專利名稱：評(píng)價(jià)組織保存溶液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及評(píng)價(jià)組織保存溶液的方法。
背景技術(shù)：
目前，已開發(fā)了多種組織保存溶液并用于移植治療。為開發(fā)組織保存溶液，確定了 新的組織保存溶液成分和組成，分離自例如大鼠等動(dòng)物的組織(器官)浸入所述保存溶液 中，保存的組織被移植到動(dòng)物體內(nèi)或進(jìn)行生物化學(xué)評(píng)價(jià)以確定保存效果。因此，評(píng)價(jià)保存溶 液的保存效果需要相當(dāng)長的時(shí)間，其使得難以快速開發(fā)新的組織保存溶液，因此，需要開發(fā) 一種更快并且更方便地評(píng)價(jià)組織保存溶液的保存效果的方法。 同時(shí)，影像策略的最新進(jìn)展明確顯示了細(xì)胞和分子的實(shí)時(shí)生物事件，這使人們?nèi)?易理解活體動(dòng)物中表達(dá)的生物過程。分子標(biāo)記的發(fā)展，例如來源于水母(維多利亞水母 (Aequorea victoria))的綠色熒光蛋白(GFP)、來源于螢火蟲(北美螢火蟲(photi皿s pyralis))的螢光素酶等促進(jìn)了最近十年的變革，使得復(fù)雜生化過程與活細(xì)胞中的蛋白 作用相關(guān)起來(非專利文獻(xiàn)1、2)。特別的，發(fā)光成像提供了在活細(xì)胞中研究各種生物過 程的重要機(jī)會(huì)(非專利文獻(xiàn)2、3)。生物發(fā)光報(bào)道物在哺乳動(dòng)物組織中顯示了很高的信 噪比，基于此，在正常動(dòng)物中釋放的光信號(hào)可通過非侵入性測定方法量化。本發(fā)明人因此 開發(fā)了GFP轉(zhuǎn)基因大鼠、LacZ轉(zhuǎn)基因大鼠和螢光素酶轉(zhuǎn)基因大鼠，并且報(bào)道了使用來源 于這些大鼠的組織可容易地觀察到移植排斥(非專利文獻(xiàn)4、5)。非專利文獻(xiàn)6公開了 即使在來源于GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的細(xì)胞死亡后，GFP仍然能釋放強(qiáng)的熒光。非專利文獻(xiàn)1 : Science, vol. 300 (5616) ， p. 87， 2003非專利文獻(xiàn)2 :Nat. Med. ， vol. 4 (2)， p. 245， 1998非 專利文獻(xiàn)3 :An皿.Rev. Biomed. Eng. ， vol. 4， p. 235， 2002非專利文獻(xiàn)4 :Biochem. Biophys. Res. Commun. ， vol. 329(1) ， p. 288,2005非專禾U文獻(xiàn)5 -Transplantation, vol. 81， No. 8， p. 1179-1184， 2006非專利文獻(xiàn)6 :J. Biomed. Opt. ，vol. 10 (4) ， p. 41204， 2005發(fā)明內(nèi)容發(fā)明 所要解決的問題 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供快速和方便地評(píng)價(jià)組織保存溶液保存效果的方法。解決 問題的方法 本發(fā)明人為達(dá)到上述目的進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)組織保存溶液的保存效果可通 過以下方式實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)將引入發(fā)光或熒光標(biāo)記基因例如螢光素酶等的組織保存于組織保存 溶液中作為評(píng)價(jià)目標(biāo)，并且測定該保存的組織的發(fā)光或熒光水平，其導(dǎo)致了本發(fā)明的最終 完成。 因此，本發(fā)明涉及以下方面。[1] 一種評(píng)價(jià)組織保存溶液保存效果的方法，包括將 引入發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物的組織浸入所述組織保存溶液中，浸入后測量該組織 中標(biāo)記基因的發(fā)光或熒光水平，以及基于所述發(fā)光或熒光水平評(píng)價(jià)所述組織保存溶液的保 存效果。[2]根據(jù)[1]的方法，其中標(biāo)記基因是螢光素酶。[3]根據(jù)[1]的方法，其中所述 組織中的發(fā)光或熒光水平非破裂地測定。[4]根據(jù)[1]的方法，其中所述組織分離自引入 發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的非人哺乳動(dòng)物。[5]根據(jù)[4]的方法，其中標(biāo)記基因在所述哺乳動(dòng) 物中遍在地表達(dá)。[6]根據(jù)[4]的方法，其中目標(biāo)基因在所述哺乳動(dòng)物的目標(biāo)組織中特異 性表達(dá)。[7]根據(jù)[1]至[6]任一項(xiàng)的方法，其中所述組織保存溶液是細(xì)胞保存溶液。[8]
3根據(jù)[1]至[6]任一項(xiàng)的方法，其中所述組織保存溶液是器官保存溶液。[9]根據(jù)[1]的 方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織是器官的部分。[10] —種生產(chǎn)具有證實(shí)的保存效果的組織保 存溶液的方法，包括下列步驟(I)混合所需組織保存溶液的組成成分，產(chǎn)生所述組織保存 溶液；(II)分離部分(I)中獲得的組織保存溶液作為樣品；(III)將引入發(fā)光或熒光標(biāo)記 基因的哺乳動(dòng)物組織浸入(II)中分離的樣品中；(IV)浸入后測量該組織中標(biāo)記基因的發(fā) 光或熒光水平；(V)基于所述發(fā)光或熒光水平評(píng)價(jià)所述樣品的保存效果；和(VI)獲得作為 具有證實(shí)的保存效果的組織保存溶液的組織保存溶液，來源于所述組織保存溶液的樣品在 (V)中被證實(shí)具有所需的保存效果。本發(fā)明的效果 使用本發(fā)明的方法可非?？焖俸头奖愕脑u(píng)價(jià)組織保存溶液的保存效果。此外，使 用從遍在地引入發(fā)光/熒光標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分離的組織，可通過一次試驗(yàn)同時(shí)評(píng)價(jià) 多種組織的保存效果。這樣，使用本發(fā)明的方法，可顯著改善組織保存溶液的開發(fā)速度。附 圖簡述 圖l顯示了保存開始時(shí)(0小時(shí))各器官的發(fā)光(心臟、肺、腎、小腸、胰、脾、肝)。 左側(cè)生理鹽水，右側(cè)ET-Kyoto溶液。圖2顯示了保存開始后24小時(shí)的各器官中的發(fā)光。 左側(cè)生理鹽水，右側(cè)ET-Kyoto溶液。圖3顯示了保存開始后48小時(shí)的各器官中的發(fā)光。 左側(cè)生理鹽水，右側(cè)ET-Kyoto溶液。圖4顯示了保存開始后72小時(shí)的各器官中的發(fā)光。 左側(cè)生理鹽水，右側(cè)ET-Kyoto溶液。圖5顯示了小腸、心臟、胰和肺中發(fā)光水平時(shí)間_過 程變化。單位p/秒/cm7sr， :生理鹽水，■ :ET-Kyoto溶液。圖6顯示了脾、腎和肝中 發(fā)光水平時(shí)間_過程變化。單位p/秒/cm7sr， :生理鹽水，■ :ET-Kyoto溶液。圖7顯 示了各種組織保存溶液中浸入的肝切片發(fā)光水平時(shí)間_過程變化，其中保存開始時(shí)的發(fā)光 水平為100%。從左側(cè)開始條顯示1、3和6小時(shí)后的發(fā)光水平。UW :威斯康星大學(xué)溶液， EC :Euro-Collins溶液，ET-K :ET-Kyoto溶液，HTK :組氨酸-色氨酸酮戊二酸溶液，Perf : Perfadex溶液。實(shí)施本發(fā)明的最佳模式 本發(fā)明提供了評(píng)價(jià)組織保存溶液的保存效果的方法，包括將引入發(fā)光或熒光標(biāo)記
基因的哺乳動(dòng)物組織浸入所述組織保存溶液中，浸入后測量該組織中的標(biāo)記基因發(fā)光或熒
光水平，以及基于所述發(fā)光或熒光水平評(píng)價(jià)所述組織保存溶液的保存效果。 在本發(fā)明的方法中，使用弓|入發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物組織。 用于本發(fā)明方法中的發(fā)光或熒光標(biāo)記基因包括編碼具有發(fā)光或熒光的蛋白的基
因、編碼當(dāng)與相應(yīng)的發(fā)光或熒光底物混合時(shí)發(fā)射光或熒光的酶的基因。前者的例子包括編
碼熒光蛋白例如GFP、 RFP、 YFP、 CFP、 EGFP等的基因。后者的例子包括編碼酶例如螢光素
酶、P-半乳糖苷酶、過氧化物酶等的基因。螢光素酶的底物(發(fā)光的)例子包括螢光素
(以及必要時(shí)的ATP)等。13半乳糖苷酶底物(發(fā)光的)的例子包括螢光素半乳糖苷底物
(6-0-|3-吡喃半乳糖基螢光素)等。過氧化物酶底物的例子包括魯米那(以及必要時(shí)的過
氧化氫)等。從靈敏度等角度，所述標(biāo)記的基因優(yōu)選為發(fā)光標(biāo)記基因。作為發(fā)光標(biāo)記基因，
編碼上述酶的基因是優(yōu)選的，作為酶，特別優(yōu)選螢光素酶。GFP即使在細(xì)胞死亡后也能釋放
強(qiáng)的熒光(J. Biomed. Opt. ，vol. 10 (4) ， p. 41204， 2005)。然而，由于螢光素酶的活性良好的
反映了組織的存活性，使用螢光素酶基因作為標(biāo)記基因可在很高的靈敏度下評(píng)價(jià)組織保存
溶液的保存效果。 在器官保存中，起始階段器官(細(xì)胞)中ATP的消耗是引起組織中細(xì)胞死亡的原
4因之一。因此，組織的ATP濃度是影響組織存活的重要因素。螢光素酶以ATP依賴的方式 氧化螢光素，釋放光。組織中的螢光素酶可與螢光素反應(yīng)，釋放反映組織中殘余ATP水平的 光。這樣，使用螢光素酶作為標(biāo)記基因，組織保存溶液的保存效果的高靈敏評(píng)價(jià)同時(shí)可反映 組織中的殘余ATP水平。 哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括嚙齒類例如小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例如兔等，馴 養(yǎng)動(dòng)物例如豬、牛、山羊、馬、綿羊、水貂等，寵物例如狗、貓等，靈長類例如人、猴、獼猴、狨 猴、猩猩、黑猩猩等。 組織包括任何需要在保存溶液中保存的器官(例如腦、脊髓、胃、胰、腎、肝、甲狀 腺、骨髓、皮膚、肌肉、肺、胃腸道(例如大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾、外周血、睪丸、卵 巢、胎盤、子宮、骨、骨骼肌等)，部分(切片等)器官，細(xì)胞(例如肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、 胰P細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂 肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)、 軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、精子、卵子、受精卵以及祖細(xì)胞、干細(xì)胞或這些細(xì)胞 的癌細(xì)胞)。 使用部分(切片等)器官作為組織，將其浸入多孔板中的組織保存溶液中，可一次
評(píng)價(jià)多種組織保存溶液樣品。因此，在這種情況下，使用組織切片機(jī)等將部分器官制備成適
合于多孔板中的每一個(gè)孔的大小(例如直徑3-6mm，重10-50mg)。 在本說明書中，組織保存溶液包括細(xì)胞保存溶液和器官保存溶液。 發(fā)光或熒光標(biāo)記的基因可通過本身公知的遺傳工程技術(shù)引入哺乳動(dòng)物組織中。例
如，將分離自哺乳動(dòng)物的組織在體外用構(gòu)建體(表達(dá)載體)轉(zhuǎn)染，其中上述的標(biāo)記基因與目
標(biāo)組織中可操作的啟動(dòng)子下游連接，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)所述組織，由此可將標(biāo)記基因
引入該組織中。 轉(zhuǎn)染方法的實(shí)例包括生物方法、物理方法、化學(xué)方法等。生物方法的例子包 括使用病毒載體的方法、使用特定受體的方法、細(xì)胞融合方法(HVJ(日本血凝病毒 (Hemgglutinating Virus of Japan))、聚乙二醇(PEG)、電細(xì)胞融合法和核融合法(染色體 轉(zhuǎn)移)。此外，物理方法的例子包括顯微注射法、電穿孔法、以及使用基因槍(粒子槍)方 法?；瘜W(xué)方法的例子包括磷酸鈣沉淀法J旨轉(zhuǎn)染法JEAE-葡聚糖法、原生質(zhì)體法、紅細(xì)胞影 (red blood cell ghost)法、紅細(xì)胞膜影法和微膠囊方法。 表達(dá)載體的實(shí)例包括質(zhì)粒載體、PAC、 BAC、 YAC、病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等?？?從這些中選擇合適的載體。 啟動(dòng)子的類型并沒有特別的限制，只要其能夠誘導(dǎo)或促進(jìn)標(biāo)記基因在引入其的組 織中表達(dá)即可。啟動(dòng)子的例子包括SRa啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、 R0SA26等。 上述的表達(dá)載體優(yōu)選含有終止目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄的序列(多聚A、通常稱為終止子)。
此外，為獲得標(biāo)記基因的更高表達(dá)，真核基因的剪接信號(hào)、增強(qiáng)子區(qū)域和部分內(nèi)含子還可以
與啟動(dòng)子區(qū)域的5'上游端、啟動(dòng)子區(qū)域和翻譯區(qū)域之間、或翻譯區(qū)域的3'下游端連接。
此外，上述表達(dá)載體還可包括選擇性標(biāo)記基因，用于選擇穩(wěn)定包含所引入標(biāo)記基因的克隆
(例如，藥物抗性基因如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、氨芐西林抗性基因等)。 此外，可使用從引入了發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物中分離的組織。所述哺乳動(dòng)物可通過本身公知的遺傳工程技術(shù)產(chǎn)生。例如，通過基因轉(zhuǎn)移方法例如磷酸鈣共沉淀法、
電穿孔法、脂轉(zhuǎn)染法、凝集法、顯微注射法、基因槍(粒子槍)法、DEAE-葡聚糖法等，將發(fā)光
或熒光標(biāo)記基因引入哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞如受精卵、未受精卵、精子和其祖細(xì)胞等中，獲得
來源于該生殖細(xì)胞的子代動(dòng)物，由此產(chǎn)生引入發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物。 對(duì)于轉(zhuǎn)基因至生殖細(xì)胞中，使用構(gòu)建體(表達(dá)載體)通常是有利的，其中目標(biāo)標(biāo)記
基因與目標(biāo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子下游連接。 特別的，將表達(dá)載體通過顯微注射的方法注入目標(biāo)哺乳動(dòng)物的受精卵等內(nèi)，其中 所述表達(dá)載體中，含有標(biāo)記基因的多核苷酸與目標(biāo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可操作的啟動(dòng)子下游連 接，將所述受精卵移植到假孕動(dòng)物的子宮內(nèi)，可產(chǎn)生能高表達(dá)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。
表達(dá)載體的實(shí)例包括質(zhì)粒載體、PAC、 BAC、 YAC、病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等?？?從這些中選擇合適的載體。 啟動(dòng)子的類型并沒有特別的限制，只要標(biāo)記基因在引入其的哺乳動(dòng)物中的表達(dá)能 夠被誘導(dǎo)或促進(jìn)即可。使用組織非特異性的啟動(dòng)子，可產(chǎn)生遍在地表達(dá)發(fā)光或熒光標(biāo)記基 因的哺乳動(dòng)物。使用分離自該哺乳動(dòng)物的組織，可在一次試驗(yàn)中同時(shí)評(píng)價(jià)多種組織的保存 效果。所述組織非特異性啟動(dòng)子的例子包括SRa啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、SV40啟 動(dòng)子、ROSA26、13肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等。此外，使用組織特異性的啟動(dòng)子可產(chǎn)生在目標(biāo)組織中 特異性表達(dá)發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物。例如，可使用a l-AT啟動(dòng)子在肝中特異性表 達(dá)標(biāo)記基因，使用a肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子在骨骼肌中、使用烯醇化酶啟動(dòng)子在神經(jīng)元中特異性 表達(dá)標(biāo)記基因。 上述表達(dá)載體優(yōu)選含有終止目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄的序列(多聚A、通常稱為終止子)。此
外，為獲得標(biāo)記基因的更高表達(dá)，真核基因的剪接信號(hào)、增強(qiáng)子區(qū)域和部分內(nèi)含子還可與啟 動(dòng)子區(qū)域的5'上游端、啟動(dòng)子區(qū)域和翻譯區(qū)域之間、或翻譯區(qū)域的3'下游端連接。此外，上
述表達(dá)載體還可包括選擇性標(biāo)記基因，用于選擇穩(wěn)定包含所引入標(biāo)記基因的克隆(例如， 藥物抗性基因如新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、氨芐西林抗性基因等)。
哺乳動(dòng)物組織可通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法浸入評(píng)價(jià)目標(biāo)組織保存溶液中。所述 方法的實(shí)例包括包括直接將分離自動(dòng)物的組織浸入組織保存溶液中的方法，包括用生理水 溶液例如林格溶液、生理鹽水等洗去組織中的血液并將所述組織浸入組織保存溶液中的方 法，包括用組織保存溶液灌注組織并將所述組織浸入組織保存溶液的方法等等。盡管保存 期和保存溫度可根據(jù)對(duì)象和組織保存溶液的種類適當(dāng)設(shè)定，保存期通常為約1-30天，保存 溫度為約l-l(TC (優(yōu)選約1_6°C )。 在通過浸入評(píng)價(jià)目標(biāo)組織保存溶液保存哺乳動(dòng)物組織一定時(shí)期后，測定組織中發(fā) 光或熒光標(biāo)記基因的發(fā)光或熒光水平。發(fā)光或熒光水平可通過浸入后勻漿組織、測定勻漿 物中的發(fā)光或熒光水平進(jìn)行測定，或者可非破壞性的測定所述組織中的發(fā)光或熒光水平。 由于操作方便、測量后所述組織可連續(xù)用于進(jìn)一步的評(píng)價(jià)試驗(yàn)，優(yōu)選不通過勻漿組織測定 發(fā)光或熒光水平。發(fā)光或熒光水平可使用本身已知的設(shè)備測量，例如光度計(jì)、熒光分光光度 計(jì)等。當(dāng)非破壞性的測定發(fā)光或熒光水平時(shí)，可使用能檢測發(fā)光或熒光的成像系統(tǒng)等等。
當(dāng)使用編碼具有發(fā)光或熒光的蛋白的基因作為標(biāo)記基因時(shí)，浸入后可直接測定組 織中所述蛋白的發(fā)光或熒光。另一方面，當(dāng)使用編碼與相應(yīng)的發(fā)光或熒光底物混合時(shí)產(chǎn)生 發(fā)光或熒光的酶(例如螢光素酶)的基因作為標(biāo)記基因時(shí)，浸入后的組織(或其勻漿物)
6與相應(yīng)的底物(例如螢光素)接觸，由此測定發(fā)光或熒光。 例如，當(dāng)使用上述的酶作為標(biāo)記基因非破壞性的測定發(fā)光或熒光水平時(shí)，將浸入 后的組織浸泡于含有相應(yīng)底物的水溶液中(底物溶液)。作為水溶液可使用生理溶液例如 組織保存溶液、林格溶液、生理鹽水等等。當(dāng)使用組織保存溶液時(shí)，在發(fā)光和熒光水平測定 后，組織可連續(xù)用于進(jìn)一步的評(píng)價(jià)試驗(yàn)。 底物溶液的底物濃度在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常使用的濃度范圍內(nèi)適當(dāng)設(shè)定。例 如，當(dāng)使用螢光素作為底物時(shí)，底物濃度通常為約10-1000 ii g/ml (例如150 ii g/ml)。
同樣，適當(dāng)?shù)脑O(shè)定從組織浸入底物溶液到實(shí)際測定發(fā)光或熒光的時(shí)間。當(dāng)這段時(shí) 間太短時(shí)，發(fā)光或熒光水平不夠充分，靈敏度變得低。另一方面，當(dāng)這段時(shí)間太長時(shí)，底物降 解，同樣導(dǎo)致了低的靈敏度。此外，當(dāng)這段時(shí)間太長時(shí)，組織溫度升高，發(fā)光或熒光水平測定 后的組織有時(shí)難以用于進(jìn)一步的評(píng)價(jià)試驗(yàn)。從這方面來說，優(yōu)選在將組織浸入底物溶液后 約3-30分鐘內(nèi)測定發(fā)光或熒光水平(例如5分鐘)。 底物溶液的溫度可在允許酶反應(yīng)的范圍內(nèi)適當(dāng)設(shè)定。當(dāng)?shù)孜锶芤旱臏囟忍蜁r(shí)，
酶反應(yīng)不進(jìn)行；當(dāng)溫度太高時(shí)，酶滅活。從這些方面來說，底物溶液的濃度通常為1-40°C。
當(dāng)發(fā)光或熒光水平測定后的組織連續(xù)用于進(jìn)一步評(píng)價(jià)試驗(yàn)時(shí)，所述熒光或發(fā)光水平優(yōu)選在
相對(duì)低的溫度下測量(例如約l-l(TC，優(yōu)選1_6°C )，以維持良好的組織保存狀態(tài)。因此在
這種情況下應(yīng)選擇能在所述低溫條件下產(chǎn)生足夠發(fā)光或熒光的基因作為標(biāo)記基因。螢光素
酶和螢光素甚至在上述提到的低溫條件下也能反應(yīng)并產(chǎn)生足夠的發(fā)光。 隨后，基于發(fā)光或熒光水平評(píng)價(jià)組織保存溶液的保存效果。例如測定浸入前組織
中發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的發(fā)光或熒光水平，比較浸入后的發(fā)光或熒光水平與浸入前的水
平，計(jì)算浸入前后發(fā)光或熒光水平的下降量。發(fā)光或熒光水平下降的量越少，所述組織保存
溶液的保存效果越高。 或者，當(dāng)未使用組織保存溶液時(shí)測定發(fā)光或熒光水平的下降量(例如，使用幾乎 不具有組織保存效果的生理水溶液，例如生理鹽水等)(陰性對(duì)照)。隨后，將該陰性對(duì)照 與評(píng)價(jià)目標(biāo)組織保存溶液的發(fā)光或熒光水平下降量進(jìn)行比較，當(dāng)所述下降量小于陰性對(duì)照 時(shí)，評(píng)價(jià)目標(biāo)組織保存溶液被認(rèn)為具有組織保存效果。 在上述提到的判斷中，優(yōu)選同時(shí)測量已知具有保存效果的組織保存溶液(陽性對(duì) 照)的上述的發(fā)光或熒光水平下降量(例如，ET-Kyoto溶液、UW溶液等)。使用該陽性對(duì) 照，可保證本發(fā)明評(píng)價(jià)方法良好的運(yùn)行，評(píng)價(jià)目標(biāo)組織保存溶液的組織保存效果水平可基 于與陽性對(duì)照的比較進(jìn)行評(píng)價(jià)。 使用本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法，可方便的開發(fā)具有新組成的組織保存溶液。此外，本發(fā)明 的評(píng)價(jià)方法可用于工廠中組織保存溶液大規(guī)模生產(chǎn)中的組織保存溶液質(zhì)量控制。
此外，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有證實(shí)的保存效果的組織保存溶液的方法，包括下列 步驟(I)混合所需組織保存溶液的組成成分，產(chǎn)生所述組織保存溶液；(II)分離部分(I) 中獲得的組織保存溶液作為樣品；(III)將引入發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物組織浸入 (II)中分離的樣品中；(IV)浸入后測定該組織中標(biāo)記基因的發(fā)光或熒光水平；(V)基于所 述發(fā)光或熒光水平評(píng)價(jià)所述樣品的保存效果；和(VI)獲得作為具有證實(shí)的保存效果的組 織保存溶液的組織保存溶液，來源于所述組織保存溶液的樣品在(V)中證實(shí)具有所需的保 存效果。
在(I)中，所述組織保存溶液的組成成分包括但不限于水、緩沖劑(磷酸鹽、醋酸 鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、HEPES等)、等滲劑(山梨醇、葡萄糖、甘露醇、海藻糖、甘油、聚乙二 醇、氯化鈉、氯化鉀等)，不可滲透試劑(乳糖醛酸鈉、棉子糖)、膠體滲透劑(羥基乙基淀 粉、葡聚糖等)、活性氧消除試劑(維生素C、黃酮類、多酚、谷胱甘肽等)、抗生素等等。例 如，混合水、緩沖劑和等滲劑以獲得組織保存溶液。 當(dāng)產(chǎn)生組成已知的組織保存溶液(ET-Kyoto溶液、UW溶液、EURO-collins溶液、組
氨酸_色氨酸酮戊二酸溶液、Perfadex溶液等)時(shí)，混合基于預(yù)定組成的組成成分。當(dāng)開
發(fā)具有新的組成的組織保存溶液時(shí)，以所需要混合比例混合組成成分。 在(II)中，從(I)中獲得的組織保存溶液中分離用于評(píng)價(jià)的足夠的量作為樣品。 步驟(III)-(V)根據(jù)上述本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行，這里當(dāng)生產(chǎn)具有已知組成的組
織保存溶液時(shí)，優(yōu)選使用已證實(shí)具有某種水平的組織保存效果的批次中具有同樣組成的組
織保存溶液作為陽性對(duì)照。 隨后，可獲得作為具有證實(shí)的保存效果的組織保存溶液的組織保存溶液，來源于 所述組織保存溶液的樣品在(V)中證實(shí)具有某種水平的組織保存效果。
使用本發(fā)明的生產(chǎn)方法，可穩(wěn)定生產(chǎn)具有證實(shí)的保存效果的組織保存溶液。
本發(fā)明通過參考下述實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明，其不認(rèn)為限制本發(fā)明。實(shí)施例
實(shí)施例1試驗(yàn)方法將適量的螢光素溶于試驗(yàn)溶液中(組織保存溶液或生理鹽 水)以獲得發(fā)光溶液。所述發(fā)光溶液的螢光素濃度為150iig/ml。使用ET-Kyoto溶液 作為組織保存溶液。從引入螢光素酶基因的Lewis大鼠(Luc-LEW) (Transplantation, vol. 81， No. 8， p. 1179-1184,2006)中分離器官(心臟、肺、腎、腸、胰、脾、肝)，除去所述器 官中的血液，將所述器官于4°C下浸入發(fā)光溶液中。Luc-LEW大鼠遍在地表達(dá)螢光素酶基 因(Transplantation, vol. 81， No. 8， 2006)。器官浸入后5分鐘，使用實(shí)時(shí)體內(nèi)成像系統(tǒng) (IVIS成像系統(tǒng)，Xenogen)測定器官的發(fā)光量。在發(fā)光量測定過程中，發(fā)光溶液的溫度維持 在fC。測定發(fā)光量后，將器官按原型保存在冰箱中(4°C)。 24、48和72小時(shí)后，用新鮮溶 液交換發(fā)光溶液，交換后5分鐘使用IVIS以上述同樣的方法測定器官發(fā)光量。數(shù)字化發(fā)光 量(單位p/秒/cm7sr)，比較試驗(yàn)溶液的器官保存效果。 結(jié)果

圖1-4顯示了保存開始后0-72小時(shí)器官的發(fā)光圖像，圖5和6顯示了各器官 中發(fā)光量的時(shí)間_過程變化。在保存開始的時(shí)候，用作試驗(yàn)溶液的ET-Kyoto溶液的發(fā)光量 與生理鹽水基本相同。然而，當(dāng)每個(gè)器官在生理鹽水中保存72小時(shí)后，幾乎觀察不到器官 的螢光素酶發(fā)光。然而，當(dāng)該器官保存在ET-Kyoto溶液中時(shí)，仍然可以觀察到明顯的螢光 素酶活性(圖4-6)。根據(jù)上面的結(jié)果，證實(shí)了組織保存溶液的保存效果可使用來自器官的 螢光素酶發(fā)光作為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 實(shí)施例2從引入螢光素酶基因的Lewis大鼠(Luc-LEW) (Transplantation, vol. 81， No. 8， p. 1179-1184,2006)中分離肝臟。除去肝臟中血液，通過冰冷卻(4°C )保護(hù) 肝臟。于4t:的低溫下在室內(nèi)立即進(jìn)行下述操作。使用組織切片機(jī)將分離的肝臟切成直徑 3mm，每個(gè)肝臟切片以約14mg的一致切片制備。在96孔板的每個(gè)孔中注入試驗(yàn)溶液(組織 保存溶液或生理鹽水)(220iU)，將要檢測的肝臟切片浸入試驗(yàn)溶液中。使用威斯康星大 學(xué)溶液、ET-Kyoto溶液、EUR0-collins溶液、組氨酸_色氨酸酮戊二酸溶液或Perfadex溶 液作為組織保存溶液。用注射器加入螢光素溶液(20iU)，這樣試驗(yàn)溶液中螢光素的最終濃度為190ii g/ml，使用平板讀數(shù)器(Mithras LB 940，Berthold)測定肝臟切片的發(fā)光量。 測定發(fā)光量后，用新鮮溶液交換試驗(yàn)溶液，在4t:下保存所述混合物直到下一次測量。通過 上述的方法，測定保存開始時(shí)(0小時(shí))和保存開始后1、3和6小時(shí)的發(fā)光量，比較試驗(yàn)溶 液的器官保存效果。 結(jié)果如圖7所示。當(dāng)肝臟切片在生理鹽水中保存時(shí)，螢光素的發(fā)光量迅速下降。然 而，當(dāng)使用組織保存溶液時(shí)，發(fā)光量僅輕微下降。根據(jù)上面的結(jié)果，證實(shí)了即使使用組織切 片時(shí)，也可使用來自器官的螢光素酶發(fā)光作為指標(biāo)評(píng)價(jià)組織保存溶液的保存效果。工業(yè)實(shí) 用性 使用本發(fā)明的方法，組織保存溶液的保存效果可通過比常規(guī)方法更方便的方法評(píng) 價(jià)。本申請(qǐng)基于日本申請(qǐng)2007-064171 (申請(qǐng)日2007年3月13日)，其內(nèi)容通過援引引入 本文。
權(quán)利要求
一種評(píng)價(jià)組織保存溶液保存效果的方法，包括將引入發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物組織浸入所述組織保存溶液中，浸入后測定該組織中標(biāo)記基因的發(fā)光或熒光水平，以及基于所述發(fā)光或熒光水平評(píng)價(jià)所述組織保存溶液的保存效果。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中標(biāo)記基因是螢光素酶。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中所述組織中的發(fā)光或熒光水平非破裂地測定。
4. 權(quán)利要求l的方法，其中所述組織分離自引入發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的非人哺乳動(dòng)物。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中標(biāo)記基因在所述哺乳動(dòng)物中遍在地表達(dá)。
6. 權(quán)利要求4的方法，其中目標(biāo)基因在所述哺乳動(dòng)物的目標(biāo)組織中特異性表達(dá)。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述組織保存溶液是細(xì)胞保存溶液。
8. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述組織保存溶液是器官保存溶液。
9. 權(quán)利要求l的方法，其中所述哺乳動(dòng)物組織是器官的部分。
10. —種生產(chǎn)具有證實(shí)的保存效果的組織保存溶液的方法，包括下列步驟(I) 混合所需組織保存溶液的組成成分，產(chǎn)生所述組織保存溶液；(II) 分離部分(I)中獲得的組織保存溶液作為樣品；(III) 將引入發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物組織浸入(II)中分離的樣品中；(IV) 浸入后測定該組織中標(biāo)記基因的發(fā)光或熒光水平；(V) 基于所述發(fā)光或熒光水平評(píng)價(jià)所述樣品的保存效果；禾口(VI) 獲得作為具有證實(shí)的保存效果的組織保存溶液的組織保存溶液，來源于所述組織 保存溶液的樣品在(V)中證實(shí)具有所需的保存效果。
全文摘要
本發(fā)明提供了評(píng)價(jià)組織保存溶液保存效果的方法，包括將引入發(fā)光或熒光標(biāo)記基因的哺乳動(dòng)物組織浸入所述組織保存溶液中，浸入后測定該組織中標(biāo)記基因的發(fā)光或熒光水平，以及基于所述發(fā)光或熒光水平評(píng)價(jià)所述組織保存溶液的保存效果。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101778948SQ20088000792
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2008年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月13日
發(fā)明者小林英司 申請(qǐng)人:株式會(huì)社大塚制藥工場;學(xué)校法人自治醫(yī)科大學(xué)