離堿的 PGM。檢驗(yàn)85%; e.e. = 97%;基于步驟(a)中PG輸入的產(chǎn)率82%。 對(duì)PGM中PG (游離堿)的檢驗(yàn)0.2% (即，99.8%的"比例")。d) 合成氨芐青霉素按照W098/56946中關(guān)于從6-APA和PGA來(lái)合成氨芐青霉素所述， 進(jìn)行該步驟，S卩，PG的酰胺衍生物代替了甲酯。實(shí)施例4a)合成D-苯甘氨酸甲酯(PGM)溶液將135 g D-苯甘氨酸懸浮于252 ml甲醇中，加入107 g濃硫酸(98%)。將混合物在大約73。C下回流下保持2小時(shí)，使用真空泵在減壓 下進(jìn)行濃縮。壓力從大氣壓降至20 mBar，同時(shí)反應(yīng)混合物的溫度從40°C 升高至80°C。加入126 ml (100 g)甲醇，按照前文所述，將混合物在大 約81。C下回流下保持1小時(shí)。該過(guò)程再重復(fù)4次(加入甲醇、回流和濃縮)。最后，加入126ml甲 醇；溶液再被回流l小時(shí)，冷卻至室溫。在35分鐘內(nèi)，以恒定速率加入15 ml氨，至pH 2.3-2.4。加入75 ml 水。在減壓和低于50°C的溫度下蒸餾出甲醇。最終的PGM溶液的pH為 2.0，"比例"為99.0%。實(shí)施例5通過(guò)使用逆流萃取式離心機(jī)來(lái)生產(chǎn)PGM游離堿 按照下文所述來(lái)運(yùn)行圖1所示的工藝流程 -啟動(dòng)離心機(jī)，在2400rpm運(yùn)行-以7.5 kg/h的流速將25。/。 (w/w) Na2S04溶液引入離心機(jī)2。離心機(jī) 1的重相出口出現(xiàn)流體之后，將反應(yīng)混合物(見下文)引入離心機(jī)l， -向10升器皿中加入1000 ml 5.3 M NaCl -將IO升器皿中的內(nèi)容物冷卻至8-10 °C -以15kg/h的流速向IO升器皿中加入PGM溶液 -通過(guò)加入NaOH/NaCl溶液將10升器皿中的pH保持在pH=9.7 -通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物流出器皿的流速將10升器皿中的反應(yīng)物體積保 持為5升-將IO升器皿中的溫度保持為8-10 。C-將10升器皿中的反應(yīng)混合物泵經(jīng)熱交換器，由此溫?zé)嶂?0。C。隨后 將反應(yīng)混合物引入離心機(jī)l。-經(jīng)由熱交換器將來(lái)自離心機(jī)2的輕相冷卻至3-5 。C，并于3-5 。C貯藏于容器中。-在產(chǎn)生輕相之后少于4小時(shí)內(nèi)，在向氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化步驟中應(yīng)用 輕相。
權(quán)利要求
1.從核心和以側(cè)鏈酯形式存在的選自D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸構(gòu)成的組的側(cè)鏈和催化所述側(cè)鏈酯偶聯(lián)至所述核心的酶來(lái)合成半合成的β-內(nèi)酰胺化合物的工藝，其特征在于，所述側(cè)鏈酯不作為固體中間產(chǎn)物分離。
2. 權(quán)利要求1的工藝，包括所述側(cè)鏈酯的形成，其特征在于，所述側(cè) 鏈酯不作為固體中間產(chǎn)物分離。
3. 前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的工藝，包括下述步驟a) 用醇轉(zhuǎn)化選自D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸構(gòu)成的組的游離側(cè) 鏈，以形成包含相應(yīng)的側(cè)鏈酯的混合物；b) 通過(guò)如下方法來(lái)形成所述半合成的/3-內(nèi)酰胺化合物將步驟a)中 獲得的所述混合物與核心和所述酶混合以形成所述半合成的iS-內(nèi)酰胺化合 物，前提是步驟(a)中形成的所述側(cè)鏈酯不作為固體中間產(chǎn)物分離。
4. 權(quán)利要求3的工藝，其中，在步驟(b)中形成所述半合成的/3-內(nèi)酰 胺化合物之前，對(duì)步驟(a)中獲得的所述混合物加以純化。
5. 前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的工藝，其中，所述核心選自6-氨基 青霉烷酸(6-APA) 、 7-氨基去乙酰氧頭孢烷酸(7-ADCA) 、 7-氨基頭孢 烷酸(7-ACA)和7-氨基-3-氯-3-頭孢烯-4-羧酸酯(7-ACCA)構(gòu)成的組。
6. 前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的工藝，其中，所述半合成的/3-內(nèi)酰 胺化合物選自氨芐青霉素、頭孢氨芐、頭孢拉定和頭孢克洛構(gòu)成的組。
7. 前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的工藝，其中，所述醇是甲醇或乙 醇，優(yōu)選是甲醇。
8. 前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的工藝，其中，所述酶是青霉素G酰 化酶，優(yōu)選是固定形式的。
9. 權(quán)利要求7的工藝，其中所述青霉素G?；竵?lái)自^c/zen'c/n'a
10. 包含選自D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸構(gòu)成的組的側(cè)鏈酯的制 劑，其中，所述側(cè)鏈酯是游離堿形式的，其具有等于或大于90%的e.e.， 并且其中，所述制劑具有相對(duì)于所述側(cè)鏈酯而言優(yōu)選20摩爾％或更少的鹽含量以及優(yōu)選25%的"比例"。
11. 權(quán)利要求8的制劑，其包含選自D-苯甘氨酸甲酯、D-苯甘氨酸乙 酯、D-二氫苯甘氨酸甲酯和D-二氫苯甘氨酸乙酯構(gòu)成的組的酯。
12. 生產(chǎn)權(quán)利要求10或11的酯的工藝，其包含將所述側(cè)鏈酯的鹽與堿在水性環(huán)境中混合，由此產(chǎn)生兩相系統(tǒng)，以及 將游離堿形式的所述側(cè)鏈酯與水相分離，優(yōu)選通過(guò)離心，最優(yōu)選通過(guò) 連續(xù)離心來(lái)實(shí)現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明描述了從核心和以側(cè)鏈酯形式存在的側(cè)鏈和催化側(cè)鏈酯偶聯(lián)至核心的酶來(lái)合成半合成的β-內(nèi)酰胺化合物的工藝，側(cè)鏈選自D-苯甘氨酸和D-二氫苯甘氨酸構(gòu)成的組，其特征在于，側(cè)鏈酯不作為固體中間產(chǎn)物分離。
文檔編號(hào)C12P35/04GK101631872SQ200880007729
公開日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2008年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者哈羅德·莫洛·穆迪, 托馬斯·杜斯·范德, 西奧多瑞斯·約翰內(nèi)斯·格德弗里德·瑪麗亞·杜勒恩·范 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司