專利名稱：：天冬酰胺酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有改進(jìn)性能的新天冬酰胺酶，優(yōu)選具有改進(jìn)的耐熱性，如在高溫具有改進(jìn)的活性和/或改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及編碼這種改進(jìn)的天冬酰胺酶的DNA序列，所述酶在重組宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生，以及使用天冬酰胺酶的方法，特別是用于減少食品中的丙烯酰胺。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生和制備具有改進(jìn)性能的天冬酰胺酶變體的方法。
背景技術(shù)：
：已知在加熱至高溫的過程中，幾種食物原料(foodmaterial)中都會形成丙烯酰胺。已經(jīng)將丙烯酰胺的形成歸咎于Maillard反應(yīng)，其中天冬酰胺是反應(yīng)物之一。公知的是，通過減少食物原料中天冬酰胺的量的處理，可以減少加熱的食物產(chǎn)品中的丙烯酰胺形成，如通過使食物原料經(jīng)受酶天冬酰胺酶的作用(參見例如WO2004/026042(Frito國LayNorthAmerica,Inc.))。已經(jīng)鑒定了多種微生物天冬酰胺酶，參見例如公開了源自黑曲霉的天冬酰胺酶序列的WO2004/030468(DSM)，或公開了源自米曲霉和桔青霉(尸e"/d〃z'w;w"Yr/"ww)的天冬酰胺酶序列的WO2004/032648(NovozymesA/S)。WO2004/032648還提到了來自煙曲霉04^^^7/ws/wm^af""和構(gòu)巢曲霉的天冬酰胺酶的氨基酸序列。來自土曲霉0^peg///^fe/reus)的天冬酰胺酶的氨基酸序列可以由UniProt數(shù)據(jù)庫獲得(登錄號q0cwjl)。已經(jīng)描述了來自菊歐文氏菌(五nW"^c/w^。"^em0的L-天冬酰胺酶的氨基酸序歹'J和晶體結(jié)構(gòu)(JacekLubkowski，MiroslawaDauter,KhosrowAghaiypour,AlexanderWlodawera和ZbigniewDauter(2003)Atomicresolutionstructureof5nWm'ac/z，a威e附/L-asparaginase.D，59，84-92)。已經(jīng)描述了使用來自嗜熱棲熱菌(7Tz^tww//2ew2o//w7w力的3-異丙基蘋果酸脫氫酶作為模式酶，設(shè)計(jì)具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)的方法(Watanabe,K.等(2006)/艦編.355,664-674)。對于一些應(yīng)用，期望具有改進(jìn)性能的天冬酰胺酶，如具有改進(jìn)的耐熱性的天冬酰胺酶，例如改進(jìn)的熱穩(wěn)定性或改進(jìn)的在高溫時的活性。本發(fā)明的目的是提供可替換的天冬酰胺酶，特別是具有改進(jìn)性能的新天冬酰胺酶。這種改進(jìn)的天冬酰胺酶適用于，例如產(chǎn)生食物產(chǎn)品。發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)來自菊歐文氏菌的同源酶的已發(fā)表結(jié)構(gòu)，建立了來自米曲霉的天冬酰胺酶的三維結(jié)構(gòu)模型。根據(jù)建模的結(jié)構(gòu)，發(fā)明人鑒定了與天冬酰胺酶性能特別是耐熱性的改進(jìn)相關(guān)的氨基酸殘基。此外，本發(fā)明的發(fā)明人預(yù)測了推斷的祖先天冬酰胺酶序列，并由此序列，鑒定了其他與改進(jìn)天冬酰胺酶性能特別是耐熱性相關(guān)的氨基酸殘基。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)和功能上的考慮，構(gòu)建天冬酰胺酶變體，所述變體在鑒定的位置具有修飾的氨基酸殘基，并且具有改變的物理化學(xué)性質(zhì)，特別是改進(jìn)的在高溫時的相對活性和/或改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明涉及制備多肽的方法，其包括(a)提供具有天冬酰胺酶活性的親本多肽的氨基酸序列；(b)在序列中對應(yīng)于SEQIDNO:1中的位置54、57、68-74、82-86、88、93-96、102、107、111、113、115、137、139、164、165、172、176、184-186、194、196、201、206、209、212、214、215、219、220、223、224、226、228、231、235、246、249、255、260、262、264、266、271、275、278-288、290、299、306、307、309-321、323、325、327-342、349、351、353、356-363、365、366和/或375的任何位置選擇至少一個氨基酸殘基；(c)通過取代或缺失選擇的氨基酸殘基或插入與選擇氨基酸殘基相鄰的一個或多個氨基酸殘基來修飾序列；(d)產(chǎn)生具有所述修飾序列的變體多肽；(e)測試所述變體多肽的天冬酰胺酶活性和耐熱性；和(f)選擇與親本多肽相比具有天冬酰胺酶活性和更高耐熱性的變體多肽。本發(fā)明還涉及耐熱的天冬酰胺酶，其可以由這種方法獲得。因此，本發(fā)明涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少70%同一性；和c)熱處理后殘余的天冬酰胺酶活性是未熱處理時天冬酰胺酶活性的至少50%,其中熱處理是在pH6在至少64。C的溫度溫育20分鐘。本發(fā)明還涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少70%同一性；和(c)在pH6在65。C的天冬酰胺酶活性比在37。C高至少25%。在另一個方面，本發(fā)明涉及新天冬酰胺酶，其與SEQIDNO:1相比，在鑒定為與改進(jìn)酶的耐熱性有關(guān)的位置包含氨基酸序列的差異。因此，本發(fā)明在一個方面涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少80%同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在對應(yīng)于SEQIDNO:1中位置54、57、68-74、82-86、88、93-96、102、107、111、113、115、137、139、164、165、172、176、184-186、194、196、201、206、209、212、214、215、219、220、223、224、226、228、231、235、246、249、255、260、262、264、266、271、275、278-288、290、299、306、307、309-321、323、325、327-342、349、351、353、356-363、365、366和/或375的任何位置包含氨基酸差異。在另一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少60%同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在對應(yīng)于SEQIDNO:1中位置71-74、82、88、111、113、137、164、176、196、206、223、226、231、246、266、275、278-282、288、309、312、329-332、341、357-359和/或363的任何位置包含氨基酸差異。在另一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少60%同一性；和(c)與SEQIDNO:'l相比較，包含下述氨基酸取代中的至少一個70H/K/S、137S、164D、1961、201Q、278H/Q、283C、290V、307A、312Y、334F、336C/G/L、337F/I、366P和/或375T;其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1中氨基酸l至378的位置。在另一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少50%同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在對應(yīng)于SEQIDNO:1中位置71-73、82、111、137、164、176、206、223、226、231、246、266、275、279、281、288、312、329-332、341、357-359和/或363的任一位置包含氨基酸差異。并且在另一個方面，本發(fā)明涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少50%同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，包含下述氨基酸取代中的至少一個70H、137S、164D、1961、201Q、278H/Q、283C、290V、307A、312Y、334F、336C/G/L、337F、366P和/或375T;其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1中氨基酸1至378的位置?？梢酝ㄟ^修飾親本序列獲得氨基酸差異，例如，通過定點(diǎn)突變。然而，也可以在天然存在的多肽中發(fā)現(xiàn)氨基酸差異，所述多肽與SEQIDNO:1相比，天然具有(arebornwith)這樣的氨基酸差異。本發(fā)明還涉及編碼天冬酰胺酶的分離的核酸序列，并且涉及核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體，和包含所述核酸序列的宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生和使用所述天冬酰胺酶的方法。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供構(gòu)建親本天冬酰胺酶的變體的方法，其中所述變體與親本天冬酰胺酶相比，具有至少一種改變的性質(zhì)，該方法包括(a)提供親本天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)；(b)分析親本天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)以鑒定包含與改變所述性質(zhì)有關(guān)的至少一個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)部分；(c)構(gòu)建親本天冬酰胺酶的變體，其包含對(b)中鑒定的至少一個氨基酸殘基的修飾，從而改變所述性質(zhì)；和(d)對得到的天冬酰胺酶變體，測試所述性質(zhì)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供構(gòu)建親本天冬酰胺酶的變體的方法，其中所述變體與親本天冬酰胺酶相比，具有至少一種改變的性質(zhì)，該方法包括(a)提供親本天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)；(b)將親本天冬酰胺酶的序列與推斷的祖先天冬酰胺酶序列進(jìn)行比對以鑒定與改變所述性質(zhì)有關(guān)的至少一個氨基酸殘基；(c)構(gòu)建親本天冬酰胺酶的變體，其包含(b)中鑒定的至少一個氨基酸殘基的修飾，從而改變所述性質(zhì)；和(d)對得到的天冬酰胺酶變體，測試所述性質(zhì)。附圖簡述圖1是源自米曲霉、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、桔青霉、土曲霉和黑曲霉的天冬酰胺酶的多重比對。圖2顯示對于三個模擬溫度(300K,400K,500K)和來自米曲霉的天冬酰胺酶模型四聚體結(jié)構(gòu)的全部四個單體的分子動力學(xué)模擬數(shù)據(jù)。將具有高rmsd(均方根偏差)值(相對于該溫度的平均值)的殘基范圍鑒定為運(yùn)動區(qū)(mobileregion),并由此作為穩(wěn)定突變的目的靶標(biāo)。圖3顯示在米曲霉天冬酰胺酶的模型結(jié)構(gòu)中，四聚體天冬酰胺酶具有三個二重對稱軸(3axesof2-foldsymmetry)。圖4顯示分子動力學(xué)模擬的參數(shù)文件。圖5顯示分子動力學(xué)模擬的參數(shù)文件。圖6顯示由實(shí)施例6中使用的最大似然法(maximumlikelihoodmethod)推斷的系統(tǒng)發(fā)生樹。發(fā)明詳述新天冬酰胺酶本發(fā)明的多肽具有天冬酰胺酶活性。優(yōu)選地，它們具有M酸序列，所迷序列能與SEQIDNO:1-6中任何序列比對。SEQIDNO:1顯示來自米曲霉的天冬酰胺酶的氨基酸序列，和本發(fā)明上下文中使用的編號系統(tǒng)。編碼所迷酶的氨基酸序列和DNA序列先前已作為WO2004/032648的SEQIDNO:2和SEQIDNO:1公開。SEQIDNO:2顯示來自黑曲霉的天冬酰胺酶的氨基酸序列。編碼所述酶的氨基,列和DNA序列先前已作為WO2004/030468的SEQIDNO:3和SEQIDNO:2公開。SEQIDNO:3顯示來自煙曲霉的天冬酰胺酶的氨基酸序列(先前已作為WO2004/032648的SEQIDNO:6公開)。SEQIDNO:4顯示來自構(gòu)巢曲霉的天冬酰胺酶的氨基酸序列(先前已作為WO2004/032648的SEQIDNO:4公開)。SEQIDNO:5顯示來自桔青霉的天冬酰胺酶的氨基酸序歹'j(先前已作為WO2004/032648的SEQIDNO:12公開)。SEQIDNO:6顯示來自土曲霉的天冬酰胺酶的氨基酸序歹'J(由UniProt數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號qOcwjl)。本發(fā)明的多肽可以經(jīng)過部分或全部的翻譯后加工。例如，它們可以在不同位置進(jìn)行N-端截短，從而可以找到不同的N-端序列。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)野生型米曲霉天冬酰胺酶在米曲霉中過表達(dá)時被異源加工，從而在純化樣品中發(fā)現(xiàn)至少四個N-端序列，對應(yīng)于截短至氨基酸27-378、30-378、75-378或80-378的多肽。本發(fā)明的多肽可以在相應(yīng)位置截短，或者可以在其他位置截短。本發(fā)明的多肽因此可以，例如緊鄰對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置27、30、75或80中任何位置的位置之前被截短。在這一語境中，"緊鄰...之前"表示截短發(fā)生在所述位置的N-端側(cè)。本發(fā)明的多肽因此可以具有對應(yīng)于，例如，SEQIDNO:1的位置27、30、75或80中任何位置的N-末端。本發(fā)明的多肽可以具有與SEQIDNO:1或其片段有超過50%的同一性的氨基酸序列，優(yōu)選超過60%,如超過70%或80%,特別地超過90%,特別是超過95o/o，例如，超過98。/o。SEQIDNO:1的片段可以，例如，由氨基酸27-378、30-378、75-378或80-378組成。通常，就本發(fā)明而言，當(dāng)提到多肽的片段時，指的是由至少100個，如至少150或者至少200或300個氨基酸組成的多肽或氨基酸鏈。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的片段包含從對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置80的位置至C-端的氨基酸序列或由其組成，例如SEQIDNO:1的氨基酸80-378，SEQIDNO:2的氨基酸80-378，SEQIDNO:3的氨基酸80-374，SEQIDNO:4的氨基酸80-378，SEQIDNO:5的氨基酸80-379，或SEQIDNO:6的氨基酸80-375。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽具有與SEQIDNO:1或其片段相比具有1-50，如1-40，1-30，1-20或1-10個氨基酸差異的氨基酸序列。在另一個方面，本發(fā)明的多肽具有與SEQIDNO:2或其片段有超過50%，優(yōu)選超過60%，如超過70%或80%，特別地超過90%，特別是超過95%，例如超過98%同一性的氨基酸序列。在另一個方面，本發(fā)明的多肽具有與SEQIDNO:3-6中的任何序列或其片段有超過50%,優(yōu)選超過60%，如超過70%或80%，特別地超過90°/。，特別超過95%,例如超過98%同一性的氨基酸序列。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明的多肽是真核多肽，即衍生自、獲得自或來源自真核生物體。在更優(yōu)選的方面，多肽衍生自、獲得自或來源自曲霉屬。本發(fā)明的多肽可以顯示高耐熱性，例如它們可以具有高的熱穩(wěn)定性或具有在高溫時的高的相對天冬酰胺酶活性。在一個方面，本發(fā)明的多肽可以是熱穩(wěn)定的或者具有高的熱穩(wěn)定性。可將熱穩(wěn)定性確定為熱處理后殘余的天冬酰胺酶活性除以未熱處理的天冬酰胺酶活性。熱處理可以在高溫在pH6或大約pH6培養(yǎng)，例如，10、20、30或40分鐘。在本上下文中，可將未熱處理的天冬酰胺酶活性確定為在相同緩沖液中在4。C溫育的樣品(溫育時間與熱處理樣品的溫育時間相同)的天冬酰胺酶活性，或者可以是熱處理之前的天冬酰胺酶活性。本發(fā)明的多肽在高溫在pH6溫育一段時間，例如20分鐘后，與未熱處理的天冬酰胺酶活性相比，可以顯示至少90%，如至少80%，至少70%，至少60%,至少50%,或至少40%的殘余天冬酰胺酶活性。在本發(fā)明的上下文中的高溫可以指，例如，55。C、58°C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、66°C、67°C、68°C、69。C、70°C、72。C或75。C?？梢杂杀绢I(lǐng)域中任何已知方法確定天冬酰胺酶活性?？梢酝ㄟ^下述方法確定在pH6，在磷酸鉀緩沖液中用L-天冬酰胺和羥胺溫育酶20分鐘，然后進(jìn)行與FeCl2的耦合反應(yīng)，并測定A490，如實(shí)施例4中所述。溫育可以在任何合適的溫度進(jìn)行，例如55'C。在另一個方面，與參照溫度，例如37。C，40°C,45"C或5(TC相比，本發(fā)明的多肽在高溫可以具有高的相對天冬酰胺酶活性?？梢匀缟纤龃_定在高溫和，例如，37。C的天冬酰胺酶活性，其中用天冬酰胺溫育的過程可以分別在高溫和37。C進(jìn)行。高溫時天冬酰胺酶活性除以37。C時的活性可以為至少1100/。，優(yōu)選至少120%,如至少125%，130%，140%,150%，170%或200%，更優(yōu)選250%，如至少300%，和甚至更優(yōu)選至少500%或至少700%。在一些方面，與參照序列，例如SEQIDNO:1相比，本發(fā)明的多肽在一個或多個特定位置包含氨基酸差異?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法鑒定這些位置。本發(fā)明上下文中的氨基酸差異可以是特定位置氨基酸殘基的缺失或取代，或者是在該位置氨基酸殘基的鄰近處插入一個或多個其他氨基酸殘基。鄰近處表示在任一側(cè)，即插入可以發(fā)生在該位置氨基酸殘基的N-端或C-端，即緊鄰特定位置之前或之后插入。取代可以表示對另一種天然存在的氨基酸的取代。氨基酸差異可以是天然存在的，即可以存在于與SEQIDNO:1的同一性小于100%的天然存在的野生型天冬酰胺酶中，或者可以導(dǎo)入，例如通過蛋白質(zhì)工程，如通過定點(diǎn)突變，例如改進(jìn)親本天冬酰胺酶的性質(zhì)。本發(fā)明的多肽可以是親本多肽的變體，其中氨基酸差異可以指與親本序列相比，變體中特定位置的氨基酸序列中的差異。在這種情況下，氨基酸差異還指氨基酸修飾。本發(fā)明的多肽，其與SEQIDNO:1或親本多肽相比，在特定位置包含氨基酸差異，除了本文所述氨基酸差異之外，所述多肽可以包含其他氨基酸差異。親本天冬酰胺酶根據(jù)本發(fā)明的親本多肽可以是根據(jù)酶命名法(http:〃www.chem.qmuUc.uk/iubmb/enzyme提供)分類為EC3.5.1.1的天冬酰胺酶。它可以是真核天冬酰胺酶，例如真菌天冬酰胺酶，如絲狀真菌天冬酰胺酶，例如對于曲霉屬菌抹是天然的，特別是對于米曲霉或黑曲霉是天然的。親本天冬酰胺酶可以具有與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6中任何序列至少50%(特別是至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%或至少98%)同源的氨基酸序列。親本天冬酰胺酶可以具體為能與這些序列中任何序列比對的天冬酰胺酶。在優(yōu)選的方面，親本天冬酰胺酶可以具有下述序列的氨基^列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6中任何序列，或這些序列中任何序列的同源物。在更優(yōu)選的方面，親本天冬酰胺酶可以具有下述序列的氨基酸序列SEQIDNO:l或SEQIDNO:2，或這些序列中任何序歹'j(優(yōu)選SEQIDNO:l)的同源序列。氨基酸差異的命名法說明和權(quán)利要求通過氨基酸的一字母編碼表示氨基酸。根據(jù)一字母編碼及其位置鑒定序列中特定的氨基酸，例如Ml表示位置1的Met(曱硫氨酸)，即在N-端。本文用于確定取代而使用的命名法基本如WO92/05249所述。因此，G82P表示用P(Pro)取代位置82的G(Gly)。D223N/L表示用N(Asn)或L(Leu)取代位置223的D(Asp)。取代之間的加號(+)，例如137S+228V表示"和"，即將這兩個單獨(dú)的取代組合在一個相同的天冬酰胺酶中。取代包含取代成為其他十九種天然氨基酸中任一種，或取代成其他氨基酸，如非天然氨基酸。例如，位置71中的氨基酸T的取代包括下述取代中的每一種71A、71C、71D、71E、71F、71G、71H、711、71K、71L、71M、71N、71P、71Q、71R、71S、71V、71W和71Y。這些取代還能命名為T71A、T71C、T71D等。同樣方法可以類似地應(yīng)用于本申請所述的每種氨基酸差異或氨基酸取代，特別包括取代為任何其他氨基酸。在特定位置的插入可以表示在該位置氨基酸殘基的相鄰處插入一個或多個其他氨基酸殘基。在本上下文中相鄰處可以表示任一側(cè)，即N-端側(cè)或C-端側(cè)，即，在參照序列中該位置存在的氨基酸之前或之后。在特定位置，例如位置82的Gly后插入其他氨基酸殘基，例如Lys，命名為，例如，G82GK。當(dāng)命名特定的氨基酸差異時，可以或者可以不指明參照序列中的氨基酸殘基。例如，取代96I表示在對應(yīng)于例如SEQIDNO:1的位置96的位置取代成為I(IIe)，無論參照序列中位置96處存在何種氨基酸。如果參照序列為SEQIDNO:1，取代961也可以命名為V96I。同源性與比對就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的比對使用EMBOSS軟件包(Rice，P.Longden,I.和Bleasby,A(2000)EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite.7>*ew<3&G"e"幼'cy16,(6)pp276—277;http:〃emboss.org)2.8.0版本的Needle程序確定。Needle程序執(zhí)行Needleman，S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J!Mo/.5/o/.48，443-453中所述的全局比對算法。使用的取代矩陣為BLOSUM62,缺口打開罰分(gapopenpenalty)為10,缺口延伸罰分(gapextensionpenalty)為0.5。兩個氨基酸序列之間的同一性程度如下計(jì)算兩個序列的比對中精確匹配的數(shù)目，除以兩個序列中最短序列的長度。結(jié)果用百分比同一性表示。就本發(fā)明而言，可以使用兩個或多個序列的比對鑒定一個序列中對應(yīng)于(即相當(dāng)于)另一個序列例如參照序列(例如SEQIDNO:l)的特定位置的位置。如果要在SEQIDNO:2-6的任一個中鑒定對應(yīng)于SEQIDNO:1的特定位置的位置，可以使用如圖1所示的比對。如果要在任何其他同源序列中鑒定對應(yīng)于SEQIDNO:1的特定位置的位置，SEQIDNO:1和同源序列之間的比對如上所述進(jìn)行，并且根據(jù)比對結(jié)果，可以對應(yīng)于其在SEQIDNO:1中相當(dāng)?shù)陌被釟埢?，為同源序列中每個氨基酸殘基分配編號。在本上下文中，同源序列是能與SEQIDNO:1比對的序列。對于本發(fā)明和/或根據(jù)本發(fā)明使用的多肽中的大多數(shù)氨基酸殘基，可能直接并明確地將氨基酸殘基分配于它所對應(yīng)的SEQIDNO:1的氨基酸1至378的序列中。唯一的例外是對于SEQIDNO:1的氨基酸1至378是額外的氨基酸殘基。例如，從圖1可以看出，來自黑曲霉的氨基酸序列在米曲霉序列S338和S339之間具有額外的氨基酸S、D、T和A,其中根據(jù)SEQIDNO:1編號。在本申請的上下文中，可以根據(jù)SEQIDNO:1為本發(fā)明的多肽的氨基酸殘基編號。如果本發(fā)明的多肽是親本多肽的變體，那么也可以^4居SEQIDNO:1為親本的氨基酸殘基編號，從而根據(jù)其在SEQIDNO:1中對應(yīng)(相當(dāng))的氨基酸的編號，指定每個氨基酸殘基的位置。用于設(shè)計(jì)新天冬酰胺酶變體的方法在一個方面，本發(fā)明涉及構(gòu)建親本天冬酰胺酶變體的方法，其中所述變體與親本天冬酰胺酶相比具有至少一種改變的性質(zhì)在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及構(gòu)建親本天冬酰胺酶變體的方法，其中所述變體與親本天冬酰胺酶相比具有至少一種改變的性質(zhì)，該方法包括(a)提供親本天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)；(b)分析親本天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)以鑒定包含與改變所述性質(zhì)有關(guān)的至少一個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)部分；(c)構(gòu)建親本天冬酰胺酶的變體，其包含(b)中鑒定的至少一個氨基酸殘基的修飾，從而改變所述性質(zhì)；和(d)對得到的天冬酰胺酶變體，測試所述性質(zhì)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及構(gòu)建親本天冬酰胺酶的變體的方法，其中所述變體與親本天冬酰胺酶相比具有至少一種改變的性質(zhì)，該方法包括(a)提供親本天冬酰胺酶的序列；O)將親本天冬酰胺酶與推斷的祖先天冬酰胺酶序列的序列進(jìn)行比對，以鑒定與改變所述性質(zhì)有關(guān)的至少一個氨基酸殘基；(c)構(gòu)建親本天冬酰胺酶的變體，其包含(b)中鑒定的至少一個氨基酸殘基的修飾，從而改變所述性質(zhì)；和(d)對得到的天冬酰胺酶變體，測試所述性質(zhì)。本發(fā)明的方法中使用的親本天冬酰胺酶可以具有與SEQIDNO:1或其片段至少50%相同，優(yōu)選至少60%，70%或80%相同，更優(yōu)選至少90%相同，如至少95%或至少98%相同的氨基酸序列。SEQIDNO:1的片段可以，例如，由SEQIDNO:1的氨基酸殘基50-378或80-378組成。在另一個方面，親本天冬酰胺酶可以具有與SEQIDNO:2-6中的任一個或這些序列中4壬一個的片^a至少50%相同，優(yōu)選至少60%,70%或80%相同，更優(yōu)選至少90%相同，如至少95°/?；蛑辽?8%相同的氨基酸序列。通常通過對編碼所討論的親本多肽的DNA序列進(jìn)行適當(dāng)修^飾而完成對至少一個氨基酸殘基的修飾。本發(fā)明的上述方法中至少一種改變的性質(zhì)可以是，例如，穩(wěn)定性，如溫度穩(wěn)定性或pH依賴穩(wěn)定性；溫度或pH依賴活性；比活性；底物特異性；更高或更低的最適溫度；更高或更低的失活溫度；或者在食品產(chǎn)生過程中減少丙烯酰胺形成的能力增加。至少一種改變的性質(zhì)可以優(yōu)選為與親本天冬酰胺酶的耐熱性相比更高的耐熱性，如與親本天冬酰胺酶相比，更高的熱穩(wěn)定性或者更高的在高溫時的相對天冬酰胺酶活性。更優(yōu)選地，至少一種改變的性質(zhì)可以是在pH6在65。C與37。C相比，比親本酶更高的相對天冬酰胺酶活性?；蛘呖梢允窃趐H6在65。C,比親本酶更高的天冬酰胺酶活性?；蛘呖梢允窃诩spH6在至少64。C的溫度溫育20分鐘后，比親本酶更高的天冬酰胺酶活性?？梢匀?新天冬酰胺酶"部分所述確定在高溫時的熱穩(wěn)定性和相對天冬酰胺酶活性。用于根據(jù)3D結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)新天冬酰胺酶變體的方法可以通過本領(lǐng)域任何已知方法提供根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的親本天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)?？梢允且呀?jīng)確定并且在本領(lǐng)域中已知的結(jié)構(gòu)，這種情況下，可以通過參考文獻(xiàn)提供結(jié)構(gòu)。否則，可以通過X-射線衍射或NMR確定結(jié)構(gòu)?；蛘呖梢酝ㄟ^將根據(jù)本發(fā)明的方法使用的親本天冬酰胺酶依據(jù)另一種天冬酰胺酶結(jié)構(gòu)建模而提供，所述另一種天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)先前已確定或建模。使用已發(fā)表的來自菊歐文氏菌的L-天冬酰胺酶的三維結(jié)構(gòu)(JacekLubkowski，MiroslawaDauter，KhosrowAghaiypour，AlexanderWlodawera禾口ZbigniewDauter(2003)Atomicresolutionstructureof￡>*w/"/ac/z，o威e7w'L-asparaginase.CVy".A59,84-92)為來自米曲霉的天冬酰胺酶的三維結(jié)構(gòu)建模?？梢砸灶愃频姆绞綖榱硗獾奶於０访傅慕Y(jié)構(gòu)建模。使用"巢式(Nest)"同源建模工具(Petrey,D.，Xiang,X.，Tang,C.L.,Xie，L.，Gimpelev,M.,Mitors，T.，Soto，C.S.,Goldsmith-Fischman,S.,Kernytsky,A.，Schlessinger,A.，Koh，I.Y.Y"Alexov，E.和Honig，B.(2003)UsingMultipleStructureAlignments,FastModelBuilding,andEnergeticAnalysisinFoldRecognitionandHomologyModeling,尸ra^'ra..浙mc.，"wdGfe威53:430-435)建立米曲霉天冬酰胺酶的3D模型。使用菊歐文氏菌天冬酰胺酶的A-鏈結(jié)構(gòu)作為模板。將如下比對用作模型建立的&出。模型中不包括米曲霉天冬酰胺酶序列的前49個氨基酸殘基。通過將米曲霉天冬酰胺酶模型的拷貝與菊歐文氏菌天冬酰胺酶結(jié)構(gòu)中每個單體比對，建立完整的四聚體結(jié)構(gòu)的模型。>P1;Ao—天冬酰胺酶序列Ao一天冬酰胺酶:::::::tlpnvtifatgskqinewcndptmagawthgtdtleesaffldatvncrkpwivgamrpstaisadgplnllqsvtvaaspkardrga:livmndr工vsafyasktnantvdtfkaiemgn:lgevvsnkpyffyppvkp-tgktevdirn工tsiprvd工lysyedmhndtlysaidngakgiv工agsgsgsvstpfsaamedittkhnip工vastrtgngevpssaessqiasgylnpaksrv:l:lg:l:l:laqgksieemravfer工gva★>Pl;lo7j結(jié)構(gòu)lo7j::A::A:klpnivilatggtiagsaatgtqttgykagalgvdtl工navpevkklanvkgeqfsnmasenmtgdwlklsqrvnellard-dvdgwithgtdtveesayflhltvksdkpwfvaamrpata工sadgpMN:LLEAVRVAGDKQSRGRGVMWINDR工GSARYITKTNASTIjDTFRANEEGYLiGVIIGNRIYYQNRIDKLHTTRSVFDVRGLTSLPKVDIIjYGYQDDPEYLjYDAAIQHGVKGIVYAGMGAgsvsvrgiagmrkalekg-vwmrstrtgngivppdeelpglvsdslnpaharillmlaltrtsdpkviqeyfhty——★在本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方案中，根據(jù)來自菊歐文氏菌的L-天冬酰胺酶的已知結(jié)構(gòu)建立親本天冬酰胺酶的模型。換句話說，在建立親本天冬酰胺酶結(jié)構(gòu)的模型時，使用菊歐文氏菌天冬酰胺酶的已知結(jié)構(gòu)，如菊歐文氏菌天冬酰胺酶的A鏈結(jié)構(gòu)作為模板。在本發(fā)明方法的另一個實(shí)施方案中，根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸殘基50-378的模型三維結(jié)構(gòu)建立親本天冬酰胺酶的模型，其中該結(jié)構(gòu)如上所述建模。對酶功能的預(yù)期影響。例如等電性質(zhì)的變化，表面疏水性的變化或改變的局部動力學(xué)。這些局部變化可以導(dǎo)致酶的物理性質(zhì)改變，如熱穩(wěn)定性，存在其他化學(xué)組分(例如表面活性劑)時的穩(wěn)定性，pH鐠，吸收性質(zhì)或溶解性。在本發(fā)明方法的步驟(b)中鑒定的結(jié)構(gòu)部分可以由氨基酸殘基組成。然而，在有些情況下，結(jié)構(gòu)部分包含多于一個氨基酸殘基。待修飾的結(jié)構(gòu)部分可以包含環(huán)狀結(jié)構(gòu)中位于多聚體例如二聚體或四聚體中不同亞基之間界面處的氨基酸，其接近底物結(jié)合位點(diǎn)，或類似情形。待修飾的結(jié)構(gòu)優(yōu)選為折疊酶中據(jù)認(rèn)為對于酶的溫度穩(wěn)定鐠有貢獻(xiàn)的部分，或者可以負(fù)責(zé)天冬酰胺酶的性質(zhì)。下文所述為可以在本發(fā)明的方法中應(yīng)用的具體概念，和通過使用不同概念而設(shè)計(jì)的變體的具體建議。主要考慮改進(jìn)高溫時的活性和/或熱穩(wěn)定性而建議進(jìn)行特定的氨基酸修飾，然而修飾可能還影響其他性質(zhì)。概念分子動力學(xué)(MD)模擬分子動力學(xué)(MD)模擬是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中氨基酸移動性的表征(參見McCammon，JA和Harvey,SC.,(1987),"Dynamicsofproteinsandnucleicacids"CambridgeUniversityPress)。這種蛋白質(zhì)動力學(xué)經(jīng)常與結(jié)晶B因子(參見Stout,GH和Jensen,LH,(1989)，"X-raystructuredetermination",Wiley)比較。通過在例如不同溫度運(yùn)行MD模擬，可以模擬殘基與溫度相關(guān)的運(yùn)動?？梢越ㄗh對具有最高運(yùn)動性或靈活性(此處為各向同性波動)的區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變。應(yīng)理解的是，在蛋白質(zhì)的某些區(qū)域發(fā)現(xiàn)的高運(yùn)動性可以通過這些區(qū)域中的變化通過一個或多個殘基的取代、插入或缺失而減小。在溫度300K、400K和500K,將來自米曲霉的天冬酰胺酶模型四聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行2ns分子動力學(xué)模擬。使用GROMACS3.3分子模擬軟件包(D.vanderSpoel,E.Lindahl,B.Hess,GGroenhof,A.E.Mark和H.J.C.Berendsen(2005):GROMACS:Fast,FlexibleandFree,JComp.26p.1701-1718)。如下設(shè)置模擬1)將模型四聚體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成GROMACS拓樸，同時小心以確保正確確定二硫橋。使用OPLSAA力場。2)運(yùn)行100步最陵下坡最小化(steepestdescentsminimization)以去除原子沖撞，并修正鍵長。參見圖4的參數(shù)文件。3)將結(jié)構(gòu)在llxllxllnm水箱(waterbox)中溶劑化。4)通過100步最陡下坡最小化將溶劑化的結(jié)構(gòu)最小化。參見圖4的參數(shù)文件。5)在溫度300K、400K和500K運(yùn)行2nsNVTMD模擬。參見圖5的參數(shù)文件。6)對于每次運(yùn)行，棄去前800ps,并使用GROMACS軟件包的"g-rmsf，工具，計(jì)算最后1200ps的每個C-a原子坐標(biāo)的均方根偏差(rmsd)。7)比較三種模擬溫度之間和結(jié)構(gòu)的四個單體之間的數(shù)據(jù)(總結(jié)于圖2中)。將具有高rmsd值(相對于該溫度的平均值)的殘基范圍鑒定為運(yùn)動區(qū)域，并且因此作為穩(wěn)定突變的目的靶標(biāo)峰1:68-74峰2:279-288峰3:309-319峰4:329-342峰5:356-363本發(fā)明的一個方面涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少50%,如至少60%,至少70%,至少80%,至少85%，至少90%，至少95%或至少98%的同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在下述區(qū)域中的至少一個包含氨基酸差異位置68-74、位置279-288,位置309-319，位置329-342,和/或位置356-363,其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置。因此，與SEQIDNO:1相比較，本發(fā)明的多肽可以在下述位置中的一個或多個包含氨基^^列中的差異，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置68、69、70、71、72、73、74、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、356、357、358、359、360、361、362，和/或363。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基酸差異是取代。在一個優(yōu)選的方面，多肽是親本多肽的變體。親本多肽可為任何天冬酰胺酶，例如，具有SEQIDNO:1-6中列出的序列或其同源物的天冬酰胺酶之一。特別感興趣的多肽具有上述氨基酸差異中的一個或多個與本申請公開的任何其他氨基酸差異的組合。概念"靜電快樂"可以確定特定氨基酸殘基周圍的電荷網(wǎng)絡(luò)。這與位于表面上的殘基特別相關(guān)。"靜電快樂"概念指替換位于靜電不利環(huán)境中的帶電殘基，或者在電勢表明這種電荷為靜電有利的位置引入電荷。當(dāng)靜電電位為正時有利的條件(-快樂殘基)為帶負(fù)電殘基，或者反之亦然；不利條件(=不快樂殘基)是當(dāng)殘基電荷與靜電電位符號相同時。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了這一概念(JoseM.Sanchez-Ruiz和GeorgeI.Makhatadze(2001):Tochargeornottocharge,7T^EM)51/"所Wec/7"o/ogvl9,pp.l32-135)，但是在本文《吏用GROMACS實(shí)施。1)使用OPLSAA力場將結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成GROMACS拓樸。這也將部分電荷施加于每個原子。將每個殘基中原子上的部分電荷平均。對于不可滴定的(non-titratable)殘基，這一數(shù)值為零。2)使用GROMACS工具"genion"計(jì)算每個原子位置的靜電電勢。將每個殘基中原子上的電勢平均。3)對于每個殘基，將"靜電快樂"定義為平均的部分電荷乘以平均的靜電電勢。正值說明為不快樂殘基，負(fù)值表示為快樂殘基。對于不可滴定的殘基，這一數(shù)值為零。在一些情況下可能發(fā)生電荷反轉(zhuǎn)(例如K到E)。在其他情況下，取代結(jié)構(gòu)相似但中性的殘基可能是最優(yōu)的。根據(jù)這一概念的特定突變?yōu)椴辉趩误w之間界面處的殘基R196E、K194E、D88N、E255Q、K290E、E311K(對于顯示電荷反轉(zhuǎn)的，中性殘基可以取而代之是最優(yōu)的)。在單體之間的界面處的殘基D111N、D206N、E235Q、R266L、D275N、E331Q。本發(fā)明的一個方面涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少50%,如至少60%，至少70%,至少80%，至少85%,至少90%,至少95°/。，或者至少98%的同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在下述位置中的至少一個包含氨基酸差異D88、Dlll、K194、R196、D206、E235、E255、R266、D275、K290、E311、E331;其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置。優(yōu)選地，氨基酸差異是取代。因此，在優(yōu)選的方面，與SEQIDNO:l相比較，本發(fā)明的多肽包含下述氨基酸取代中的至少一個，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置D88N，D111N，K194E,R196E，D206N,E235Q,E255Q:R266L,D275N,K290E,E311K，E331Q。在優(yōu)選的方面，多肽是親本多肽的變體。親本多肽可以是任何天冬酰胺酶，例如，具有SEQIDNO:1-6中列出的序列或其同源物的天冬酰胺酶之一。特別感興趣的多肽具有上述氨基酸差異中一個或多個與本申請公開的任何其他氨基酸差異的組合。概念脯氨酸殘基的導(dǎo)入可以根據(jù)phi/psi骨架角度和側(cè)鏈沖撞(clash)，建議在不同位置取代成脯氨酸殘基。使用程序WHATIF的命令SUGPRO鑒定可取代脯氨酸的殘基(G.Vriend(1990》WHATIF:Amolecularmodelinganddrugdesignprogram,Mo/.GV"/7&8,p52-56)。在專利EP0585285B1中描述了替代方法。本發(fā)明的一個方面涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少50%，如至少60%,至少70%,至少80%，至少85%,至少90%,至少95%，或者至少98°/。的同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在下述位置的至少一個包含氨基酸差異G82、T113、1365、183、N278、Q84、N70、E366、V164、A137、F306、D115、T85、T280、L201;其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置。優(yōu)選地，氨基酸差異是取代。因此，在優(yōu)選的方面，與SEQIDNO:l相比較，本發(fā)明的多肽包含下述氨基酸取代中的至少一個，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置G82P、T113P、I365P、183P、N278P、Q84P、N70P、E366P、V164P、A137P、F306P、D115P、T85P、T280P、L201P。在優(yōu)選的方面，多肽是親本多肽的變體。親本多肽可以是任何天冬酰胺酶，例如，具有SEQIDNO:1-6中列出的序列或其同源物的天冬酰胺酶之一。特別感興趣的多肽具有上述氨基酸差異中一個或多個與本申請公開的任何其他氨基酸差異的組合。概念對稱點(diǎn)相互作用四聚體天冬酰胺酶具有三個二-重對稱軸，如圖3所示。因?yàn)槊甘峭此木垠w，所以沿這些軸之一定位的殘基與其他單體之一中的相應(yīng)殘基密切接觸，并且在相關(guān)對稱軸的其他末端重復(fù)這一模式(pattem)。以這種方式，可以僅通過一次突變產(chǎn)生單體之間的兩組相互作用。對于二硫橋尤其如此，可以通過僅取代或插入一個半胱氨酸殘基而導(dǎo)入二石克橋。還可以沿對稱軸導(dǎo)入其他類型的相互作用，如疏水或靜電接觸。本發(fā)明的一個方面涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少50%,如至少60%，至少70%,至少80%,至少85%，至少90%，至少95%，或者至少98%的同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在下述位置的至少一個包含氨基酸差異，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置S176、D223、G231、P246、Y271、S283、G328(取代成C將可能導(dǎo)致一個或多個二石危橋的形成)；D223、K249、D286(基于疏水或靜電接觸)。優(yōu)選地，氨基酸差異是取代。因此，在優(yōu)選的方面，與SEQIDNO:l相比較，本發(fā)明的多肽包含下述氨基酸取代中的至少一個，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置S176C;D223C;G231C;P246C;Y271C;S283C;G328C;D223N/L;K249V??；D286R/N/L。在優(yōu)選的方面，多肽是親本多肽的變體。親本多肽可以是任何天冬酰胺酶，例如，具有SEQIDNO:1-6中列出的序列或其同源物的天冬酰胺酶之一。特別感興趣的多肽具有上述氨基酸差異中一個或多個與本申請公開的任22何其他氨基酸差異的組合。概念螺旋加蓋蛋白質(zhì)oc螺旋每個末端的第一個殘基，特別是在N-末端，可以包含于骨架-側(cè)鏈氫鍵中，這對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性非常重要(參考ProteinScience(1998),7,p21-38)。此處取代可能導(dǎo)致熱穩(wěn)定性的增加。在使用分子動力學(xué)模擬鑒定的區(qū)域中，下述位置對于突變是特別感興趣的，因?yàn)榭梢詰?yīng)用上述相兌念中的一個或多個峰1:N70(負(fù)電勢，合理的脯氨酸位置)D69(不快樂Asp)A72(負(fù)電勢)峰2:D279(不快樂Asp)D286(不快樂Asp)K290(不快樂Lys)T280(螺旋加蓋)L281(螺旋加蓋)N278(負(fù)電勢)S283(對稱點(diǎn))峰3:S307(螺旋加蓋)E311(不快樂Glu)D312(不快樂Asp)H317(正電勢)峰4:E337(不快樂Glu)A336(合理的Pro位置)峰5:Q361(負(fù)電勢)K363(不快樂K,合理的Pro位置)本發(fā)明的一個方面涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少50%，如至少60%，至少70%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或者至少98%的同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在下述位置的至少一個包含氨基酸差異，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置N70;D69;A72;D279;D286;K290;T280;L281;N278;S283;S307;E311;D312;H317;E337;A336;Q361和/或K363。優(yōu)選地，氨基酸差異是取代。因此，在優(yōu)選的方面，與SEQIDNO:l相比較，本發(fā)明的多肽包含下述氨基酸取代中的至少一個，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置N70P/R/K;D69R/K;A72R/K;D279N/V/R;D286N/V/R;K290E/L;T280D/E;L281D/E;N278H/Q/R/K;S307A/D/E;E311Q/I/R;D312Y/N/V/R;H317D/E;E337Q/R/K/I;A336P;Q361認(rèn)和/或K363P/Q/E/L。在優(yōu)選的方面，多肽是親本多肽的變體。親本多肽可以是任何天冬酰胺酶，例如，具有SEQIDNO:1-6中列出的序列或其同源物的天冬酰胺酶之一。特別感興趣的多肽具有上述氨基酸差異中一個或多個與本申請公開的任何其他氨基酸差異的組合。用于根據(jù)祖先重建(AncestralReconstruction)而設(shè)計(jì)新天冬酰胺酶變體的方法可以根據(jù)一組同源蛋白質(zhì)的序列預(yù)測本發(fā)明方法中使用的推斷的祖先天冬醜胺酵序歹'J，i口文獻(xiàn)戶斤述(JosephW.Thornton:ResurrectingAncientGenes:ExperimentalAnalysisOfExtinctMolecules(2004),jV她wiev/evw6^w幼'c^5,p366-375;C.W.Cunningham,K.E.Omland&T.H.Oakley:Reconstructingancestralcharacterstates:acriticalreappraisal(1998),7Ve油￡co/ogy五vo/幼'ow13,p361-336)。依賴于序列的數(shù)目和它們的同源性，推斷的祖先序列可顯著不同于這些序列中的每一個，例如(同源性為)40-90%。因此蛋白質(zhì)和其推斷祖先序列之間的氨基酸殘基數(shù)差別很大。為了獲得熱穩(wěn)定性更好的蛋白質(zhì)，可以用推斷的祖先序列的相應(yīng)殘基取代蛋白質(zhì)的多個氨基酸殘基。因?yàn)椴町惐姸?，所以期望的是選擇用于取代的優(yōu)選殘基位置的方法。一種方法是鑒定蛋白質(zhì)中的大多數(shù)殘基與其預(yù)測的祖先序列相同的區(qū)域。在這個區(qū)域中，選擇蛋白質(zhì)與其祖先序列之間不同的殘基用于取代。根據(jù)祖先序列重建，本發(fā)明的發(fā)明人鑒定了多個熱穩(wěn)定性增加的天冬酰胺酶變體。因此本發(fā)明的一個方面涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少50°/。，如至少60%，至少70%,至少80%,至少85%,至少90%，至少95%,或者至少98%的同一性；和(c)與SEQIDNO:l相比較，在下述位置的至少一個位置包含氨基酸差異54、57、70、83、84、86、93-96、102、107、137、139、165、172、184-186、209、212、214、215、219、220、224、260、262、264、266、299、318、320、321、323、325、327、349、351、353和/或356。其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置。優(yōu)選地，氨基酸差異是取代。因此，在優(yōu)選的方面，與SEQIDNO:l相比較，本發(fā)明的多肽包含下述氨基酸取代中的至少一個，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置V54I、F57L、N70K、183V、Q84D、L86P、M93L、L94K、N95D、V96L、V102D、V歸、A137LV訓(xùn)、1165L、S172A、L184Y、Q185N、S186A、V209G、F212R、A2雨、S215T、A219T、N220T、T224A、N260K、T262D、1264L、R266K、S299N、N318G、P320V、1321V、A323R、T325S、T327V、A349Q、S351A、V353I和/或G356M。在更優(yōu)選的方面，與SEQIDNO:1相比較，本發(fā)明的多肽包含下述氨基酸取代中的至少一個，其'中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置V54I、F57L、N70K、I83V、Q84D、L86P、V102D、N260K、T262D、A323R、T327V、A349Q、S351A和/或V353I。在甚至更優(yōu)選的方面，與SEQIDNO:1相比較，本發(fā)明的多肽包含下述氨基酸取代中的至少一個，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置N70K、A323R、T327V、A349Q、S351A和/或V353L在優(yōu)選的方面，多肽是親本多肽的變體。親本多肽可以是任何天冬酰胺酶，例如，具有SEQIDNO:1-6中列出的序列或其同源物的天冬酰胺酶之一。特別感興趣的多肽具有上述氨基酸差異中一個或多個與本申請公開的任何其他氨基酸差異的組合。優(yōu)選的天冬酰胺酶本發(fā)明的一個方面涉及多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少50%,如至少60%,至少70%,至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，或者至少98%的同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在下述位置的至少一個位置包含氨基酸差異54、57、68-74、82-86、88、93-96、102、107、111、113、115、137、139、164、165、172、176、184-186、194、196、201、206、209、212、214、215、219、220、223、224、226、228、231、235、246、249、255、260、262、264、266、271、275、278-288、290、299、306、307、309-321、323、325、327-342、349、351、353、356-363、365、366和/或375，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置優(yōu)選地，與SEQIDNO:l相比較，本發(fā)明的多肽包含下述氨基酸取代中的至少一個54、57、70、83、84、86、102、137、164、196、201、228、260、262、278、283、290、307、312、323、327、334、336、337、349、351、353、366和/或375,其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置。與SEQIDNO:1相比，多肽可以包含氨基酸取代。優(yōu)選地，與SEQIDNO:1相比較，本發(fā)明的多肽包含下述氨基酸取代中的至少一個541、57L、69K/R、70H/K/P/R/S、72K/R、82P、83P/V、84P/D、85P、86P、88N、93L、94K、95D、96L、102D、1071、lllN、113P、115P、137P/S/I、1391、164D/P、165L、172A、176C、184Y、185N、186A、194E、196E/I、201P/Q、206N、209G、212R、214V、215T、219T、220T,、223C/L/N、224A、228V、231C、235Q、246C、249I/L/V、255Q、260K、262D、264L、266L/K、271C、275N、278H/K/P/Q/R、279N/R/V、280D/E/P、281D/E、283C、286L/N/R/V、290E/L/V、299N、306P、307A/D/E、311I/K/Q/R、312N/R/V/Y、317D/E、318G、320V、321V、323R、325S、327V、328C、331Q、334F、336C/G/L/P、337F/I/K/Q/R、349Q、351A、263531、356M、361K/R、363E/L/P/Q、365P、366P和/或375T。更優(yōu)選地，與SEQIDNO:l相比，多肽包含下述取代中的至少一種541、57L、70H/K//S、83V、84D、86P、102D、137S、164D、1961、201Q、228V、260K、262D、278H/Q、283C、290V、307A、312Y、323R、327V、334F、336C/G/L、337F/I、349Q、351A、3531、366P和/或375T。甚至更優(yōu)選地，與SEQIDNO:1相比，多肽包含下述取代中的至少一種，如至少兩種，至少三種，至少四種或至少五種70K、323R、327V、349Q、351A和/或3531。甚至更優(yōu)選地，與SEQIDNO:l相比，多肽包含下述取代70K、323R、327V、349Q、351A和/或3531。最優(yōu)選地，多肽具有與SEQIDNO:1相同的序列，或同源序列，除了下述取代70K、323R、327V、349Q、351A和353L多肽可以是具有SEQIDNO:1序列或同源序列的親本酶的變體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，與SEQIDNO:1相比較，多肽在對應(yīng)于SEQIDNO:1下述任何位置的位置包含氨基酸差異70、137、164、196、201、228、278、290、366和/或375。優(yōu)選地，多肽包含下述取代中的至少一種70H/K/S、137S、164D、1961、201Q、228V、278H/Q、290V、366P和/或375T。在高溫，多肽可以具有高的相對天冬酰胺酶活性，如上面在"新天冬酰胺酶"部分所確定的。如果多肽是親本多肽的變體，與親本多肽相比，變體多肽在高溫時可以具有更高的相對天冬酰胺酶活性。與SEQIDNO:1相比，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的多肽包含下述取代或取代組70H、70S、70K、70K+278H、70K+278H+196I、70K+278H+201Q、70K+283C、137S、137S+228V、164D、1961、201Q、278H、278Q、290V、366P和/或366P+375T。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，與SEQIDNO:1相比較，多肽在下述位置中至少一個位置包含氨基酸差異70、283、307、312、334、336和/或337。優(yōu)選地，多肽包含下述取代中的至少一種70K、283C、307A、312Y、334F、336C/G/L和/或337F/I,其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置。多肽可以具有高的熱穩(wěn)定性，如上文在"新天冬酰胺酶，，部分所確定。如果多肽是親本多肽的變體，與親本多肽相比，變體多肽可以具有更高的熱穩(wěn)定性。與SEQIDNO:1相比，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的多肽包含下述取代或取代組70K、70K+307A+312Y、70K+307A+312Y+336L+337F、70K+307A+312Y+336L+337F+283C、70K+307A+312Y+334F、70K+307A+312Y+336G+337I、70K+307A+312Y+283C、70K+283C、70K+336C+337F，70K+307A和/或70K+312Y。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，與SEQIDNO:1相比4交，多肽在對應(yīng)于SEQIDNO:1的下述任何位置中的位置包含氨基酸差異54、57、70、83、84、86、93-96、102、107、137、139、165、172、184-186、209、212、214、215、219、220、224、260、262、264、266、299、318、320、321、323、325、327、349、351、353和/或356。優(yōu)選地，與SEQIDNO:1相比，多肽包含下述取代中的至少一個V54I、F57L、N70K、I83V、Q84D、L86P、M93L、L94K、N95D、V96L、V102D、V畫、A137I、V139I、H65L、S172A、L184Y、Q185N、S186A、V209G、F212R、A214V、S215T、A219T、N220T、T224A、N260K、T262D、1264L、R266K、S299N、N318G、P320V、1321V、A323R、T325S、T327V、A349Q、S351A、V353I和/或G356M。更優(yōu)選地，與SEQIDNO:l相比，多肽包含下述取代中的至少一個V54I、F57L、N70K、183V、Q84D、L86P、V102D、N260K、T262D、A323R、T327V、A349Q、S351A和/或V3531。最優(yōu)選地，與SEQIDNO:l相比，多肽包含下述取代中的至少一個，如至少兩個，至少三個，至少四個或至少五個N70K、A323R、T327V、A349Q、S351A和/或V353L在高溫時，多肽可以具有高的相對天冬酰胺酶活性，如上文在"新天冬酰胺酶"部分所確定。如果多肽是親本多肽的變體，與親本多肽相比，在高溫時變體多肽可以具有更高的相對天冬酰胺酶活性。與SEQIDNO:1相比，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的多肽包含下述取代組N70K+V54I+F57L、N70K+N260K+T262D、N70K+A323R+T327V、N70K+A349Q+S351A+V353I、N70K+I83V+Q84D+A323R+T327V、N70K+L86P+V102D+A323R+T327V、N70K+A323R+T327V+A349Q+S351A+V353I、N70K+I83V+Q84D+A323R+T327V+A349Q+S351A+V353I和/或N70K+V102D+A323R+T327V+A349Q+S351A+V3531。基于序列制備天冬酰胺酶變體的方法本文鑒定為與改進(jìn)天冬酰胺酶耐熱性相關(guān)的特定氨基酸位置，與改進(jìn)其序列可以與SEQIDNO:1比對的任何天冬酰胺酶的耐熱性有關(guān)。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及制備多肽的方法，該方法包括(a)提供具有天冬酰胺酶活性的親本多肽的氨基酸序列；(b)在序列中對應(yīng)于SEQIDNO:1中下述任何位置的位置選擇至少一個氨基酸殘基54、57、68-74、82-86、88、93-96、102、107、111、113、115、137、139、164、165、172、176、184-186、194、196、201、206、209、212、214、215、219、220、223、224、226、228、231、235、246、249、255、260、262、264、266、271、275、278-288、290、299、306、307、309-321、323、325、327-342、349、351、353、356-363、365、366和/或375;(c)通過取代或缺失選擇的氨基酸殘基或插入與選擇氨基酸殘基相鄰的一個或多個氨基酸殘基來修飾序列；(d)產(chǎn)生具有修飾序列的變體多肽；(e)測試變體多肽的天冬酰胺酶活性和耐熱性；和(f)選擇與親本多肽相比具有天冬酰胺酶活性和更高耐熱性的變體多肽。親本多肽優(yōu)選具有與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或這些序列中任何序列的片段具有至少50%同一性，更優(yōu)選至少60%,至少70%或者至少80%同一性，并且甚至更優(yōu)選至少90%，至少95%或者至少98%同一性的序列。更優(yōu)選地，親本多肽具有序列，所述序列包含SEQIDNO:1-6中任何序列或其片段，或由SEQIDNO:1-6中任何序列或其片段組成。優(yōu)選的片段由從對應(yīng)于SEQIDNO:1的位置80的位置至多肽C-端的氨基酸序列組成。在本上下文中，更高的耐熱性指更高的熱穩(wěn)定性或者在高溫時更高的相對天冬酰胺酶活性。如上文在"新天冬酰胺酶"部分所述可以確定熱穩(wěn)定性和高溫時的相對天冬酰胺酶活性。在優(yōu)選的方面，選擇的至少一個氨基酸殘基在序列中的位置對應(yīng)于SEQIDNO:l中下述任何位置54、57、70、83、84、86、102、137、164、196、201、228、260、262、278、283、290、307、312、323、327、334、336、337、349、351、353、366和/或375。在另一個優(yōu)選的方面，通過取代至少一個選擇的氨基酸殘基而修飾序列。優(yōu)選地，通過導(dǎo)入下述取代中的至少一個而修飾序列541、57L、69K/R、70H/K/P/R/S、72認(rèn)、82P、83P/V、84P/D、85P、86P、麵、93L、94K、95D、96L、102D、1071、lllN、113P、115P、137P/S/I、1391、164D/P、165L、172A、176C、184Y、185N、186A、194E、196E/I、201P/Q、206N、209G、212R、214V、215T、219T、220T、223C/L/N、224A、228V、231C、235Q、246C、249I/L/V、255Q、260K、262D、264L、266L/K、271C、275N、278H/K/P/Q/R、279N/R/V、280D/E/P、281D/E、283C、286L/N/R/V、290E/L/V、299N、306P、307A/D/E、311I/K/Q/R、312N/R/V/Y、317D/E、318G、320V、321V、323R、325S、327V、328C、331Q、334F、336C/G/L/P、337F/I/K/Q/R、349Q、351A、3531、356M、361K/R、363E/L/P/Q、365P、366P和/或375T，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置。更優(yōu)選地，通過導(dǎo)入下述取代中的至少一個而修飾序列541、57L、70H/K/S、83V、84D、86P、102D、137S、164D、1961、201Q、228V、260K、262D、278H/Q、283C、290V、307A、312Y、323R、327V、334F、336C/G/L、337F/I、349Q、351A、3531、366P和/或375T，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置。在更優(yōu)選的方面，通過導(dǎo)入下述取代中的至少一個，如至少兩個，至少三個，至少四個或至少五個來修飾序列70K、323R、327V、349Q、351A和/或3531，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置。在更優(yōu)選的方面，通過導(dǎo)入下述取代而修飾序列70K、323R、327V、349Q、351A和/或3531,可能與其他取代組合，其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸1至378的位置。可以通過本領(lǐng)域已知的4壬何方法，例如，如WO94/14963或WO94/14964(Unilever)所述，完成一個或多個氨基酸殘基的修飾以獲得本發(fā)明的多肽。下文描述了用于克隆編碼天冬酰胺酶的DNA序列的方法，然后是在編碼天冬酰胺酶的序列中在特定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的方法。克隆編碼天冬酰胺酶的DNA序列編碼天冬酰胺酶的DNA序列可以使用本領(lǐng)域各種公知的方法，分離自產(chǎn)生所述天冬酰胺酶的任何細(xì)胞或微生物。首先，使用來自產(chǎn)生待克隆天冬酰胺酶的生物體的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA庫。然后，如果天冬酰胺酶的氨基酸序列已知，可以合成帶標(biāo)記的寡核苷酸探針從由所研究生物體制備的基因組文庫鑒定編碼天冬酰胺酶的克隆?；蛘撸褂冒c另一種已知天冬酰胺酶基因同源序列的寡核苷酸探針作為探針，使用低嚴(yán)緊的雜交和洗滌條件，鑒定編碼天冬酰胺酶的克隆。另一種鑒定編碼天冬酰胺酶的克隆的方法包括向表達(dá)載體如質(zhì)粒插入基因組DNA和/或cDNA的片段，用獲得的DNA文庫轉(zhuǎn)化天冬酰胺酶陰性-細(xì)菌或真菌宿主，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在允許對表達(dá)天冬酰胺酶的克隆進(jìn)行鑒定的瓊脂培養(yǎng)基上。這樣的培養(yǎng)基可以，例如，包含天冬酰胺作為唯一氮源，使得只有包含活性天冬酰胺酶基因的細(xì)胞可以生長。另一種培養(yǎng)基可以，例如，包括天冬酰胺和pH指示劑，所述指示劑響應(yīng)于因天冬酰胺酶作用而從天冬酰胺釋》文氨時發(fā)生的pH增加而改變顏色?；蛘撸绻於０访富蛳嚓P(guān)的天冬酰胺酶的氨基酸序列是已知的，可以設(shè)計(jì)簡并DNA引物，其允許從基因組DNA或從DNA文庫直接擴(kuò)增天冬或者，可以在基周文庫中確定克隆的序列，或者確定那些克隆中選定的子集的序列，并且這些序列可與已知的天冬酰胺酶序列比較，以鑒定新序列?；蛘?，可以通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成地制備編碼酶的DNA序列，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)，refra/iecra"Z^股w22,p.1859-1869描述的亞磷酰胺(phosphoroamidite)方法，或由Matthes等，(1984)，3，pp.801-805描述的方法。在亞磷酰胺方法中，例如在自動DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化，退火，連接并克隆進(jìn)合適的載體中。最后，DNA序列可以是混合的基因組和合成來源，混合的合成和cDNA來源或混合的基因組和cDNA來源，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過連接合成、基因組或cDNA來源的片段而制備(適當(dāng)時，是對應(yīng)于完整DNA序列的多個部分的片段)。還可以使用特定的引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備DNA序列，例如US4,683,202或R.K.Saiki等，(1988),6We"ce239，pp.487-491中所述。天冬酰胺酶變體的構(gòu)建可以通過在選定位置(見下文)的定點(diǎn)突變，或者通過局部隨機(jī)突變，即通過在親本多肽的選定位置或區(qū)域?qū)腚S機(jī)的氨基酸殘基，例如如WO95/22615中所述，獲得天冬酰胺酶變體。在翻譯成所述M酸序列的基因的至少三個部分中，或者在全部基因中，通it^部或區(qū)域特異性隨機(jī)突變適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行隨機(jī)突變。當(dāng)通過使用寡核普酸進(jìn)行突變時，在待改變位置合成寡核苷酸的過程中，寡核香酸可以摻雜或摻入三個非親本核苷酸?？梢赃M(jìn)行摻雜或摻入從而避免出現(xiàn)不期望的氨基酸的密碼子。通過使用例如PCR、LCR或認(rèn)為合適的任何DNA聚合酶和連接酶的任何技術(shù)，可以將摻雜或摻入的寡核苷酸并入編碼天冬酰胺酶的DNA中。優(yōu)選地，使用"定量隨機(jī)摻雜"來進(jìn)行摻雜，其中每個位置中野生型和突變的百分比是預(yù)定的。此外，摻雜可以牽涉優(yōu)選導(dǎo)入某些核苷酸，并由此優(yōu)選導(dǎo)入一個或多個特定氨基酸殘基?？梢赃M(jìn)行摻雜，例如，使得在每個位置允許導(dǎo)入90%野生型和10%突變。選擇摻雜方案時其他的考量基于遺傳的以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的約束條件。隨機(jī)突變可以有利地局限于所述親本天冬酰胺酶的一部分。這樣可以，例如當(dāng)已經(jīng)鑒定了酶的某些區(qū)域?qū)τ诿傅闹付ㄐ再|(zhì)特別重要時是有利的。定點(diǎn)突變一旦已經(jīng)分離了編碼天冬酰胺酶的DNA序列，并鑒定了突變的期望位點(diǎn)，可以使用合成寡核苷酸導(dǎo)入突變。這些寡核苷酸在期望的突變位點(diǎn)的側(cè)翼包含核苷酸序列。在具體的方法中，在攜帶天冬酰胺酶基因的載體中產(chǎn)生DNA(編碼天冬酰胺酶的序列)的單鏈缺口。然后使攜帶期望突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)填補(bǔ)剩余的缺口，并使用T4連接酶連接構(gòu)建體。在Morinaga等，(1984)，所0fec/2"0/0w2,pp.636-639中描述了這種方法的具體實(shí)例。US4,760,025公開了通過對盒進(jìn)行較少的(minor)改變而導(dǎo)入編碼多個突變的寡核苷酸。然而，通過Morinaga方法可以在任何一個時間導(dǎo)入甚至更多樣的突變，因?yàn)榭梢詫?dǎo)入不同長度的大量寡核苷酸。在Nelson和Long,(1989),爿"fl/聲/c"/所oc/ze/w:y/7180，pp.147-151中描述了向編碼天冬酰胺酶的DNA序列中導(dǎo)入突變的另一種方法。這種方法涉及產(chǎn)生PCR片段的3個步驟，所述片段包含期望的突變，其通過使用化學(xué)合成的DNA鏈作為引物之一在PCR反應(yīng)中導(dǎo)入。由PCR產(chǎn)生的片段，可以通過限制性內(nèi)切核酸酶切割而分離攜帶突變的DNA片段，并且重新插入表M粒中。天冬酰胺酶的表達(dá)根據(jù)本發(fā)明，可以以酶的形式，使用表達(dá)載體表達(dá)編碼本發(fā)明的多肽的DNA序列，所述序列包括由上述方法或由本領(lǐng)域已知的其他替代方法產(chǎn)生的變體，所述表達(dá)載體通?？梢园ǜ鞣N調(diào)控序列，例如，啟動子、操縱基因、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻i奪起始信號，和，在某些情況中，抑制子基因或多種激活子基因。表達(dá)載體攜帶編碼本發(fā)明天冬酰胺酶的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是任何載體，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且載體的選擇將通常依賴于將導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞。載體可以是一種當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時，整合到宿主細(xì)胞基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。在載體中，DNA序列應(yīng)該與適當(dāng)?shù)膯幼有蛄锌刹僮鞯剡B接。啟動子應(yīng)該是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并且可以源自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包含合適的轉(zhuǎn)錄終止子，并且，在真核細(xì)胞中，包含與編碼本發(fā)明的天冬酰胺酶的DNA序列可操作地連接的聚腺苦酸化序列。終止序列和fj^苷酸化序列可以合適地源自與啟動子源自相同的來源。載體可以進(jìn)一步包含能夠使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這樣的序列的實(shí)例是質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和piJ702的復(fù)制起點(diǎn)。載體還可以包含選擇性標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可以補(bǔ)充宿主細(xì)胞中缺陷的基因，如來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的da/基因，或者賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。此外，載體可以包含曲霉屬選擇標(biāo)記，如amdS、argB、niaD和sC,產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或者可以通過共轉(zhuǎn)化完成選#^，例如，如WO91/17243所述。用于連接本發(fā)明編碼天冬酰胺酶的DNA構(gòu)建體和任選的啟動子、終止子和/或其他元件，并將它們插入包含復(fù)制必需信息的適當(dāng)載體中的步驟是本領(lǐng)域4支術(shù)人員熟知的(參見，例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989)。宿主細(xì)胞包含如上所定義的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明的細(xì)胞，可以有利地在本發(fā)明的天冬酰胺酶的重組產(chǎn)生中用作宿主細(xì)胞?？梢苑奖愕赝ㄟ^將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體(一個或多個拷貝)整合進(jìn)宿主染色體，用編碼天冬酰胺酶的本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通常認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)镈NA序列更可能在細(xì)胞中保持穩(wěn)定?？梢愿鶕?jù)常規(guī)方法將DNA構(gòu)建體整合進(jìn)宿主染色體，例如通過同源或異源重組進(jìn)行?；蛘?，可以如上所述，用與不同類型宿主細(xì)胞有關(guān)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。合適的細(xì)菌的實(shí)例是革蘭氏陽性細(xì)菌如枯草芽孢桿菌(Ba"7/ws"^'fc)、地衣芽孢桿菌(Ba"7/ws"ctem/onw》、遲緩芽孢桿菌(5acz'〃us/e"fw"、短芽孢桿菌(5ad〃w6reW力、嗜熱月旨肪芽孢桿菌C8acz7/wsWeara^ermqp/n'/ws)、嗜堿芽孑包才干菌(5ac/〃usa/Aa/o_p/7us)、解f定灃分芽孑包^干菌(5ac/〃wsamy/o/z々wey^c/e""、凝結(jié)芽孢桿菌(5ac/〃wcoagw/a""、環(huán)狀芽孢桿菌(^z"7/z^">cw/ara)、杣爛芽孢桿菌(A2c/〃M/"Mrt^)、巨大芽孢桿菌(^ac/〃wweg"/e/v'w附)、蘇云金芽孢桿菌(^c/〃w//7wr/wg/era7》或淺青紫鏈霉菌(5"/re內(nèi)OAW少ces/zV/da"力或鼠灰鏈霉菌(5^eptomycesm^7'm^)，或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌?？梢酝ㄟ^，例如，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或使用感受態(tài)細(xì)胞以本身已知方式實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化。酵母生物體可以合適地選自酵母屬或裂殖酵母屬的菌種，例如釀酒酵母。宿主細(xì)胞還可以是絲狀真菌例如屬于曲霉屬的菌種，特別是米曲霉或黑曲霉，或者鐮孑包屬的菌4朱，長口尖鐮孑包(i^ksan.wm0j9^/0nw7)、禾谷鐮孑包(/^kra7'wmgrfl/m'"e"rww)、石克色鐮孑包(Fwjar/w/wJw/pAwreww)、才以絲孑包鐮孑包(Fw^an'ww/n'c/7oAec/ozVfes)、桿孑包狀鐮孑包(尸usan'wmZac^7W/o/fifes)、"t妄骨木鐮孑包CFwsan'wwsaw6wc/"wm)、凈分鄉(xiāng)工嫌孑包(尸MS(3n'M附roseww)、禾本^牛嫌孑包(Fws"n'w附cerea/z's)、庫威鐮孑包CFksan'wmcraA:^we〃erae)或鑲片鐮孑包(Fwsan.wmve"e"a&m)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是蛋白酶缺陷或蛋白酶負(fù)菌抹。這可以是例如蛋白酶缺陷菌抹米曲霉JaL125，其缺失了名為"alp"的堿性蛋白酶基因。這個菌林在WO97/35956(Novo.NordiskA/S)中描述。將絲狀真菌細(xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化然后為細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。使用曲霉屬作為宿主微生物在EP238023(NovoNordiskA/S)中描述，其內(nèi)容通過提述并入本文。通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體而產(chǎn)生天冬酰胺酶本發(fā)明主要(interalia)涉及產(chǎn)生本發(fā)明的天冬酰胺酶的方法，所述方法包括在有利于產(chǎn)生天冬酰胺酶的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基回34收所述酶。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于所述宿主細(xì)胞生長并獲得本發(fā)明的天冬酰胺酶表達(dá)的任何常規(guī)培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)提供商獲得，或者根據(jù)發(fā)表的配方(例如美國模式培養(yǎng)物中心的目錄中所述)制備。從宿主細(xì)胞分泌的天冬酰胺酶可以方便地通過公知的步驟從培養(yǎng)物回收，所述步驟包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基分離細(xì)胞，和通過鹽如;5克酸銨沉淀培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)類組分，然后使用色鐠步驟如離子交換色鐠、親和色鐠等。篩選與測試對于由本文所述任何方法產(chǎn)生的天冬酰胺酶變體，可以在純化前或純化后測試天冬酰胺酶活性，例如在篩選試驗(yàn)中進(jìn)行，所述篩選試驗(yàn)測量變體例如在高溫，水解天冬酰胺的能力。為了進(jìn)行這樣的篩選，將用編碼感興趣的突變天冬酰胺酶并具有表達(dá)它的能力的DNA序列轉(zhuǎn)化的微生物，在合適的培養(yǎng)基中和適于分泌酶的條件下溫育?？梢岳缤ㄟ^在高溫(例如在50。C-80。C的范圍中，優(yōu)選在60、62、64、66、68和/或70。C)溫育培養(yǎng)物上清液一段時間(例如5至30分鐘，如20分鐘)，并在合適的溫度例如55。C測量天冬酰胺水解能力，從而進(jìn)行熱穩(wěn)定性增加的變體的篩選。可以例如通過在合適的參照溫度(例如37。C)和高溫(例如在50。C-80。C的范圍中，優(yōu)選在60、62、64、66、68和/或7(TC)測量培養(yǎng)物上清液的天冬酰胺水解活性，從而進(jìn)行與例如37。C相比在高溫時的相對活性增加的變體的篩選。確定在高溫時的天冬酰胺水解活性除以參照溫度的活性作為相對活性?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行天冬酰胺水解能力的測量，例如如實(shí)施例中所述?？梢赃x擇編碼天冬酰胺酶變體的克隆，所述變體具有更高的熱穩(wěn)定性和/或在高溫時更高的相對活性，以確認(rèn)序列并純化酶。可以在純化變體中，按照本領(lǐng)域的已知方法，進(jìn)行與其他已改變的性質(zhì)有關(guān)的進(jìn)一步測試。這些已改變的性質(zhì)包括熱穩(wěn)定性、溫度依賴活性、熱失活、pH依賴活性、pH依賴穩(wěn)定性、比活性或底物特異性，和任何其他感興趣的參數(shù)。食物的產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的天冬酰胺酶適用于食物產(chǎn)品的生產(chǎn)中，如熱加工的含糖食品。這些食物產(chǎn)品，包括咖啡、谷類、曲奇、馬鈴薯片、餅干(crackers)、法式炸薯?xiàng)l、面包和巻(roll)，已經(jīng)在很多情況下顯示包含丙烯酰胺，其被認(rèn)為可能對于動物和人類有致癌作用。當(dāng)還原糖存在的情況下加熱氨基酸天冬酰胺時可能形成丙烯酰胺。因此，通過加熱前向食物原料中加入本發(fā)明的天冬酰胺酶，可以實(shí)現(xiàn)熱加工食品中丙烯酰胺的減少。本發(fā)明的上下文中的食物原料表示食物產(chǎn)品的任何未加工或部分加工形式，其在獲得食物產(chǎn)品的最終形式之前在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)。因此本發(fā)明的一個方面是減少食物產(chǎn)品中的丙烯酰胺，其中向隨后要加熱的食物原料中加入本發(fā)明的天冬酰胺酶。應(yīng)該以對于減少待加熱的食物原料中存在的天冬酰胺酶水平有效的量加入酶?？梢允褂酶鶕?jù)本發(fā)明方法的食物產(chǎn)品的實(shí)例包括任何基于谷類的產(chǎn)品，如面包(bread)、面制糕點(diǎn)(pastiy)、蛋糕(cake)、椒鹽脆餅干(pretzels)、百吉圈(bagels)、曲奇(cookies)、姜汁々并(gingerbread)、姜汁蛋糕、(gingercake)、早餐谷類(breakfastcereals)和脆南包干(crispbread);任何基于馬鈴薯的產(chǎn)品，如法式炸薯?xiàng)l(Frenchfries)、薯?xiàng)l(pommesfrites)、薯片(potatochips)或炸薯片(crisps)、合成的馬鈐薯小吃(fabricatedpotatosnacks)和炸肉餅(croquettes);和任何基于咖啡的產(chǎn)品。優(yōu)選的加熱步驟是這樣的步驟，其中將至少部分食物原料，例如食物原料的表面暴露于促進(jìn)丙烯酰胺形成的溫度，例如ll(TC或更高，或者120。C或更高。根據(jù)本發(fā)明的方法中加熱步驟可以在烤箱中進(jìn)行，例如在180-220。C的溫度進(jìn)行，如面包和其他面包產(chǎn)品的烘培，或在油中，如炸薯片，例如在160-190。C。一個優(yōu)選的實(shí)施方案是減少法式炸薯?xiàng)l或其他油炸的蔬菜基食物產(chǎn)品中的丙烯酰胺的方法。蔬菜食物原料，例如馬鈴薯，可以在漂白后或過程中，在干燥和半炸(par-fiying)(以產(chǎn)生半炸的蔬菜食物原料)之前與根據(jù)本發(fā)明的天冬酰胺酶接觸。也可以在半炸后加入酶。半炸的蔬菜食物原料優(yōu)選進(jìn)行最終的炸制以產(chǎn)生油炸蔬菜食物產(chǎn)品，或者冷凍以產(chǎn)生冷凍的半炸的蔬菜食物原料，其例如在冷凍保存后可以進(jìn)行最終的炸制以產(chǎn)生油炸蔬菜食物產(chǎn)品，例如法式炸薯?xiàng)l。優(yōu)選通過將蔬菜食物原料在酶的水溶液或包含所述酶的混合物中蘸取、浸入或涂覆，來完成與本發(fā)明的天冬酰胺酶的接觸。實(shí)施例材料與方法菌抹與質(zhì)粒大腸桿菌DH12S(可從GibcoBRL獲得)用于酵母質(zhì)粒拯救(plasmidrescue)。pJN001N2是TPI啟動子控制下的釀酒酵母和大腸桿菌穿梭載體，由WO01/92502中所述的pJC039構(gòu)建，其中已經(jīng)插入米曲霉天冬酰胺酶基因。釀酒酵母YNG318:MATaDpep4[cir+]ura3-52，leu2-D2，his4-539用于天冬酰胺酶變體表達(dá)。其在J.Biol.Chem.272(15),pp9720-9727，1997中描述。培養(yǎng)基與底物IOX基礎(chǔ)溶液酵母氮基礎(chǔ)w/o氨基酸(DIFCO)66.8g/1，琥珀酸(鹽)100g/1，NaOH60g/1。SC-葡萄糖:20%葡萄糖(即，終濃度2。/。-2g/100ml)100ml/l，5%蘇氨酸4ml/1,1%色氨酸10ml/1,20%酪蛋白氨基酸25ml/1,10X基礎(chǔ)溶液100ml/l。使用孔大小為0.20微米的濾膜將溶液除菌。將瓊脂和1120(約761ml)一起高壓滅菌，并將單獨(dú)除菌的SC-葡萄糖溶液加入瓊脂溶液中。YPD:細(xì)菌用蛋白胨20g/1，酵母提取物10g/1,20%葡萄糖100ml/l。PEG/LiAc溶液40%PEG400050ml，5M乙酸鋰1ml。DNA操作除非特別說明，使用如Sambrook等(1989)Molecularcloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborlab.ColdSpringHarbor,NY;Ausubel,F.M.等(編)"CurrentprotocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,1995;Harwood，C.R.和Cutting,S.M.(編)中所述的分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行DNA操作和轉(zhuǎn)化。酵母轉(zhuǎn)化用乙酸鋰方法進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化。將0.5微升載體(用限制性內(nèi)切酶消化)和1微升PCR片段混合。在冰上將YNG318感受態(tài)細(xì)胞解凍。在12ml聚丙烯管(Falcon2059)中混合100微升細(xì)胞、DNA混合物和10微升載體DNA(Clontech)。加入0.6mlPEG/LiAc溶液并輕輕混合。在3(TC和200rpm溫育30分鐘。在42。C溫育30分鐘(熱休克)。轉(zhuǎn)移至eppendorf管并離心5秒鐘。棄去上清并重新溶解于3mlYPD中。在3(TC和200rpm溫育細(xì)胞懸浮液45分鐘。將懸浮液倒在SC-葡萄糖平板上并在30。C培養(yǎng)3天以產(chǎn)生菌落。由Nucleicacidsresearchvol.20，No.14(1992)3790中所述的Robzyk和Kassir的方法提取酵母總DNA。DNA測序?yàn)镈NA測序，通過電穿孔(BIO-RADGenePulser)進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化。通過石威方法(MolecuIarCloning,ColdSpringHarbor)或用Qiagen⑧質(zhì)并立^式劑盒制備DNA質(zhì)粒。通過Qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠回收DNA片段。使用PTC-200DNAEngine進(jìn)行PCR。使用ABIPRISMTM310GeneticAnalyzer確定所有DNA序列。實(shí)施例1:天冬酰胺酶表達(dá)載體的構(gòu)建用引物對Cutipre-asparaN2F(SEQIDNO:7)和AsparaCR(SEQIDNO:8)擴(kuò)增米曲霉天冬酰胺酶基因(SEQIDNO:1)。將獲得的PCR片段與pJC039載體一起導(dǎo)入釀酒酵母YNG318,所述pJC039載體用限制性酶消化以去除特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶基因的成熟部分。Cutipre-asparaN2(41聚體)AGCCTTGTTGCTGCTCTCCCCGCCACAGACTCGAACGTCACAsparaCR(50聚體)將命名為pJN001N2的質(zhì)粒從SC-葡萄糖平板上的酵母轉(zhuǎn)化體中回收，并確定內(nèi)部序列，以證實(shí)天冬酰胺酶基因。因此pJN001N2具有來自特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶的信號序列(MKFFTTILSTASLVAALP)，其后為米曲霉天冬酰胺酶的成熟部分的序列(SEQIDNO:1的氨基酸27-378)。實(shí)施例2:酵母文庫和定點(diǎn)變體的構(gòu)建通過SOEPCR方法(重疊延伸剪接，參見"PCR:Apracticalapproach",p.207-209,OxfordUniversitypress,編者M(jìn)cPherson，Quirke，Taylor)構(gòu)建酵母中的文庫和定點(diǎn)變體，然后將與載體消化物混合的純化的PCR片段導(dǎo)入釀酒酵母用于體內(nèi)重組。實(shí)施例3:文庫篩選(相對活性選擇)使用pJN001N2作為骨架，如實(shí)施例2制備酵母克隆/文庫。將SC-葡萄糖上的克隆接種至包含YPD培養(yǎng)基的96孔微量滴定板的孔中，并在28'C培養(yǎng)3天。為了與參照溫度(37。C)相比在某個高溫確定相對活性，在37。C和更高溫度(63。C或65。C)測定培養(yǎng)物上清液的天冬酰胺水解活性。將高溫的天冬酰胺水解活性除以37。C的活性確定為相對活性。選擇具有更高相對活性的克隆并確認(rèn)序列。試劑1M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)1MKH2P04(136g/500ml)+1MK2HP04(174g/500ml)調(diào)至pH6.0100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)+0.1%tritonX-lOO(1L)100ml1M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)lgTritonX-100調(diào)至1000ml2M羥胺(HA)溶液(100ml)13.9g羥胺用100mM磷酸鉀緩沖液(pH6)調(diào)至100ml終止溶液(500ml)23.83ml乙酸(鹽)13.88gFeCl36H2084ml5NHC1用H20調(diào)至500ml底物溶液C100ml)10ml1M磷酸鉀緩沖液0.5gL-天冬酰胺(132,12，終濃度0.0325M)5ml2MHA溶液用1120調(diào)至100ml。39實(shí)驗(yàn)1用移液器吸取20微升樣品加入孔中。2向孔中加入lOO樣t升底物溶液。3在37匸和更高的溫度溫育20分鐘。4向孔中加入100孩i:升終止溶液。5測量A490并確定對于37°C的相對活性。結(jié)果表l.克隆JN001N2攜帶編碼野生型米曲霉天冬酰胺酶的pJN001N2。在其他克隆中，編碼的天冬酰胺酶具有指明的氨基酸取代。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例4:文庫篩選(穩(wěn)定性選擇)使用pJN001N2作為骨架，如實(shí)施例2制備酵母克隆/文庫。將SC-葡萄糖上的克隆接種至包含YPD培養(yǎng)基的96孔微量滴定板的孔中，并在28。C培養(yǎng)3天。為了確定熱處理后的殘余活性，在高溫(64。C或66。C,4。C作為參照)溫育20分鐘后在55。C測量培養(yǎng)物上清液的天冬酰胺水解活性。然后選擇具有更高殘余活性的克隆，并確認(rèn)序列。試劑1M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)1MKH2PO4(136g/500ml)+1MK2HPO4(174g/500ml)調(diào)至pH6.0100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)+0.1%tritonX-lOO(1L)100ml1M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)lgTritonX-廳調(diào)至1000ml2M羥胺(HA)solution(100ml)13.9g羥胺用1OOrnM磷酸鉀緩沖液(pH6)調(diào)至100ml終止溶液(500ml)23.83ml乙酸(鹽)13,88gFeCl36H2084ml5NHC1用H2O調(diào)至500ml底物溶液(100ml)10ml1M磷酸鉀緩沖液0.5gL-天冬酰胺(132.12，終濃度0.0325M)5ml2MHA溶液用1120調(diào)至100ml實(shí)驗(yàn)1用移液器吸取20微升樣品加入孔中。2在適當(dāng)?shù)臏囟葘?6孔板溫育20分鐘。(對照為4°C)3向孔中加入IOO微升底物溶液。4在55。C溫育20分鐘。5向孔中加入IO(H效升終止溶液。6測量A490。結(jié)果表2.克隆JN001N2攜帶編碼野生型米曲霉天冬酰胺酶的pJN001N2。在其他克隆中，編碼的天冬酰胺酶具有指明的氨基酸取代。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實(shí)施例5:飽和文庫與測試相對活性如實(shí)施例2制備飽和文庫。骨架是JNOOl,其與JN001N2相比具有額外的K226R突變。如實(shí)施例2中所述構(gòu)建SC-葡萄糖上的克隆。如實(shí)施例3所述進(jìn)行對提高的相對活性的篩選。表中顯示性能優(yōu)于JN001的變體。表3.克隆JN001N2攜帶編碼野生型米曲霉天冬酰胺酶的pJN001N2。在其他克隆中，編碼的天冬酰胺酶具有指明的氨基酸取代。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實(shí)施例6:基于祖先序列比對構(gòu)建定點(diǎn)變體使用默認(rèn)設(shè)置，用CLUSTALX(Thompson,J.D.，Gibson,T.J.,Plewniak,F.<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>由鄰位相連法(Saitou，N,&Nei，M.(1987).Theneighbor-joiningmethod:anewmethodforreconstructingphylogenetictrees.TWo/.B/o/,￡vo/.4，406—425)才勾建天冬酰胺酶系統(tǒng)發(fā)育樹。選擇十八個天冬酰胺酶序列(表5)用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過去除低同源性的序列和避免重復(fù)以涵蓋盡可能廣的多樣性來選擇這些序列。表5.選擇用于重構(gòu)的微生物天冬酰胺酶<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>用GBLOCKS(Castresana，J.(2000).Selectionofconservedblocksfrommultiplealignmentsfortheiruseinphylogeneticanalysis.M/.5/o/.￡Vo/.17,540-52)選擇充分對齊的(well-aligned)區(qū)域，用Tree-Puzzle5.0(Schmidt,H.A.,Stri謹(jǐn)er，K.，Vingron,M.&vonHaeseler,A.(2002).TREE-PUZZLE:maximumlikelihoodphylogeneticanalysisusingquartetsandparallelcomputing.B/o&yb;rmaft.cs18,502-4)推斷四重奏迷惑(quartetpuzzling)樹。然后通過PAML3.13(Yang,Z.(1997).PAML:aprogrampackageforphylogeneticanalysisbymaximumlikelihood.Ow^W.jpp/.13,555-6)軟件包中具有半自動樹搜索選項(xiàng)的CODEML,使用四重奏迷惑樹作為初始樹，搜索最大似然樹。然后使用PAML中具有用戶樹選項(xiàng)的CODEML推斷祖先殘基，其中，使用了最大似然樹的拓樸(圖6)。然后，使用節(jié)點(diǎn)19和20作為通過最大似然法推斷的祖先序列。還使用簡約法(parsimonymethod)及軟件Bogen(BogenpheilCo.Ltd.)來推斷樹中節(jié)點(diǎn)19和節(jié)點(diǎn)20處的推斷祖先序列。這些序列也顯示為下面的V19和V20。推斷的祖先序列>節(jié)點(diǎn)19(SEQIDNO:9)<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例7:對構(gòu)建的祖先定點(diǎn)變體的評價如實(shí)施例4中所述評價實(shí)施例6的定點(diǎn)變體(只是在37。C而不是55。C測量熱處理后的殘余活性)。包括JN001N2，其包含編碼野生型米曲霉天冬酰胺酶的pJN001N2。JN002N2包含N70K取代。表7.在所述溫度溫育20分鐘后在37。C的殘余活性。將活性描述為與在4'C溫育后活性的相對值。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例8:差示掃描熱量測定測試的變體JN002N2Y是具有下述取代的野生型米曲霉天冬酰胺酶N70K，由釀酒酵母表達(dá)的變體。JN065N2Y是具有下述取代的野生型米曲霉天冬酰胺酶N70KA323RT327VA349QS351AV353I,由釀酒酵母表達(dá)的變體。樣品制備用于差示掃描熱量測定(DSC):將約1.5ml樣品轉(zhuǎn)移至Slide-A-Lyzer⑧透析盒(Pierce,目錄號66380,10kDaMWCO)并在冷凍室(coldroom)(約5。C)中在磁力攪拌下針對500ml的50mMMES緩沖液pH6.0透析1-1K小時。將緩沖液改變?yōu)樾迈r批次的500ml50mMMESpH6.0，并透析過夜。使用透析緩沖液作為通過在280nm測量吸收(A280)的濃度測定中的空白，并作為DSC的參照。使用透析緩沖液調(diào)整樣品的體積，直至得到A28O約為0.5-0.55。使用基于氨基酸序列數(shù)據(jù)(VectorNTIv.9.0.0)計(jì)算的消光系數(shù)，這一系數(shù)對應(yīng)于約1.5-1.7mg/ml的酶濃度。在載入DSC設(shè)備之前，通過真空抽吸和磁力攪拌約10分鐘使樣品脫氣。DSC數(shù)據(jù)記錄與處理設(shè)備VP-DSC(MicroCaFM)掃描區(qū)間20-80°C掃描率60。C/h數(shù)據(jù)處理軟件MicroCalOriginv.4.10。將熱失活溫度(Td)確定為對應(yīng)于熱分析圖(thermograph)中信號頂點(diǎn)的溫度。下面的表8中總結(jié)了這些數(shù)據(jù)。表8:宿主細(xì)胞酵緩沖液掃描率(。C/h)掃描區(qū)間(。c)Td(。c)A280釀酒酵母JN002N2Y50mMMESpH6.06020-80640.54釀酒酵母扁65N2Y50mMMESpH6.06020-80710.5049實(shí)施例9:天冬酰胺酶活性測定法天冬酰胺酶單位(ASMJ)定義為在37。C和pH7.0，1分鐘內(nèi)產(chǎn)生1.0微摩爾氨所需的酶量。保存溶液(stocksolution):50mMTris緩沖液，pH7.0189mML-天冬酰胺溶液1.5M三氯乙酸(TCA)Nessler試劑，Aldrich保存號34，514-8(Sigma-Aldrich)酶反應(yīng)物將500微升緩沖液100孩i升L-天冬酰胺溶液350微升水混合并在37。C平衡。加入100微升酶溶液，并將反應(yīng)物在37。C溫育30分鐘。通過置于冰上并加入50微升1.5MTCA而終止反應(yīng)。混合樣品并在20,000g離心2分鐘。游離氨的測定將50微升酶反應(yīng)混合物與100微升水和50微升Nessler試劑混合，1分鐘后在436nm測定吸光度。將活性與已知標(biāo)準(zhǔn)品比較。實(shí)施例10:熱穩(wěn)定變體JN065N2在處理法式炸薯?xiàng)l用于減少丙烯酰胺中的應(yīng)用性能將賓杰(Bintje)馬鈴薯(Grill-Kartoflen,InterfrugtCatering,Denmark)手動去皮并使用法式炸薯?xiàng)l切割器(Tagliapatate)切成法式炸薯?xiàng)l，尺寸為0.8x0.8cm。將馬鈴薯?xiàng)l分成每份150g(確保每份由來自不同馬鈴薯的條組成)，并置于400ml去離子水中直至使用。通過下述兩個步驟將馬鈴薯?xiàng)l輕燙(blanch):首先在85。C浸入4L去離子水中4分鐘，然后浸入預(yù)熱至70。C的400ml去離子水中15分鐘。通過將輕燙的馬鈴薯?xiàng)l在40。C浸入300ml酶溶液(去離子水溶液)中1分鐘而進(jìn)行酶處理，所述酶溶液具有10,000ASNU/L由米曲霉表達(dá)的實(shí)施例6的熱穩(wěn)定變體JN065N2。為了進(jìn)行比較，包括了未用酶處理的對照樣品(輕燙后立即炸制)。樣品以一式兩份制備。在酶處理后，在85。C在通風(fēng)加熱櫥中將馬鈴薯?xiàng)l干燥10分鐘，并在175。C在植物油中半炸1分鐘。將樣品氣流冷凍(blastfrozen),并最后在175。C第二次炸制3分鐘。將炸薯?xiàng)l混合，并使用乙腈和自動溶劑提取儀(來自Dionex的ASE)提取丙烯酰胺。用Carrez溶液I和II處理提取物，在冰箱中放置過夜，并在HPLC分析(柱DionexIonPacICE-AS1，9x250mm，洗脫液5mMHCl，檢測UV202nm)之前使用0.22微米注射器濾膜(syringefilter)過濾。通過與已知標(biāo)準(zhǔn)品比較而鑒定丙烯酰胺并定量。在下面的表9中給出了結(jié)果。表9:處理丙烯酰胺，ppb對照1190JN065N2600最終法式炸薯?xiàng)l產(chǎn)品中的丙烯酰胺降低了50%，顯示酶在這種應(yīng)用中具有活性。對于野生型酶，通常下降約50-60%,而浸入無酶的水中產(chǎn)生大約25%的下降。實(shí)施例11:在連續(xù)處理法式炸薯?xiàng)l用于減少丙烯酰胺中比較變體JN065N2和野生型酶的熱穩(wěn)定性將賓杰(Bintje)馬鈴薯(Grill-Kartoflen,InterfrugtCatering,Denmark)手動去皮并使用法式炸薯?xiàng)l切割器(Tagliapatate)切成法式炸薯?xiàng)l，尺寸為0.8x0.8cm。將馬鈴薯?xiàng)l分成每份150g(確保每份由來自不同馬鈴薯的條組成)，并置于400ml去離子水中直至使用。通過下述兩個步驟將馬鈴薯?xiàng)l輕燙首先在85。C浸入4L去離子水中4分鐘，然后浸入預(yù)熱至70°C的400ml去離子水中15分鐘。通過將輕燙的馬鈴薯?xiàng)l在6(TC在1500ml酶溶液(去離子水溶液)中保持5分鐘而進(jìn)行酶處理，所述酶溶液具有10,000ASNU/L由米曲霉表達(dá)的實(shí)施例6的熱穩(wěn)定變體JN065N2，或具有10，000ASNU/L的野生型酶。每5分鐘將新的輕燙馬鈴薯?xiàng)l部分浸入酶浴，以模擬連續(xù)使用酶浴。每10-15分鐘從酶浴取出樣品，共進(jìn)行2-3小時，并將樣品冷凍用于后面的活性分析。棄去處理后的馬鈴薯。51結(jié)果示于下面的表10中。表10:<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>將測定的酶活性擬合成指數(shù)式衰變曲線后，即可估計(jì)酶的半衰期(T1/2)。對于野生型酶，(TY2)為135分鐘，而對于熱穩(wěn)定變體JN065N2為157分鐘，相當(dāng)于增加16%。范圍內(nèi)，因?yàn)檫@些實(shí)施方案意欲作為本發(fā)明幾個方面的說明。任何等同的實(shí)施方案意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，以包括定義的本公開為準(zhǔn)。本文引用了許多參考文獻(xiàn)，其公開的內(nèi)容通過提述以其整體并入。權(quán)利要求1.制備多肽的方法，其包括(a)提供具有天冬酰胺酶活性的親本多肽的氨基酸序列；(b)在所述序列中對應(yīng)于SEQIDNO1中的位置54、57、68-74、82-86、88、93-96、102、107、111、113、115、137、139、164、165、172、176、184-186、194、196、201、206、209、212、214、215、219、220、223、224、226、228、231、235、246、249、255、260、262、264、266、271、275、278-288、290、299、306、307、309-321、323、325、327-342、349、351、353、356-363、365、366和/或375的任何位置選擇至少一個氨基酸殘基；(c)通過取代或缺失選擇的氨基酸殘基或插入與選擇氨基酸殘基相鄰的一個或多個氨基酸殘基來修飾所述序列；(d)產(chǎn)生具有修飾序列的變體多肽；(e)測試變體多肽的天冬酰胺酶活性和耐熱性；和(f)選擇與親本多肽相比具有天冬酰胺酶活性和更高耐熱性的變體多肽。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中親本多肽的序列與SEQIDNO:1-6中任何序列或其片段具有至少50°/。同一性。3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法，其中親本多肽的序列與SEQIDNO:1的氨基酸80-378,SEQIDNO:2的氨基酸80-378，SEQIDNO:3的氨基酸80-374,SEQIDNO:4的氨基酸80-378,SEQIDNO:5的氨基酸80-379,或SEQIDNO:6的氨基酸80-375具有至少50°/。同一性。4.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的方法，其中親本多肽的序列包含SEQIDNO:1-6中的任何序列，或其片段。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中親本多肽的序列包含SEQIDNO:1的氨基酸80-378，SEQIDNO:2的氨基酸80-378,SEQIDNO:3的氨基酸80-374，SEQIDNO:4的氨基酸80-378，SEQIDNO:5的氨基酸80-379，或SEQIDNO:6的氨基酸80-375。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)的方法，其中更高的耐熱性包含在pH6在至少64。C的溫度溫育20分鐘后有更高的天冬酰胺酶活性。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中更高的耐熱性包含在pH6在65。C與37。C相比有更高的相對天冬酰胺酶活性。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中選擇的至少一個氨基酸殘基在序列中的位置對應(yīng)于SEQIDNO:1中位置54、57、70、83、84、86、102、137、164、196、201、228、260、262、278、283、290、307、312、323、327、334、336、337、349、351、353、366和/或375的任何位置。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中通過取代選擇的氨基酸殘基來修飾序列。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中通過下述取代的至少一種來修飾序列541、57L、70H/K/S、83V、84D、86P、102D、137S、164D、1961、201()、228V、260K、262D、278H/Q、283C、290V、307A、312Y、323R、327V、334F、336C/G/L、337F/L349Q、351A、3531、366P和/或375T;其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1中氨基酸1至378的位置。11.根據(jù)權(quán)利要求9-10中任一項(xiàng)的方法，其中通過下述取代中的至少一種來修飾序列:70K、323R、327V、349Q、351A和/或353I;其中每個位置對應(yīng)于SEQIDNO:1中氨基酸1至378的位置。12.多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少70%同一性；和(c)熱處理后殘余的天冬酰胺酶活性是未經(jīng)過熱處理時天冬酰胺酶活性的至少50%,其中熱處理是在pH6在至少64。C的溫度溫育20分鐘。13.多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少70%同一性；和(c)在pH6在65。C^;天冬酰胺酶活性比在37。C時高至少25%。14.多肽，其(a)具有天冬酰胺酶活性；(b)與SEQIDNO:1的氨基酸80-378具有至少80%同一性；和(c)與SEQIDNO:1相比較，在對應(yīng)于SEQIDNO:1中位置54、57、68-74、82-86、88、93-96、102、107、111、113、115、137、139、164、165、172、176、184-186、194、196、201、206、209、212、214、215、219、220、223、224、226、228、231、235、246、249、255、260、262、264、266、271、275、278-288、290、299、306、307、309-321、323、325、327-342、349、，351、353、356-363、365、366和/或375的任何位置包含氨基酸差異。15.權(quán)利要求14的多肽，其中氨基酸差異是取代。16.權(quán)利要求15的多肽，其在下述位置中的至少一個位置包含取代54、57、70、83、84、86、102、137、164、196、201、228、260、262、278、283、290、307、312、323、327、334、336、337、349、351、353、366和/或375。17.權(quán)利要求15-16中任一項(xiàng)的多肽，其在位置70包含取代。18.權(quán)利要求17的多肽，其在下述位置中的至少一個位置進(jìn)一步包含取代54、57、83、84、86、102、137、164、196、201、228、260、262、278、283、290、307、312、323、327、334、336、337、349、351、353、366和/或375。19.權(quán)利要求15的多肽，其包含下述取代中的至少一個541、57L、69K/R、70H/K/P/R/S、72K/R、82P、83P/V、84P/D、85P、86P、88N、93L、94K、95D、96L、102D、1071、111N、113P、115P、137P/S/L1391、164D/P、165L、172A、176C、184Y、185N、186A、194E、196E/L201P/Q、206N、209G、212R、214V、215T、219T、220T、223C/L/N、224A、228V、231C、235Q、246C、249I/L/V、255Q、260K、262D、264L、266L/K、271C、275N、278H/K/P/Q/R、279N/R/V、280D/E/P、281D/E、283C、286L/N/R/V、2卯E/L/V、299N、306P、307A/D/E、311I/K/Q/R、312N/R/V/Y、317D/E、318G、320V、321V、323R、325S、327V、328C、331Q、334F、336C/G/L/P、337F/I/K/Q/R、349Q、351A、3531、356M、361K/R、363E/L/P/Q、365P、366P和/或375T。20.權(quán)利要求19的多肽，其包含下述取代中的至少一個541、57L、70H/K/S、83V、84D、86P、102D、137S、164D、1961、201Q、228V、260K、262D、278H/Q、283C、290V、307A、312Y、323R、327V、334F、336C/G/L、337F/I、349Q、351A、3531、366P和/或375T。21.權(quán)利要求20的多肽，其包含下述取代中的至少一個N70H、N70K或N70S。22.權(quán)利要求21的多肽，其包含取代N70K。23.權(quán)利要求22的多肽，其進(jìn)一步包含下述取代中的一個323R、327V、349Q、351A和/或3531。24.分離的核酸序列，其包含編碼權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)的多肽的核酸序列。25.包含權(quán)利要求24的核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述序列與指導(dǎo)多肽在合適的表達(dá)宿主中產(chǎn)生的一個或多個調(diào)控序列可操作地連接。26.包含權(quán)利要求25的核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)栽體。27.包含權(quán)利要求25的核酸構(gòu)建體和/或權(quán)利要求26的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)力包。28.產(chǎn)生權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)的多肽的方法，該方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，產(chǎn)生包含多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。29.產(chǎn)生食物產(chǎn)品的方法，其包括(a)提供食物原料；和(b)用權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)的多肽處理所述食物原料。30.權(quán)利要求29的方法，其中在步驟(b)后加熱所述食物原料。31.權(quán)利要求29-30中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法用于減少食物產(chǎn)品中的丙烯酰胺。32.權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)的方法，其中食物產(chǎn)品是基于谷類的產(chǎn)品，如面包、面制糕點(diǎn)、蛋糕、椒鹽脆餅、百吉圈、曲奇、姜汁餅、姜汁蛋糕、早餐谷物或脆面包干；基于植物的產(chǎn)品，例如基于馬鈴薯的產(chǎn)品，如法式炸薯?xiàng)l、馬鈴薯片或炸薯片，合成的馬鈴薯小吃或炸肉餅，或基于咖啡的產(chǎn)品。全文摘要本發(fā)明涉及具有改進(jìn)性能的新天冬酰胺酶，優(yōu)選具有改進(jìn)的耐熱性，如在高溫具有改進(jìn)的活性和/或改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及編碼這種改進(jìn)的天冬酰胺酶的DNA序列，所述酶在重組宿主細(xì)胞中的產(chǎn)生，以及使用天冬酰胺酶的方法，具體用于減少食品中的丙烯酰胺。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生和制備具有改進(jìn)性能的天冬酰胺酶變體的方法。文檔編號C12N9/82GK101641439SQ200880007804公開日2010年2月3日申請日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日發(fā)明者埃斯本·P·弗里斯,山岸明彥,松井知子申請人:諾維信公司