專利名稱：：豬肝酯酶的同工型的制作方法豬肝酯酶的同工型本發(fā)明涉及豬肝酯酶的同工型CyPLE)，涉及含有其運載體以及涉及其在對映異構(gòu)體富集的醇和酯的生產(chǎn)中的應(yīng)用。脂肪酶和酯酶可以用作有效的生物催化劑以制備各種各樣的光學(xué)活性化合物。然而，雖然許多脂肪酶、特別是那些源于微生物的脂肪酶可以商購，但是僅極少的酯酶可以工業(yè)規(guī)模數(shù)量用于外消旋物的拆分[Bornscheuer，U.T.andKazlauskasR丄，HydrolasesinOrganicSynthesis(2005)，2nded,Wiley誦VCH，Weinheim]。由于豬肝酯酶在有機(jī)合成中的令人感興趣的催化性質(zhì)，本發(fā)明特別關(guān)注于其[Faber,K.,BiotransformationsinOrganicChemistry(2004)，5thed.Springer,Berlin;Jones,J.B.PureAppl.Chem,(1990),62，1445-1448,Jonesetal.Can.J.Chem.(1985),63，452-456;Lam,L,K,P.et.al.，J.Org.Chem,(1986),51,2047-2050)。盡管已經(jīng)證實來自豬肝組織的酯酶提取物可以以良好立體選擇性部分轉(zhuǎn)化底物，但是這種提取物的應(yīng)用仍具有許多缺點。除了不同批次之間酯酶比例的波動之外，關(guān)于立體選擇性的特殊問題可以認(rèn)為是存在進(jìn)一步的水解酶(Seebach,D.et.al,25Chimia(1986),40，315-318)。另外的問題是常規(guī)的提取物由多種同工酶組成(Farb，D.,et.al，Arch.Biochem.Biophys.(1980)203,214-226)，在一些情況中它們的底物特異性明顯不同。Heymann,E.andJunge,W.(Eur.J.Biochem.(1979)，95，509-518;Eur.J.Biochem.(1979),95，519-525)進(jìn)行了復(fù)雜的電泳分離術(shù)，從而分離了優(yōu)選裂解丁酰膽堿、脯氨酸-P-萘胺和丁酸甲酯的級分。相反，其它研究(例如Lam，L.K.P.,etal,J.Am.Chem.Soc.(1988)110,4409-4411)僅示出具有不同活性但是無不同特異性的各個級分。盡管對推定的豬肝酯酶基因的克隆已知有一段時間了(Takahashi,T，et.al.,J.Biol.Chem.(1989),264,11565-11571;FEBSLett,(1991)，280,297-300;FEBSLett.(1991),293,37-41;David,L.et.al,Eur,J.Biochem.(1998)257，142-148)，但是活性豬肝酯酶的功能性重組表達(dá)先前僅在畢赤酵母(Pichiapastoris)(Lange，S.etal"ChemBioChem(2001),2,576-582)和大腸桿菌(E.coli)(DE10061864)中描述。另外有文獻(xiàn)描述了在大腸桿菌表達(dá)期間向培養(yǎng)基中添加物質(zhì)。向培養(yǎng)基中加入直至3。/。(v/v)的乙醇誘導(dǎo)內(nèi)源大腸桿菌伴侶蛋白的形成，這是有助于折疊過程并且通常支持正確折疊的酶(Thomas,JQProteinExpressionandPurif(1997),11,289-296)。然而，向培養(yǎng)基中加入3M(v/v)乙醇，豬肝酯酶在大腸桿菌Origami中的表達(dá)產(chǎn)生在大腸桿菌中不可檢測的活性酯酶表達(dá)，但僅是內(nèi)含體。DE10061864提議特定伴侶蛋白與"/PLE的共表達(dá)。以這種方式首次可以從大腸桿菌中產(chǎn)生活性yple。總而言之，可以說盡管天然豬肝酯酶從大腸桿菌中表達(dá)是可能的，但是仍未在工業(yè)規(guī)模確立。因此改良豬肝酯酶的(底物席性對于另外獲得改良的系統(tǒng)是有益且必要的，該系統(tǒng)可優(yōu)選在工業(yè)規(guī)模用于化學(xué)中間體的生物合成制備框架中。因此，本發(fā)明的一個目的是相對于現(xiàn)有技術(shù)改良的新酯酶。本發(fā)明目的在于提供具有改良的活性和域選擇性和域穩(wěn)定性的新酯酶。這些酯酶應(yīng)優(yōu)于現(xiàn)有那些酯酶，特別是在空間/時間產(chǎn)率和在轉(zhuǎn)化期間的對映體選擇性(enantioselectivivty)以及改變或者擴(kuò)展的底物特異性方面。這個目的根據(jù)權(quán)利要求書所述實現(xiàn)。本發(fā)明提供了Seq.IDNo.2所示酯酶，其具有選自如下一組的至少一個突變位置氧基酸94E96I97A，G98G101108R113I114P150V154s155T159160A255F257A258G306P307F308A311315P323T480A482F484R其令人驚奇地產(chǎn)生了滿足所述目的的種類(spedes)。更特別地，在這些位點的突變可以修飾和改良天然yple的底物特異性、對映體選擇性和/或活性。在此所述位置自然是指Seq.IDNo.2的第一個氨基酸。本發(fā)明優(yōu)選Seq.IDNo.4、6、8和10所示酯酶。這些酯酶具有優(yōu)于天然YPLE的活性和/或選擇性和/或穩(wěn)定性。本發(fā)明的酯酶特別在活性、對映體選擇性及其它底物特異性方面尤為突出。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明酯酶的分離的核酸。優(yōu)選的核酸序列是Seq.IDNo.3、5、7和9所示那些序列或者其互補形式。另一方面，本發(fā)明涉及具有本發(fā)明的一或多個核酸的基因、重組表達(dá)系統(tǒng)(例如微生物)或者重組質(zhì)粒/載體。表達(dá)系統(tǒng)是指重組表達(dá)本發(fā)明的核酸且從而重組產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的系統(tǒng)。所述產(chǎn)生優(yōu)選在用相應(yīng)的核酸序列或載體(見下文所述)轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的微生物或者其它宿主中發(fā)生(根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"是同義詞，可互換使用)。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染可以根據(jù)已知方法進(jìn)行，例如通過磷酸鈣共沉淀、脂染、電穿？L、PEG/DMSO方法、粒子轟擊或者病毒/噬菌體感染。本發(fā)明的細(xì)胞可含有染色體外或者染色體整合形式的重組核酸。換句話說轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化可以是穩(wěn)定的或者瞬時的。轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化方案為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知(ChanandCohen.1979.HighFrequencyTransformationofBacillussubtilisProtoplastsbyPlasmidDNA.MolGenGenet.168(1》111-5;Kieseretal,2000.PracticalStreptomycesGenetics.TheJohnInnesFoundationNorwich;Sambrooketal..1989.MolecularCloning.ALaboratoryManual,In:seconded..ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor.NY.;IraniandRowe.1997.EnhancementoftransformationinPseudomonasaeruginosaPAOlbyMg2+andheat.Biotechniques22:54-56;Balbas,P.andBolivar,R(1990),DesignandconstructionofexpressionplasmidvectorsinE.coli,MethodsEnzymol.185，14-37;Rodriguez,R丄.andDenhardt，D.T(eds)(1988),Vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,205-225,Butterworth,Stoneham)。對于一般程序而言(PCR、克隆、表達(dá)等)，可參考如下的文獻(xiàn)和其中引文UniversalGenomeWalkerKitUserManual,Clontech,3/2000;TrigliaT.;Peterson,M.G.andKemp，D丄(1988)，AprocedureforinvitroamplificationofDNAsegmentsthatlieoutsidetheboundariesofknownsequences,NucleicAcidsRes.16,8186。宿主優(yōu)選是原核生物來源的重組微生物。合適的宿主細(xì)胞包括單細(xì)胞微生物的細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞。對此可以提及的微生物是原核生物如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。可用于表達(dá)本發(fā)明核酸序列的其它細(xì)菌是乳桿菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)、紅球菌(Rhodococus)、彎曲桿菌(Campylobacter)、柄桿菌(Caulobacter)、分枝桿菌(Mycobacterium)、鏈霉菌(Streptomyces)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、Ralstonia、假單胞菌(Pseudomonas)和農(nóng)桿菌(Agrobacterium)屬/種的夷|1些細(xì)菌。為此目的優(yōu)選使用大腸桿菌菌株。特別優(yōu)選的是大腸桿菌XL1Blue、NM522、JMIOI、JM109、JM105、RR1、DH5a、TOP10-、HBIOI、BL21codonplus、BL21(DE3)codonplus、BL21、Rosetta、Rosetta-gami、MM294、W3110、DSM14459(EP1444367)、Origami。相應(yīng)的菌株可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得并且至少部分可從國際保藏機(jī)構(gòu)如ATCC或DMSZ獲得。也可以應(yīng)用真核生物例如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或者植物細(xì)胞或者例如酵母如多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)、畢赤酵母屬(Pichiasp.)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或者真菌如曲霉(Aspergillussp.)重組產(chǎn)生所述多肽。合適的真核細(xì)胞包括CHO細(xì)胞、HeLa細(xì)胞等等。許多這些細(xì)胞可以從保藏機(jī)構(gòu)如ATCC或者DMSZ獲得。本發(fā)明的多肽也可以在非人宿主中重組制備。所述非人宿主可以是細(xì)胞或者多細(xì)胞生物體。合適的多細(xì)胞生物體包括分子生物學(xué)領(lǐng)域熟知的模型系統(tǒng)，如黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、斑馬魚或者線蟲(Celegans)。轉(zhuǎn)基因非人動物可以通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人動物可優(yōu)選具有不同的遺傳結(jié)構(gòu)。其可以(i)組成型或者可誘導(dǎo)地過表達(dá)本發(fā)明核酸序列的基因，(ii)含有失活形式的本發(fā)明核酸序列的內(nèi)源基因，(iii)含有本發(fā)明核酸序列的突變基因，該基因完全或者部分置換了本發(fā)明核酸序列的內(nèi)源基因，(iv)具有本發(fā)明核酸序列的基因的條件性和組織特異性過表達(dá)或者低表達(dá)，或者(v)具有本發(fā)明核酸序列的基因的條件性和組織特異性敲除。所述轉(zhuǎn)基因動物優(yōu)選另外含有在使其過表達(dá)的啟動子控制下的本發(fā)明核酸序列的外源基因?；蛘撸景l(fā)明核酸序列的內(nèi)源基因可以通過激活和/或置換內(nèi)源啟動子而被過表達(dá)。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸序列的基因的內(nèi)源啟動子具有使得所述基因表達(dá)增加的遺傳修飾。所述內(nèi)源啟動子的遺傳修飾包含個別堿基的突變以及缺失和插入突變。在本發(fā)明宿主的特別優(yōu)選的實施方案中，所述宿主是轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因大鼠或者轉(zhuǎn)基因綿羊、轉(zhuǎn)基因牛、轉(zhuǎn)基因山羊或者轉(zhuǎn)基因豬。小鼠具有優(yōu)于其他動物的許多優(yōu)勢。它們易于飼養(yǎng)且其生理學(xué)被認(rèn)為是人類的模型系統(tǒng)。這種遺傳操作動物的產(chǎn)生為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知且可以通過常規(guī)方法進(jìn)行(見例如Hogan，B.,Beddington,R.，Costantini,F.andLacy,E.(1994)，ManipulatingtheMouse-Embryo;ALaboratoryManual,2ndedition.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY;WO91/08216)?；蛘呋虼送猓部梢詫⒓?xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)特別是人細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)用于本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因動物。本發(fā)明另一方面涉及具有本發(fā)明核酸的完整基因?；蚋鶕?jù)本發(fā)明是指在分子水平的節(jié)段，其主要可以由兩個不同區(qū)域組成從中通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈RNA拷貝的DNA節(jié)段，，參與調(diào)解這個拷貝過程的所有其它DNA節(jié)段。更詳細(xì)的描述可見于http:〃de.wikipedia.org/wiki/Gen。編碼核酸序列可以克隆進(jìn)常規(guī)質(zhì)粒/載體中，在用這種載體轉(zhuǎn)染微生物或者其它宿主細(xì)胞之后在細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得為此目的合適質(zhì)?；蜉d體。這種質(zhì)粒和載體可見于例如Studier及其同事(Studier，W.F.;RosenbergA.H.;DunnJ.J.;DubendroffJ.W.;,UseoftheT7RNApolymerasetodirectexpressionofclonedgenes，MethodsEnzymol.1990,185，61誦89)或者Novagen,Promega，NewEnglandBiolabs,Clontech或GibcoBRL的手冊。其它優(yōu)選的質(zhì)粒和載體可見于Glover，D.M.(1985),DNAcloning:apracticalapproach,Vol.I-III,IRLPressLtd.,Oxford;Rodriguez,R丄.andDenhardt,D.T(eds)(1988),Vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,179-204,Butterworth,Stoneham;Goeddel，D.V"Systemsforheterologousgeneexpression,MethodsEnzymol.1990，185，3-7;Sambrook,J.;Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)，Molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork?？捎糜趯⒈景l(fā)明核酸序列或者含有其的基因構(gòu)建體以非常優(yōu)選的方式克隆進(jìn)宿主生物體的質(zhì)粒是pUC18(RocheBiochemicals)、pKK-177-3H(RocheBiochemicals)、pBTac2(RocheBiochemicals)、pKK223畫3(AmershamPharmaciaBiotech)、pKK-233-3(Stratagene)或者pET(Novagen)。對于大腸桿菌而言合適的載體例如是pET-21a(+)，但是也可以使用用于原核單細(xì)胞生物體的其它表達(dá)載體以及用于真核生物的載體。證實適于酵母的載體的例子是pREP載體和pINT載體。例如已經(jīng)揭示了桿狀病毒載體如EP127839或EP549721中所述那些載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，以及例如SV40載體適于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)且可常規(guī)獲得。特別優(yōu)選的是用于單細(xì)胞真核生物體的載體，特別是pET載體，用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，特別是大腸桿菌Origami。在特別優(yōu)選的實施方案中，已經(jīng)導(dǎo)入載體中的本發(fā)明的核酸序列另外與所述載體提供的組氨酸標(biāo)記融合。優(yōu)選將導(dǎo)入的核酸序列克隆進(jìn)優(yōu)選的pET載體中，由此轉(zhuǎn)錄處于所述載體中存在的IPTG-可調(diào)節(jié)啟動子控制下。或者，也優(yōu)選應(yīng)用鼠李糖可調(diào)節(jié)啟動子。除了常規(guī)的標(biāo)記如抗生素抗性基因之外，所述載體可含有進(jìn)一步的功能性核苷酸序列以調(diào)節(jié)特別是抑制或誘導(dǎo)ADH基因和/或報道基因的表達(dá)。例如優(yōu)選利用可調(diào)節(jié)弱啟動子如rha啟動子或者nmtl啟動子，或者可調(diào)節(jié)強(qiáng)啟動子如lac、ara、lambda、pL、T7或T3-啟動子。編碼DNA片段必須可以從載體中的啟動子轉(zhuǎn)錄。已確立的啟動子的其他例子是在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒多角體蛋白啟動子(見例如EP127839)和早期SV40啟動子，以及LTR啟動子，例如MMTV啟動子(MouseMammaryTumourVirus;Leeetal,(1981)Nature,294(5838),228-232)。因此，本發(fā)明的基因、載體/質(zhì)?？珊羞M(jìn)一步的功能性序列區(qū)，例如復(fù)制起點、操縱基因或者終止信號。在特別有利的實施方案中，本發(fā)明涉及重組微生物，其中除了本發(fā)明的核酸序列之外，其還含有一或多個克隆的伴侶基因。優(yōu)選的合適伴侶是GroEL和GroES，特別是在大腸桿菌Origami菌株中。令人驚奇地，盡管其它可選伴侶系統(tǒng)例如通過加入乙醇誘導(dǎo)的內(nèi)源大腸桿菌伴侶或者其它共表達(dá)的伴侶如DnaK、DnaJ和GrpE未成功(DE10061864)，但是所述活性酶的表達(dá)在存在這兩個折疊輔助蛋白的條件下實現(xiàn)。令本領(lǐng)域技術(shù)人員驚奇的是伴侶系統(tǒng)Dnak、DnaJ、GrpE和GroEL、GroES相當(dāng)共表達(dá)或者單獨GroEL或GroES與豬肝酯酶在大腸桿菌中的共表達(dá)僅導(dǎo)致內(nèi)含體形式的表達(dá)，且在大腸桿菌細(xì)胞粗提物中無可檢測的活性。因此在任何情況中優(yōu)選的是伴侶系統(tǒng)GroEL/GroES，是優(yōu)選的誘導(dǎo)/表達(dá)系統(tǒng)，即使宿主生物體中同時存在其它伴侶系統(tǒng)。真核蛋白在大腸桿菌中的功能性表達(dá)是一種強(qiáng)挑戰(zhàn)，特別是在如果所述蛋白是翻譯后糖基化蛋白質(zhì)的情況中。在豬肝酯酶在大腸桿菌中重組表達(dá)的情況中，特定伴侶系統(tǒng)GroEL、GraES的使用顯然抵償翻譯后糖基化的缺乏。關(guān)于此方面的發(fā)展和實施方案可參見DEI02006031600所述。另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明(重組)多肽在制備對映異構(gòu)體富集的醇、羧酸和酯中的應(yīng)用，特別是從上述化合物的內(nèi)消旋形式例如任選取代的二羧酸酯如丙二酸二酯進(jìn)行制備?？梢允褂霉潭ɑ问降拿?SharmaB.R;BaileyL.F.andMessingR.A.(1982),ImmobilisierteBiomaterialien-TechnikenundAnwendungen[Immobilizedbiomaterials畫Techniquesandapplications],Angew.Chem.94,836-852)。固定化可以通過凍干法便利地實現(xiàn)(Paradkar，V.M.;Dordick，J.S.(1994),Aqueous-LikeActivityofa-ChymotrypsinDissolvedinNearlyAnhydrousOrganicSolvents,J.Am.Chem.Soc.116,5009-5010;Mori,T.;Okahata，Y.(1997),Avarietyoflipi-coatedglycosidehydrolasesaseffectiveglycosyltransfercatalystsinhomogeneousorganicsolvents,TetrahedronLett.38,1971-1974;Otamiri,M.;Adlercreutz,R;Matthiasson,B.(1992),Complexformationbetweenchymotrypsinandethylcelluloseasameanstosolubilizetheenzymeinactiveformintoluene,Biocatalysis6,291-305)。特另lj優(yōu)選的是在存在表面活性劑的條件下凍干，所述表面活性劑如AerosolOT或者聚乙烯吡咯垸酮或者聚乙二醇(PEG)或者Brij52(二乙二醇單十六垸基醚)(Kamiya，N.;Okazaki,S.畫Y.;Goto,M.(1997),Surfactant-horseradishperoxidasecomplexcatalyticallyactiveinanhydrousbenzene,Biotechnol.Tech.11,375-378)。最優(yōu)選的是固定化于Eupergit,特別是EupergitC⑧和Eupergit250L(R6hm)(參見E.Katchalski-Katzir,D.M.Kraemer，J.Mol.Catal.B:Enzym.2000，10，157)。也優(yōu)選組合由附著His標(biāo)記(六組氨酸)修飾的多肽固定于Ni-NTA(Petty,K.J.(1996)，Metal-chelateaffinitychromatographyIn:Ausubel,RM.etal.eds.CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.2,NewYork:JohnWileyandSons)。使用CLEC也是可行的(St.Clair,N.;Wang，Y.-F.;Margolin,A.L.(2000)，Angew.Chem.Int.Ed.39，380-383)。這些措施可以從有機(jī)溶劑不穩(wěn)定的(重組)多肽成功產(chǎn)生可以在水性和有機(jī)溶劑混合物中或者完全于有機(jī)溶劑中起作用的多肽。優(yōu)選如下所述使用本發(fā)明的多肽轉(zhuǎn)化酯或者羧酸和醇。將多肽以希望的形式(游離的、固定化的、于宿主生物體中或者隨機(jī)破壞形式)加入適當(dāng)培養(yǎng)基中，優(yōu)選水溶液中。向這個混合物中加入底物，同時保持最佳溫度范圍和最佳pH范圍。在完成轉(zhuǎn)化之后，獲得的醇或者酯可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從反應(yīng)混合物中分離(結(jié)晶、提取、層析)。利用酯酶將酯或者羧酸和醇經(jīng)酶促轉(zhuǎn)化為對映異構(gòu)體富集的醇、羧酸和酯的原理為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知(見在文中開始處引用的參考文獻(xiàn)；圖示2)。特別感興趣的是前述衍生物的內(nèi)消旋形式的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化是有益的，其中對映異構(gòu)體富集的產(chǎn)物可獲得100%收率，而外消旋化合物的正常拆分僅可產(chǎn)生至多50%的特定對映異構(gòu)體。因此，例如使用特定取代的丙二酸二酯可以產(chǎn)生對映異構(gòu)體富集的產(chǎn)物，其是化學(xué)合成中的重要中間體。以此方式可以有效且容易地產(chǎn)生任選N保護(hù)的氨基丙二酸二酯，即相應(yīng)的對映異構(gòu)體富集的不對稱氨基羧酸單酯。下圖示1所示反應(yīng)順序也是感興趣的。圖示lR，OC)CPLE'COOF^1.酰胺化2.Cl降解R，OOC,100%收率R，OOCCOOH理論100%收率對于該反應(yīng)合適的基團(tuán)可見于下文列出。酰胺化和Cl降解的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知(Organikum,VEBDeutscherVerlagderWissenschaften，Berlin1986,pp.388ff，pp.571ff)。圖示2:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>本領(lǐng)域技術(shù)人員也熟知可以從相應(yīng)手性酯中根據(jù)I.或者VI.制備的或者可用于制備對映異構(gòu)體富集的酯的對映異構(gòu)體富集的醇的例子。它們可以由如下通式概括示出-OHFTR,其中R、R，和R"彼此不同，特別是H，(CrQi)-烷基，(d-Cs)-烷氧基，HO-(CrCs)-垸基，(<:2-<:8)-烷氧基烷基,(CVd8)-芳基(C7-Cw)-芳烷基(Q-d8)-雜芳基(Crd9)-雜芳烷基，(d-C8)-垸基-(C6-d8)-芳基，(CrC8)-烷基-(C3-d8)-雜芳基(C3-C8)-環(huán)垸基，(CrC8)-烷基-(C3-Cs)-環(huán)烷基(C3-C8)-環(huán)垸基-(d-C8)-垸基或者R與R，和/或R與R"禾口/或R，與R"形成(CVC5)-亞烷基橋(alkylenebridge)。對映異構(gòu)體富集的酯或酸的例子可以為如下通式所示，其中R、R'和R"彼此相同或不同，特別是，H,(CrCs)-垸基，(d-Cs)-垸氧基，HO-(d-C8)-垸基，((32-(:8)-垸氧基垸基，(C6-C,8)-芳基(C7-C!9)-芳烷基，(C3-ds)-雜芳基，(Crd9)-雜芳垸基，(CrC8)-垸基-(C6-C!8)-芳基，(CrCs)-烷基-(C3-d8)-雜芳基(C3-Q)-環(huán)烷基(CrC8)-烷基-(C3-C8)-環(huán)垸基，(C3-C8)-環(huán)烷基-(d-C8)-烷基或者R與R'或者R與R"或者R，與R"形成(C3-C5)-亞垸基橋，以及R。R2和R3彼此不同，特別是，H，(C廠C8)-垸基，(d-C8)-烷氧基，HO-(C廣C8)-烷基，(CVC8)-垸氧基烷基，環(huán)戊二烯基，(C6-C,8)-芳基，(C7-d9)-芳烷基，(C3-ds)-雜芳基，(CVd9)-雜芳烷基，(CrCs)-垸基-(C6-d8)-芳基，(d-C8)-垸基-(C3-C,8)-雜芳基，(CrQ)-環(huán)垸基，(CrC8)-垸基-(C3-C8)-環(huán)垸基，(C3-C8)-環(huán)烷基-(d-C8)-垸基或者與R2和/或與R3和/或R2與R3形成(CrC5)-亞垸基橋。適于本發(fā)明使用的是適當(dāng)緩沖的水性溶劑。然而，也可以使用pH-stat儀器[公司SchottAQMainz,Germany,brandTitroLinealpha]進(jìn)行反應(yīng)。優(yōu)選在0°C至85°C之間、特別優(yōu)選在3(TC至80。C之間及最優(yōu)選在大約50°C溫度下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。技術(shù)人員也可以自由選擇反應(yīng)的pH，且反應(yīng)可以在固定PH以及pH區(qū)間內(nèi)不同的pH條件下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明目的的最佳反應(yīng)結(jié)果選擇pH。優(yōu)選在pH為pH5到9、優(yōu)選pH6到8及特別優(yōu)選pH6.5到7.5條件下進(jìn)行反應(yīng)。如上所述，所述多肽可以均質(zhì)純化的化合物的天然形式或者作為重組產(chǎn)生的酶而應(yīng)用。此外，(重組)多肽也可以用作完整客體(guest)生物體的成分或者與任何純度的宿主生物體的破壞的細(xì)胞量結(jié)合使用。如果使用的底物在細(xì)胞培養(yǎng)物中例如通過應(yīng)用合適宿主而被轉(zhuǎn)化為希望的產(chǎn)物，則根據(jù)使用的宿主生物體或者使用的細(xì)胞培養(yǎng)物而選用合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基。宿主細(xì)胞合適的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域已知且可以商購。此外，可以為細(xì)胞培養(yǎng)物補充常用的添加劑例如抗生素、生長促進(jìn)劑如血清(胎牛血清等)以及類似的已知補充劑。進(jìn)一步優(yōu)化的反應(yīng)條件可見于DE102006031600所述。本發(fā)明另一應(yīng)用涉及多肽的制備，所述多肽具有優(yōu)于SEQ.ID.NO:2多肽的改良的活性和減選擇性和域穩(wěn)定性，通過如下步驟制備i)誘變本發(fā)明的核酸，優(yōu)選誘變Seq.3、5、7、9所示核酸，ii)將可得自i)的核酸序列克隆進(jìn)合適載體中，隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的表達(dá)系統(tǒng)中，及iii)檢測并分離具有改良的活性和域選擇性和域穩(wěn)定性的所述多肽。通過誘變方法改良本發(fā)明的核酸序列或者由其編碼的多肽的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。合適的誘變方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員為此目的可利用的任何方法。特別是飽和誘變法、隨機(jī)誘變法、體外重組方法和定點誘變銜Eigen,M.andGardiner,W.，EvolutionarymolecularengineeringbasedonRNAreplication,PureAppl.Chem.1984,56，967-978;Chen,K.andArnold,F.，Enzymeengineeringfornonaqueoussolvents:randommutagenesistoenhanceactivityofsubtilisinEinpolarorganicmedia.Bio/Technology1991，9,1073-1077;Horwitz,M.andLoeb,L.，PromotersSelectedFromRandomDNA-Sequences,ProcNatlAcadSciUSA83,1986，7405-7409;Dube,D.andL.Loeb，MutantsGeneratedByTheInsertionOfRandomOligonucleotidesIntoTheActive-SiteOfTheBeta-LactamaseGene,Biochemistry1989,28，5703-5707;Stemmer,P.C.，RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling,Nature1994，370，389-391andStemmer,P.C.,DNAshufflingbyrandomfragmentationandreassembly:Invitrorecombinationformolecularevolution.ProcNatlAcadSciUSA91，1994，10747-10751)。通過下文所述方法(參見下文)將獲得的新核酸序列克隆進(jìn)宿主生物體中，使用合適的篩選方法檢測以此方式表達(dá)的多肽并隨后分離。合適的檢測方法是對于這種多肽產(chǎn)生的分子在原則上任何可能的檢測反應(yīng)。對于產(chǎn)生或消耗的NADH特別適合的檢測方法是光量測定法，適合檢測由這種酶產(chǎn)生的醇的是HPLC或者GC方法。此外，通過凝膠電泳或者通過抗體的檢測方法也適于檢測已經(jīng)通過遺傳工程方法修飾的新多肽。光學(xué)富集的(Opticallyenriched)(對映異構(gòu)體富集的)化合物對于本發(fā)明是指在具有另一對映體的混合物中一種光學(xué)對映體的存在>50mol%。術(shù)語核酸序列是指所有種類的單鏈或者雙鏈DNA以及RNA或者其混合物。因此，本發(fā)明的核酸序列可以是DNA分子或者RNA分子。優(yōu)選所述核酸分子是cDNA分子或者mRNA分子。根據(jù)本發(fā)明，所述DNA分子也可以是基因組DNA分子。本發(fā)明進(jìn)一步包含其中所述DNA分子是PNA分子或者DNA分子的另一衍生物的實施方案。本發(fā)明所用術(shù)語"互補"是指互補性延伸至本發(fā)明核酸分子的整個區(qū)域，無任何缺口。換句話說，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的是延伸至本發(fā)明核酸序列整個區(qū)域即從5'末端至3，末端的100%互補性。根據(jù)本發(fā)明，改良的活性和/或選擇性和/或穩(wěn)定性是指所述多肽更具活性和/或更具選擇性，和/或在使用的反應(yīng)條件下更加穩(wěn)定。雖然酶的活性和穩(wěn)定性自然應(yīng)盡可能地高以適于工業(yè)應(yīng)用，但是關(guān)于選擇性的改良是指這樣的情況，即所述酶的底物選擇性降低但是對映體選擇性增加。這也同樣適用于本發(fā)明的所述表達(dá)，沒有實質(zhì)降低。對于本發(fā)明請求保護(hù)的蛋白質(zhì)序列和核酸序列，本發(fā)明還包含與任何這些序列任一具有高于97%、優(yōu)選高于97.5%、98°/?；蛘?8.5°/。、更優(yōu)選高于99%或99.5%同源性(除天然簡并之外)的那些序列，只要這個序列保留其功能性或者效用即可。如本文所用，術(shù)語"同源性"(或者相同性)可以由等式H(。/。)-[l-V/X]X100定義，其中H是指同源性，X是對比序列的核苷酸堿基/氨基酸總數(shù)，V是基于對比序列被認(rèn)為不同的核苷酸堿基/氨基酸的數(shù)目。在任何情況中，術(shù)語編碼多肽的核酸序列包括根據(jù)遺傳密碼的簡并性而看起來可能存在的任何序列。本文所用術(shù)語"在嚴(yán)格條件下"的含義如Sambrooketal.(Sambrook,J.;Fritsch,E.F.andManiatis，T.(1989),Molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)所述。優(yōu)選i也，如果在用1XSSC(150mM氯化鈉、15mM擰檬酸鈉，pH7.0)和0.1%SDS(十二垸基硫酸鈉)在50°C、優(yōu)選在55°C、更優(yōu)選在62。C以及最優(yōu)選在68°C洗滌1小時之后，更優(yōu)選用0.2XSSC和0.1。/oSDS在50。C、更優(yōu)選在55。C、尤為優(yōu)選在62。C以及最優(yōu)選在68°C洗滌1小時之后，陽性雜交信號仍可觀測到，則根據(jù)本發(fā)明認(rèn)為雜交是嚴(yán)格的。(CrC8)-垸基可以是甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基或辛基，以及任何其結(jié)合異構(gòu)體。根據(jù)本發(fā)明的定義范圍，(CVC2o)-烷基是具有1直至20個碳原子的相應(yīng)基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的定義范圍，(C3-C2o)-烷基是具有3直至20個碳原子的相應(yīng)基團(tuán)。((VC8)-烷氧基相應(yīng)于(d-C8)-烷基，條件是前者通過氧原子結(jié)合。(C2-Q)-垸氧基垸基是指其中烷基鏈被至少一個氧官能團(tuán)中斷，兩個氧原子彼此連接是不可能的。碳原子的數(shù)目表示該基團(tuán)中含有的碳原子的總數(shù)。(C3-Cs)-亞烷基橋是具有3到5個碳原子的碳鏈，該鏈通過兩個不同碳原子與相關(guān)分子結(jié)合。上述基團(tuán)可以由卣素和域(d-C8)-烷氧基羰基和/或含有N-、O-、P-、S-、Si-原子的基團(tuán)單或多取代。后者特別是上述種類的垸基，其鏈具有一或多個所述雜原子或者其通過這些雜原子之一與分子結(jié)合。(C3-C8)-環(huán)垸基是指環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)庚基等。這些可以由一或多個鹵素和/或含有N-、O-、P-、S-、Si-原子的基團(tuán)取代，和/或在其環(huán)中可具有N、O、P、S原子，例如l-，2-，3-,4-哌啶基，l-，2-,3-吡咯垸基，2-，3-四氫呋喃基，2-,3-,4-嗎啉基。(C3-Q)-環(huán)烷基-(d-C8)-烷基是指如上述環(huán)烷基，其通過如上述烷基與分子結(jié)合。對于本發(fā)明，(CrC8)-烷氧基羰基是指如上述具有直至8個碳原子的烷基，其通過O(OO)官能團(tuán)結(jié)合。對于本發(fā)明，(d-C8)-酰氧基是指如上述具有直至8個碳原子的垸基，其通過(CK))O官能團(tuán)結(jié)合。對于本發(fā)明，(d-C8)-?；侵溉缟鲜鼍哂兄敝?個碳原子的烷基，其通過(C-O)官能團(tuán)結(jié)合。(C6-C,8)-芳基是指具有6到18個碳原子的芳基。更特別地，其包括這樣的化合物，如苯基、萘基、蒽基、菲基、聯(lián)苯基或者與所述分子退火的上述種類的系統(tǒng)，例如茚基系統(tǒng)，其可任選由(CrQ)-烷基、(d-C8)-烷氧基、(C2-Q)-烷氧基烷基、NH(d-C8)-垸基、N((C,-C8)-垸基)2、OH、0(CrC8)-垸基、N02、NH(C廣C8)-?；((d-Q)-?；?2、F、Cl、CF3、(d-Cs)陽?；?Q-C8)-酰氧基、(C7-C,9)-芳垸基、(Q-Q9)-雜芳烷基取代。(C7-d9)-芳垸基是通過(d-C8)-烷基與分子結(jié)合的(C6-C8)-芳基。在本發(fā)明范圍中，(C3-ds)-雜芳基是指具有3到18個碳原子的5、6或7元芳環(huán)系統(tǒng)，其環(huán)中具有雜原子例如N、O、或者S。這種雜芳族化合物被認(rèn)為特別是如l-,2國，3-呋喃基，如l-,2誦，3-吡咯基、l-,2-,3-噻吩基、2-,3-,4-吡啶基、2-，3-,4-,5-,6-，7-吲哚基、3-,4-，5-吡唑基、2陽，4-,5-咪唑基、吖啶基、喹啉基、菲啶基,2-，4-,5-，6-嘧啶基這樣的基團(tuán)。所述雜芳族化合物可以如上述(C6-d8)-芳基相同方式取代。(C4-d9)-雜芳垸基是指相應(yīng)于(C7-d9)-芳烷基的芳香雜環(huán)系統(tǒng)。合適的鹵素(Hal)是氟、氯、溴或者碘。術(shù)語水性溶劑是指水或者主要由水組成的溶劑混合物且含有可溶于水的有機(jī)溶劑，例如醇，特別是甲醇或乙醇，或者醚如THF或二氧雜環(huán)已垸，或者其它共溶劑如DMSO。本文中列舉的參考文獻(xiàn)被認(rèn)為也在本發(fā)明揭示范圍內(nèi)。序列表中示出的蛋白質(zhì)序列在C末端另外含有His標(biāo)記和接頭序列。代表活性yple的實際蛋白質(zhì)序列因此是序列表中所示序列，其在c末端截短21個氨基酸。對于編碼所述蛋白質(zhì)序列的核酸序列也如此。方法mRNA的分離與cDNA合成將新鮮豬肝組織(0.1g)用Trizol⑧試劑(TRIzo1⑧PlusRNAPurificationKit,Invitrogen,CA,USA)處理，均質(zhì)(在室溫進(jìn)行10分鐘；UltraturraxT25，IKA-Labortechnik)，并且根據(jù)廠商指導(dǎo)分離RNA。通過分光光度測定法確定RNA濃度。根據(jù)廠商的方案通過RT-PCR進(jìn)行cDNA合成，使用oligo(dT)15引物及具有RNaseH活性的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega,Madison,WI,USA)。PLE基因的擴(kuò)增與克隆將RT-PCR產(chǎn)物用于擴(kuò)增PLE基因，使用基于yPLE序列的兩個基因特異性引物具有以斜體字標(biāo)示的Ndel限制性裂解位點的(5'-CACCC4r，GGGCAGCCAGCCTCGC-3'(Seq.IDNo.ll)以及具有以斜體字標(biāo)示的Xhol限制性裂解位點的5'-CCGCrC04GTCACTTTATCTTGGGTGGCTTCTTTGC-3'(S叫IDNo.12);下劃線處是起始密碼子和終止密碼子)。正向引物在其5'末端還含有堿基CACC，隨后可以克隆進(jìn)TOPO載體中(見下文所述)。這些引物已經(jīng)除去了在原始豬基因的N末端附著的18個氨基酸信號序列，及4個氨基酸C末端ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))滯留信號，從而促進(jìn)隨后在大腸桿菌中的表達(dá)(Lange，S，et.al,，ChemBioChem(2001)，2，576-582)。在熱f盾環(huán)儀(TechneProgene，JepsonBoltonLaboratoryEquipment,"Watford,UnitedKingdom)上進(jìn)行PCR。根據(jù)廠商指導(dǎo)，所述PCR應(yīng)用PfbPlus聚合酶(Roboklon,Berlin,Germany)以及如下溫度程序在95°C變性5分鐘之后，進(jìn)行如下30次循環(huán)(在95°C1分鐘，在60°C1分鐘及在72°C3分鐘)，最后在72°C進(jìn)行7分鐘。根據(jù)廠商指導(dǎo)，將PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中分級分離，純化并克隆進(jìn)TOPO/pET101中(ChampionTMpETDirectionalTOPOExpressionKit;Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)。用該構(gòu)建體混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10細(xì)胞[FmcrAD(mrr-hsdRMSmcrBC)(F801acZDM15)DlacX74recAldeoRaraD139D(ara-leu)7697galUgalKrpsL(StrK)endAlnupG](Invitrogen)并在瓊脂平板上分離出。將以此方式獲得的重組單克隆單獨培養(yǎng)，分離質(zhì)粒DNA，通過大小測定法或者限制性作圖鑒別，并用作PLE序列的PCR擴(kuò)增模板。然后對擴(kuò)增的序列測序(MWG-Biotech，Martinsried,Germany)。表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建根據(jù)廠商方案，將各個TOPO/pET101-PLE構(gòu)建體的質(zhì)粒DNA用Ndel禾口Xhol消化(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA,USA;Promega,Madison,WI,USA)，將大小為大約1694bp的特定片段插入Ndel/XhoI-消化的、經(jīng)瓊脂糖凝膠純化的pET15b載體(Novagen,Madison，WI,USA)中，這樣為基因添加了額外的N末端His標(biāo)記。將該連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株(Novagen,Madison,WI,USA)[supE44AlacU169(①801acZAM15)hsdR17recAlendAlgyrA96thi-lrdA1]，并且通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的菌株增殖質(zhì)粒。從重組菌株中分離質(zhì)粒，再次測序檢驗。由此獲得的pET15b-PLE構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami(DE3)菌株[A(ara—leu)7697AlacX74AphoAPvuIIphoRaraD139ahpCgalEgalKrpsLF[lac+laclqpro](DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,StrR，TetR)4](Novagen，Madison,WI，USA)，該菌株先前已經(jīng)用pGro7質(zhì)粒(ChaperonePlasmidSet,TAKARABIOInc.,Otsu，Shiga,Japan)轉(zhuǎn)化，這樣使得伴侶蛋白GroEL+GroES表達(dá)。關(guān)于與伴侶蛋白復(fù)合物GmEL/ES共表達(dá)而表達(dá)豬肝酯酶的詳細(xì)描述見B6ttcher,D,,BrUsehaber，E.，Doderer.K.,Bornscheuer,U.T.(2007)，F(xiàn)unctionalexpressionofthegamma-isoenzymeofpiglivercarboxylesteraseinEscherichiacoli，Appl.Microbiol.Biotechnol.，(2007)，73(6)，1282-1289。重組PLE同工酶在大腸桿菌Origami中的表達(dá)與GroEL/ES伴侶蛋白復(fù)合物共表達(dá)將伴侶蛋白與PLE同工酶在含有20嗎/mL氯霉素和50pg/mL氨芐青霉素的150ml的LB培養(yǎng)基中共表達(dá)以進(jìn)行質(zhì)粒選擇。伴侶蛋白表達(dá)通過加入lmg/mLL-阿拉伯糖立即起始。在OD600=0.5通過加入40pMIPTG誘導(dǎo)PLE產(chǎn)生。24小時后通過離心取出細(xì)胞，將其再懸浮于10ml磷酸鈉緩沖液(50mM，pH7.5)中，使用超聲進(jìn)行破壞。細(xì)胞碎片通過離心除去，將上清用于進(jìn)一步實驗中(細(xì)胞粗提物)。根據(jù)Bradford或者使用pNPA測定法確定蛋白質(zhì)含量和酯酶活性。天然聚丙烯酰胺凝膠電泳及用快紅染料(FastRed)活性染色將含有重組產(chǎn)生的PLE的粗提物的混合物(5-15pL，相應(yīng)于pNPA分析的0.05-0.15U)與緩沖液(20。/。(w/v)甘油；在dH20中的0.0025%(w/v)溴酚藍(lán))(5-l(HiL)混合。將其等份在天然聚丙烯酰胺凝膠(7.5%)上分離。對于活性染色，將凝膠在新鮮制備的ot-乙酸萘酯與快紅染料混合物中保溫。在產(chǎn)生的a-萘酚與快紅染料之間紅色復(fù)合物的形成表示酯酶的水解活性(Krebs傷nger,N.，et.al,，(1998)EnzymeMicrob.Technol，22，641-646)。然后將該凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。酯酶活性在磷酸鈉緩沖液(50mM)中通過分光光度測定法確定酯酶活性，使用乙酸對硝基苯酯(10mM，溶解于二甲亞砜中)作為底物。在室溫在波長410nm(s=15*103cm")及pH7.5條件下確定產(chǎn)生的對硝基酚的量。1單位(U)定義為酶在分析條件下每分鐘能轉(zhuǎn)化liaM對硝基酚的量(Krebs傷nger，N.,et.al,，(1998)EnzymeMicrob.Technol,22，641-646)。酯酶底物特異性在恒定pH下分析。將已知量的酯酶在37°C加入含有酯底物(5Q/o(v/v);三丁酸甘油酯，乙酸乙酯，三油酸酯或者丁酸甲酯)和P可拉伯樹膠(2。/。(w/v))的乳狀液(20mL)中。在pHstatiometer(Schott，Mainz,Germany)中用O.OlNNaOH自動計數(shù)滴定釋放的酸以維持恒定pH為7.5。1單位(U)定義為酶在分析條件下每分鐘能產(chǎn)生lpM酸的量。仲醇的乙酸酯的酶促水解的立體選擇性(見DE10258327A1)在370C在熱混合器(thermomixer)(ThermomixercomfortEppendorf,Hamburg,Germany)中的1.5ml反應(yīng)容器中進(jìn)行水解。0.5U酯酶粗提物(基于pNPA測定)用于lml底物溶液(在pH7.5磷酸鈉緩沖液中l(wèi)OmM，50mM)。通過用二氯甲烷提取混合物而終止反應(yīng)，將有機(jī)相經(jīng)過無水硫酸鈉干燥。對映異構(gòu)體純度和轉(zhuǎn)化通過氣相層析確定。變體酶的對映體選擇性根據(jù)Chen等所述計算(CS.Chen,Y.Fujimoto,G.Girdaukas,C丄Sih，J.Am.Chem.Soc.1982，104，7294)。關(guān)于GC分析中底物合成及保留時間的詳細(xì)描述見Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer,U.T""SubstrateSpecificityoftheY國isoenzymeofrecombinantpigliveresterasetowardsacetatesofsecondaryalcohols"J.Mol.Catal.B.Enzym.2002，19-20，129-133所述。順式-3，5-二乙酰氧基環(huán)戊-l-烯(cis-3，5-diacetoxycyclopent-l-ene)的酶促水解的立體選擇性該實驗程序與仲醇外消旋物的拆分相同，使用在lml反應(yīng)混合物中的0.5單位(pNPA)的PLE粗提物，所述反應(yīng)混合物含有在pH7.550mM磷酸鈉緩沖液中的10mM底物。反應(yīng)在37。C進(jìn)行，在指定時間取樣。轉(zhuǎn)化和產(chǎn)物對映體過量通過氣相層析分析。該分析應(yīng)用在C-R5AChromatopac/IntegratorGC儀器(Shimadzu,Duisburg，Germany)中的Hydrodex-b-3P(heptakis-(2，6-di-0-methyl-3-0-pentyl-b-cyclodextrin)(25m，0.25mm))GC柱(MacheiyNagel,Diiren,Germany)。在110°C柱溫等溫級分的保留時間是順式-3，5-二乙酰氧基-環(huán)戊-l-烯21.8分鐘；3(S)-乙酰氧基-5(尺)-羥基-環(huán)戊-1-烯18.2分鐘；3(R)-乙酰氧基-5(S)-羥基-環(huán)戊-l-烯16.0分鐘。結(jié)果從豬肝中分離mRNA及RT-PCR分離的RNA的質(zhì)量在瓊脂糖凝膠上檢驗(圖未示出)，并通過分光光度測定法定量所述RNA(2.6pg/Vl);因此，從使用的O.lg組織中獲得260pg的RNA。在通過RT-PCR轉(zhuǎn)錄為cDNA之后，所述cDNA的質(zhì)量通過使用其作為模板擴(kuò)增管家基因p-肌動蛋白進(jìn)行檢驗。圖1示出所述cDNA使得卩-肌動蛋白基因擴(kuò)增，并且其質(zhì)量因此適于進(jìn)一步實驗。圖1:通過(3-肌動蛋白基因的擴(kuò)增進(jìn)行的cDNA質(zhì)量控制。模板泳道1:人cDNA(陽性對照)，泳道2:豬肝cDNA;泳道3:水(陰性對照)。PLE基因的擴(kuò)增與克隆所述cDNA用于使用基于yPLE序列的引物擴(kuò)增PLE基因。如圖2所示，在瓊脂糖凝膠中應(yīng)用PCR之后的反應(yīng)混合物產(chǎn)生大約1.7kbp的明顯條帶，相應(yīng)于yPLE的大小。切下這個條帶，分離DNA并且借助于通過正向引物附著的CACC突出端克隆進(jìn)TOPO載體中。在用這個構(gòu)建體混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO細(xì)胞之后獲得重組克隆。從這些克隆中分離質(zhì)粒DNA，通過限制性作圖檢驗并測序。圖2:從豬肝cDNA中擴(kuò)增PLE基因。泳道1:作為模板的cDNA;泳道2:lkbp標(biāo)記物；泳道3:作為模板的水(陰性對照)。測序結(jié)果對新PLE基因進(jìn)行測序表明獲得四個新的基因序列，其彼此互不相同且與？PLE不同。在圖3的氨基酸序列對比中示出與？PLE序列不同的位置。PLE及其因此存在的基因從1至5編號，PLE1相應(yīng)于先前揭示的Y-PLE。新PLE與已知，PLE的不同之處可概括如下PLE2:6個核苷酸取代(3個氨基酸取代)[同工酶4]PLE3:35個核苷酸取代(20個氨基酸取代)[同工酶24]PLE4:34個核苷酸取代(20個氨基酸取代)[同工酶39]PLE5:34個核苷酸取代(21個氨基酸取代)[同工酶41]圖3:發(fā)現(xiàn)的PLE:PLE2、3、4和5的氨基酸序列與^PLE(PLEl)序列的部分對比。蛋白質(zhì)的表達(dá)將發(fā)現(xiàn)的5個基因亞克隆進(jìn)pET15b載體中。用這些構(gòu)建體及用編碼兩個伴侶蛋白部分GroES和GroEL的pGro7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami。對于這個表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)描述了PLE在大腸桿菌中的成功過表達(dá)(DE10061864)。將該菌株小規(guī)模培養(yǎng)(50ml/150ml)，誘導(dǎo)伴侶分子和PLE構(gòu)建體的蛋白質(zhì)表達(dá)。此外，將YPLE與用pGm7而非pET載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Origami共培養(yǎng)以進(jìn)行對比，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。破壞上清(體積3ml/9ml)，通過離心獲得含有可溶細(xì)胞內(nèi)蛋白的粗提物并將其用于隨后的實驗中。所有粗提物中的蛋白質(zhì)含量為大約7-9mg/ml(其中形成的大部分蛋白質(zhì)相應(yīng)于伴侶蛋白)；根據(jù)培養(yǎng)物的大小，粗提物的最終體積為3或9ml。天然凝膠與快紅染料染色將所述粗提物應(yīng)用于天然凝膠，隨后將其在快紅溶液中保溫，a-乙酸萘酯作為底物，由此檢驗酯酶活性。隨后進(jìn)行考馬斯染色(圖4:PLE2、克隆12、PLE3、PLE4、PLE5、<yPLE和大腸桿菌OrigamipGro7野生型(陰性對照)的粗提物的天然PAGE。左側(cè)用(X-乙酸萘酯快紅染色；右側(cè)隨后的考馬斯亮藍(lán)染色)。用PLE2、PLE3、PLE4、PLE5和丫PLE可見活性酯酶條帶，奇怪的是其具有不同大小及非常重的成片條帶(smear)。這可能是由于方法所致，因為天然凝膠不能如變性SDS凝膠那樣清楚地運行；然而，也可能是一些粗提物含有三聚體和四聚體PLE構(gòu)建體，這兩種構(gòu)建體均是活性的?？寺?2未示出任何活性。同樣，正如所預(yù)期的，在無pET15b構(gòu)建體的大腸桿菌Origami粗提物中無可檢測的酯酶活性?？捡R斯染色中的蛋白質(zhì)條帶明確表明除了YPLE之外，許多伴侶蛋白過表達(dá)。通過Bradford確定的蛋白質(zhì)含量因此主要包含伴侶蛋白且不提供關(guān)于yPLE含量的任何信息。基于在快紅染色之后進(jìn)行的考馬斯染色不能精確評估過表達(dá)程度。與具有伴侶蛋白的野生型大腸桿菌對比，在活性條帶區(qū)域中無另外可見的蛋白質(zhì)條帶。然而，所述蛋白質(zhì)在活性染色之后通常不再被考馬斯染色。然而，這也可意味著過表達(dá)非常低，但是仍提供具有良好活性的蛋白質(zhì)。對乙酸對硝基苯酯的活性酯酶活性首先通過使用pNPA測定法檢驗。結(jié)果示于表1。表1:PLE變體和表達(dá)菌株(具有伴侶質(zhì)粒pGro7的大腸桿菌Origami)對pNPA的體積活性(U/ml)。所有酯酶均具有N末端His6標(biāo)記。_粗提物體積活性(U/ml)PLE1(Y孔E)11PLE28PLE321PLE426PLE540大腸桿菌Origami+0.02pGro7所有PLE均示出對pNPA的活性，一些新酯酶甚至比Y-PLE的高2-4倍。對非手性酯的活性新PLE變體對非手性酯的活性使用pHstat檢測。在酶純化后，確定比活性，結(jié)果示于表2。表2:新PLE和，PLE對一些非手性酯的比活性，通過在10分鐘的測量期間在pHstat在37°C和pH7.5確定。三丁酸甘油酯辛酸乙酯丁酸甲酯乙酸乙酯三油酸酉iPLE1(y孔E)3066357380PLE32246323248PLE41314476259PLE54091441821712仲醇的乙酸酯的外消旋物的拆分研究如下外消旋乙酸酯的水解:OAcOAc1234乙酸(艮S)-l-苯乙酸(KS)-l-苯乙酸(R^S)-l-苯乙酸(KS)小苯基基-l-丙酯基-乙酯基-2-丁酯-2-戊酯氣相層析研究產(chǎn)生的結(jié)果在表3到6中示出。商購PLE制品的數(shù)據(jù)得自A.Musidlowska(Musidlowska-Persson,A.andBornscheuer，U.T"J.Mol.Catal.B.Enzym.2002,19-20，129-133.)，加入該數(shù)據(jù)以進(jìn)行對比。表3:新PLE變體在1乙酸(尺5>1-苯基-1-丙酯的外消旋物的動力學(xué)拆分中的對映體選擇性。("FlukaPLE禾卩ChirazymeE2的數(shù)據(jù)得自Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer,U.T.，J.Mol.Catal.B.Enzym.2002，19-20，129-133。PLE同工酶時間[h]對映體過量[%ees][%eeP]轉(zhuǎn)化[%]E優(yōu)選PLE1(y孔E)44145484RPLE223849444RPLE312534433SPLE41.551714210RPLE5161934051RFlukaPLE("12128432.2RChirazymeE2(*)0.51827402.1R表4:新PLE變體在2乙酸(尺》-l-苯基-2-乙酯的外消旋物的動力學(xué)拆分中的對映體選擇性。("FlukaPLE和ChirazymeE2的數(shù)據(jù)得自Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer,U.T.,J.Mol.Catal.B.Enzym.2002，19-20,129-133。PLE同工酶時間[h]對映體過量[%ees][%eeP]轉(zhuǎn)化[%]E優(yōu)選PLE1(Y-PLE)274774917RPLE2267814519RPLE31.51824432SPLE4368944266RPLE5279954594RFlukaPLE(*)1.56556547RChirazymeE2。)16156527R表5:新PLE變體在3乙酸(尺0-1-苯基-2-丁酯的外消旋物的動力學(xué)拆分中的對映體選擇性。C)FlukaPLE和ChirazymeE2的數(shù)據(jù)得自Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer!U.T.,J.Mol.Catal.B.Enzym.2002，19-20,129-133。PLE同工酶時間[h]對映體過量〖％ees][%eeP]轉(zhuǎn)化率[%]E優(yōu)選PLE1(Y孔E)483934772SPLE2467934255SPLE342632452RPLE4365834325RPILE5482894845RFlukaPLEC*)21212491.4SChirazymeE2(*)15840594S表6:新PLE變體在4乙酸(尺5)-l-苯基-2-戊酯的外消旋物的動力學(xué)拆分中的對映體選擇性。("FlukaPLE和ChirazymeE2的數(shù)據(jù)得自Musidlowska-Persson,A.andBornscheuer:<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>圖5再一次以圖例證了對映體過量中的不同。圖5:不同豬肝酯酶同工酶在底物1-4的外消旋物的動力學(xué)拆分中的對映體選擇性。商購FlukaPLE的數(shù)據(jù)得自文獻(xiàn)(Musidlowska-Persson,A.andBomscheuer,U.T.，J.Mol.Catal.B.Enzym.2002,19-20，129-133)。順式-3,5-二乙酰氧基環(huán)戊-l-烯的水解表7:新PLE變體、y-PLE(PLEl)和可商購的FlukaPLE對內(nèi)消旋-順式-3,5-二乙酰氧基環(huán)戊-l-烯的不對稱作用。反應(yīng)用0.5單位(pNPA)粗提物在37°C進(jìn)行，對映體過量通過氣相層析確定。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>圖6例證了PLE變體在產(chǎn)物對映體過量中的不同。圖6:順式-3，5-二乙酰氧基環(huán)戊-l-烯的水解中不同豬肝酯酶同工酶的產(chǎn)物對映體過量。抑制劑的影響通過用三種酯酶抑制劑的任一種處理粗提物確定新PLE變體的可抑制性。研究苯甲基磺酰氟、氟化鈉和毒扁豆堿的影響。在一定時間點取樣，通過pNPA測定法確定殘余酯酶活性。表8示出結(jié)果。表8:在與三種抑制劑-氟化鈉、苯甲基磺酰氟和毒扁豆堿-在25。C保溫后新PLE同工酶的殘余活性[%]?；钚酝ㄟ^pNPA測定法確定。___殘余活性％抑制劑濃度PLE1(Y-PLE)PLE2PUE3PLE4PUE5NaF1mM5分鐘201744648330分鐘2115466688苯甲基磺酰氟(PMSF)0.01mM1分鐘97877778885分鐘858251567630分鐘5550772460分鐘4636523毒扁豆堿0.01mM1分鐘41618390945分鐘122581829830分鐘7672667權(quán)利要求1.Seq.IDNo.2所示酯酶，其具有選自如下一組的至少一個突變位置氧基酸94E96I97A，G98G101L108R113I114P150V154S155T159L160A255F257A258G306P307F308A311L315P323T480A482F484R。2.Seq.IDNo.4、6、8或者10所示的酯酶。3.編碼權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2的酯酶的分離的核酸。4.具有權(quán)利要求3的克隆的核酸的基因、載體、質(zhì)粒和重組微生物。5.權(quán)利要求4的重組微生物，其另外含有至少一個克隆的伴侶基因。6.權(quán)利要求1和/或2的酯酶在制備對映異構(gòu)體富集的醇、羧酸和酯中的應(yīng)用。7.權(quán)利要求3的核酸在制備多肽的方法中的應(yīng)用，所述多肽與SEQ.ID.NO:2多肽相比具有改良的活性和域選擇性和域穩(wěn)定性，所述多肽如下制備i)誘變SEQ.ID.NO:3、5、7或者9，ii)將可得自i)的核酸序列克隆進(jìn)合適載體中，隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)合適表達(dá)系統(tǒng)中，及iii)檢測和分離具有改良的活性和/或選擇性和/或穩(wěn)定性的所述多肽。全文摘要本發(fā)明涉及γPLE的新的突變體，涉及含有其的載體并涉及其在生產(chǎn)對映異構(gòu)體富集的醇、羧酸和酯中的應(yīng)用。文檔編號C12N9/18GK101641437SQ200880009457公開日2010年2月3日申請日期2008年3月11日優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日發(fā)明者A·胡梅爾,D·伯特歇爾,E·布呂澤哈貝爾,H·特勞特韋因,K·多德雷爾,U·T·博恩朔伊爾申請人:贏創(chuàng)德固賽有限責(zé)任公司