專利名稱：：聚酵素芽孢桿菌kjs-2產(chǎn)生的抗菌大環(huán)內(nèi)酯菌素a的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種由聚酵素芽孢桿菌(5ac/〃w;w/^y/enwe"Wc^)KJS-2(KCCM10了69P)產(chǎn)生的抗生素一一大環(huán)內(nèi)酯菌素A(MacrolactinA)及其應用；特別涉及具有針對有害細菌例如耐萬古霉素腸球菌(VRE)和耐曱氧西林金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococcas^wrew)(MRSA)的抗菌活性的大環(huán)內(nèi)酯菌素A及其應用。
背景技術(shù)：
：耐萬古霉素腸球菌(VRE)的增加對于人類而言是不幸的，帶來了許多問題，例如非常高的新抗生素開發(fā)費用。有報道稱在1989年醫(yī)院中VRE感染率僅為0.3%,-f旦該感染率在1993年增加到了7.9%。由多重耐藥性VRE所引起的菌血癥死亡率高達約70%,與此同時人們擔憂VRE抗性基因轉(zhuǎn)化其他革蘭氏陽性球菌的能力，其可增加耐萬古霉素MRSA的可能性。近來，已有報道居家已開始使用抗生素替考拉寧(teycoplanin)來抵抗耐藥菌，同時出現(xiàn)了耐替考拉寧細菌。因此，本發(fā)明人已分離出一抹產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯菌素A的新菌林——聚酵素芽孢桿菌KJS-2，該大環(huán)內(nèi)酯菌素A具有針對耐萬古霉素VRE和耐曱氧西林MRSA，以及大腸桿菌C&c/^n'c/z/aco//)、枯草芽孑包桿菌(5ac/〃/51w6"嗣168、膝黃微球菌(M/crococcws/她us)、創(chuàng)傷孑瓜菌(Ff6n'ovw/myc^)和副乳房鏈3求菌(5^eptocMccws/oraMZ)eW50的抗菌活性，并且該新菌抹已保藏(菌抹保藏編號KCCM10769P)。純化了活性成分并測定了其結(jié)構(gòu)，證實其為大環(huán)內(nèi)酯菌素A,并驗證具有相同的效果。在下文中，將給出關于大環(huán)內(nèi)酯菌素A和產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯菌素A的菌林的本研究的概要。WilliamFenical首先于1989年從存在于深海的海洋細菌中純化出大環(huán)內(nèi)酯菌素A。據(jù)報道大環(huán)內(nèi)酯菌素A具有選擇性抗菌活性并顯示出針對B16-F10鼠黑素瘤癌細胞的細胞毒性，還具有針對單純皰滲和HIV的抗病毒活性。在1997年，ICK-DONGYOO從馬杜拉放線菌04c""oma^/wra平)中純化出大環(huán)內(nèi)酯菌素A,該純化的大環(huán)內(nèi)酯菌素A被用于研究通過谷氨酸鹽觸發(fā)的神經(jīng)元保護。在2001年，HiroshiSano從芽孢桿菌(5ac/〃肌乎)PP19-H3中純化出大環(huán)內(nèi)酯菌素A，并研究了其針對金黃色葡萄球菌IFO12732和枯草芽孢桿菌IFO3134的抗菌活性。在2003年，Sung-WonChoi從鏈霉菌OS&印to附;;ce;y5/.)YB-401中純化出大環(huán)內(nèi)酯菌素A,并顯示具有對膽固醇生物合成的抑制效果。在2004年，Keun-HyungPark從解淀粉芽孢桿菌(5ac/〃wam_y/o//^e/ac/era)CHO104中純化出大環(huán)內(nèi)酯菌素A，并研究了其針對金黃色葡萄球菌KCTC1928、大腸桿菌KCTC2593和灰葡萄孢菌CSo^y^c/"ea)的抗菌活性。在2005年，Joo-WonSuh從芽孢桿菌sunhua(5ac/〃wssp.ww/ma)中純化出大環(huán)內(nèi)酉旨菌素A，并將純化的大環(huán)內(nèi)酯菌素A用于研究對疾痂病鏈霉菌O^reptomycMscaZ/e力的抑制作用。在2006年，GabriellaMolinari從枯草芽孢桿菌DSM16696中純化出大環(huán)內(nèi)酯菌素A和丙二?；?大環(huán)內(nèi)酯菌素A(MMA),分別測試了它們針對耐萬古霉素腸球菌(VRE)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和洋蔥伯克氏菌(5wr狄oWer/flc印ac/a)的抗菌活性。在該研究中，丙二?；?大環(huán)內(nèi)酯菌素A(MMA)顯示出針對所有用于該試驗的細菌的優(yōu)異的抗菌活性，與此同時大環(huán)內(nèi)酯菌素A僅顯示具有針對MRSA的抗菌活性。這些結(jié)果是非常有意義的，然而由各種菌抹所純化出的大環(huán)內(nèi)酯菌素A的最大量小于1mg/1,以及丙二?；?大環(huán)內(nèi)酯菌素A(MMA)的最大量小于1.2mg/1,這已經(jīng)妨礙了它們的工業(yè)應用。此外，尚未有針對大環(huán)內(nèi)酯菌素A的光學異構(gòu)體的研究，并且其低產(chǎn)率也使得它們難以得到鑒定。將來必定需要該方面的研究，并且作為本發(fā)明結(jié)果獲得的大環(huán)內(nèi)酯菌素也未被作為光學異構(gòu)體得到充分研究。理論上，結(jié)構(gòu)中的4個手性中心有可能存在16種光學異構(gòu)體。由于是大多數(shù)藥物所具有的情況，因此帶有光學上不同結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酯菌素應當在特性上顯示不同的效果，即使它們的結(jié)構(gòu)式是相同的。這意味著不同菌抹所產(chǎn)生的物質(zhì)可能具有取決于它們的光學結(jié)構(gòu)的不同效果。這是科學上所證實的事實——即使具有相同結(jié)構(gòu)式的物質(zhì)也具有取決于它們的光學結(jié)構(gòu)的不同的性質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是產(chǎn)生具有針對VRE和MRSA以及大腸桿菌、枯草芽孢桿菌168、藤黃微球菌、創(chuàng)傷弧菌和副乳房鏈球菌的抗菌活性的大環(huán)內(nèi)酯菌素A,以及通過測試其效果將本發(fā)明的物質(zhì)開發(fā)成抗生素。本發(fā)明物質(zhì)是具有帶有多個雙鍵和羥基(-OH)的環(huán)結(jié)構(gòu)、分子量402.24的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。該24元環(huán)結(jié)構(gòu)具有碳和氧，并且該物質(zhì)的分子式為C24H3405。公開本發(fā)明以達到利用一種新分離的菌抹——聚酵素芽孢桿菌KJS-2菌抹(保藏編號KCCM10769P)提供一種特異性控制VRE和MRSA手段的目的。為實現(xiàn)上述目的之一，本發(fā)明有利地利用了菌抹聚酵素芽孢桿菌KJS-2(保藏編號KCCM10769P),提供了具有優(yōu)異的針對VRE和MRSA的抗菌活性的大環(huán)內(nèi)酯菌素A。為實現(xiàn)另一目的，本發(fā)明提供了聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素A,其具有優(yōu)異的針對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌168、藤黃凝:球菌、創(chuàng)傷弧菌和副乳房鏈球菌的抗菌活性；以及該菌林產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素衍生物。由本發(fā)明提供的新菌抹——聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素A顯示了針對多種微生物和真菌的廣語抗菌活性。引人注目地，抑制超過90%的11種VRE菌林和13種MRSA菌抹生長所需的平均最小抑制濃度(MIO90)分別為約31.25pg/ml和約19.83)ig/ml,與目前感染多重耐藥性菌患者所使用的替考拉寧相比，其活性高至45.3倍；因此表明其具有開發(fā)成抗生素的足夠價值。因此，本發(fā)明的聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素A和該大環(huán)內(nèi)酯菌素A的衍生物可產(chǎn)生極好的物質(zhì)用于控制微生物和細菌，由此對于醫(yī)藥工業(yè)是非常有用的。圖1是在發(fā)酵期間于不同的時間點由UV檢測儀(OD6oonm)測量出的用于本發(fā)明的菌抹聚酵素芽孢桿菌KJS-2培養(yǎng)基中的細胞數(shù)目。圖2是在發(fā)酵過程中的不同時間點由HPLC采集并分析的用于本發(fā)明的菌林聚酵素芽孢桿菌KJS-2培養(yǎng)基的色譜圖。圖3是用于本發(fā)明的菌林聚酵素芽孢桿菌KJS-2培養(yǎng)基的LC/Mass分析數(shù)據(jù)，該培養(yǎng)基是在發(fā)酵2.5天后釆集的。萃取該培養(yǎng)基并通過LC/Mass進行分析。圖4是用于本發(fā)明的菌抹聚酵素芽孢桿菌KJS-2培養(yǎng)基的生物測定，該培養(yǎng)基是在發(fā)酵2.5天后采集的。萃取該培養(yǎng)基并進行HPLC分餾，并對每個峰的餾分進行生物測定。圖5是測定由圖4中所示優(yōu)異抗菌活性的第一餾分純化得到的物質(zhì)的純度和分子量的LC/Mass數(shù)據(jù)。圖6是圖4中聚酵素芽孢桿菌KJS-2培養(yǎng)基的第一餾分的制備性LC分析，該第一餾分來自發(fā)酵所產(chǎn)生的物質(zhì)。圖7是用于確定由圖6制備性LC的第一餾分純化得到物質(zhì)的純度和分子量的LC/Mass數(shù)據(jù)。圖8是通過BruckerNMR在500MHz分析得到的圖7的純化的物質(zhì)的iH-NMR波譜。圖9是通過BruckerNMR在500MHz分析得到的圖7的純化的物質(zhì)的13C-NMR波譜。圖10是通過BruckerNMR在500MHz分析得到的圖7的純化的物質(zhì)的DEPT-90NMR波譜。圖11是通過BruckerNMR在500MHz分析得到的圖7的純化的物質(zhì)的DEPT-135NMR波鐠。圖12是通過BruckerNMR在500MHz分析得到的圖7的純化的物質(zhì)的HOMO-COZYNMR波譜。圖13是通過BruckerNMR在500MHz分析得到的圖7的純化的物質(zhì)的HMQCNMR波譜。圖14是通過BruckerNMR在500MHz分析得到的圖7的純化的物質(zhì)的HMBCNMR波譜。圖15是圖7的純化的物質(zhì)的HR-Mass分析。圖16是大環(huán)內(nèi)酯菌素A的結(jié)構(gòu)式。圖17是本發(fā)明中使用的菌抹聚酵素芽孢桿菌KJS-2的培養(yǎng)基的分析數(shù)據(jù)，該菌抹是在發(fā)酵2.5天后采集的。萃取該培養(yǎng)基并通過LC/Mass分析所萃取的溶液。圖18是在本發(fā)明中使用的菌林聚酵素芽孢桿菌KJS-2的培養(yǎng)基的分析數(shù)據(jù)，該培養(yǎng)基是在發(fā)酵4.2天后采集的。萃取該培養(yǎng)基并通過LC/Mass分析所萃取的溶液。圖19是間接測定大環(huán)內(nèi)酯菌素A在50%丙酮溶劑和曱醇溶劑中的溶解度的HPLC分析。(A)是已稀釋10倍的在1ml的50%丙酮中的1mg大環(huán)內(nèi)酯菌素A的1pi等分試樣的HPLC色譜圖。(B)是已稀釋IO倍的在1ml的曱醇中的1mg大環(huán)內(nèi)酯菌素A的1pl等分試樣的HPLC色譜圖。圖20是測試純化后的大環(huán)內(nèi)酯菌素A針對釀酒酵母(Sacc/^ramycescerev/57'a)、創(chuàng)傷弧菌、藤黃樣i3求菌和副乳房者連5求菌的抗菌活性結(jié)果。圖21是在濃度梯度下測試的純化的大環(huán)內(nèi)酯菌素A針對VRE5菌林的抗菌活性結(jié)果。具體實施例方式在針對日本Terakado博士的研究組于1933年分離出的聚酵素芽孑包斥干菌(5flc〃/w51/o(y/ermew〃CMS".s;)的4元菌活'〖生i式馬全過禾呈中，分離得到一株在形態(tài)學上具有不同于其他芽孢桿菌菌抹的菌抹。顯微鏡觀察顯示該菌林具有芽孢桿菌的特性并產(chǎn)生孢子，并基于16srRNA的DNA序列同源性的系語圖分析證實了其是一種屬于芽孢桿菌屬的新菌抹。該芽孢桿菌菌抹被命名為聚酵素芽孢桿菌KJS-2，其在2006年8月16日保藏于KCCM(韓國微生物保藏中心)，并給出保藏編號KCCM10769P。為純化聚酵素芽孢桿菌KJS-2菌株所產(chǎn)生的具有抗菌活性的物質(zhì)，在3L的TSB培養(yǎng)基(TSB瓊脂胰蛋白胨17g,大豆胨3g，葡萄糖2.5g,NaCl:5g,磷酸氫二鉀2.5g,pH6.87.2)中培養(yǎng)聚酵素芽孢桿菌KJS-2菌抹，然后接種于相同的培養(yǎng)基中并發(fā)酵2.5天(30。C，200rpm,1vvm,pH6.8)。對培養(yǎng)基進行乙酸乙酯溶劑萃取，繼之以LC/MS分析。通過LC/Mass分析找出具有優(yōu)異抗菌活性的餾分，并同樣測試抗菌效果，最后使用制備硅膠RP-18進行純化。同樣，進行第一NMR和第二NMR(^H-NMR、13C-NMR、90-DEPT,135-DEPT、HMQC、HMBC)以及HRMS/FAB以分析最終純化的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，結(jié)果證實本發(fā)明的聚酵素芽孢桿菌KJS-2菌抹所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)是大環(huán)內(nèi)酯菌素A。用實驗方法測定了抑制超過90。/()(MICw())的臨床上分離的11種VRE菌林和13種MRSA菌抹的生長所需的聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素A的最小抑制濃度分別為約31.25pg/ml和約19.83pg/ml,與目前用于治療多重耐藥性菌的替考拉寧相比，其活性高至45.3倍。此外，大環(huán)內(nèi)酯菌素A顯示抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌168、創(chuàng)傷弧菌和副乳房鏈球菌的優(yōu)異的抗菌活性。聚酵素芽孢桿菌KJS-2菌抹所產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素A同樣顯示優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，并且在弱酸性和中性環(huán)境中非常穩(wěn)定。除聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的抗生素大環(huán)內(nèi)酯菌素A之外，該物質(zhì)的衍生物也顯示廣語抗菌活性。以下試—驗實施例和實施例更詳細地描述了本發(fā)明的內(nèi)容，<旦是本發(fā)明權(quán)利要求的范圍不受限于如下實施例。實施例1:聚酵素芽孢桿菌KJS-2的分離和鑒定以及抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生聚酵素芽孢桿菌KJS-2菌抹的抗菌活性菌抹抑制作用藤黃孩i球菌+++枯草芽孢桿菌++米曲霉C^5/eZ-g7'〃W51+++++:非常強的抑制++:強抑制+:抑制在上表1中自身顯示優(yōu)異抗菌活性的本發(fā)明的菌林被命名為聚酵素芽孢桿菌KJS-2,并在2006年8月16日保藏于KCCM(韓國微生物保藏中心)，并給出保藏編號KCCM10769P。[步驟2:用于分析的設備和條件]下述設備和條件用于分析本發(fā)明菌抹所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)。為了HPLC分析，使用agilent1100系列和ShimadzuHPLC以及ZorbaxSB-C18柱(柱尺寸4.6*250mm,粒度5pm)。使用包括加入乙腈中的0.1%甲酸和水的溶劑。兩種條件用于HPLC分析(1)0%~100%梯度濃度的乙腈，持續(xù)20分鐘，(2)40%等度濃度的乙腈。使用Agilent1100系列時用于HPLC的流速為1ml/min,和使用ShimadzuHPLC時流速為1.5ml/min。在228、262、280、300和350nm波長下的UV檢測儀用于HPLC分析。Agilent1100MSD用于LC/Mass分析，用于LC/Mass分析的條件與HPLC相同，并且用于LC/Mass分析的條件為如下在AP-ESI模式中，干燥氣體的流速為131/min,蒸氣壓為50psi,干燥氣體的溫度為350°C，毛細管電壓為4000V(在陽離子模式下)和3500V(在陰離子模式下)，質(zhì)量范圍為100~1000m/z,石卒片電壓為150V,以及流速為1ml/min。Agilent制備LC與制備柱Gemini-C18(柱尺寸10mm*250mm,粒度10pm)—起用于制備LC。乙腈和水用作溶劑，流速為5ml/min。在228、262、280、300和350nm;皮長下的UV才全觀'M義也用于制備LC。+和402.8的分子量。實施例2:從聚酵素芽孢桿菌KJS-2的培養(yǎng)基中純化抗菌物質(zhì)為了純化菌林聚酵素芽孢桿菌KJS-2所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，將該菌抹的種培養(yǎng)物稀釋于3L的TSB培養(yǎng)基(TSB瓊脂胰蛋白胨17g,大豆胨3g,葡萄糖2.5g,NaCl5g，磷酸氫二鉀2.5g,pH6.8~7.2)中至4%的終濃度，并培養(yǎng)2.5天(30。C,200rpm,lvvm，pH6.8)。用乙酸乙酯萃取培養(yǎng)基并在使用實施例1的步驟2的溶劑的條件下，由HPLC進行分析，如圖4中所示分餾出每個峰。測試每個餾分對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌168和耐萬古霉素腸球菌的抗菌活性。結(jié)果顯示餾分1、4、5和7具有針對大腸桿菌的抗菌活性(參看圖4),餾分1、2、4、5、6、7和9具有針對枯草芽孢桿菌168的抗菌活性(參看圖4)。而餾分1和2則同時顯示針對耐萬古霉素腸球菌的抗菌活性(參看圖4)。然而，由于本發(fā)明的餾分1不僅較餾分2產(chǎn)率更高，并且其還顯示出針對用于該試驗的所有三種細菌的抗菌活性(參看圖4),因此餾分1被確定用于試驗。下圖5是在實施例1的步驟2的相同條件下，通過LC/Mass對圖4的餾分1的分析，該純化達到的純度為94.63%。實施例3:顯示針對VRE的優(yōu)異的抗菌活性的餾分的結(jié)構(gòu)分析為分析最終純化的抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌168和耐萬古霉素腸球菌生長的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，在與實施例1的步驟2的制備LC相同的條件下大量制備餾分(參看圖6)。在與實施例1的步驟2的LC/Mass相同的條件下分析餾分，對實施例2的餾分1進行純化，具有97.72%的純度(參看圖7)。將通過制備LC純化的30mg物質(zhì)溶解在700pl的溶劑DMS0-d6中并測試第一和第二NMR(^H-雇R、13C-NMR、90-DEPT、135-DEPT、H-HCOZY、HMQC、HMBC)。NMR分析的結(jié)果示于以下表2、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12、圖13和圖14中?；贜MR分析的結(jié)果，最終純化的物質(zhì)被鑒定為大環(huán)內(nèi)酯菌素A(參看圖16)，并通過進行HRMS/FAB測試證實為大環(huán)內(nèi)酯菌素A,其具有425.23m/z的[M+Na]+和402.23的分子量。使用HRMS(FAB)JMS-700進行精確的質(zhì)量分析。該通過HRMS/FAB的精確的質(zhì)量分析數(shù)據(jù)示于下圖15中?？偨Y(jié)所有分析數(shù)據(jù)，具有優(yōu)異抗菌活性的實施例2的餾分1被鑒定為大環(huán)內(nèi)酯菌素A，其具有(3241!3405的分子式和402.23的分子量(參看圖16)。[表2]聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)——大環(huán)內(nèi)酯菌素A的NMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例4:聚酵素芽孢桿菌KJS-2的培養(yǎng)基中代謝物的LC/Mass分析在發(fā)酵2.5天和4.2天后，通過使用乙酸乙酯萃取50ml的實施例2的聚酵素芽孢桿菌KJS-2的培養(yǎng)基，并通過LC/Mass進行分析。基于聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的所有代謝物的分子量和UV光譜以及關于芽孢桿菌屬代謝物的現(xiàn)有文獻，獲得了示于下表3和表4中的結(jié)果(參看圖17和圖18)。下表3和表4中所期望的物質(zhì)的評判是基于大環(huán)內(nèi)酯菌素A衍生物的分子量和特有的UV波長，以及之后要求的關于NMR的結(jié)構(gòu)分析以及抗菌活性測試的附加數(shù)據(jù)。[表3〗在發(fā)酵2.5天后，聚酵素芽孢桿菌KJS-2的培養(yǎng)基的萃取后溶液的LC/Mass分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>[表4]在發(fā)酵4.2天后，聚酵素芽孢桿菌KJS-2的培養(yǎng)基的萃取后溶液的LC/Mass分析<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例5:針對VRE和MRSA的最小抑制濃度(MIC)的比較測定針對VRE和MRSA的MIC(最小抑制濃度)以測試聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素A的抗菌活性，該聚酵素芽孢桿菌KJS-2是抗這兩種菌林的本發(fā)明的菌抹。用于試驗的菌抹是臨床上分離的11種VRE菌抹和13種MRSA菌抹。在37°C下，在MHII培養(yǎng)基中以200rpm將每一用于試驗的菌抹培養(yǎng)6小時，使用UV檢測儀在OD6oo證處測定培養(yǎng)基的吸光度，然后將1ml等分試樣的培養(yǎng)基涂抹在MHII瓊脂培養(yǎng)基上并在37°C下培養(yǎng)16小時。將培養(yǎng)16小時后瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落個數(shù)進行計數(shù)。在37°C下，在MHII培養(yǎng)基中以200rpm培養(yǎng)每一用于試驗的菌抹6小時，并使用UV檢測儀在OD,謹處測定培養(yǎng)基的吸光度。基于菌落數(shù)目對培養(yǎng)基吸光度的比值計算細胞數(shù)目，并通過上述方法測定。將每種培養(yǎng)基稀釋到0.25*107cfu/ml的最終細胞濃度，并將大環(huán)內(nèi)酯菌素A溶解在溶劑DMSO中，同時將氨芐西林、替考拉寧、萬古霉素和曱氧西林溶解在水中。為測定大環(huán)內(nèi)酯菌素A或其他四種抗生素的MIC,將分別處于500pieppendorff管中的列于表5中的物質(zhì)和大環(huán)內(nèi)酯菌素A的混合物或列于表6中的物質(zhì)和其他四種抗生素中每一種的混合物在37°C下以200rpm培養(yǎng)16小時，然后使用熒光多功能酶標儀(FluorescenceMulti-DetectionReader)通過UV/可見光4企測4義在600nm處測定吸光度。如表7和表8所示的結(jié)果揭示大環(huán)內(nèi)酯菌素A抗11種VRE菌抹的平均MIC^o為31.25pg/ml,其為替考拉寧的4倍那么高；而大環(huán)內(nèi)酯菌素A抗13種MRSA菌抹的平均MIO90為19.83jxg/ml,其為替考拉寧的5.3倍那么高。[表5]MIC的比較，以及大環(huán)內(nèi)酯菌素A濃度梯度<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>大環(huán)內(nèi)酯菌素A溶于DMSC^中細月包*的濃度為0.25x107cfu/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>氨爺西林、替考拉寧、萬古霉素、曱氧西林溶于水中細胞*的濃度為0.25x107cfu/ml[表7]大環(huán)內(nèi)酯菌素A和其他抗生素抗11種VRE菌抹的MIC>90的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例6:大環(huán)內(nèi)酯菌素A的生物測定進行生物測定以測量本發(fā)明菌抹——聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素A對微生物的抑制效果。用于該試驗的菌抹是釀酒酵母、創(chuàng)傷弧菌、藤黃微球菌和副乳房鏈球菌。除創(chuàng)傷弧菌之外，將每種菌林接種在TSB培養(yǎng)基中并在37°C下以200rpm培養(yǎng)16小時，然后將0.5ml(大約2.8*109cfu/ml)等分試樣的培養(yǎng)基涂抹在TSB瓊脂培養(yǎng)基上。將創(chuàng)傷弧菌接種在TSB培養(yǎng)基中并在25°C下(其最佳生長條件)以200rpm培養(yǎng)16小時，然后將上述量的培養(yǎng)基涂抹在瓊脂培養(yǎng)基上。生物測定所需的溶劑為對用于該試驗的菌抹不具有毒性的、可溶解大環(huán)內(nèi)酯菌素A的溶劑。曱醇是一種用于大環(huán)內(nèi)酯菌素A的良好的溶劑，但不適合于生物測定，原因在于其自身顯示針對試驗用菌抹的毒性。然而，50%丙酮對用于該試驗的三種菌抹不顯示毒性(參看圖20)。在圖19中，(A)是已稀釋IO倍的于1ml的50%丙酮中的1mg大環(huán)內(nèi)酯菌素A的1|il等分試樣的HPLC色譜圖，(B)是已稀釋10倍的在1ml的曱醇中的1mg大環(huán)內(nèi)酯菌素A的1pi等分試樣的HPLC色譜圖。即，在實施例2的步驟2的HPLC條件下進行色譜分析?？偨Y(jié)實驗結(jié)果，因為50%丙酮對試驗用的三種菌林不顯示毒性(圖20),同時大環(huán)內(nèi)酯菌素A在50%丙酮中的溶解度類似于曱醇(圖19),因此用50%丙酮作為生物測定的溶劑。測試10pl的溶于50%丙酮中的大環(huán)內(nèi)酯菌素A溶液(25mg/ml)并顯示針對釀酒酵母、創(chuàng)傷弧菌、藤黃微球菌和副乳房鏈球菌菌抹具有優(yōu)異的抗菌活性(參看圖20)。此外，將10pl的大環(huán)內(nèi)酯菌素A溶液(1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml禾口20mg/ml，分別溶于50%丙酮中)施用于已涂抹在TSB瓊脂培養(yǎng)基上的VRE5(該VRE5用于實施例5的MIC試驗中)，同時分別施用10pl的50%丙酮和10pl的萬古霉素溶液(5mg/ml，溶于1120中)作對照組。結(jié)果表明用于該試驗的VRE5不為50%丙酮或萬古霉素溶液(5mg/ml)所抑制，但為具有高于1.25mg/ml濃度的大環(huán)內(nèi)酯菌素溶液所抑制(參看圖21)。實施例7:液體培養(yǎng)基中抗VRE效果對于使用VRE的該試驗，將菌抹接種在液體培養(yǎng)基中直至濃度達到l，OOO，OOOcfu/ml，并與大環(huán)內(nèi)酯菌素A(用于待測試的菌抹)或不與大環(huán)內(nèi)酯菌素A(用于對照)一起培養(yǎng)。大環(huán)內(nèi)酯菌素A的濃度為50嗎/ml,如下用于該試驗的11種菌抹獲得自Donga大學醫(yī)學院VRE1、VRE2、VRE3、VRE4、VRE5、VRE6、VRE7、VRE8、VREll、VRE914和VRE915。如下表所示，與4小時相比，在培養(yǎng)6小時后，對照組(C)顯示顯著的生長，而測試組顯示顯著的生長延緩和抑制；VRE8和VRE11顯示顯著的生長延緩，但與其他菌林相比顯然具有更低的敏感性。所測試的11種菌抹中的9種顯示顯著的生長抑制。在培養(yǎng)4小時后，對照組的平均吸光度為0.76,而與大環(huán)內(nèi)酯菌素A—起培養(yǎng)的組的吸光度則為0.19，顯示在這兩組之間存在顯著差異。在培養(yǎng)6小時后，對照組顯示快速生長至1.5的吸光度，而與大環(huán)內(nèi)酯菌素A—起培養(yǎng)的組的吸光度再次顯示顯著的生長抑制至0.26的吸光度。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例8:測定比旋光的結(jié)果由"Gabriella，，等測定的大環(huán)內(nèi)酯菌素A的比旋光為[a]22D(c于MeOH中)=-10.7(0.68)(7-O-MalonylMacrolactinA,aNewMacrolactinAntibioticfromBacillussubtilisActiveagainstMethicillin-ResistantStaphylococcusaureus,Vancomycin-ResistantEnterococci,andaSmall-ColonyVariantofBurkholderiacepacia.Antimicrob.AgentsChemother.50:1701-1709,2006)。由"Yoo"等測定的大環(huán)內(nèi)酯菌素A的比旋光為[a]18D(c于MeOH中)=-20(0.1)(NeuronalcellprotectionactivityofmacrolactinAproducedbyActinomadurasp.J.Microbiol.Biotechnol.7:429-434.1997)。由"William"等測定的大環(huán)內(nèi)酯菌素A的比旋光為[a]D(c于MeOH中)=-9.6(1.86)(Themacrolactins,anovelclassofantiviralandcytotoxicmacrolidesfromadeep-seamarinebacterium.J.Am.Chem.Soc.111:7519-7524.1989)。由"Park"等測定的大環(huán)內(nèi)酯菌素A的比旋光為[a]25D(c于MeOH中)=-10.36(0.13)(IsolationandCharacterizationofAntimicrobialSbustanceMacrolactinAProducedfromBacillusamyloliquefaciensCHOI04IsolatedfromSoil.J.Microbiol.Biotechnol.14:525-531,2004)。由聚酵素芽孢桿菌KJS-2制得的本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯菌素A的比旋光為[a]22D(c于MeOH中)=-10(4.0)。這不同于之前的結(jié)果，例證了作為一種光學異構(gòu)體的唯一性，同時用作對照的蔗糖的比旋光顯示了正常值的[a]28D(c于水中)=64.038(26)。結(jié)果，可推斷本發(fā)明具有一種不同于純化自其他菌抹的大環(huán)內(nèi)酯菌素A的異構(gòu)體。權(quán)利要求1.聚酵素芽孢桿菌KJS-2菌株，其是一株產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯菌素A的新菌株(保藏編號KCCM10769P)。2.—種使用權(quán)利要求1的大環(huán)內(nèi)酯菌素A作為抗耐萬古霉素腸球菌(VRE)的抗生素的方法。3.權(quán)利要求2的方法，其中大環(huán)內(nèi)酯菌素A的最小抑制濃度MIC,為15.63|tig/ml~31.25pg/ml。4.一種使用權(quán)利要求1的大環(huán)內(nèi)酯菌素A作為抗耐曱氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的抗生素的方法。5.權(quán)利要求4的方法，其中大環(huán)內(nèi)酯菌素A的最小抑制濃度MIC,為7.81ng/ml~31.25pg/ml。6.—種使用權(quán)利要求1的大環(huán)內(nèi)酯菌素A作為抗傳染性菌的抗生素的方法，該傳染性菌包括創(chuàng)傷弧菌和副乳房鏈球菌。全文摘要本發(fā)明涉及一株新的芽胞桿菌菌株——酵素芽孢桿菌KJS-2(KCCM10769P)產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素A作為抗生素的應用。本發(fā)明的由聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯菌素A顯示了針對多種微生物和真菌的廣譜抗菌活性，經(jīng)證明特別對多重耐藥性菌——耐萬古霉素腸球菌(VRE)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的抑制是非常有效的。該聚酵素芽孢桿菌KJS-2產(chǎn)生的抗生素大環(huán)內(nèi)酯菌素A可用作一種抗耐萬古霉素腸球菌(VRE)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的極好的抗生素，因此本發(fā)明對于醫(yī)藥工業(yè)是一項非常有用的發(fā)明。文檔編號C12P17/02GK101636501SQ200880008596公開日2010年1月27日申請日期2008年3月12日優(yōu)先權(quán)日2007年3月16日發(fā)明者姜在璿,崔光進,李進英,洪勇根,洪才憲,車仁俊,金東勛,金東熙,金天圭,金江民申請人:仁濟大學校產(chǎn)學協(xié)力團;姜在璿