專利名稱：微生物在透明滲透膜上的檢測(cè)和鑒定的制作方法
微生物在透明滲透膜上的檢測(cè)和鑒定與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求名稱為 "Detection and Identification ofMicroorganisms on Transparent Permeable Membranes" 的美國(guó)臨時(shí)序列號(hào)60/896, 321的優(yōu)先權(quán)，其通過引用整體合并入本文。
背景技術(shù)：
1. 發(fā)明領(lǐng)域
總的來說，本公開內(nèi)容涉及生物學(xué)領(lǐng)域并且尤其涉及快速檢測(cè)、鑒定且計(jì)數(shù)微生物的小菌落(microcolony)的領(lǐng)域。
2. 現(xiàn)有技術(shù)的描述
現(xiàn)代微生物學(xué)分析基于2個(gè)主要趨勢(shì)1 )無初步生長(zhǎng)的分析和2 )在此種初步生長(zhǎng)后的分析。第一個(gè)趨勢(shì)包括一組某些免疫學(xué)方法[例如，免疫熒光、放射性免疫測(cè)定、關(guān)于單個(gè)細(xì)胞的酶免疫測(cè)定法(EIA)];
一組經(jīng)由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR )基于DNA/RNA分析的方法；和一組流式細(xì)胞術(shù)方法[在通過熒光抗體或熒光底物標(biāo)記后單個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)]。人工底物也用于通過顯孩吏鏡方法檢測(cè)和分析細(xì)胞。然而，這些方法中的某些(PCR和免疫學(xué))無法用于檢測(cè)活細(xì)胞。與人工(主要是熒光)底物組合的流式細(xì)胞術(shù)能夠檢測(cè)活細(xì)胞，但非常昂貴，并且需要高度熟練的實(shí)驗(yàn)室專家和濃縮的樣品。然而，用于檢測(cè)和鑒定不同醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、食物、農(nóng)業(yè)、藥學(xué)、環(huán)境和軍事樣品中的活細(xì)胞的快速、廉價(jià)和有效的方法對(duì)于許多人類需要還是重要的。并且在微生物學(xué)中的確使用細(xì)胞的常用測(cè)試[脂肪酸的層析法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、質(zhì)鐠法、傅里葉變換紅外(FTIR)光譜法和免疫分析]全都需要微生物菌落的初步生長(zhǎng)，這代表在檢測(cè)和鑒定可以進(jìn)行前的至少一次費(fèi)時(shí)的初始細(xì)胞培養(yǎng)。
盡管存在這些高科技備選方法，但在陪替氏平板(Petri plate)
5上的常規(guī)生長(zhǎng)仍是用于檢測(cè)樣品中存在的微生物的最常用方法。 一般
分析將執(zhí)行樣品的幾次10倍稀釋，隨后將1毫升稀釋樣品平均分配在營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面上。10倍稀釋的量通?？梢栽谌魏畏秶?-12內(nèi)，其中在特定范圍中的每個(gè)稀釋物在陪替氏平板中涂布，以便發(fā)現(xiàn)適合于計(jì)數(shù)微生物菌落的稀釋度。然而，這可能需要幾塊到一打或更多陪替氏平板。在實(shí)踐中，如由FDA推薦的，當(dāng)一塊可計(jì)數(shù)平板上的細(xì)菌菌落數(shù)目不超過250個(gè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)正確稀釋度。為了達(dá)到這個(gè)數(shù)目，接種平板對(duì)于細(xì)菌溫育約24-48小時(shí)而對(duì)于真菌溫育約72-120小時(shí)。因此需要相對(duì)長(zhǎng)的時(shí)間，以形成對(duì)于肉眼容易看見的菌落。然而，如果樣品屬于時(shí)間敏感的生物危害事故，或危重護(hù)理中的醫(yī)院患者，那么時(shí)間是極其重要的，并且費(fèi)時(shí)溫育和連續(xù)測(cè)試可以是具有潛在威脅生命的后果的重大負(fù)擔(dān)。
在固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落僅進(jìn)行計(jì)數(shù)用于檢測(cè)和計(jì)數(shù)總微生物生長(zhǎng)，或被取出且根據(jù)常規(guī)微生物學(xué)操作、質(zhì)譜法、FTIR光譜法、層析法、免疫測(cè)定法或PCR進(jìn)行分析。
可疑菌落的取出和該菌落通過長(zhǎng)和麻煩的傳統(tǒng)方法或復(fù)雜和昂貴的高科技方法和儀器的后續(xù)分析導(dǎo)致CHROMagarTM營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的發(fā)明，
所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含允許目的菌落的生長(zhǎng)和同時(shí)特異性顯色的特殊物質(zhì)、底物和抗生素。CHROMagar Ca/^/cTa 、 CHROMagar 0157、CHROMagar "/細(xì)e"a、 CHROMagar 5Y一， aw，s和某些其他培養(yǎng)基目前通過粉色、綠色或藍(lán)色用于鑒定目的菌落。起始顯色的物質(zhì)收集在細(xì)胞體中，這引起生長(zhǎng)問題。因此，菌落非典型地小且通常需要延長(zhǎng)的溫育。僅常規(guī)大小的菌落可以進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)轭伾苋?，并且小量光吸收?duì)于顯微鏡方法是無效的。這意味著小菌落(菌落形成的早期階段)無法使用CHR0MagarT"進(jìn)行檢測(cè)。僅目的物種和某些其他物種可以在CHROMagar 上生長(zhǎng)。因此，CHROMagar 對(duì)于在微生物學(xué)中最常用的綜合(總的活生物體)微生物檢測(cè)和計(jì)數(shù)是無效的。
總的來說，在陪替氏平板上的生長(zhǎng)是醫(yī)學(xué)、工業(yè)、生物技術(shù)、研究和藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室中使用的一般微生物學(xué)操作。每年通過這些方法進(jìn)行全世界范圍的、億萬次分析。因此，存在對(duì)于更有效、劃算、精確和適時(shí)的產(chǎn)品和操作的巨大需要，以允許檢測(cè)、鑒定和計(jì)數(shù)微生物。
發(fā)明概述
本公開內(nèi)容提供了克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性的儀器、方法和材料的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案。特別地，本公開內(nèi)容通過用于檢測(cè)、鑒定或計(jì)數(shù)微生物的裝置來實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，所述裝置包括用于提供營(yíng)養(yǎng)物以維持微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基容器，和與營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基接觸的多孔元件或多孔膜。多孔元件其自身允許營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基通過其，以維持一般常規(guī)大小的菌落和小菌落(統(tǒng)稱為"菌落")的生長(zhǎng)。并且多孔元件可從容器轉(zhuǎn)移到
其他位置，用于經(jīng)由指示物(indicator )和進(jìn)一步的目視檢查的后續(xù)處理。
因?yàn)榫淇山?jīng)由多孔元件轉(zhuǎn)移，所以細(xì)胞和小菌落的生長(zhǎng)和指示物階段可以分開用于最佳結(jié)果用于快速細(xì)胞生長(zhǎng)而在其中無延緩生長(zhǎng)的有害指示物的生長(zhǎng)階段，以及用于有效允許快速檢測(cè)更小尺寸小菌落的專用著色(dedicated coloring)和鑒定的指示物階段。此外，如果細(xì)胞在早期階段以初始小菌落大小進(jìn)行評(píng)估，那么因?yàn)樗鼈兛梢杂帽景l(fā)明有效檢測(cè)，所以連續(xù)稀釋是較不必要的。因此，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的局限性，即基本上需要在連續(xù)稀釋以防止菌落彼此過度生長(zhǎng)后來自例如經(jīng)由CHROMagar的延長(zhǎng)溫育的一般常規(guī)大小菌落。本發(fā)明需要更少的稀釋或不需要稀釋，從而更快速達(dá)到結(jié)果和節(jié)約實(shí)驗(yàn)室資源。特別地，可以取出多孔元件連同在多孔元件上或在定位于多孔元件上的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落，進(jìn)行后續(xù)處理步驟(用于廣泛范圍的處理)，包括有色小菌落的生物化學(xué)指示物處理或者手動(dòng)或自動(dòng)化目視檢測(cè)、計(jì)數(shù)和形狀分析(通過形狀區(qū)分)，所述有色小菌落在標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡下可容易地看見。為了允許樣品接種在培養(yǎng)基或多孔元件上，多孔元件具有允許樣品的液體部分通過其向下傳遞到容器內(nèi)的性質(zhì)。然后，為了促進(jìn)由樣品捕獲的細(xì)胞的生長(zhǎng)，多孔元件具有允許來自培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物通過其傳遞給細(xì)胞的性質(zhì)。接下來，為了允許細(xì)胞用指示物處理，多孔元件具有允許生物化學(xué)指示物例如不同染料或
7抗體綴合物通過其傳遞給細(xì)胞，同時(shí)維持多孔膜上的細(xì)胞和小菌落的完整性而不溶解或洗掉小菌落的性質(zhì)。最后，為了允許檢查細(xì)胞和小菌落，多孔元件具有透明的視覺性質(zhì)。
存在將多孔元件定位在培養(yǎng)基上的2個(gè)不同實(shí)施方案。在第一個(gè)實(shí)施方案中，將多孔元件放置在培養(yǎng)基層之上并且不用任何后續(xù)培養(yǎng)基覆蓋。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的運(yùn)輸，這個(gè)實(shí)施方案中的多孔膜不具有大于希望評(píng)估的最小細(xì)胞的孔隙度，以便使細(xì)胞捕獲在多孔元件上。因此，當(dāng)多孔元件從培養(yǎng)基取出并轉(zhuǎn)移以進(jìn)行后續(xù)處理時(shí)，細(xì)胞和菌落伴隨多孔元件保持完整。這個(gè)第一個(gè)實(shí)施方案對(duì)于熒光分析有用，因?yàn)槎嗫自渥陨聿痪哂斜尘盁晒狻Ｔ诘诙€(gè)實(shí)施方案中，將多孔元件放置在培養(yǎng)基層之上并且隨后用另外的培養(yǎng)基覆蓋。在這個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞和小菌落將在另外的培養(yǎng)基之上生存，并且因此多孔元件可以具有大于最小細(xì)胞的孔徑，因?yàn)榧?xì)胞和小菌落捕獲在另外的培養(yǎng)基的頂部表面上，所述另外的培養(yǎng)基在多孔元件其自身上。因此，當(dāng)多孔元件從容器中取出時(shí)，它帶走在多孔元件上的另外的培養(yǎng)基，連同在另外的培養(yǎng)基上生存的小菌落。第二個(gè)實(shí)施方案對(duì)于小菌落的光吸收著色而不是熒光檢測(cè)有用，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基其自身具有大量背景熒光。
為了提供方便的測(cè)試，測(cè)試試劑盒系統(tǒng)包括用于提供營(yíng)養(yǎng)物以促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基容器；滲透膜；和選自下述的次級(jí)培養(yǎng)基(secondary media ):瓊脂糖、角叉菜膠、明膠或能夠成為具有釋放指示物分子的能力的載體的其他凝膠，所述指示物分子例如生色底物、熒光底物、或者熒光或放射性標(biāo)記的抗體。
總的來說，本發(fā)明提供了用于下述的更快速、更有效、更廉價(jià)和更可靠的儀器和方法通過強(qiáng)烈著色的小菌落進(jìn)行活小菌落或微生物總數(shù)目(TV0)的檢測(cè)；通過小菌落的容易看見的形狀使一種小菌落類型與另一種區(qū)分(其對(duì)于物種或物種的群是半特異性的)；檢測(cè)和鑒定抗生素抗性微生物的小菌落；通過使用免疫熒光或放射免疫標(biāo)記的抗體鑒定；以及通過光吸收方法或通過熒光方法檢測(cè)、區(qū)分和/或鑒定。在已閱讀優(yōu)選實(shí)施方案的下述詳述后，本公開內(nèi)容的這些和其他目的和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是顯而易見的，所述優(yōu)選實(shí)施方案 也在各個(gè)附圖中舉例說明。
附圖的幾個(gè)^f見圖的簡(jiǎn)述
隨同包括的附圖并入且形成本說明書的部分。附圖舉例說明本發(fā) 明的實(shí)施方案，并且連同說明書用于解釋本發(fā)明的原理。應(yīng)當(dāng)理解本 說明書中提及的附圖并非按比例描繪，除非像這樣明確指出。
圖1是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，舉例說明用于評(píng)估具有
在溶液中的細(xì)胞的樣品的多孔性和結(jié)構(gòu)元件和生長(zhǎng)培養(yǎng)基元件的2個(gè) 實(shí)施方案的空間和功能關(guān)系的功能方框圖。
圖2A是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，在其上具有多個(gè)過濾元 件的瓊脂培養(yǎng)基容器。
圖2B是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示空間關(guān)系的培養(yǎng)基 和過濾元件的多個(gè)實(shí)施方案的橫截面視圖。
圖3是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，通過使用培養(yǎng)基和可轉(zhuǎn) 移的多孔元件檢測(cè)小菌落的細(xì)胞檢測(cè)試劑盒的組分和步驟的圖示。
圖4是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，在其上具有多個(gè)多孔元 件的瓊脂培養(yǎng)基容器中的培養(yǎng)物連同分開的次級(jí)培養(yǎng)基(用于著色) 的注釋圖。
圖5A到5H是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，使用可轉(zhuǎn)移的多 孔元件和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的芽孢桿菌屬(勘ci7/"s)的幾個(gè)不 同物種的顯微照片。
圖6是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，使用可轉(zhuǎn)移的多孔元件 和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的來自利斯特氏菌屬(Z"/er/a)的物種的 顯微照片。
圖7是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，使用可轉(zhuǎn)移的多孔元件 和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的來自葡萄球菌屬(57a/7ArA coccu;y)的物 種的顯微照片。
圖8是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，使用可轉(zhuǎn)移的多孔元件 和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的來自埃希氏菌屬(^c力eWc力/a)的物種的 9顯微照片。
圖9是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，使用可轉(zhuǎn)移的多孔元件 和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的來自假單胞菌屬(Aeu化邁o"w)的物種的 顯微照片。
圖IO是根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，用于檢測(cè)和鑒定細(xì)胞和 小菌落的方法的流程圖。
發(fā)明詳述
現(xiàn)在將詳細(xì)提及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)例在 附圖中舉例說明。雖然本發(fā)明將結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但應(yīng)當(dāng) 理解它們不意欲于將本發(fā)明限制于這些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明意欲 包含如由所附權(quán)利要求限定的可以包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的備 選方案、修飾和等價(jià)物。此外，在本公開內(nèi)容的下述詳述中，闡述了 眾多具體細(xì)節(jié)以便提供對(duì)本公開內(nèi)容的充分理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員顯而易見的是，無需這些具體細(xì)節(jié)也可以實(shí)踐本公開內(nèi) 容。在其他情況下，未詳細(xì)描述眾所周知的方法、操作、組分和微生 物學(xué)細(xì)節(jié)，以避免不必要地模糊本公開內(nèi)容的方面。
術(shù)語和解釋
生長(zhǎng)培養(yǎng)基。生長(zhǎng)培養(yǎng)基是在本發(fā)明的背景下用于小菌落的生長(zhǎng) 的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。它可以是用于細(xì)菌生長(zhǎng)的一般培養(yǎng)基，例如Tryptic Soy Agar,用于真菌和酵母生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，例如Saboraud Dextrose Agar,或用于微生物的特定群體的生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，例如用于假單胞菌 屬物種的生長(zhǎng)的Cetrimide Agar,或用于揭示革蘭氏陰性腸病原體的 MacConkey Agar。生長(zhǎng)培養(yǎng)基充當(dāng)固定在其表面上的多孔元件的固體 栽體。
小菌落。小菌落是在溫育3-6小時(shí)后出現(xiàn)的小的菌落。小菌落的 一般大小是10-100 pm。它們是無色的且在常規(guī)光學(xué)顯微鏡下看不 見。甚至有色的小菌落例如黃色的金黃色葡萄球菌在光學(xué)顯微鏡下通 常也看不見。因此，小菌落一般需要著色以便變得可見。大多數(shù)微生 物物種在生長(zhǎng)的早期階段過程中(3-6小時(shí))產(chǎn)生特定形狀的小菌落。通常，它們形狀的差異如此明顯，使得分析員具有良好的機(jī)會(huì)通過給
定小菌落的形狀簡(jiǎn)單地區(qū)分物種(參見圖5A-5H，以及6-9)。小菌落 由彼此并非機(jī)械連接的細(xì)胞鏈組成。因此，所有生長(zhǎng)培養(yǎng)基和次級(jí)培 養(yǎng)基必須不包含游離液體，以免小菌落的細(xì)胞彼此分離。所有營(yíng)養(yǎng)液 和溶解物質(zhì)由瓊脂糖或另一種聚合凝膠結(jié)合。
膜。膜或多孔元件是允許小菌落生長(zhǎng)和標(biāo)記的重要材料，以便使 得它們可見且研究其特定形狀。關(guān)于這個(gè)膜的需求如下必須是光透 明的以便當(dāng)與顯微鏡一起使用時(shí)，允許光透過；對(duì)于水和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基 的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及來自次級(jí)培養(yǎng)基的指示物質(zhì)必須是可滲透的，以便在 小菌落形成過程中伺喂微生物且隨后使這些小菌落著色；必須允許標(biāo) 記分子滲透且與小菌落的細(xì)胞反應(yīng)；對(duì)于細(xì)胞必須是不可滲透的(其 中在其上具有培養(yǎng)基層的多孔膜明顯例外)，從而使得細(xì)胞將僅在膜 的一側(cè)上生長(zhǎng)；對(duì)于細(xì)胞外的酶必須是有抵抗力的，以便使膜結(jié)構(gòu)保 持完整且保持半滲透性；必須是可高壓滅菌的，因?yàn)槟ぴ谑褂们氨仨?是無菌的；必須是親水的，以便允許水和大多數(shù)物質(zhì)自由滲透通過其-疏水膜對(duì)于這類滲透具有強(qiáng)烈抵抗力；必須是非熒光 (non-fluorescent )和無色的，因?yàn)楸尘盁晒鈱?duì)于熒光分析方法是嚴(yán) 格不耐受的，并且顏色可以掩蓋小菌落的顏色；必須不包含阻止或抑 制微生物生長(zhǎng)的任何物質(zhì)。此外，膜必須不包含可見顆?；蚶w維(如 過濾膜具有的)，因?yàn)轭w粒和纖維阻止微菌落的自由生長(zhǎng)，并且能夠 改變生長(zhǎng)時(shí)間和微菌落的形狀(其中在多孔膜上具有培養(yǎng)基層的明顯 例外)。實(shí)驗(yàn)顯示用于這些目的的最佳聚合物是再生纖維素及其衍生 物，如玻璃紙、銅紡和透析膜?？梢允褂蔑@示相同特性的其他聚合物。 可以使用用于膜的許多其他類型的材料，例如具有天然存在的孔、或 具有人工產(chǎn)生的孔的有機(jī)或無機(jī)材料。膜必須是透明的以傳遞光用于 最佳顯現(xiàn)結(jié)果，但也可以是半透明的，或白色的或其他顏色，盡管它 們對(duì)于顯現(xiàn)具有較不希望的結(jié)果。
次級(jí)培養(yǎng)基。次級(jí)培養(yǎng)基是凝膠、聚合物或BioNanoChannerM平 板，充當(dāng)指示物質(zhì)或標(biāo)記抗體的載體。它的主要功能是攜帶在液體(水或緩沖溶液)中溶解的指示物質(zhì)或抗體，并且經(jīng)由簡(jiǎn)單擴(kuò)散將它們通 過膜轉(zhuǎn)移給小菌落。凝膠如純瓊脂(瓊脂糖)、明膠、角叉菜膠或具 有長(zhǎng)聚合分子的其他合適的多糖，可以用于結(jié)合液體和半固體形式的
物質(zhì)。通常避免將僅液體溶液用作指示物(其中BioNanoChannel明顯 例外)，因?yàn)閷?shí)際的液體溶液快速滲透過膜并且形成大區(qū)域，其中所 有小菌落分離、失去其形狀，并且再次合并在一起，形成一個(gè)大細(xì)胞 凝塊。然而，標(biāo)記抗體是相對(duì)大的分子(IgG具有約150， 000 Da的大 小)，并且無法容易地從凝膠的聚合結(jié)構(gòu)中釋放。在這種情況下，可 以使用BioNanoChannel平板代替所述的凝膠。每塊平板由數(shù)百萬小納 米通道組成，其各自具有IO jjm或更小的直徑。因此，標(biāo)記抗體比納 米通道小數(shù)千倍，并且可以從平板的一側(cè)在液體中自由移動(dòng)到納米通 道內(nèi)。然而， 一旦液體在納米通道中，它就由強(qiáng)毛細(xì)管作用力捕獲， 并且無法快速移動(dòng)通過膜和如游離液體一樣分解小菌落。
指示物。在本發(fā)明的范圍中，指示物是能夠特異性或非特異性標(biāo) 記小菌落的物質(zhì)。它們是生色和/或熒光底物或者它們的混合物和標(biāo)記 抗體。在與特定或非特定酶或一組酶反應(yīng)后，生色和熒光底物產(chǎn)生光
吸收或熒光物質(zhì)。這些底物的小分子可以自由離開凝膠，通過膜，并 且與活細(xì)胞的酶反應(yīng)。由熒光染料或放射性同位素標(biāo)記且引入 BioNanoChannel平板內(nèi)的抗體可以自由地離開納米通道且通過膜，例 如只要膜具有1(T6 Da或更大的孔。通過將膜轉(zhuǎn)移至另一塊 BioNanoChannel平板一次或多次去除未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。
檢測(cè)、區(qū)分和鑒定。術(shù)語"檢測(cè)，， 一般理解為意指不依賴其分類 學(xué)分類法揭示和計(jì)算/計(jì)數(shù)任何小菌落的能力。"區(qū)分"意指所使用的 方法通過其形狀、顏色或熒光的波長(zhǎng)/顏色使在膜上的2種或更多物種 彼此區(qū)分的能力。"鑒定"意指給定小菌落的屬和物種的確定。檢測(cè) 僅需要生色或熒光底物。區(qū)分基于小菌落的形狀或顏色中的差異。鑒 定需要使用抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
附圖詳述
現(xiàn)在參考圖1，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示舉例說明用于評(píng)估具有在溶液中的細(xì)胞的樣品的多孔性和結(jié)構(gòu)元件和生長(zhǎng)培養(yǎng)
基元件的2個(gè)實(shí)施方案的空間和功能關(guān)系的功能方框圖10。第一個(gè)實(shí) 施方案利用放置在生長(zhǎng)培養(yǎng)基裝置16的頂部表面17上的多孔性和結(jié) 構(gòu)元件或裝置14A,其中樣品溶液12的液體部分18B通過過濾元件裝 置14A,并且向下通過生長(zhǎng)培養(yǎng)基16朝向容納生長(zhǎng)培養(yǎng)基16的容器 底部，而由于膜的孔徑小于待阻斷的所需細(xì)胞的大小，樣品溶液12 的細(xì)胞部分20B被捕獲或阻斷不能通過多孔性元件裝置14A。來自生 長(zhǎng)培養(yǎng)基裝置16的營(yíng)養(yǎng)物22通過膜裝置14至位于多孔性元件功能元 件(function) 14A之上的細(xì)胞20B。
與第一個(gè)實(shí)施方案形成對(duì)比，圖1的第二個(gè)實(shí)施方案利用在多孔 性和結(jié)構(gòu)元件裝置14A上或放置在多孔性和結(jié)構(gòu)元件裝置14A上的另 外任選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基層13。如此，樣品溶液12的液體部分18A通過 另外的生長(zhǎng)培養(yǎng)基層13和多孔性元件裝置14A并通過生長(zhǎng)培養(yǎng)基16， 但樣品溶液12的細(xì)胞部分20A被捕獲或阻斷不能通過另外的生長(zhǎng)培養(yǎng) 基層13,因?yàn)橐后w可以滲透培養(yǎng)基，但細(xì)胞不能。為此，第二個(gè)實(shí)施 方案的膜裝置14A無需符合孔隙度必須小于待阻斷的所需細(xì)胞大小的 要求。相反，這個(gè)第二個(gè)實(shí)施方案的多孔性元件裝置14A具有提供另 外的生長(zhǎng)培養(yǎng)基層13以及在其上的細(xì)胞和小菌落的結(jié)構(gòu)支持用于轉(zhuǎn) 移裝置24的主要功能。在第二個(gè)實(shí)施方案中多孔性元件裝置14A的次 功能是將來自生長(zhǎng)培養(yǎng)基16的營(yíng)養(yǎng)物22傳遞給位于另外的生長(zhǎng)培養(yǎng) 基層13上的細(xì)胞和小菌落，所述另外的生長(zhǎng)培養(yǎng)基層13其自身可以 具有用于相同目的的營(yíng)養(yǎng)物。為此，過濾元件可以具有廣泛得多的材 料和孔徑選擇，以符合這個(gè)結(jié)構(gòu)要求和營(yíng)養(yǎng)物傳遞。
膜裝置14A對(duì)于所有實(shí)施方案的重要功能是轉(zhuǎn)移或提取位于多孔 性元件裝置14A上或放置在其上的另外的生長(zhǎng)培養(yǎng)基層13上的經(jīng)過 濾、捕獲或限制的細(xì)胞的功能24，其用于在指示物階段31中在改變 的多孔性/結(jié)構(gòu)元件14B上通過與指示物23相互作用后續(xù)處理捕獲或 阻斷的細(xì)胞或小菌落。轉(zhuǎn)移活細(xì)胞和小菌落同時(shí)維持其完整性的能力 使得細(xì)胞和小菌落的生長(zhǎng)和指示物階段能夠分開用于最佳結(jié)果用于快速細(xì)胞生長(zhǎng)而在其中無延緩生長(zhǎng)的有害指示物的生長(zhǎng)階段21，以及 用于有效允許快速檢測(cè)更小尺寸的小菌落的專用著色和鑒定的指示物 階段31。此外，如果細(xì)胞在早期階段以初始小菌落大小進(jìn)行評(píng)估，那 么因?yàn)樗鼈兛梢杂帽景l(fā)明有效檢測(cè)，所以連續(xù)稀釋是較不必要的。因 此，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的局限性，即基本上需要在連續(xù)稀釋以防 止菌落彼此過度生長(zhǎng)后來自例如經(jīng)由CHROMagar的延長(zhǎng)溫育的一般常 規(guī)大小菌落。
現(xiàn)在參考圖2A，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了在其上 具有多個(gè)膜204的瓊脂培養(yǎng)基203的容器202，用于樣品在單個(gè)容器 中的平行測(cè)試。容器202可以是用于容納營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基203的常規(guī)陪替 氏平板，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基203僅包含不會(huì)阻止或抑制微生物生長(zhǎng)的物 質(zhì)，以便促進(jìn)小菌落的不受抑制的生長(zhǎng)從而獲得測(cè)試的最快應(yīng)答時(shí)間。 培養(yǎng)基203的不同實(shí)施方案包括固體一般用途營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，或選擇性、 鑒別、液體或半固體培養(yǎng)基，或具有僅適度影響微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)的 培養(yǎng)基。
多孔元件204可以是允許樣品溶液和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基通過其的多孔元 件。多孔元件可以是膜、滲透膜、透析膜、或任何類型的現(xiàn)有過濾元 件，包括纖維素、有小孔的塑料材料等。所選擇的多孔元件204的具 體類型取決于是否將另外的培養(yǎng)基層放置在其上。多孔元件可以是透 明的、水可滲透的、以及對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和指示物質(zhì)可滲透的，但任選 對(duì)于微生物不可滲透。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多孔元件是具有一個(gè)或 多個(gè)下述特征的滲透膜可高壓滅菌、親水、非熒光、無色、對(duì)分泌 的細(xì)胞酶具有抗性，并且具有在1000-10、道爾頓(Da)范圍內(nèi)的常 規(guī)或非常規(guī)孔。多孔元件材料可以選自再生纖維素、玻璃紙、銅紡、 透析膜和具有合適大小的孔且符合本文提及的其他性質(zhì)的其他材料。 已知透析膜對(duì)于一定大小的物質(zhì)/分子例如培養(yǎng)微生物所需的營(yíng)養(yǎng)物 是高度可滲透的。透析膜的孔可以在l，OOO到數(shù)十萬Da (道爾頓)范 圍內(nèi)。大尺寸的孔允許許多物質(zhì)通過膜轉(zhuǎn)移。然而，具有長(zhǎng)分子的聚 合物例如在微生物固體培養(yǎng)基中使用的半乳糖瓊脂中的半乳糖聚合物無法滲透透析膜。實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)膜置于固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基之上時(shí)，微生物 可以在透析膜的表面上生長(zhǎng)，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物容易滲透通過膜以使細(xì)胞生 長(zhǎng)。在固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的表面上或裝入瓊脂層內(nèi)的透析膜允許將在其 表面上出現(xiàn)的菌落或小菌落轉(zhuǎn)移至充滿指示物質(zhì)的另一個(gè)表面。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，多孔元件可以是主要提供結(jié)構(gòu)和液體傳遞 功能而非細(xì)胞捕獲或阻斷功能的廣泛多樣的常規(guī)過濾元件，所述細(xì)胞 捕獲或阻斷功能通過如由圖1的第一個(gè)實(shí)施方案單獨(dú)提供的在過濾元 件之上的另外的培養(yǎng)基層執(zhí)行。
現(xiàn)在參考圖2B，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了揭示空 間關(guān)系的培養(yǎng)基和多孔元件的多個(gè)實(shí)施方案的橫截面視圖200。橫截 面A-A舉例說明簡(jiǎn)單放置在固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基206A之上的多孔元件 204A,其允許容易地從固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基206A上的生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)移，但可
能降低來自樣品的細(xì)胞平均應(yīng)用到多孔元件的頂部表面上。相比之下， 備選實(shí)施方案橫截面A-A'提供了在固定營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的頂層中的腔 210，其具有足以允許多孔元件204B從零凹陷到固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基表面 下的某個(gè)額定值208 (例如O. 1-5謹(jǐn))的深度，從而提供其中可以有 把握地在受控表面區(qū)域中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行吸取和涂布的淺孔。腔210可以 這樣通過具有腔的形狀的熱元件形成通過使液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基圍繞具 有腔的形狀的臨時(shí)間隔物成形，所述臨時(shí)間隔物在培養(yǎng)基固化后去除。 橫截面B-B提供了其中放置固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的第一個(gè)部分、隨后固化、 隨后放置多孔元件204C、隨后放置以層深度212覆蓋多孔元件的營(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基的第二個(gè)層206C(在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的第一個(gè)和第二個(gè)層206B和C 之間留下不可見的接縫界面214)的實(shí)施方案。本發(fā)明適合于將多孔 元件放置在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基之上或之內(nèi)的廣泛多樣的方法和操作。
現(xiàn)在參考圖3，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了通過使 用培養(yǎng)基和可轉(zhuǎn)移的多孔元件檢測(cè)小菌落的細(xì)胞檢測(cè)試劑盒300的組 分和步驟的圖示。在從生長(zhǎng)階段321中的包含生長(zhǎng)培養(yǎng)基的容器202 中取出后，將多孔元件204D-1轉(zhuǎn)移至在指示物階段331中的具有指示 物質(zhì)的次級(jí)培養(yǎng)基302，其潛在改變多孔元件204D-2上的細(xì)胞和小菌落。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用2個(gè)或更多指示物步驟，以滿足用于指 示所需細(xì)胞或小菌落的方案，例如第二個(gè)指示物步驟使用培養(yǎng)基303, 其進(jìn)一步轉(zhuǎn)移指示物質(zhì)，以潛在修飾在多孔元件204D-3上的細(xì)胞或小 菌落。次級(jí)培養(yǎng)基選自瓊脂糖、角叉菜膠、明膠和能夠成為具有釋 放指示物分子的能力的載體的凝膠。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試試劑 盒系統(tǒng)在溶劑水、緩沖液、氯化鈉溶液或液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中提供約 0. 1%-10%的凝膠濃度。用于小菌落的指示物可以是生色底物、熒光 底物、或熒光或放射性標(biāo)記的抗體。例如，次級(jí)培養(yǎng)基可以是充滿瘞 峻藍(lán)(methyl tiazoltetrazolium bromide) (MTT)的純瓊月旨，其可以 使小菌落顯示深紫色。未著色的小菌落/細(xì)胞在顯微鏡中基本上看不 見。許多其他物質(zhì)可以用于檢測(cè)和區(qū)分微生物，包括對(duì)細(xì)胞有毒且限 制生長(zhǎng)的那些。許多快速和簡(jiǎn)單的檢測(cè)和鑒定方法可以轉(zhuǎn)變成與這種 方法一起4吏用。
在用指示物材料和方法處理后，可以視覺上觀察且計(jì)數(shù)具有適當(dāng) 著色的小菌落322A和322B的最終的多孔元件204D-5,例如在光學(xué)顯 微鏡下或使用具有放大功能的自動(dòng)化硬件和軟件圖像鑒定、識(shí)別和計(jì) 數(shù)系統(tǒng)。任選的格柵324通過印刷制造或通過刻痕或蝕刻幾何地形成， 從而提供用于求出與計(jì)數(shù)的表面積的比的方便的計(jì)數(shù)參照或度量，以 得到最終的小菌落總數(shù)。
在備選測(cè)定法中，菌落和小菌落可以用由熒光染料標(biāo)記的抗體鑒 定。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種測(cè)定法可以通過4吏用BioNanoChannel ("BNC")檢測(cè)裝置330作為抗體的載體來實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，抗體在 納米通道內(nèi)的液體溶液中提供，在其上放置具有菌落的多孔元件。BNC 的頂部提供對(duì)多孔元件204D-4的支持，以維持現(xiàn)有菌落的完整性和粘 著性，同時(shí)分開地允許抗體大分子在納米通道中漂浮，且傳遞給緊在 開放通道頂部上的多孔元件204D-4上的任何菌落。多孔膜具有足夠大 的孔例如T6 Da或更大，或孔對(duì)于希望轉(zhuǎn)移給菌落的特異性抗體合適。 當(dāng)抗體與其接觸時(shí)，僅合適的菌落(抗原)產(chǎn)生反應(yīng)。通過將多孔元 件轉(zhuǎn)移至具有不含熒光分子的溶劑或緩沖液的另一個(gè)BNC —次或多次，可以去除在多孔元件上存在的過量的標(biāo)記抗體。相比之下，大抗 體分子在瓊脂或凝膠中將不具有移動(dòng)性，因?yàn)樗鼈兊拇蟪叽鐚⒆璧K其 移動(dòng)。此外，將多孔元件直接放置在具有抗體的液體培養(yǎng)基的開放容 器上將不能維持菌落的完整性，因?yàn)槟⒂梢后w飽和、淹沒或沖洗， 從而溶解菌落且使菌落脫位。因此，使用本公開內(nèi)容的可轉(zhuǎn)移多孔膜
結(jié)合提供對(duì)多孔膜的支持和用于標(biāo)記抗體的遞送機(jī)制的BNC平板，提 供了克服現(xiàn)有技術(shù)局限性的非常有效的解決方案。
BNC是包含大量一個(gè)或兩個(gè)末端開放的圓柱狀和平行微通道的平 板，所述微通道具有約1-30 inm的微通道直徑和約100-1000 iim的 長(zhǎng)度和約100， 000-1， 000， 000的微通道數(shù)目/平方厘米(直徑/長(zhǎng)度 =1/10-1/100)。 BioNanoChannel儀器和方法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)和描述在 Sergey Gazenko的共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/109, 857中提 供，所述申請(qǐng)的名稱為 "Device For Rapid Detection And Identification Of Single Microorganisms Without Preliminary Growth",所述申請(qǐng)通過引用整體合并入本文。
現(xiàn)在參考圖4，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了在其上 具有多個(gè)多孔元件的瓊脂培養(yǎng)基容器中的培養(yǎng)物連同分開的次級(jí)培養(yǎng) 基(用于著色)的注釋圖400。具有多個(gè)多孔元件例如204E和在其上 的培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的陪替氏平板容器202A舉例說明了在生長(zhǎng)階 段421中的小菌落的成功生長(zhǎng)，以及多孔元件的澄清度和多孔元件 204F容易轉(zhuǎn)移至在指示物階段431中在其中具有次級(jí)指示培養(yǎng)基的容 器302，所述指示物明確顯示變黑的小菌落，所述小菌落在僅營(yíng)養(yǎng)物 的培養(yǎng)基容器202A的指示物階段中難以檢測(cè)。
現(xiàn)在參考圖5A到5H，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了 使用可轉(zhuǎn)移的多孔元件和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的芽孢桿菌屬的幾個(gè) 不同物種的顯微照片。
現(xiàn)在參考圖6，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了使用可 轉(zhuǎn)移的多孔元件和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的來自利斯特氏菌屬的物種 的顯微照片?，F(xiàn)在參考圖7,根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了使用可 轉(zhuǎn)移的多孔元件和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的來自葡萄球菌屬的物種的 顯微照片。
現(xiàn)在參考圖8，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了使用可 轉(zhuǎn)移的多孔元件和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的來自埃希氏菌屬的物種的 顯微照片。
現(xiàn)在參考圖9，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了使用可 轉(zhuǎn)移的多孔元件和分開的次級(jí)培養(yǎng)基鑒定的來自假單胞菌屬的物種的 顯微照片。
現(xiàn)在參考圖10，根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案，顯示了用于檢 測(cè)和鑒定菌落包括小菌落和常規(guī)菌落的方法的流程圖1000。首先，步 驟1002提供了具有放置在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的表面之上或之下的多孔元件 的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基容器，如圖2B中所示。隨后，在步驟1004中，將液體 樣品傾入或吸取到容器內(nèi)的多孔元件上的區(qū)域中。樣品可以作為涂布 平板的樣品處理以涂布整個(gè)陪替氏平板，或其可以僅集中在多孔元件 上，例如如橫截面A-A'中所示，其中多孔元件204B凹陷入腔210內(nèi)， 從而限制樣品使之僅暴露于多孔元件204B。然后在步驟1006中，微 生物捕獲或阻斷在多孔元件中，或備選地在多孔元件之上的另外的培 養(yǎng)基層上，后者示于圖2B的橫截面B-B中。步驟1008提供了溫育以 發(fā)展小菌落，其比用于常規(guī)大小菌落的一般現(xiàn)有技術(shù)溫育短得多，然
而后者是本公開內(nèi)容的另一個(gè)實(shí)施方案。在后續(xù)步驟1010中，將多孔 元件和在其上的任何培養(yǎng)基從具有營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的容器轉(zhuǎn)移到具有指示
物的另一種培養(yǎng)基，以就微生物檢測(cè)和/或鑒定進(jìn)行測(cè)定。在步驟1012 中，調(diào)查決定是否需要另外的指示物步驟。如果需要(其為通常情況)， 那么重復(fù)步驟IOIO，但很可能使用新的或互補(bǔ)指示物試劑。另外，步 驟1014提供了檢查菌落的形狀或顏色的最終步驟以檢測(cè)、鑒定或計(jì)數(shù) 合適的小菌落。 實(shí)施例
活微生物總數(shù)目(TVO)的檢測(cè)是全世界最需要的實(shí)驗(yàn)室操作之一。它顯示食物、生物技術(shù)、環(huán)境和其他工業(yè)中微生物污染的存在和水平。
常規(guī)TVO這樣完成在緩沖液、液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或0. 9%NaCl溶液中 進(jìn)行樣品的幾次(3-12次)10倍稀釋，然后將1毫升每種稀釋物涂布 在充滿合適的營(yíng)養(yǎng)瓊脂的常規(guī)陪替氏平板的表面上。平板在32-37。C 溫育24-48小時(shí)。這之后，從培養(yǎng)箱中取出平板且計(jì)數(shù)菌落。這個(gè)操 作需要3-12個(gè)管用于稀釋，3-12個(gè)陪替氏平板和長(zhǎng)期溫育。結(jié)果僅 在24-48小時(shí)后出現(xiàn)。這個(gè)簡(jiǎn)單操作每年在全世界重復(fù)億萬次。本文 描述的本公開內(nèi)容的方法更快速(3-6小時(shí))，不需要10倍稀釋，并 且僅需要具有預(yù)安裝的膜的i-2個(gè)平板。膜的安裝通過將幾個(gè)圓形、 滅菌的U21。C, 15分鐘)透析膜(孔徑12, 000- 18, 000 Da)放置在 于陪替氏平板中固化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂的表面上來完成。也可以利用具有不 同孔徑的其他膜或玻璃紙膜。具有膜的平板的整個(gè)表面隨后由熱的 (80-90。C )固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基覆蓋l-2秒；傾出在1-2秒后未固化的過 量培養(yǎng)基。這意味著所有膜將由薄(O. 1-0. 2 mm)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基層覆蓋。 上層具有與下層培養(yǎng)基的自由交換，這意味著除聚合物瓊脂糖外所有 水和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以在2層之間轉(zhuǎn)移。
根據(jù)本發(fā)明的操作如下將1毫升樣品轉(zhuǎn)移且涂布在具有安裝的 膜的陪替氏平板的表面上(圖2)。來自樣品的液體吸收至培養(yǎng)基中， 溫育平板，并且活細(xì)胞(如果有的話)開始生長(zhǎng)且形成小菌落。實(shí)驗(yàn) 顯示所有研究的細(xì)菌在35-37。C在5小時(shí)內(nèi)形成小菌落。這些小菌落 由數(shù)十到數(shù)百個(gè)未著色和基本上看不見的細(xì)胞組成。為了使它們著色， 使用無菌鑷子將膜從平板剝離,并且轉(zhuǎn)移至次級(jí)培養(yǎng)基。才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方 法，次級(jí)培養(yǎng)基是在0. 15M磷酸緩沖液，pH7. 5中的具有0.7 mg/ml 濃度的生色底物3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-3，5-二苯基四唑溴的1% 純瓊脂糖。這種略微黃色的底物在與活細(xì)胞的脫氫酶反應(yīng)后，具有變 成深紫色的能力。這種物質(zhì)具有改變所有已知好氧和厭氧細(xì)菌和酵母 的顏色的能力，因?yàn)樗c微生物的電子傳遞鏈的最后一個(gè)步驟反應(yīng)。 換言之，它不阻斷呼吸鏈的開始或中間部分(這可以導(dǎo)致細(xì)胞早期死 亡)。因此，顏色產(chǎn)物以高濃度收集在細(xì)胞間體的表面上(脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)的位置)，賦予細(xì)胞體深紫色或黑色。使小菌落顯色所需的時(shí)
間一般在30-40。C下在10-20分鐘的范圍內(nèi)。這個(gè)時(shí)間足以使底物分 子游離，并且允許它們通過擴(kuò)散滲透膜和固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基薄層，且與 脫氫酶反應(yīng)。在反應(yīng)完成后，將具有次級(jí)培養(yǎng)基和有色小菌落的平板 移到光學(xué)顯微鏡下，并且計(jì)數(shù)小菌落。小菌落的大小和形狀可以是用 于物種區(qū)分的另外特征(圖5. 1-5. 8)。
這種方法僅需要5-6小時(shí)和比現(xiàn)有技術(shù)方法少得多的材料和操 作。必須指出的是，呈現(xiàn)的例子不需要眾多的IO倍稀釋，在極高濃度 的情況下僅需要1-2次稀釋。因?yàn)樾【涞南鄬?duì)小的尺寸，這個(gè)方便 性是可能的樣品中的細(xì)胞濃度可以是數(shù)百萬/毫升，但所有小菌落將 分開生長(zhǎng)而不重疊，因?yàn)橐粋€(gè)小菌落的尺寸平方比常規(guī)菌落的尺寸平 方小數(shù)千倍。
熒光實(shí)施方案
在本方法中使用的膜由為非熒光和透明材料的再生纖維素制成。 然而，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基其自身包含高度熒光的物質(zhì)。這限制了在多孔元件 或膜上的薄層營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的使用，如在一個(gè)實(shí)施方案中描述的。在這 種情況下推薦的膜是100， 000 Da透析膜。這種膜中相對(duì)大的孔徑允許 小菌落的良好生長(zhǎng)，甚至無需在其上的薄層培養(yǎng)基。濕度的增強(qiáng)在這 個(gè)實(shí)施方案中也是有用的，因?yàn)樗a(chǎn)生更有利的條件(微小氣候 (microclimate))用于小菌落形成。在生長(zhǎng)5-6小時(shí)后，取出膜至充 滿一種或多種熒光底物的次級(jí)培養(yǎng)基。對(duì)于TVO檢測(cè)，使用在0.1 mg/mL丙酮中的4-甲基傘形酮磷酸酯和乙酸4-甲基傘形酯的新鮮制備 的混合物。在將包含小菌落的膜固定在其上之前，將這種混合物傾倒 在次級(jí)培養(yǎng)基(在蒸餾水中的1%瓊脂糖)表面上數(shù)分鐘。溫育在 35-40。C下進(jìn)行10-15分鐘。所有小菌落獲得在熒光顯微鏡中非常明顯 的藍(lán)色熒光，因?yàn)樗褂玫牡孜锘旌衔锱c在所有活細(xì)胞中存在的大量 磷酸酶和酯酶反應(yīng)。光透明的、非熒光的膜允許使用廉價(jià)的熒光顯微 鏡，其具有從底部指向頂部的激發(fā)UV (例如波長(zhǎng)350-380 nm)光，然 而也可以使用昂貴的落射熒光(epi-fluorescent)顯微鏡。免疫熒光實(shí)施方案；鑒定
微生物通過用熒光染料(FITC、熒光素、羅丹明(Rodaraine)或其他) 標(biāo)記的抗體的鑒定可以通過使用多孔元件或膜來執(zhí)行，且無需在其上 的固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基層。用作抗體的免疫球蛋白是極大的蛋白質(zhì)分子復(fù) 合物。例如，常用的免疫球蛋白G (IgG)約150，000 Da。此種大復(fù)合 物必須能夠通過膜且與細(xì)胞的表達(dá)的表面抗原反應(yīng)(抗原-抗體相互作 用)。因此膜孔徑很大，例如1(T6 Da或更大。
為了執(zhí)行該方法，將包含不同物種(包括靶物種)的活細(xì)胞的樣 品涂布在膜的表面上。液體滲入瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)，并且平板在 35-37。C下在高度濕潤(rùn)的條件下溫育5-6小時(shí)，以便形成小菌落。這之 后，將在其表面上具有小菌落的膜置于充滿溶液的BioNanoChannel 平板上，所述溶液包含與靶微生物互補(bǔ)的標(biāo)記抗體(例如IgG-FITC)。 標(biāo)記抗體分子自由漂浮在納米通道內(nèi)，每個(gè)納米通道具有10 UM的直 徑和500 juM的長(zhǎng)度。約2. 5百萬個(gè)納米通道覆蓋具有25 mm直徑的 BioNanoChannel平板。因此，具有抗體的溶液;故"捕獲"在樣t小玻璃 通道的大量集合內(nèi)。這對(duì)于防止?jié)駶?rùn)區(qū)域具有過量液體是重要的，所 述過量液體可以溶解小菌落且使靶細(xì)胞與其他物種的細(xì)胞混合。 BioNanoChannel平板的使用也是重要的，因?yàn)樗试S大IgG分子自由 漫游，而其他實(shí)施方案(用于小分子的那些)中使用的瓊脂糖將不能 從其聚合結(jié)構(gòu)中釋放IgG。
標(biāo)記的IgG分子通過擴(kuò)散到達(dá)所有小菌落且與靶抗原反應(yīng)。這個(gè) 過程在室溫下可以花費(fèi)0.5-1.0小時(shí)。通過將膜置于充滿洗滌溶液 (PBS， pH 7. 5)的另 一塊BioNanoChannerM平板上10-20分鐘可以去除 未反應(yīng)的分子。這之后，將具有標(biāo)記和未標(biāo)記(熒光和無或弱熒光) 的小菌落的膜置于熒光顯微鏡下，并且檢測(cè)和計(jì)數(shù)熒光(耙)小菌落。
檢測(cè)、鑒定和/或小菌落形狀識(shí)別可以由操作者使用目測(cè)方法或通 過使用圖像鑒別器來完成。目前使用的不同種類的圖像鑒別器基于 CCD照相機(jī)和計(jì)算機(jī)圖像鑒定程序，并且與顯微鏡和計(jì)算機(jī)組合以形 成和分析圖像。小菌落的鑒定可以通過使用顯微操作器進(jìn)行改善，所述顯微操作
器取出通過形狀或熒光選擇的小菌落，隨后小菌落通過PCR或其他合 適方法進(jìn)行鑒定。小菌落的取出可以通過不同方法來完成。然而，小 菌落通過PCR的鑒定不意味著給定小菌落的特別取出是必需的，因?yàn)?PCR方法允許在其他物種的背景DNA中識(shí)別耙生物體的DNA。
不同孔徑和其他性質(zhì)的膜對(duì)于病毒學(xué)有用，特別是當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物 用于病毒的生長(zhǎng)和檢測(cè)(通過細(xì)胞層中的洞)的情況下。
凈化性質(zhì)
流行病后的室內(nèi)環(huán)境的凈化，具有致命疾病的人員的存在，或恐 怖分子或外來軍事生物攻擊對(duì)于一般微生物學(xué)家來說都是非常重要的 困境。在凈化后存活細(xì)胞的存在和量限定進(jìn)一步使用經(jīng)凈化的設(shè)施的 可能性。這種分析必須在極短時(shí)間內(nèi)完成，特別是當(dāng)涉及重要的公共 使用設(shè)施(機(jī)場(chǎng)、政府或軍事設(shè)施、或具有高公眾接近和重要性的其 他場(chǎng)所)時(shí)。在這個(gè)環(huán)境下必須檢測(cè)僅活/存活細(xì)胞。并且已知僅實(shí)際 的細(xì)胞生長(zhǎng)是檢測(cè)活微生物的最可靠方法。常規(guī)生長(zhǎng)花費(fèi)24-48小時(shí) 或更多來產(chǎn)生菌落。本發(fā)明允許在5-6小時(shí)中得到相同結(jié)果，且廉價(jià) 得多，并且需要少得多的手工處理；從而意味著可以分析大量樣品。 例如，如果區(qū)域被炭疽芽孢桿菌(&"7/i/5" a/ ^ rac/5")孢子污染， 并且凈化殺死所有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和孢子，那么僅芽孢桿菌屬的孢子可以存 活。由于不同原因，梭菌屬(Clostridium )、放線菌屬(Act inomycetes ) 和真菌(Fungi)的孢子不能在用于炭疽芽孢桿菌的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因 此，在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的唯一芽孢桿菌屬物種是炭疽芽孢桿菌。TSA 可以在這種情況下使用。將來自設(shè)施的不同部分的液體樣品置于TSA 上，其中在薄層TSA上具有膜。在37。C下溫育5小時(shí)后，將具有可能 的小菌落的膜轉(zhuǎn)移至具有3-(4， 5-二曱基噻唑基-2)-3， 5-二苯基四唑 溴的平板(在PBS pH 7. 5中的1%純瓊脂糖)。在10-20分鐘內(nèi)，特 定形狀的強(qiáng)烈著色的小菌落可以從其他芽孢桿菌屬物種中識(shí)別(例如， 圖5.4顯示看起來象枯草芽孢桿菌球形變異(勘C27/m w6〃/" g/o6/口7)的那種，其已知在炭疽芽孢桿菌研究中作為模型)。這些小菌落可以取出且通過快速PCR( 1 - 1.5小時(shí))進(jìn)行分析，用于證實(shí) 炭疽芽孢桿菌的殘留凈化。因此設(shè)施的繼續(xù)使用的許可可以在6-8小 時(shí)而不是24-48或更多小時(shí)后給予。 抗生素抗性微生物的檢測(cè)
在人樣品中和作為醫(yī)院內(nèi)感染的抗生素抗性微生物的檢測(cè)(金黃 色葡萄球菌(57a/7力y/0cocc^ ai/rezAj)、銅綠假單胞菌(/^e油/z/,51 se考/",)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(J/由/e/7a組7鏡)和其他)是 快速增長(zhǎng)的醫(yī)學(xué)問題。受感染的人的生命強(qiáng)烈依賴抗生素抗性菌抹的 快速診斷。在抗生素的存在下菌落的生長(zhǎng)和產(chǎn)生是在抗生素抗性菌林 的診斷中廣泛使用的唯一可靠的方法。目前需要24小時(shí)以發(fā)現(xiàn)在具有 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和抗生素的平板(CHROMagar， MRSA或其他)上的生長(zhǎng)/菌 落。將這種分析限制于6-8小時(shí)每年可以挽救全世界數(shù)萬條生命。例 如，用于快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的一般方法如下將推測(cè)包含抗生 素抗性金黃色葡萄球菌的樣品(血液或環(huán)境)涂布在具有安裝的膜的 由曱氧西林(MRSA培養(yǎng)基)填充的平板上。5-6小時(shí)后，將膜轉(zhuǎn)移至 具有瓊脂糖和生色底物的平板。10-15分鐘后，所有小菌落獲得深紫 色并且變得可見。特定形狀的小菌落(圖7)識(shí)別為抗生素抗性金黃 色葡萄球菌。
大腸桿菌(E. coli)的快速檢測(cè)
食物和環(huán)境樣品中大腸桿菌的存在已知是糞便污染的可靠特征。 僅活細(xì)胞對(duì)于獲得計(jì)數(shù)結(jié)果是重要的；免疫學(xué)和PCR方法在這種情況 下無效。形成菌落的能力是活大腸桿菌的最可靠特征。對(duì)于大腸桿菌 的生長(zhǎng)和檢測(cè)，MacConkey瓊脂廣泛用于革蘭氏陰性、乳糖陽性微生 物。備選地，CIRCLEGROW⑧培養(yǎng)基用于大腸桿菌的快速生長(zhǎng)。還可以
使用LB瓊脂。所有這些培養(yǎng)基適合于大腸桿菌以及樣品中存在的某些 其他微生物的小菌落的生長(zhǎng)。安裝在培養(yǎng)基表面上的多孔元件或膜必 須不具有在頂部上的薄層瓊脂培養(yǎng)基，并且必須具有合適的孔徑例如 50， 000-100， 000 Da。大腸桿菌在37。C下溫育4-6小時(shí)后形成良好可 見的小菌落(圖8)。溫育期后，將包含大腸桿菌和其他物種的小菌落的膜轉(zhuǎn)移至由4-甲基傘形基-p-D-吡喃半乳糖苷(在35%乙醇中 0.1 mg/ml)填充的BioNanoChannel平板。溫育5-10分鐘后，大腸 桿菌的小菌落在焚光顯微鏡下在激發(fā)UV 350-380 nm處獲得亮藍(lán)色熒 光。其他小菌落保持無色。 備選實(shí)施方案
本說明書可應(yīng)用于廣泛多樣的應(yīng)用中，并且不限于本公開內(nèi)容中 描述的任何具體類型的測(cè)定、培養(yǎng)基、濾器、膜或微生物。鑒于本文 描述的實(shí)施方案，已顯示本公開內(nèi)容提供克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性的方 法和儀器，所述局限性例如眾多的連續(xù)稀釋、大量時(shí)間和實(shí)驗(yàn)室資源 消耗以及弱結(jié)果。
例如，本^Hf內(nèi)容的方面可以適合于檢測(cè)在薄層原核或真核細(xì)胞 上生長(zhǎng)且在病毒繁殖處的表面上產(chǎn)生清晰的洞的病毒。在這種情況下， 顯色可以是完整且不被病毒感染的著色的細(xì)胞，和小的清晰的空隙或 噬斑，其中細(xì)胞被病毒感染且分解，無活細(xì)胞著色。
已呈現(xiàn)本公開內(nèi)容的具體實(shí)施方案的前述說明，用于舉例說明和 描述的目的。它們不意欲是詳盡的或使本發(fā)明限制于所公開的精確形 式。自然地，根據(jù)前述教導(dǎo)，許多修飾和變化是可能的。選擇和描述 實(shí)施方案，以便最佳地解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本 領(lǐng)域技術(shù)人員能夠最佳地利用本發(fā)明和具有適合于預(yù)期的具體用途的 各種修飾的各種實(shí)施方案。本發(fā)明的范圍意欲由附加于其的權(quán)利要求
及其等價(jià)物限定。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)、鑒定或計(jì)數(shù)微生物的裝置，所述裝置包含用于提供營(yíng)養(yǎng)物以維持微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基容器；與所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基接觸的多孔元件，其中所述多孔元件允許營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基通過其以維持細(xì)胞生長(zhǎng)，所述多孔元件可從所述容器轉(zhuǎn)移用于經(jīng)由指示物或目視檢查的后續(xù)處理，并且所述多孔元件是透明的、水可滲透的、并且對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和指示物質(zhì)是可滲透的。
2. 權(quán)利要求l中所述的裝置，其中所述多孔元件是對(duì)于微生物不 可滲透，但可高壓滅菌、親水、非熒光、無色、且對(duì)分泌的細(xì)胞酶具 有抗性的滲透膜。
3. 權(quán)利要求l中所述的裝置，其中所述培養(yǎng)基僅包含不會(huì)阻止或 抑制微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)，并且其中所述培養(yǎng)基是固體一般用途營(yíng)養(yǎng)培 養(yǎng)基或選擇性或鑒別培養(yǎng)基。
4. 權(quán)利要求l中所述的裝置，其中所述多孔元件放置在所述容器 中的培養(yǎng)基上，并且在其上具有或不具有另外的培養(yǎng)基層。
5. 權(quán)利要求l中所述的裝置，其中所述多孔元件選自再生纖維 素、玻璃紙、銅紡和透析膜。
6. 權(quán)利要求1中所述的裝置，其中所述多孔元件是具有在 1000-107 Da范圍內(nèi)的常規(guī)或非常規(guī)孔的滲透膜。
7. 權(quán)利要求1中所述的裝置，其中所述培養(yǎng)基為固體、半固體或 液體狀態(tài)，并且其中所述多孔元件使?fàn)I養(yǎng)物從所述培養(yǎng)基傳遞至位于 所述多孔元件上方或之上的微生物。
8. 權(quán)利要求l中所述的裝置，其進(jìn)一步包含平行排列的放置在培養(yǎng)基之上或之中的多個(gè)多孔元件，用于平行 測(cè)試。
9. 用于檢測(cè)、鑒定或計(jì)數(shù)^:生物的測(cè)試試劑盒系統(tǒng)，所述裝置包含用于維持微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的容器；與所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基接觸的多孔元件，其中所述多孔元件用于支持 在所述多孔元件上或在所述多孔元件之上的培養(yǎng)基上的菌落，并且用于將菌落轉(zhuǎn)移至后續(xù)指示物處理步驟，所述多孔元件是透明的、水可滲透的、并且對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和指示物質(zhì)是可滲透的；和充當(dāng)釋放指示物分子以使菌落著色的載體的次級(jí)培養(yǎng)基。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的測(cè)試試劑盒系統(tǒng)，其中所述次級(jí)培養(yǎng)基選 自瓊脂糖、角叉菜膠、明膠和能夠傳遞的凝膠，并且其中所述凝膠 的濃度可以是在溶劑水、緩沖液、氯化鈉溶液或液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中約 0. 1%- 10%。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9的測(cè)試試劑盒系統(tǒng)，其中用于小菌落的指示 物可以是生色底物、熒光底物、或者熒光或放射性標(biāo)記的抗體。
12. 用于檢測(cè)、鑒定或計(jì)數(shù)微生物的方法，所述方法包括下述步驟提供具有多孔元件的培養(yǎng)基容器，所述多孔元件放置在所述培養(yǎng) 基之上或在所述培養(yǎng)基的頂部表面下，其中所述培養(yǎng)基具有營(yíng)養(yǎng)物以維持微生物生長(zhǎng)；將液體樣品傾入所述容器中的多孔元件上的區(qū)域中； 使微生物捕獲在所述過濾元件中或在所述多孔元件上方的培養(yǎng)基上；溫育所述容器；將所述多孔元件以及任何在其上的培養(yǎng)基從所述容器轉(zhuǎn)移至具有 指示物的次級(jí)培養(yǎng)基，以評(píng)估其中的微生物；將所述多孔元件從所述次級(jí)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至用于檢測(cè)和鑒定細(xì)胞的 裝置；和檢查菌落的形狀以檢測(cè)、鑒定或計(jì)數(shù)微生物。
13. 權(quán)利要求12中所述的方法，其中所述檢查步驟手工或用自動(dòng) 化圖像鑒定和識(shí)別系統(tǒng)來執(zhí)行。
14. 權(quán)利要求12中所述的方法，其進(jìn)一步包含下述步驟 檢測(cè)活小菌落的總數(shù)目(TV0)。
15. 權(quán)利要求12中所述的方法，其中所述用于檢測(cè)和鑒定細(xì)胞的 裝置是顯微鏡或自動(dòng)化圖像檢測(cè)系統(tǒng)。
16. 權(quán)利要求12中所述的方法，其中所述次級(jí)培養(yǎng)基包含指示物 質(zhì)以幫助鑒定在所述多孔元件上的微生物。
17. 權(quán)利要求12中所述的方法，其中所述多孔元件捕獲不可過濾 或可過濾的樣 品。
18. 制造用于微生物的檢測(cè)裝置的方法，所述方法包括下述步驟 提供培養(yǎng)基容器；將多孔元件放置在所述容器中的培養(yǎng)基上；和將另外的液體培養(yǎng)基傾倒在所述多孔元件上和所述容器中的培養(yǎng) 基的頂部表面上，其中所述容器中的培養(yǎng)基或所述另外的液體培養(yǎng)基 具有營(yíng)養(yǎng)物以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。
19. 權(quán)利要求18中所述的方法，其進(jìn)一步包括下述步驟 在所述培養(yǎng)基的頂部表面中產(chǎn)生腔，以接受過濾元件， 將所述過濾元件插入所述腔內(nèi)，從而使得所述過濾元件的頂部表面與所述培養(yǎng)基的頂部表面持平或低于所述培養(yǎng)基的頂部表面；和將在其上不具有任何培養(yǎng)基的過濾元件放置到所述腔內(nèi)，從而使 得所述不具有任何培養(yǎng)基的過濾元件大約低于頂部表面。
20. 權(quán)利要求19中所述的方法，其中產(chǎn)生腔的步驟包括下述步驟將間隔物放置在所述培養(yǎng)基之上；將液體培養(yǎng)基傾倒在所述間隔物上和所述培養(yǎng)基容器的頂部表面 上，以形成頂部表面；允許所述液體培養(yǎng)基至少部分固化，以便提供在所述間隔物上的 薄層培養(yǎng)基；和取出所述間隔物連同在所述間隔物上的薄層培養(yǎng)基，以在所述培 養(yǎng)基中產(chǎn)生腔。
全文摘要
本發(fā)明描述了在固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上安裝的光透明的、分子可滲透的膜上的常規(guī)或短(數(shù)小時(shí))生長(zhǎng)期后，微生物的菌落或小菌落的快速檢測(cè)和鑒定。在膜上出現(xiàn)的菌落或小菌落可以容易地從生長(zhǎng)平板轉(zhuǎn)移至另一種培養(yǎng)基，例如充滿指示物質(zhì)或底物的純瓊脂或紙。可過濾和不可過濾的樣品可以通過這種方法進(jìn)行分析。許多不同的檢測(cè)和鑒定方法可以使用本發(fā)明以小菌落形式實(shí)現(xiàn)所有活細(xì)胞或特定活細(xì)胞的檢測(cè)和計(jì)數(shù)；抗生素抗性微生物的檢測(cè)和同時(shí)鑒定；不同的免疫學(xué)檢測(cè)方法；使用機(jī)器分析例如自動(dòng)化圖像鑒別器的檢測(cè)和計(jì)數(shù)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101641448SQ200880009395
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2008年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日
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