專利名稱：：植物的脅迫耐受性的增強(qiáng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)和轉(zhuǎn)化植物中的基因表達(dá)的改變。更具體來說，本發(fā)明涉及通過調(diào)控編碼C重復(fù)結(jié)合因子(C-repeat-bindingfactors,CBF)的基因的表達(dá)來增強(qiáng)工業(yè)上關(guān)注的植物的脅迫耐受性(stresstolerance)、同時減少與所需基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)的方法。本申請案主張2007年3月29日申請的美國臨時申請案60/908,940的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
：低溫脅迫是不僅限制植物可生長的區(qū)域而且還影響作物的數(shù)量和品質(zhì)的主要環(huán)境因素。每年全世界因低溫?fù)p害造成的作物產(chǎn)量損失達(dá)到約20億美元。在佛羅里達(dá)州(Florida),偶爾的冰凍已迫使柑橘帶遷移到更南的地方，而在加利福尼亞州(California)，近年來由于冬季冰凍，柑橘作物時常遭受嚴(yán)重?fù)p害。植物暴露于水分脅迫減小植物膨壓，導(dǎo)致葉子凋蔞且減少光合作用，由此阻礙并最終阻止正常生長。植物基因表達(dá)受到凋蔞強(qiáng)烈地影響(格雷羅(Guerrero)和馬萊特(Mullet),1988)。霜凍或水分脅迫期間的脫水引起淀粉和蛋白質(zhì)的水解增加，隨后導(dǎo)致酶活性降低。失水損傷的程度視土壤和大氣因素的條件而定。植物抵抗低溫或水分脅迫的能力極大地不同。來源于熱帶地區(qū)的植物(諸如玉米、水稻和木薯)會在干旱期間或在暴露于低溫(即使溫度在冰點以上)時被殺死或受到嚴(yán)重?fù)p害。另一方面，來源于溫帶氣候的植物受水分脅迫或冰凍溫度的影響較低。桉樹(Eucalyptus)植物包含超過八百個物種，其生長于世界的熱帶和溫帶地區(qū)。桉樹具有高生長速率，適應(yīng)于多種環(huán)境，且顯示極不易受蟲害影響。除其杰出的生長性質(zhì)外，桉樹還提供用于造紙工業(yè)的纖維的最大來源。硬木物種(諸如桉樹)的纖維一般比軟木(諸如松木)的纖維短很多。由桉樹產(chǎn)生的較短纖維可以制造具有合意表面特征(包括平滑度和亮度)但撕裂強(qiáng)度或拉伸強(qiáng)度較低的紙漿和紙。桉樹木料用于膠合板和碎料板且制材在家具和地板工業(yè)中具有經(jīng)濟(jì)重要性并提供木柴和裝飾和建筑材料(諸如梁和柱)的來源。來自桉樹的木片可用于多種復(fù)合木材產(chǎn)品，諸如定向結(jié)構(gòu)刨花板(orientedstrandboard,OSB)或中密度纖維板(mediumdensityfiberboard，MDF)。作為生長快速的物種，桉樹還可用作薪材，用于得到木炭，和用于其它能源生產(chǎn)應(yīng)用，諸如生物燃料和生物產(chǎn)品制造的原料。桉樹還種植用來產(chǎn)生林地覆蓋物和提供用于美觀和工業(yè)應(yīng)用的防風(fēng)林。來自桉樹的精油還用于清潔、美容產(chǎn)品，諸如肥皂和香料，以及用于醫(yī)學(xué)目的。此外，認(rèn)為桉樹種植園對制造碳中和和可再生的生物燃料很有價值，所述生物燃料可用作昂貴化石燃料的替代品。桉樹生物質(zhì)可轉(zhuǎn)化為建筑材料、紙、燃料、食物、動物飼料和其它產(chǎn)品，諸如植物來源的化學(xué)品，如蠟和清潔劑。固體生物質(zhì)還可用于產(chǎn)生工藝用熱和電力。另外生物質(zhì)加工還可用于生物精煉以產(chǎn)生燃料、化學(xué)品、新生物基材料和電力。生物燃料可使用快速熱解工藝由桉樹制造，所述工藝是一種在不存在空氣的情況下將可再生的生物質(zhì)快速加熱到45(TC-60(TC的生物轉(zhuǎn)化方法。桉樹是世界上最常種植的硬木。然而，桉樹物種由于其對低溫的高敏感性和其抵抗水分脅迫的能力有限而主要局限于氣候溫和的地區(qū)。雖然一些桉樹物種對暴露于低溫的耐受性比其它桉樹物種好，但是突然的嚴(yán)重霜凍對大部分(如果不是全部)桉樹物種的生存也會造成很大威脅。誘導(dǎo)出的對逐漸更低溫度的耐受性(稱為冷馴化(coldacclimation))可僅在暴露于鍛煉冷處理伴隨光強(qiáng)度降低和日照時間縮短之后獲得，但其成功取決于數(shù)種因素，包括物種和其來源、鍛煉期的持續(xù)時間和樹的健康狀況。大部分桉樹物種抵抗水分脅迫的能力也極其有限。過量失水導(dǎo)致生長普遍減慢和葉面積比、比葉面積和葉根面積比顯著降低。對脅迫(包括冰凍脅迫和水分脅迫)的抗性更大的植物可生長于較大范圍的地理區(qū)域且其作物將經(jīng)受極少環(huán)境風(fēng)險。然而，盡管持續(xù)努力，但傳統(tǒng)育種僅在賦予作物植物較好脅迫耐受性方面取得了有限的成功。植物遺傳工程改造對于改良商業(yè)上重要的植物物種具有很大潛力。近年來，對樹的遺傳工程改造已用于改良應(yīng)用于造紙和燃料工業(yè)中的木材品質(zhì)。楊屬(P叩ulusgenera)中的物種已用作遺傳工程改造樹的模型(金(Kim)等人1997)，且諸如抗蟲性和除草劑耐受性的各種性狀已工程改造到樹物種中(克勞普芬斯坦(Klopfenstein)等人1993，迪布羅克(DeBlock)1990)。近年來，數(shù)個研究小組已將其研究集中在鑒別負(fù)責(zé)植物的脅迫耐受性的機(jī)制中的脅迫調(diào)控基因和其功能上。植物中在冷處理后誘導(dǎo)出的基因統(tǒng)稱為冷調(diào)控基因(Cold-RegulatedGene，COR)。在擬南芥屬"m&Wo/w")中，冷馴化與由稱為CRT(C重復(fù))/DRE(脫水應(yīng)答元件(dehydrationresponsiveelement))DNA調(diào)控元件的冷和脫水應(yīng)答DNA調(diào)控元件介導(dǎo)的COR基因誘導(dǎo)相關(guān)。分別稱為CBF1、CBF2和CBF3或DREBlb、DREBle和DREBla的冷應(yīng)答轉(zhuǎn)錄活化因子的小家族識別存在于冷和脫水應(yīng)答基因的啟動子區(qū)中的CRT(C重復(fù))/DRE序列。與CRT/DRE序列結(jié)合的擬南芥屬CBF1(—種轉(zhuǎn)錄活化因子)的表達(dá)增加誘導(dǎo)COR基因表達(dá)且增強(qiáng)非馴化擬南芥屬植物的耐凍性。在使植物暴露于低的非冰凍溫度后15min內(nèi)且在誘導(dǎo)含有CRT/DRE調(diào)控元件的冷調(diào)控基因2小時內(nèi)CBF基因被誘導(dǎo)；出現(xiàn)通常所說的"CBF調(diào)節(jié)子"，使得在接下來幾天內(nèi)植物耐凍性增強(qiáng)(嘉格羅-奧托森(Jaglo-Ottosen)等人，1998)。CBF調(diào)節(jié)子表達(dá)還增強(qiáng)對干旱和高鹽度脅迫的耐受性。(史托金(Stockinger)等人，1997;福勒(Fowler)和托馬休(Thomashow),2002;春日(Kasuga)等人，1999;哈克(Haak)等人，2002)。CBF基因存在于包括玉米、大豆、小麥、水稻、大麥、番茄、苜蓿、芥花等若干作物物種以及諸如甘藍(lán)型油菜(&a^'ca"印船)等蔬菜和樹中。已在四種不同桉樹物種中證明CBF基因的存在巨桉(E"ca/;^^gramfo)(阿伯基因公司(ArborGen)，egCBFl和egCBF3);鄧恩桉,d畫")(阿伯基因公司，ed7.1和ed8.1);加擰桉(五wca(ypa^gw"m7)(基因庫(GenBank)保藏編號ABB51638);和藍(lán)桉(五wca/少/^wsg/o6w/w)(基因庫保藏編號ABF70207)。在過去幾年中，開發(fā)脅迫耐受性改良的轉(zhuǎn)基因植物已受到很大關(guān)注。然而，改良對寒冷、干旱和鹽負(fù)荷的耐受性的同時，擬南芥屬CBF1在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)還伴有對正常生長條件下植物的生長和產(chǎn)量的負(fù)面影響。已報道CBF/DREB1的表達(dá)在擬南芥屬和番茄中產(chǎn)生矮態(tài)(吉爾摩(Gilmour)等人，2000;謝(Hsieh)等人，2002b;春日(Kasuga)等人，1999;劉(Liu)等人，1998)。將小麥DREB2A同源基因引入水稻植物中也導(dǎo)致矮態(tài)(沈(Shen)等人，2003)。因此，亟需開發(fā)更好的技術(shù)來改良商業(yè)上重要的樹和植物的脅迫耐受性(包括耐凍性和失水耐受性)，所述樹和植物包括熱帶樹，諸如桉樹、柑橘樹、鱷梨樹、番木瓜樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹，所述技術(shù)允許通過過表達(dá)轉(zhuǎn)錄活化因子(諸如CBF1)來調(diào)節(jié)脅迫反應(yīng)和耐寒性和失水耐受性所涉及的基因的表達(dá)，同時減少與調(diào)控植物的脅迫耐受性的復(fù)雜機(jī)制相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供可進(jìn)行操作來增強(qiáng)植物的脅迫耐受性的基因。本發(fā)明的目的還在于提供驅(qū)動增強(qiáng)植物的脅迫耐受性的基因表達(dá)的啟動子序列。本發(fā)明的另一目的在于提供與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比展現(xiàn)脅迫耐受性改良的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的目的還在于提供通過改變植物的脅迫耐受性來調(diào)節(jié)其表型的方法。17本發(fā)明的又一目的在于提供由展現(xiàn)脅迫耐受性改良的轉(zhuǎn)基因植物制造木材的方法。本發(fā)明的又一目的在于提供由展現(xiàn)脅迫耐受性改良的轉(zhuǎn)基因植物制造結(jié)構(gòu)制材的方法。本發(fā)明的又一目的在于提供由展現(xiàn)脅迫耐受性改良的轉(zhuǎn)基因植物制造生物燃料的方法。為實現(xiàn)這些和其它目標(biāo)，本發(fā)明提供DNA構(gòu)筑體，其包含可操作地連接于脅迫相關(guān)啟動子序列的由SEQIDNO:1、3、5或7代表的CBF基因序列或CBF同源基因序列，所述啟動子序列在經(jīng)干燥、寒冷或高鹽條件誘導(dǎo)后引起植物中的CBF基因或CBF同源基因表達(dá)，同時減少與CBF基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。在一實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的樹細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于脅迫相關(guān)基因擬南芥"ra6Wo;w"Z/^/Z朋a)啟動子RD29A的擬南芥CBF2基因。在另一實施例中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物，其與CBF2在同一物種的非轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)相比展現(xiàn)CBF2表達(dá)增加，且與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的表型相比具有特征為脅迫耐受性增強(qiáng)的表型。轉(zhuǎn)基因植物可為雙子葉植物或單子葉植物。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因植物是被子植物。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物是硬木熱帶樹，包括桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹。本發(fā)明的實施例中也包括轉(zhuǎn)基因植物的器官，包含葉子、莖、花、子房、果實、種子和愈傷組織。在另一實施例中，本發(fā)明提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因樹的方法，其包含用包含可操作地連接于擬南芥RD29A啟動子的擬南芥CBF2基因的DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞；和在促進(jìn)與同一物種的非轉(zhuǎn)化樹相比展現(xiàn)脅迫耐受性改良的樹生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞。在另一實施例中，本發(fā)明提供增強(qiáng)樹的耐凍性的方法，其包含用包含可操作地連接于擬南芥RD29A啟動子的擬南芥CBF2基因的DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞；和在促進(jìn)樹生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，其中由^KCBF2基因編碼的多肽在轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞中表達(dá)，且所述樹是與同一物種的非轉(zhuǎn)化樹相比展現(xiàn)耐寒性改良的轉(zhuǎn)基因樹。在又一實施例中，本發(fā)明提供由轉(zhuǎn)基因樹制造木材和木漿的方法，其包含用包含可操作地連接于擬南芥RD29A啟動子的擬南芥CBF2基因的DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞；和在促進(jìn)樹生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，其中由^^CBF2基因編碼的多肽在轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞中表達(dá)，且所述樹是與同一物種的非轉(zhuǎn)化樹相比展現(xiàn)脅迫耐受性改良的轉(zhuǎn)基因樹。在又一實施例中，本發(fā)明提供由SEQIDN0:9或IO代表的脫水蛋白啟動子序列，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且與具有SEQIDNO:9或10的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。在另一實施例中，本發(fā)明提供DNA構(gòu)筑體，其包含可操作地連接于由SEQIDNO:9或IO代表的脫水蛋白啟動子序列或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸的核酸序列且與具有SEQIDNO:9或10的脫水蛋白啟動子至少50%—致的片段或變異體的所需基因，其中所述啟動子驅(qū)動植物中的所述所需基因在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與所需基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。優(yōu)選地，所述脅迫條件是0'C到約-30X:的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1H到10日直到凋蔞點的范圍內(nèi)。在另一實施例中，本發(fā)明提供DNA構(gòu)筑體，其包含可操作地連接于啟動子的包含由SEQIDNO:l、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其包含與由SEQIDNO:1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70%—致的核苷酸序列的片段或變異體，其中所述啟動子驅(qū)動植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與CBF基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。優(yōu)選地，所述脅迫條件是0'C到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與包含SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。本發(fā)明的核酸序列可包括一個或一個以上堿基缺失、取代、插入和/或添加。在另一實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于啟動子的包含由SEQIDNO:1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其包含與由SEQIDNO:1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70%—致的核苷酸序列的片段或變異體，其中所述啟動子驅(qū)動植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與CBF基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。優(yōu)選地，所述脅迫條件是0。C到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S19啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與具有SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。在另一實施例中，本發(fā)明提供與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的脅迫耐受性程度相比展現(xiàn)脅迫耐受性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，所述脅迫條件是0'C到-3(TC的冰凍溫度。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水。轉(zhuǎn)基因植物可為雙子葉植物或單子葉植物。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物是被子植物。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物是硬木熱帶樹，包括桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鍔梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹。本發(fā)明的實施例中也包括轉(zhuǎn)基因植物的器官，包含葉子、莖、花、子房、果實、種子和愈傷組織。在另一實施例中，本發(fā)明提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包含用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于啟動子的包含由SEQIDNO:1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其包含與由SEQIDNO:1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70%—致的核苷酸序列的片段或變異體，其中所述啟動子驅(qū)動植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與CBF基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和在促進(jìn)與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比展現(xiàn)耐寒性改良的植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。優(yōu)選地，所述脅迫條件是0r到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與具有SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。在另一實施例中，本發(fā)明提供增強(qiáng)被子植物的耐凍性的方法，其包含用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于啟動子的包含由SEQIDNO:1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其包含與由SEQIDNO:1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70%—致的核苷酸序列的片段或變異體，其中所述啟動子驅(qū)動植物中的植物轉(zhuǎn)錄因子在所述植物暴露于脅迫條件歷時2小時到72小時范圍內(nèi)的時間段后表達(dá)，同時減少與CBF基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中由所述經(jīng)分離的聚核苷酸序列編碼的多肽在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)，且所述植物是與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相20比展現(xiàn)耐寒性改良的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是具有由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與包含SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。優(yōu)選地，所述脅迫條件是0'C到-3(TC的冰凍溫度。在又一實施例中，本發(fā)明提供一種由轉(zhuǎn)基因植物制造木材和/或木漿的方法，其包含用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于啟動子的包含由SEQIDNO:l、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其包含與由SEQIDNO:1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70%—致的核苷酸序列的片段或變異體，其中所述啟動子驅(qū)動植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與CBF基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中由所述聚核苷酸序列編碼的多肽在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)；和由所述轉(zhuǎn)基因植物制造木材。優(yōu)選地，所述脅迫條件是0°C到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與包含SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%一致的核酸序列的片段或變異體。優(yōu)選地，植物是與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比展現(xiàn)脅迫耐受性改良的轉(zhuǎn)基因植物。在又一實施例中，本發(fā)明提供一種由轉(zhuǎn)基因植物制造薄板和/或妥爾油(talloil)的方法，其包含用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于啟動子的包含由SEQIDNO:1、3、5或7代表的CBF同源基因的核酸序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其包含與由SEQIDNO:1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70%—致的核苷酸序列的片段或變異體，其中所述啟動子驅(qū)動植物中的所述CBF同源基因在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與CBF基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中由所述聚核苷酸序列編碼的多肽在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)；和由所述轉(zhuǎn)基因植物制造薄板和/或妥爾油。優(yōu)選地，所述脅迫條件是0。C到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與包含SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。優(yōu)選地，植物是與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比展現(xiàn)脅迫耐受性改良的轉(zhuǎn)基因植物。在另一實施例中，本發(fā)明提供一種由轉(zhuǎn)基因植物制造生物燃料的方法，其包含用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于啟動子的包含由SEQIDNO:l、3、5或7代表的CBF2基因序列或CBF同源基因序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其包含與由SEQIDNO:1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70%—致的核苷酸序列的片段或變異體，其中所述啟動子驅(qū)動植物中的植物轉(zhuǎn)錄因子在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與CBF基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中由所述聚核苷酸序列編碼的多肽在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)；和由所述轉(zhuǎn)基因植物制造生物燃料。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與具有SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段。優(yōu)選地，在暴露于脅迫條件之前冷馴化轉(zhuǎn)基因植物，所述脅迫條件是0'C到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物的表型的特征為與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比脅迫耐受性增強(qiáng)。在另一實施例中，本發(fā)明提供DNA構(gòu)筑體，其包含編碼包含由SEQIDNO:2、4、6或8代表的氨基酸序列的具有CBF活性的多肽或包含與由SEQIDNO:2、4、6或8代表的氨基酸序列具有至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%序列一致性的氨基酸序列的具有CBF活性的多肽的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地連接于一個或一個以上引起核酸序列表達(dá)的合適啟動子。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與具有SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。本發(fā)明的多肽可包括不會改變轉(zhuǎn)錄因子活性的氨基酸取代、添加和缺失。在另一實施例中，本發(fā)明提供一種經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其表達(dá)由包含由SEQIDNO:1、3、5或7代表的CBF同源基因序列的聚核苷酸或其包含與由SEQIDNO:1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70%—致的核苷酸序列的片段或變異體編碼的多肽，其中所述CBF同源基因的表達(dá)在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后由啟動子驅(qū)動，同時減少與CBF基因的表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。優(yōu)選地，所述脅迫條件是Ot:到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、IO或U代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與包含SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。優(yōu)選地，所述多肽包含由SEQIDNO:2、4、6或8代表的氨基酸序列，或是包含與由SEQIDNO:2、4、6或8代表的氨基酸序列具有至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%序列一致性的氨基酸序列的具有CBF活性的多肽。在又一實施例中，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因植物，其表達(dá)包含由SEQIDNO:2、4、6或8代表的氨基酸序列的多肽，或包含與由SEQIDNO:2、4、6或8代表的氨基酸序列具有至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%序列一致性的氨基酸序列的具有CBF活性的多肽，其中所述轉(zhuǎn)基因植物展現(xiàn)的表型不同于同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的表型，且其中所述多肽的表達(dá)在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后被驅(qū)動，而無與具有CBF活性的多肽表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。優(yōu)選地，所述脅迫條件是ox:到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比，轉(zhuǎn)基因植物展現(xiàn)脅迫耐受性改良。在又一實施例中，本發(fā)明提供一種由轉(zhuǎn)基因植物制造木材和/或木漿的方法，其包含用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于一個或一個以上引起所需基因表達(dá)的合適啟動子的所需基因，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中由所述所需基因編碼的多肽在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)，且所述植物是展現(xiàn)的表型不同于同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和由所述轉(zhuǎn)基因植物制造木材。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與具有SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。優(yōu)選地，在暴露于脅迫條件之前冷馴化轉(zhuǎn)基因植物，所述脅迫條件是or到約-3(rc的冰凍溫度且所述23時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比，轉(zhuǎn)基因植物展現(xiàn)脅迫耐受性改良。在又一實施例中，本發(fā)明提供一種由轉(zhuǎn)基因植物制造薄板和/或妥爾油的方法，其包含用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于一個或一個以上引起所需基因表達(dá)的合適啟動子的所需基因，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中由所述所需基因編碼的多肽在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)，且所述植物是展現(xiàn)的表型不同于同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和由所述轉(zhuǎn)基因植物制造薄板和/或妥爾油。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與包含SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。優(yōu)選地，在暴露于脅迫條件之前冷馴化轉(zhuǎn)基因植物，所述脅迫條件是O'C到約-30°(:的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比，轉(zhuǎn)基因植物展現(xiàn)脅迫耐受性改良。在另一實施例中，本發(fā)明提供一種由轉(zhuǎn)基因植物制造生物燃料的方法，其包含用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于一個或一個以上引起所需基因表達(dá)的合適啟動子的所需基因，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述所需基因的產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)，且所述植物是展現(xiàn)的表型不同于同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和由所述轉(zhuǎn)基因植物制造生物燃料。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與包含SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。優(yōu)選地，在暴露于脅迫條件之前冷馴化轉(zhuǎn)基因植物，所述脅迫條件是0'C到約-30。C的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物的表型的特征為與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比脅迫耐受性增強(qiáng)。在又一實施例中，本發(fā)明提供一種由轉(zhuǎn)基因植物制造生物能量的方法，其包含用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含可操作地連接于一個或一個以上引起24所需基因表達(dá)的合適啟動子的所需基因，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述所需基因的產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)，且所述植物是展現(xiàn)的表型不同于同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和由所述轉(zhuǎn)基因植物制造生物能量。優(yōu)選地，所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子或CaMV35S啟動子。更優(yōu)選地，啟動子是包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列的脫水蛋白啟動子，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸且與包含SEQIDNO-.9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。優(yōu)選地，在暴露于脅迫條件之前冷馴化轉(zhuǎn)基因植物，所述脅迫條件是0'C到約-30'C的冰凍溫度且所述時間段在2小時到約72小時范圍內(nèi)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選方面中，脅迫條件是缺水且時間段在1日到10日直到凋萎點范圍內(nèi)。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物的表型的特征為與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比脅迫耐受性增強(qiáng)。圖1A說明pABCTEOl(SEQIDNO:12)的質(zhì)粒圖譜。圖1B說明帶有用于增強(qiáng)耐寒性的CBF2基因和用于減少桉樹中木質(zhì)素的基因的質(zhì)粒pABCTE03B(SEQIDNO:13)的圖譜。圖2說明與非轉(zhuǎn)化擬南芥屬植物的0.0%的存活率相比，表達(dá)J《BF2的rdCBF2國7擬南芥屬植物在暴露于-l(TC的冰凍脅迫8小時后展現(xiàn)69%的存活率。圖3說明當(dāng)與野生型擬南芥屬植物相比時，9個表達(dá)CBF2的擬南芥屬品種中的8個在暴露于冰凍溫度后顯示電解質(zhì)滲漏減少。rdCBF2-5是唯一在冰凍溫度下顯示電解質(zhì)滲漏增加的表達(dá)CBF2的擬南芥屬品種。圖4說明暴露于冰凍脅迫后帶有Z,CBF2基因的轉(zhuǎn)基因桉樹植物和野生型桉樹植物。使所述植物在1加侖盆中生長20日且在轉(zhuǎn)基因柵欄區(qū)中馴化25日，隨后暴露于冰凍脅迫。對于冰凍脅迫測試來說，用塑料袋包裹所述盆以防止干燥且置于精確低溫生長室(PrecisionLowTemperatureGrowthChamber)中。使植物暴露于在-2。C與-6。C之間范圍內(nèi)的冰凍溫度48小時，使其在4i:下恢復(fù)8小時，且接著轉(zhuǎn)移到溫室中。在溫室中5日后對經(jīng)歷冰凍脅迫后存活的植物數(shù)目進(jìn)行計分。放回轉(zhuǎn)基因柵欄區(qū)后20日進(jìn)行拍照。圖5說明從在暴露于冰凍脅迫后對擬南芥屬植物的葉子執(zhí)行的電解質(zhì)滲漏檢定獲得的結(jié)果。與非轉(zhuǎn)化擬南芥屬植物的葉子相比，表達(dá)pd35SegCBFl的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物的葉子顯示電解質(zhì)滲漏減少。.圖6A說明含有鄧恩桉啟動子(SEQIDNO:9)的pAGW14的質(zhì)粒圖譜。圖6B說明含有毛皮桉脫水蛋白啟動子(SEQIDNO10)的pAGW15的質(zhì)粒圖譜。圖7說明暴露于低溫(4°C)24小時的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物中的鄧恩桉啟動子(SEQIDNO:9)或毛皮桉脫水蛋白啟動子(SEQIDNO10)的誘導(dǎo)。圖8說明pSrc-GUS(SEQIDNO:11)的質(zhì)粒圖譜。圖9說明2個用pAGW16(SEQIDNO:18)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因品種中的鄧恩桉脫水蛋白啟動子的倍數(shù)誘導(dǎo)和2個用pAGW17(SEQIDNO:19)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因品種中的毛皮桉脫水蛋白啟動子的倍數(shù)誘導(dǎo)。圖10說明暴露于低溫(4°C)24小時的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物中的Src2啟動子(SEQIDNO:11)的誘導(dǎo)。圖11說明4個帶有驅(qū)動CBF2基因或CBF同源基因表達(dá)的啟動子的質(zhì)粒的圖譜。圖IIA展示帶有驅(qū)動CBF同源基因加檸桉CBFl(SEQIDNO:5)表達(dá)的鄧恩桉啟動子(SEQIDNO:9)的質(zhì)粒pAGSM23。圖11B展示帶有驅(qū)動CBF同源基因鄧恩桉8.1(SEQIDNO:3)表達(dá)的鄧恩桉啟動子(SEQIDNO:9)的質(zhì)粒pAGSM24。圖11C展示帶有驅(qū)動CBF同源基因加擰桉CBF1(SEQIDNO:5)表達(dá)的Src啟動子(SEQIDNO:11)的質(zhì)粒pAGSM42。圖11D展示帶有驅(qū)動擬南芥CBF2基因表達(dá)的Src啟動子(SEQIDNO:11)的質(zhì)粒pAGSM47。圖12A說明質(zhì)粒pAGW16(SEQIDNO:18)的圖譜。圖12B說明質(zhì)粒pAGW17(SEQIDNO:19)的圖譜。圖13呈現(xiàn)展示桉樹CBF同源物edC7.1和edC8.1的表達(dá)回應(yīng)于低溫暴露而增加的DNA凝膠。使三棵盆栽IPB1植物在1加侖盆中生長到約2英尺高且暴露于低溫(4°C)0.5小時、l小時、2小時或4小時。在每一時間點，對嫩葉取樣且立即處理用于總RNA提取。也在暴露于寒冷之前從植物取得葉樣品，且其稱為零時樣品。由從各葉樣品制備的總RNA合成Poly(A)RNA和相應(yīng)單鏈cDNA(sscDNA)。在25^PCR反應(yīng)中使用10ngsscDNA和IO皮莫耳兩種基因特異性引物。PCR后，在DNA凝膠上對10^各反應(yīng)液進(jìn)行電泳。圖14說明在暴露于水分脅迫之前生長于2個單獨1加侖盆中的轉(zhuǎn)基因品種TUH000427和TUH000435的桉樹IPBl樹苗。各盆含有一棵轉(zhuǎn)基因植物和一棵野生型(WT)植物。圖15說明8日不澆水的生長于2個單獨1加侖盆中的轉(zhuǎn)基因品種TUH000427和TUH000435的桉樹IPBl樹苗和WT植物的凋萎程度。各盆含有一棵轉(zhuǎn)基因植物和一棵野生型(WT)植物。圖16說明在期間不對植物澆水的8日后，在期間對植物定期澆水的10日時間結(jié)束時，生長于2個單獨1加侖盆中的轉(zhuǎn)基因品種TUH000427和TUH000435的桉樹IPB1樹苗和WT植物的恢復(fù)情況。各盆含有一棵轉(zhuǎn)基因植物和一棵野生型(WT)植物。圖17說明在暴露于水分脅迫之前生長于2個單獨1加侖盆中的轉(zhuǎn)基因品種TUH000427和TUH000435的桉樹IPB1樹苗。各盆含有一棵轉(zhuǎn)基因植物和一棵野生型(WT)植物。圖18說明8日不澆水的生長于2個單獨1加侖盆中的轉(zhuǎn)基因品種TUH000427和TUH000435的桉樹IPB1樹苗和WT植物的凋萎程度。各盆含有一棵轉(zhuǎn)基因植物和一棵野生型(WT)植物。圖19說明在期間不對植物澆水的8日后，在期間對植物定期澆水的10日時間結(jié)束時，生長于2個單獨1加侖盆中的轉(zhuǎn)基因品種TUH000427和TUH000435的桉樹IPB1樹苗和WT植物的恢復(fù)情況。各盆含有一棵轉(zhuǎn)基因植物和一棵野生型(WT)植物。具體實施例方式本發(fā)明涉及對植物的脅迫耐受性進(jìn)行遺傳操縱的方法，和展現(xiàn)脅迫耐受性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。植物經(jīng)歷冰凍溫度和水分脅迫后存活的能力具有極大不同。大部分來源于熱帶地區(qū)的植物對冰凍溫度具有極低耐受性且抵抗極端水分脅迫的能力有限，而許多來自溫帶地區(qū)的草本植物物種可經(jīng)歷水分脅迫和溫度在-5。C到-30。C范圍內(nèi)的冰凍后存活，這視物種而定。耐寒性可通過使植物暴露于約10。C以下的低溫而誘導(dǎo)出，這是一種稱為"冷馴化"的現(xiàn)象(休斯(Hughes)和鄧恩(Dunn)，1996;托馬休(Thomashow)，1999)。改良經(jīng)濟(jì)上重要的植物的脅迫耐受性具有顯著實際應(yīng)用，因為水分脅迫和冰凍溫度是限制適合于作物和園藝植物生長的地理位置的主要因素且在周期性方面解釋植物生產(chǎn)率的顯著損失。在一些情況下，通過暴露于若干水分脅迫循環(huán)來調(diào)節(jié)植物使得植物對缺水的敏感性降低。植物以活化多個使得脅迫耐受性增強(qiáng)的生物化學(xué)機(jī)制來應(yīng)答馴化。使擬南芥屬植物暴露于低溫導(dǎo)致編碼稱為C重復(fù)(CRT)結(jié)合因子(CBF1、CBF2禾nCBF3)或脫水應(yīng)答元件(DRE)結(jié)合因子(DREBlb、DREBlc和DREBla)的轉(zhuǎn)錄活化因子的小基因家族的快速誘導(dǎo)。CBF表達(dá)活化冷調(diào)控基因(COR)，其轉(zhuǎn)而又引發(fā)多個事件的級聯(lián)反應(yīng)級聯(lián)反應(yīng)，從而使得耐寒性增強(qiáng)。已顯示CBF基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)改良對干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受性，但其也伴有不當(dāng)效應(yīng)，諸如在正常生長條件下的生長停滯和矮態(tài)(伊藤(Ito)等人植物和細(xì)胞生理學(xué)(P/a"/a"dCW/P/^/o/ogy)V7(7人141-153(2006);李(Lee)等人植物、細(xì)胞和環(huán)境(尸/"W，Ce〃在￡"v/ra"we"026(7"1181-卯(2003))。對CBF基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)的先前工作不能預(yù)示本發(fā)明者的發(fā)現(xiàn)CBF基因和CBF同源基因可在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，同時減少與CBF表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。因此，提供改良植物、植物細(xì)胞和植物組織的脅迫耐受性的方法。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，用CBF或CBF同源基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和整個植物，所述基因在植物細(xì)胞或整個植物中表達(dá)時引起脅迫耐受性增強(qiáng)而不會引起任何先前報道的與CBF表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。在一優(yōu)選實施例中，用CBF或CBF同源基因轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞是被子植物。優(yōu)選地，用CBF或CBF同源基因轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞是桉樹植物。本文所使用的所有技術(shù)術(shù)語是生物化學(xué)、分子生物學(xué)和農(nóng)業(yè)學(xué)中常用的術(shù)語，且可由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所了解。技術(shù)術(shù)語可見于以下文獻(xiàn)中分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning:ALaboratoryManual),第3版，第1-3巻，薩姆布魯克(Sambrook)和拉塞爾(Russell)編，冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),紐約冷泉港(ColdSpringHarbor,N.Y.),2001;最新分子生物學(xué)實驗方法匯編(CurrentProtocolsinMolecularBiology),阿蘇貝爾(Ausubel)等人編，紐約格林出版協(xié)會和威利出版社(GreenePublishingAssociatesandWiley-Interscience,NewYork),1988(定期更新)；精編分子生物學(xué)實驗指南最新分子生物學(xué)實驗方法匯編的方法概要(ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology),第5版，第1-2巻，阿蘇貝爾(Ausubel)等人編，約翰威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc.),2002;基因組分析實驗室手冊(GenomeAnalysis:ALaboratoryManual),第1-2巻，格林(Green)等人編，冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),紐約冷泉港(ColdSpringHarbor,N.Y.),1997。本文描述涉及植物生物學(xué)技術(shù)的方法且其詳細(xì)地描述于諸如以下的論文集中植物分子生物學(xué)方法實驗室教程手冊(M"/wcfez'"尸/cm〖Mo/簡/ar爿丄由na^yCo腦e她""a/),瑪麗嘉(Maliga)等人編，冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，紐約冷泉港(ColdSpringHarbor,N.Y.)，1995。使用PCR的各種技術(shù)描述于以下文獻(xiàn)中英尼斯(Innis)等人，PCR實驗方法方法與應(yīng)用指導(dǎo)(PC/iVo^co/r^GwWe"Me^oAfl"t/v4;;7/!'ca〃o"s),學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress),圣地亞哥(SanDiego),1990,和迪芬巴克(Dieffenbach)和德維克思勒(Dveksler),PCR引物實驗室手冊(戶Ci尸".證:^LWora/o^yMa"wa/)，第2版，冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratory28Press),紐約冷泉港(ColdSpringHarbor,N.Y.),2003。PCR引物對可通過欲用于所述目的的已知技術(shù)從己知序列獲得，諸如使用計算機(jī)程序，引物(Primer),0.5版，1991,懷特黑德生物醫(yī)學(xué)研究所(WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch),馬薩諸塞州坎布里奇(Cambridge,MA)?；瘜W(xué)合成核酸的方法例如論述于以下文獻(xiàn)中博卡吉(Beaucage)和凱魯瑟斯(Caruthers),1981,四面體通訊(Tetra.￡歐)".'1859-1862和麥特茲(Matteucci)和凱魯瑟斯(Caruthers),1981美國化學(xué)會雜志(《/.Xm.C&附.Soc.)3185。限制酶消化、磷酸化、連接和轉(zhuǎn)化如以下文獻(xiàn)中所述進(jìn)行薩姆布魯克(Sambrook)等人，實驗室手冊(Mo/"w/arC/om'"g:^丄a6orWo^Mcmwa/),第2版(1989),冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)。除非另外規(guī)定，否則用于細(xì)菌細(xì)胞生長和維持的所有試劑和材料都從以下公司獲得奧爾德里奇化學(xué)品公司(AldrichChemicals)(威斯康星州密爾沃基(Milwaukee,WI))、DIFCO實驗室(密歇根底特律(Detroit,MI))、英杰公司(Invitrogen)((Gaithersburg,MD))或西格馬化學(xué)公司(SigmaChemicalCompany)(密蘇里州圣路易斯(St.Louis,MO))。術(shù)語"編碼"是指基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯的機(jī)制向細(xì)胞提供信息的過程，通過所述信息，一系列氨基酸可組裝成特定氨基酸序列以產(chǎn)生活性酶。由于遺傳密碼子的簡并性，DNA序列的某些堿基變化不會改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。因此，應(yīng)了解，涵蓋編碼轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列中不會實質(zhì)上影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)的修飾。術(shù)語"表達(dá)"表示由基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)生。術(shù)語"過表達(dá)"是指基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因生物體中的產(chǎn)生超過正?；蚍寝D(zhuǎn)化生物體的產(chǎn)生量。C重復(fù)結(jié)合因子序列短語"CBF基因"是指編碼與存在于包括稱為COR(冷調(diào)控)等許多冷和干旱誘導(dǎo)性基因的啟動子中的CRT(C重復(fù))/DRE(脫水應(yīng)答元件)DNA調(diào)控元件結(jié)合的編碼轉(zhuǎn)錄活化因子的基因。短語"同源CBF基因"是指與CBF基因共有高序列一致性或相似性且具有CBF功能的基因。在本說明書中，短語"CBF基因序列"和"CBF同源基因序列"表示賦予脅迫相關(guān)植物C重復(fù)結(jié)合因子(CBF)活性的任何核酸、基因、聚核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子。包含由SEQIDNO:1、3、5或7代表的序列且編碼顯示CBF活性的多肽的聚核苷酸說明這一類別。適合于本發(fā)明的CBF或同源CBF聚核苷酸序列可從特征為存在CBF基因的無數(shù)植物中鑒別出。盡管本文揭示上述核苷酸序列，但其不應(yīng)視為對本發(fā)明的限制。可使用基29于本文所揭示的DNA或蛋白質(zhì)序列的寡核苷酸引物或探針，以cDNA或基因組DNA形式從任何合適的植物物種分離出CBFDNA序列?？煞蛛x出CBF基因的植物物種的特定實例包括雙子葉植物，諸如葫蘆科(Cucurbitaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、蕓香科(Rutaceae)、蝶形花科(Papilionaceae)(諸如苜蓿禾口豇豆(Wgwaw"gw/cw/加a))、錦葵科(Malvaceae)、菊禾斗(Asteraceae)、金虎尾科(Malpighiaceae)(諸如楊屬)、桃金娘科(Myrtaceae)(諸如桉樹屬)；和單子葉植物，諸如禾本科(gramineae),包括小麥、大麥和玉米。出于本發(fā)明的目的，優(yōu)選地CBF基因是從擬南芥分離，且優(yōu)選地CBF同源基因是從桉樹分離。在本說明書中，短語"CBF聚核苷酸序列"和"CBF同源聚核苷酸序列"也指具有能夠在嚴(yán)格條件下與本文所揭示的任何序列雜交且編碼具有等效于包含本文以SEQIDNO:2、4、6或8揭示的氨基酸序列的多肽的脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性的多肽的核苷酸序列的任何核酸分子。所述短語還包括與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7交叉雜交的序列，其與由SEQIDNO:1、3、5或7代表的核苷酸序列至少70。/。一致。本發(fā)明的核苷酸序列可編碼與本文所揭示包含由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8代表的氨基酸序列的多肽同源的多肽。此外，本發(fā)明的核苷酸序列包括那些編碼具有脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性并具有與本文以SEQIDNO:2、4、6或8揭示的氨基酸序列具有至少55%、優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%序列一致性的氨基酸序列的多肽的序列。如本文所提及，"嚴(yán)格條件"的意思是以下條件僅編碼具有等效于由CBF基因序列或CBF同源基因序列編碼的轉(zhuǎn)錄因子的脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性的多肽的堿基序列與特異性CBF或CBF同源序列形成雜交體(稱為特異性雜交體)，而編碼無所述等效活性的多肽的堿基序列不會與特異性序列形成雜交體(稱為非特異性雜交體)。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可易于通過改變雜交反應(yīng)和洗滌過程中的溫度或雜交反應(yīng)和洗滌過程中的鹽濃度來選擇所述條件。特定實例包括(但不限于)以下條件在65'C下在3.5XSSC、1X鄧哈特氏溶液(Denhardt'ssolution)、25mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.5%SDS禾口2mMEDTA中歷時18小時達(dá)成雜交，隨后在65。C下用2XSSC、0.1%SDS洗滌過濾器4次歷時20分鐘，和用0.5XSSC、0.1%SDS,或?qū)τ诟邍?yán)格度來說用0.3XSSC禾B0.1%SDS，和對于甚至更高嚴(yán)格度來說用0.1XSSC、0.P/。SDS進(jìn)行最后洗滌歷時多達(dá)20分鐘?？捎闷渌鼦l件替代，只要嚴(yán)格度等于本文所提供的使用0.5xSSC最后洗滌的嚴(yán)格度即可。另夕卜，CBF同源基因序列包括由SEQIDNO:1或3、5或7代表的聚核苷酸的片段和變異體，其具有一個或一個以上堿基缺失、取代、插入或添加且編碼具有脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性的多肽。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員普遍了解，本文所提及的"具有一個或一個以上堿基缺失、取代、插入或添加的堿基序列"保留生理活性，即使一般具有生理活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有一個或一個以上氨基酸取代、缺失、插入或添加。舉例來說，可缺失polyA尾或5'或3'末端非翻譯區(qū)，且可缺失堿基達(dá)到使氨基酸缺失的程度。也可取代堿基，只要不導(dǎo)致讀框移位(frameshift)即可。也可"添加"堿基，只要所述修飾不會導(dǎo)致?lián)p失脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性即可。在本文中，經(jīng)修飾的DNA可通過經(jīng)由如卓樂(Zoller)和史密斯(Smith),1982,核酸研究(iVwc/e/c爿cW)70:6487-6500中所述的定點突變來修飾本發(fā)明的DNA堿基序列以使特定位點處的氨基酸被取代、缺失、插入或添加來獲得。啟動子本發(fā)明提供引起轉(zhuǎn)化植物的脅迫耐受性改良的核酸分子。本發(fā)明的一重要方面是使用DNA構(gòu)筑體，其中CBF基因或同源CBF基因核苷酸序列可操作地連接于一個或一個以上驅(qū)動所述CBF基因序列或CBF同源基因序列以組成性方式或在某些細(xì)胞類型、器官或組織中表達(dá)或驅(qū)動CBF基因序列或CBF同源基因回應(yīng)于脅迫(諸如水分脅迫和低溫)暴露而短暫表達(dá)的啟動子，以便改良轉(zhuǎn)化植物的脅迫耐受性而不會不適當(dāng)?shù)赜绊懫湔０l(fā)育或生理。根據(jù)本發(fā)明，所選啟動子應(yīng)引起CBF基因或CBF同源基因的表達(dá)，以調(diào)節(jié)宿主植物細(xì)胞或宿主植物的脅迫耐受性。合適的啟動子由以下X但不限于)說明組成性啟動子，諸如花椰菜花葉病毒CaMV35S、基于玉米Adhl的pEmu、水稻Actl和玉蜀黍Ubi啟動子；脅迫應(yīng)答啟動子，諸如擬南芥rd29A啟動子；和本文所揭示的脫水蛋白啟動子，包含由SEQIDNo:9、10或11代表的核酸序列，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少個40連續(xù)核苷酸且與具有SEQIDNO:9、10或11的脫水蛋白啟動子至少50%—致的核酸序列的片段或變異體。其它合適的啟動子揭示于美國專利6,380,459、美國專利申請案第10/702319號、美國專利申請案第10/717897號和美國專利申請案第10/703091號中，所述專利以引用的方式并入本文中。用于遺傳工程改造的植物本發(fā)明包含通過驅(qū)動CBF基因或CBF同源基因表達(dá)(優(yōu)選在如上文所述的啟動子的控制下)對植物進(jìn)行遺傳操縱以增強(qiáng)其脅迫耐受性。結(jié)果是脅迫耐受性增強(qiáng)。術(shù)語"植物"表示可進(jìn)行遺傳操縱的任何含有纖維的植物材料，包括(但不限于)31已分化或未分化植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、全株植物、植物組織或植物器官，或植物的任何組分，諸如葉子、莖、根、芽、塊莖、果實、根狀莖等?？筛鶕?jù)本發(fā)明進(jìn)行工程改造的植物包括(但不限于)樹，諸如桉樹屬物種和其雜交種(白桉(五.a/k)、白厚皮桉(Ea/6ew)、廣葉桉(Kawp/z/o//a)、杏仁桉(五.iw^gcfe//"fl)、香油桉(￡.arama/Wo/a)、比禾l)桉(五.6a"eya"a)、球冠桉(￡.6a〃oc/o"/e"J7、)、孟力口拉桉(五.邊沁桉(五.6e"A謹(jǐn)7)、雙肋桉W譜腦)、葡萄桉(五.6,o*)、短蕊桉(￡.6離—^a)、褐斑桉(五.6應(yīng)/畫)、短柱桉(￡.6固.外/h)、布羅維桉(￡.6nc^w—)、赤桉(￡.ca/羅Ww/era/s)、蠟桉(￡.cemcea)、昆斯蘭桉(￡.c/oez/tma)、聚果桉(￡.c頻/簡)、圓葉桉(五.corafato)、耶桉(￡.cw"幽)、粗皮桉(￡.co"/com)、常桉(￡.cre6ra)、科羅阿津高桉(￡.craa力'"go/e"^s)、柯氏桉(￡.cw"w7)、山桉(￡.fia/r，p/ea"a)、剝桉(￡.cfeg/寧a)、大桉(￡.de/eg她瞎、)、美脈桉(￡.de//Wa)、異色桉(￡.^vww'co/or)、異葉桉(K(^^^:/^//。)、豐桉(￡.Wves)、長果桉(E.cto歸麵f7a)、多里高桉(￡.i/mWgom^)、鄧達(dá)司桉(￡.dw"^m7)、鄧恩桉(￡.c/w""http://)、濱河白桉(￡.e/Wa)、紅盔桉(￡er;/Araco0^)、紅血桉(￡.er_yAro/7Wo/")、垂枝桉(￡.e"d^wo)、銀油桉(￡./a/cW")、合葉桉(Eg層p/^〃a)、蒼赤桉(￡.g/函'"a)、藍(lán)桉(￡.g/oW^)、藍(lán)桉雙肋桉亞種(Eg/o6w/wWcoWWa)、藍(lán)桉藍(lán)桉亞種(￡.g/o6w/ww^/.g/o6w/w)、石桉(￡.go"gy/ocarpa)、巨桉(￡.gra"ofe)、巨桉X尾葉桉(￡.gramfo;cwrap/^〃a)、黃剌桉(￡.gw!7/炒/d)、加檸桉(￡.gw""z7)、好木桉(￡/za〃")、金伯利白桉(￡./wwea"a)、杰克森桉(五.7"cfcyo"")、紅花小桉(￡./a"^fow"etma)、萊替斯桉(￡./ato/"era^)、鱗皮桉(￡./ewc叩/z/o/a)、白木桉(￡./ewcoxy/o")、落基桉(E/ocAye〃')、盧卡斯桉(￡./w謹(jǐn)'0、毛皮桉(￡.麵,7j訓(xùn)'!-)、直干桉(￡.畫Wem'/)、加拉桉(Ew一w齒)、大果桉(￡.weg謹(jǐn)啊)、蜜味桉(￡.we〃zWora)、斑點桉(￡.m/由"/畫)、小巾冒桉(￡.附Zcr歸，)、小套桉(￡.m/craA,)、粘皮桉(￡.羅e〃e"'畫)、亮果桉(￡.""面)、亮葉桉(五.""油)、斜葉桉oWZ,)、寬花桉(￡.。6to!y/翻)、西方桉(￡oc"We"tofc)、優(yōu)桉(￡.o;"ma)、卵葉桉(￡.ova")、厚葉桉(￡.pac^y/7/^〃a)、雪桉(五./aw";/7ora)、少花桉(￡.戸〃"a)、穿葉桉(￡.p""'"/a"a)、水藍(lán)桉(￡■p"/o/fln's)、彈丸桉(五.^/w/a&)、壺果桉(￡.p/pen7a)、闊葉桉(;/a(y;^y〃")、多花桉(丑;o(ycm^zew(W)、白楊桉(五.po/7"/wea)、鐘果桉(五./7"^j7'a"a)、假藍(lán)桉(五./7Je"dog/o6"/wj)、窄葉桉(￡.pw/c/ze〃")、放射桉(rad/加a)、放射桉放射桉亞種(jw^;.m&。/a)、王桉(￡.Mg""""、利生桉(En'Wom7)、羅伯特尼桉(￡.ro&r"om'z')、羅德威桉(￡.rodwy;Z)、河紅桉(￡.n<W￡/a)、赤褐桉(￡.rw6/g/"cwa)、柳葉桉(￡.^//g"a)、紅皮桉(￡.^/附畫;/7/o/a)、掃帚桉(￡."o戸/f/)、銀頂白蠟桉(￡.We6m')、濕地桉(￡.印W/m/fl/a)、斯待爾桉(￡.Wae〃')、猩紅桉(￡.Woa/e/)、窄葉白桉(￡.rem/^e;y)、銀桉(￡.Z麵i謂k)、細(xì)葉桉(￡.敏"'c簡.j)、四棱果桉(￡./e""go"")、澳大利亞紅桉(五.化,rado加a)、廷達(dá)萊斯桉(￡.//wda//"e)、珊瑚桉(￡./ow"a,a)、寬葉白桉(￡.wwZra)、尾葉桉(五.wro;/^〃a)、漆桉(￡.ver"/cosa)、多豐支桉v/w/waZ/jX革柔桉(￡".w\7"c/oo)、韋塔桉(Ew/\s)、威力斯桉(五.vn窗/)、威力斯桉鐮桉亞種(￡.w贏〃.y^/ci(/bnmj)、威力斯桉威力斯桉亞禾中(五.vv/〃/s//w6j1/7.w/〃/j77)、黃花桉(f.wooc/mwy^);楊屬物種和其雜交種(銀白楊(Z5a/6a)、銀白楊X大齒楊a/6ax尸gra"Wc^"/ara)、銀白楊X歐洲山楊(尸.a/6a;c尸加ww/a)、銀白楊X歐洲山楊腺毛楊變種(/>a/6ajc尸g/a"^/osa)、銀白楊X美洲山楊(尸.a/6axP"eww/oW^)、香脂楊(尸6aAso7m/era)、香月旨楊毛果楊亞禾中(尸6a/sam/en3！sw&p.Wc/ocar;a)、香月旨楊毛果楊亞禾中X美洲黑楊(P6fl^07m/emw&p.^*/c/wcw77fl!xde〃oZc/es)、緣毛楊(尸c"/ato)、美洲黑楊(尸.c/e/,oz如)、胡楊(尸Wca)、歐美楊(i5e謹(jǐn)證/畫a)、顫楊(尸A:"aA:a7m-e"w'51)、大葉豐局(P/as/ocarpa)、苦年湯(尸/awzyb//a)、遼豐li(尸.max/mow/cz〃)、遼楊X香月旨楊毛果楊亞禾中(Pmax/wovWcz〃x尸6a/iwm/eraw65p.Wc/zocarpa)、黑楊(尸."/gm)、曰本山楊X大齒楊(尸s/eZoW"x尸.gra"t/Zfife"^^a)、舌甘楊(尸s"aveo/e"s)、川楊(尸.szec/2wam'ca)、毛白楊(尸.詢e"f畫)、歐洲l山楊(尸.的應(yīng)/a)、歐洲山楊X美洲山楊(尸/"mw/ajc尸.kemw/o/des)、美洲山楊(尸.^"emw/oz'c/es)、椅楊(戶.vW&om7)、力口拿大楊(尸.ca"a&"w、)、滇楊(尸"朋訓(xùn)ew");針葉樹，諸如火炬松(火炬松(P/m/"ae&))、濕地松(濕地松("肌^///0"0)、美國西部黃松(美國西部黃松(戶!'"wspo"t/emsa))、扭葉松(扭葉松(尸Zmwcowo"a))和輻射松(輻射松(P/m^m^ato));花旗松((尸^i^o"wgawe"z/ew7));力口州鐵杉(加州鐵杉(7iwgaca"acfew"));美洲云杉(美洲l云杉(尸/ceag/awca));紅杉(紅杉(Se《wo/aww/7enn>e"s));真冷杉，諸如銀冷杉(銀冷杉(^^"wflW/"))和香脂冷杉(香脂冷杉(廟e"a/讀ea));雪松，諸如紅雪松(紅雪松(77w_/a/7"ca/￡/))和黃扁柏(黃扁柏(C7"mae《ypan^wo^aera"));柑橘樹物種，包括香櫞(C.m^/ca)、萊檬(C"wra""/o//a)、卡西大翼橙(C.檸檬(C)、柑橘(C.Wcw/齒)、臍橙(C.w'"畫;y)、葡萄柚(C.)、酸橙(C.aw層//,)、粗檸豐蒙(C._/aw6/zW)、柚(Cgm"d")、野橘(C./"c/,'c")、宜昌橙(C.,'c/""ge"j/j)、番橘(C.fac/n力謹(jǐn))、小花苦橙(C.脂.謹(jǐn)A");柑橘樹雜交種，包括巴勒斯坦甜萊檬(Palestinesweetlime)、香擰檬和沃爾卡默檸檬(Volkamerlemon)、蘭卜萊檬(Rangpurlime)和粗皮檸檬(Roughlemon);鱷梨樹(鱷梨(尸e^ea"wm'ca加M///))、番木瓜樹(番木瓜(Ojr/c"/7a;a少a))、肉豆蔻樹(肉豆蔻(Myristicainsipida))、阿月渾子樹(阿月渾子(泡ac,o謂))、獼猴桃樹(獼猴桃(^"mW/fl^Z/c/twaAC/iev.))和荷荷芭樹(荷荷芭(57wmom^/ac/n'we,、))。產(chǎn)纖維植物也包括在本文中。說明性作物是棉(棉屬(Go^//訓(xùn)spp.))、亞麻(亞麻(M"atow'wwm))、小蕁麻(異株蕁麻(LW/ca))、啤酒花(啤酒花(//www/ws/wpw/w))、椴樹(心葉椴(77/!'"coWato)、荷蘭椴樹(7:x.和歐椴大葉椴CT;Za妙一/ws))、鷹爪豆(鷹爪豆(SjfaW畫j'wwce訓(xùn)))、苧麻(苧麻(Boe/zmm'a))、構(gòu)樹(構(gòu)樹(^TOM^o"e0^/ap;;n/era))、新西蘭麻(NewZealandflax)(新西蘭麻(尸/zonm'i/m/e"ax))、羅布麻(羅布麻(^pocy"wmctmwa6〖"w附))、鸞尾屬(Iris)物禾中(道格拉斯鳶尾(/.cfowg/w/a"a)、長管鳶尾(/7w"cra^7/w")和佩地鳶尾(/./7wr辦/))、馬利筋(馬利筋屬(Ayc/e戸'")物種)、菠蘿和香蕉。短語"轉(zhuǎn)基因植物"是指并有包括(但不限于)以下的DNA序列的植物通常不存在于宿主植物基因組中的基因，通常不轉(zhuǎn)錄為RNA或翻譯為蛋白質(zhì)("表達(dá)")的DNA序列，或通常存在于非轉(zhuǎn)化植物中、經(jīng)遺傳工程改造或表達(dá)改變的任何其它基因或DNA序列。短語"轉(zhuǎn)基因植物"涵蓋由從轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞獲得的愈傷組織再生的初級轉(zhuǎn)化體(Ro植物)，以及從其種子得到的R,與R2后代，和Rq植物與R,和R2后代的無性繁殖衍生體。本發(fā)明還涵蓋使用Ro、！^或R2植物作為親本產(chǎn)生雜交種。預(yù)期在一些情況下，將通過穩(wěn)定引入轉(zhuǎn)基因使本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的基因組規(guī)模增加。然而，在其它情況下，所引入的基因?qū)⒅脫Q內(nèi)源性序列。根據(jù)本發(fā)明'在這點上，優(yōu)選基因是CBF基因或CBF同源基因。DNA構(gòu)筑體根據(jù)本發(fā)明的一個方面，將CBF基因或CBF同源基因序列并入適合于植物轉(zhuǎn)化的DNA構(gòu)筑體中。如上文所述，所述DNA構(gòu)筑體可用于調(diào)節(jié)CBF在植物中的表達(dá)。因此，提供DNA構(gòu)筑體，其包含受啟動子(諸如任何那些上文所述的啟動子)控制的CBF基因序列或CBF同源基因序列以使所述構(gòu)筑體可在宿主植物細(xì)胞中產(chǎn)生RNA。重組DNA構(gòu)筑體可使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制造。舉例來說，用于轉(zhuǎn)錄的DNA序列可通過用限制酶處理含有所述序列的載體以切除適當(dāng)區(qū)段來獲得。用于轉(zhuǎn)錄的DNA序列也可通過使合成寡核苷酸退火和連接或通過在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中使用合成寡核苷酸以在各末端產(chǎn)生合適的限制性位點來產(chǎn)生。接著將DNA序列克隆到含有上游啟動子和下游終止子序列的載體中。34本發(fā)明的表達(dá)載體也可含有終止序列，其位于本發(fā)明的核酸分子的下游，以使mRNA的轉(zhuǎn)錄終止；和所添加的polyA序列。所述終止子的實例是花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子和胭脂堿合成酶基因Tnos終止子。表達(dá)載體也可含有增強(qiáng)子、起始密碼子、拼接信號序列和靶向序列。本發(fā)明的表達(dá)載體也可含有可在培養(yǎng)物中鑒別轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的選擇標(biāo)記。所述標(biāo)記可與異源性核酸分子，即可操作地連接于啟動子的基因相關(guān)。如本文中所使用，術(shù)語"標(biāo)記"是指編碼允許選擇或篩選含有所述標(biāo)記的植物或植物細(xì)胞的性狀或表型的基因。通常標(biāo)記基因?qū)⒕幋a抗生素或除草劑抗性。這允許從未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。合適的可選擇標(biāo)記的實例包括腺苷脫氨酶、二氫葉酸還原酶、潮霉素(hygromydn)-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸苷激酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、草甘膦(glyphosate)和草銨膦(glufosinate)抗性和氨基-糖苷3'-0-磷酸轉(zhuǎn)移酶(卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)和G418抗性)。這些標(biāo)記包括對G418、潮霉素、博來霉素(bleomycin)、卡那霉素和慶大霉素(gentamicin)的抗性。構(gòu)筑體也可含有賦予對除草性草胺膦(phosphinothricin)類似物(如草丁膦銨(ammoniumgluphosinate))的抗性的可選擇標(biāo)記基因Bar(湯姆遜(Thompson)等人，1987,歐洲分子生物學(xué)組織會刊(EMBOJ.)9:2519-2523)。其它合適的選擇標(biāo)記為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知。也可包括細(xì)菌或病毒來源的復(fù)制序列以允許將載體克隆到細(xì)菌或噬菌體宿主中。優(yōu)選地，使用廣泛宿主范圍原核復(fù)制起點?？砂ㄓ糜诩?xì)菌的可選擇標(biāo)記以允許選擇帶有所需構(gòu)筑體的細(xì)菌細(xì)胞。合適的原核可選擇標(biāo)記也包括對諸如卡那霉素或四環(huán)素(tetracycline)等抗生素的抗性。如所屬領(lǐng)域中所已知，其它編碼另外功能的DNA序列也可存在于載體中。舉例來說，當(dāng)土壤桿菌屬(^gw6a"eWww)是宿主時，可包括T-DNA序列以促進(jìn)隨后轉(zhuǎn)移和并入到植物染色體中。植物轉(zhuǎn)化本發(fā)明的構(gòu)筑體可用于使用合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化任何植物細(xì)胞。單子葉植物與雙子葉被子植物或裸子植物的植物細(xì)胞都可以所屬領(lǐng)域已知的多種方式來轉(zhuǎn)化。舉例來說，參見克萊因(Klein)等人，1993,生物技術(shù)4:583-590;貝專納(Bechtold)等人，1993，法國巴黎科學(xué)院報告輯(CZ.v4c^.尸an、)斑1194-1199;本特(Bent)等人，1986,分子基因遺傳學(xué)(Mo/.Ge".)嵐383-396;帕組夫斯基(Paszowski)等人，1984，歐洲分子生物學(xué)組織會刊(房50J.)3:2717-2722;薩基(Sagi)等人，1994，植物細(xì)胞報告(P/"WCe〃化/.)":262-266。根據(jù)內(nèi)格爾(Nagel)等人，1990,M/craWo/丄",67:325，可使用例如諸如根癌土壤桿菌(A,wwe/ac/e"s)和發(fā)根土壤桿菌(AA/20ge"^)等土壤桿菌屬物種。土壤桿菌屬可通過電穿孔用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，隨后通過熟知葉盤方法將土壤桿菌屬引入植物細(xì)胞中。其它方法包括(但不限于)粒子槍轟擊、磷酸鈣沉淀、聚乙二醇融合、轉(zhuǎn)移到正萌發(fā)的花粉粒中、直接轉(zhuǎn)化(羅茲(Lorz)等人，1985，分子遺傳學(xué)(Mo/.)799:179-182)和所屬領(lǐng)域已知的其它方法。使用諸如卡那霉素抗性等選擇標(biāo)記允許快速鑒別成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。已知上述土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化方法適用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物。對于轉(zhuǎn)化谷類單子葉植物來說，參見德拉佩納(delaPena)等人，1987,自然(AWwe)J25:274-276;羅得斯(Rhodes)等人，1988，科學(xué)(Sc/e"ce)2W:204-207;和島本(Shimamato)等人，1989，自然(爆騰)325:274-276，所述文獻(xiàn)全部都以引用的方式并入本文中，已使用土壤桿菌屬進(jìn)行轉(zhuǎn)化。又參見貝專納(Bechtold)等人，1994，法國巴黎科學(xué)院報告輯(C/.厶^.戶a^)316,其展示使用真空侵入來進(jìn)行土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。可根據(jù)所屬領(lǐng)域中熟知的方法測量特定細(xì)胞中蛋白質(zhì)、多肽或核酸分子的存在以確定例如細(xì)胞是否已被成功地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。脅迫耐受性本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的特征為脅迫耐受性增強(qiáng)。短語"脅迫耐受性增強(qiáng)"是指當(dāng)與經(jīng)歷水分脅迫或冰凍脅迫后不存活或顯示顯著失水或凍傷的同一物種的野生型或非轉(zhuǎn)化植物相比時，轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)歷水分脅迫或冰凍脅迫暴露后存活且存活后維持其正常表型。術(shù)語"鍛煉"或"馴化"是指植物在低于最佳水分供應(yīng)的條件下生長。術(shù)語"冷馴化"是指植物暴露于冷鍛煉處理5到25日，其在于使所述植物暴露于高于冰點的低溫，同時降低光強(qiáng)度和減少日照時間。短語"水分脅迫"表示使未鍛煉的植物暴露于干燥條件(缺水)1到10日或直到凋萎點，隨后澆水和在室溫下24小時的恢復(fù)期，隨后轉(zhuǎn)移到22。C的溫室中。短語"干燥條件"或"缺水"是指可引起葉子開始、暫時或持久凋萎而不引起不可逆凋萎的條件。短語"開始凋萎"是指不易引起注意的葉子的凋萎階段。短語"暫時凋萎"是指特征為白天葉子明顯下垂、晚上植物恢復(fù)的凋萎階段。短語"持久凋萎""是指植物在整夜期間不會恢復(fù)的凋蔞階段。當(dāng)將水加到土壤中時，持久凋萎的植物可恢復(fù)原狀。除凋蔞外，葉子還可能會巻曲或扭曲，變皺，沿邊緣變成棕色(枯黃)，變黃，變成棕色和/或從樹上掉下。短語"長期持久凋萎"是指植物己達(dá)到凋萎點且在加水后不會恢復(fù)的階段。術(shù)語"凋萎點"是指植物需要不會不可逆地凋萎的土壤水分最小點且表示植物凋萎并在置于飽和氛圍中12小時時不會再恢復(fù)其膨脹度的水分減少極限。水分脅迫耐受性的增強(qiáng)可通過與同一物種的野生型或非轉(zhuǎn)化植物數(shù)目相比，在溫室中10日后對經(jīng)歷水分脅迫后存活的轉(zhuǎn)基因植物數(shù)目進(jìn)行計分來評估。水分脅迫耐受性的增強(qiáng)也可通過對暴露于水分脅迫后芽和葉子的凋萎程度進(jìn)行計分來評估。短語"冰凍脅迫"表示冷馴化的植物暴露于在0'C與-3(TC之間范圍內(nèi)的溫度2到72小時，隨后為4'C下的4到8小時恢復(fù)期，隨后轉(zhuǎn)移到22'C的溫室中。耐寒性的增強(qiáng)可通過與同一物種的野生型或非轉(zhuǎn)化植物數(shù)目相比，在溫室中1到5日后對經(jīng)歷冰凍脅迫后存活的轉(zhuǎn)基因植物數(shù)目進(jìn)行計分來評估。耐寒性的增強(qiáng)也可通過對在暴露于冰凍脅迫后葉子和芽的凍傷進(jìn)行計分來評估。以下呈現(xiàn)獲得包含CBF基因或CBF同源基因序列的DNA構(gòu)筑體以及通過土壤桿菌屬引入目標(biāo)基因以產(chǎn)生植物轉(zhuǎn)化體的方法的特定實例。這些實例旨在舉例且不對本發(fā)明作限制。實例l制備含有擬南芥屬CBF2基因的DNA構(gòu)筑體含有擬南芥屬CBF2(ACBF2)基因(基因庫保藏編號AF074601)和驅(qū)動ACBF2表達(dá)的擬南芥屬rd29A啟動子的質(zhì)粒pMEN068是從孟德爾生物技術(shù)公司(MendelBiotechnology,Inc)獲得。將pMEN68質(zhì)粒中的rd29A::CBF2::E9ter片段克隆到阿伯基因公司(ArborGen)主鏈pWVR5中。所述主鏈載體pWVR5是移除了35S啟動子GUS序列且NOS啟動子被來自擬南芥屬的UBQ10啟動子置換的pBI121載體(克隆技術(shù)實驗室公司(Clontechlaboratories),加利福尼亞州帕洛阿爾托(PaloAltoCA))(孫C,W(S叫C.W)和J卡利思(Callis,J)(1997)植物雜志(P/a""),11:101-111〉。接著獲得pABTV14質(zhì)粒。接著用Kpn1〃PstI將rd29A::CBF2::E9ter序列從pABTV14質(zhì)粒中消化出來且亞克隆到pAGF243質(zhì)粒(美國專利申請案第10/946622號)中以獲得pABCTE01質(zhì)粒(圖IA，SEQIDNO:12),其帶有阿伯基因公司(ArborGen)花粉控制序列盒PRMC2::芽孢桿菌RNA酶(barnase)H102E(美國專利申請案第10/946622號)。用NotI將4CLRNAi序列從pARB599(美國專利申請案第11/229856號)質(zhì)粒中消化出來且亞克隆到pABCTEOl質(zhì)粒(SEQIDNO:12)中以獲得pABCTE03B質(zhì)粒(圖IB,SEQIDNO:13)。這種質(zhì)粒含有三個序列盒rd29A::CBF2序列、花粉控制序列盒和4CLRNAi序列盒。使用pABCTEOl和pABCTE03B兩種質(zhì)粒進(jìn)行桉樹轉(zhuǎn)化。實例2表達(dá)CBF2基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物具有增強(qiáng)的耐凍性使用如P.J.格林(GreenP.J.)植物生理學(xué)(尸/a^'o/.)7/9:331-342(1999)所37述的真空侵入，用含有rd29A啟動子和J/CBF2基因的質(zhì)粒pMEN068轉(zhuǎn)化擬南芥屬植物。在室溫下使轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物的T2種子在皮氏培養(yǎng)皿(Petridish)的含有IXMS鹽和0.5%蔗糖加卡那霉素(35pg/ml)的瓊脂上發(fā)芽。在野生型對照擬南芥屬種子發(fā)芽的情況下，瓊脂中不添加卡那霉素。在22'C下在恒定光照下生長21日后，在4'C下在光照下培育在皮氏培養(yǎng)皿的瓊脂上生長的新植物幼苗以誘導(dǎo)rd29A啟動子，且接著在黑暗中暴露于-l(TC歷時8小時。冰凍脅迫后，將所述植物轉(zhuǎn)移到生長室(22°C)中以使其恢復(fù)。在22。C下恢復(fù)2日后，對經(jīng)歷冰凍脅迫后存活的植物數(shù)目進(jìn)行計分。9種帶有含有rd29A:JfCBF2序列的pMEN068的擬南芥屬轉(zhuǎn)基因植物中的8種顯示耐凍性增強(qiáng)。具體來說，rdCBF2-7植物在冰凍脅迫后維持其正常表型且顯示最佳存活率，其中69。/。的個別植物顯示耐凍性。相比之下，0.0%的野生型擬南芥屬植物經(jīng)歷沐凍脅迫后存活。(參見圖2)。表1總結(jié)結(jié)果。表1帶有JZCBF2基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物具有增強(qiáng)的耐凍性。植物編號表型植物的總數(shù)*存活植物的數(shù)目存活率(％)WT正常11900rdCBF2-l正常442045rdCBF2-3正常622134rdCBF2-5正常5300rdCBF2-6正常752533rdGBF2-7正常654569rdCBF2-9矮小645180rdCBF2-10正常713144rdCBF2-11正常NANANArdCBF2-12矮小684363rdCBF2-13半矮765775*轉(zhuǎn)基因植物的總數(shù)是從單個皮氏培養(yǎng)皿(150X100mm)收集，而相同數(shù)目的WT是從兩個皮氏培養(yǎng)皿收集。另外，當(dāng)與野生型擬南芥屬植物相比時，9種帶有含有rd29A:J/CBF2序列的pMEN068的擬南芥屬轉(zhuǎn)基因植物中的8種顯示在暴露于冰凍溫度后電解質(zhì)滲漏減少。rdCBF2-5是唯一在冰凍溫度下顯示電解質(zhì)滲漏增加的表達(dá)CBF2的擬南芥屬品種(參見圖3)。實例3桉樹IPB1克隆的轉(zhuǎn)化根據(jù)美國專利申請案第10/981742號中所述的方案，用質(zhì)粒pABCTE01(SEQIDNO:12)禾卩pABCTE03B(SEQIDNO:13)轉(zhuǎn)化桉樹IPB1克隆。實例4表達(dá)CBF2基因的轉(zhuǎn)基因桉樹植物具有增強(qiáng)的耐凍性測試帶有pABCTEOl質(zhì)粒的桉樹植物的增強(qiáng)的耐凍性。使帶有JK:BF2基因的轉(zhuǎn)基因桉樹植物和野生型桉樹植物在1加侖盆中生長20日。在轉(zhuǎn)基因柵欄區(qū)中馴化所述植物25日，隨后暴露于冰凍脅迫。對于冰凍脅迫測試來說，用塑料袋包裹所述盆以防止干燥且置于精確低溫生長室中。使植物暴露于在-2r與-6'C之間范圍內(nèi)的冰凍溫度48小時，使其在4。C下恢復(fù)8小時，且接著轉(zhuǎn)移到溫室中。在溫室中5日后，對經(jīng)歷冰凍脅迫后存活的植物數(shù)目和葉子和芽的凍傷進(jìn)行計分。圖4說明與非轉(zhuǎn)化桉樹植物相比顯示耐凍性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因桉樹植物。在測試條件下42棵帶有含有ACBF2基因的pABCTEOl質(zhì)粒的桉樹轉(zhuǎn)基因植物中的31棵顯示耐凍性增強(qiáng)?？偟恼f來，74。/。帶有CBF2基因的轉(zhuǎn)基因桉樹植物顯示耐凍性增強(qiáng)。相比之下，GUS或野生型桉樹對照植物遭受顯著損傷。表2總結(jié)測試的結(jié)果。表2帶有/4/CBF2基因的轉(zhuǎn)基因桉樹植物具有增強(qiáng)的耐凍性。轉(zhuǎn)基因品種編號耐凍性等級*1+-+4+-6-7++8+9+10++11+12++13++14+15++16++17-18++19-20-39<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>的13個氨基酸的39個堿基對。合成寡核苷酸(SEQIDNO:14和SEQIDNO:15)且使用PCR技術(shù)獲得EgCBFlcDNA的全長(SEQIDNO:5)。也使用PCR技術(shù)合成全長EgCBF3cDNA(SEQIDNO:7)和具有SEQIDNO:16和SEQIDNO:17的寡核苷酸。接著用限制酶SalI和NotI消化PCR產(chǎn)物且直接克隆到含有CaMV35S啟動子的pMEN203(由孟德爾生物技術(shù)公司(MendelBiotechnology)提供)中，產(chǎn)生pd35SEgCBFl和pd35SEgCBF3的構(gòu)筑體。這兩個構(gòu)筑體適合于轉(zhuǎn)化擬南芥屬，但不適合于轉(zhuǎn)化桉樹。使用限制酶PstI切除pd35SEgCBF3所帶有的35S::EgCBF3片段且將所得片段克隆到pWVCZ2，即使用pWVR5主鏈(參見實例1)且添加PRAG1啟動子(美國專利申請案第10/946,622號)和從密歇根技術(shù)大學(xué)(MichiganTechnologyUniversity)獲得的RNS2cDNA制造的質(zhì)粒中，，從而產(chǎn)生適合于轉(zhuǎn)化桉樹的pAB35SegCBF3。實例6赤桉(EMCfl/yp/MSCa/附d/rfM/e/ts/S)克隆的轉(zhuǎn)化使用美國專利申請案第09/153,320號中所述的方案，用質(zhì)粒pAB35SegCBF3轉(zhuǎn)化赤桉克隆。實例7來自桉樹的CBF基因同源物增強(qiáng)擬南芥屬和桉樹的耐凍性測試使用格林(Green)植物生理學(xué)(P/a^P/y/wW.)"9:331-342(1999)中所述的方法轉(zhuǎn)化的帶有pdS35EgCBFl質(zhì)粒(35S::EgCBFl)的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物的增強(qiáng)的耐凍性。如實例2中所述，使T2種子在皮氏培養(yǎng)皿的瓊脂上發(fā)芽且測試植物幼苗的耐凍性。帶有pdS35EgCBFl質(zhì)粒的擬南芥屬轉(zhuǎn)基因植物顯示耐凍性增強(qiáng)。具體來說，egcbfl-5和egcbfl-6植物顯示最佳存活率，其中43%的個別植物經(jīng)歷冰凍脅迫后存活。相比之下，0.0%的野生型擬南芥屬植物經(jīng)歷冰凍脅迫后存活。表3總結(jié)結(jié)果。表3帶有EgCBFl基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物具有增強(qiáng)的耐凍性。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>另外，對暴露于冰凍脅迫后擬南芥屬植物的葉子執(zhí)行的電解質(zhì)滲漏測定顯示，與非轉(zhuǎn)化擬南芥屬植物的葉子相比，表達(dá)pd35SegCBFl的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物的葉子顯示電解質(zhì)滲漏減少(參見圖5)。如實例4中所述，在一些微小改動下，測試如實例6中所述轉(zhuǎn)化且并有pAB35SegCBF3的轉(zhuǎn)基因赤桉植物的增強(qiáng)的耐凍性。在-3.5'C下使植物經(jīng)受脅迫24小時，且接著將溫度升到4'C整夜以使其恢復(fù)，隨后轉(zhuǎn)移到溫室中。轉(zhuǎn)移到溫室后3日記錄結(jié)果且展示于表4中。結(jié)果顯示當(dāng)與未轉(zhuǎn)化的對照植物或GUS對照植物相比時，過表達(dá)EgCBF3基因的6棵轉(zhuǎn)基因赤桉植物中的4棵(67%)具有增強(qiáng)的耐寒性。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>實例8桉樹CBF基因ed8.1的過表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥屬的耐凍性。如實例2中所述，使含有質(zhì)粒pABTV20(rd29A::ed8.1)的T2種子在皮氏培養(yǎng)皿的瓊脂上發(fā)芽且測試植物幼苗的增強(qiáng)的耐凍性。如通過冰凍脅迫后存活植物的數(shù)目所指示，當(dāng)與野生型(WT)相比時，IO個測試轉(zhuǎn)基因品種中的6個具有更佳耐凍性。所有非轉(zhuǎn)化(WT)擬南芥屬植物在相同冰凍脅迫條件下都死亡(表5)。表5表達(dá)ed8.1的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物具有增強(qiáng)的耐凍性。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>桉樹CBF基因ed8.1的過表達(dá)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因桉樹的耐凍性。如實例4中所述，在一些微小改動下，測試如實例3中所述轉(zhuǎn)化且并有質(zhì)粒pAGSM24(圖11B)的轉(zhuǎn)基因IPB1植物的增強(qiáng)的耐凍性。在-5。C下使植物經(jīng)受脅迫24小時，轉(zhuǎn)移到4。C下整夜，且接著移到溫室中。在溫室中5閂后，對經(jīng)歷冰凍脅迫后存活的植物數(shù)目和葉子和芽的凍傷進(jìn)行計分。結(jié)果顯示在室中測試的13個轉(zhuǎn)基因品種中的4個(31%)具有增強(qiáng)的耐凍性(表6)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>桉樹CBF同源物edC7.1和edC8.1、egCBFl和egCBF3回應(yīng)于寒冷而在桉樹中表達(dá)這些實驗設(shè)定成研究桉樹CBF同源物edC7.KedC8.1、egCBFl和egCBF3回應(yīng)于寒冷而在桉樹中的表達(dá)。使三棵盆栽IPB1植物在1加侖盆中生長直到約2英尺高且接著暴露于低溫(4°C)0.5小時、1小時、2小時或4小時。在每一時間點，對嫩葉取樣且立即處理用于總RNA提取。也在暴露于寒冷之前從植物取得葉樣品，且其稱為零時樣品。由從各葉樣品制備的總RNA合成Poly(A)RNA和相應(yīng)單鏈cDNA(sscDNA)。在25nlPCR反應(yīng)中使用lOngsscDNA禾Q10皮摩爾兩種基因特異性引物。PCR后，用DNA凝膠對IOpl各反應(yīng)液進(jìn)行電泳(參見圖13)。將這一實驗重復(fù)兩次。以下列出PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小。引物_預(yù)期產(chǎn)物_1.EdC7.1439bp2.EdC8.1483bp3.EgCBFl369bp4.EgCBF3431bp表7桉樹CBF同源物回應(yīng)于冷處理而在IPB1植物中的表達(dá)4'C下的暴露時間(小時)基因表達(dá)量*Ed7.1Ed8.1EgCBFlEgCBF3<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>*-,凝膠上無明顯PCR產(chǎn)物；+/-，凝膠上觀察到微量PCR產(chǎn)物；+,凝膠上觀察到低含量的PCR產(chǎn)物；++，凝膠上觀察到中等含量的PCR產(chǎn)物；+++，凝膠上觀察到高含量的PCR產(chǎn)物；++++，凝膠上觀察到極高含量的PCR產(chǎn)物。結(jié)果顯示桉樹CBF同源物edC7.1和edC8.1應(yīng)答低溫，且其表達(dá)受寒冷誘導(dǎo)。暴露于寒冷的最初30分鐘和直到4小時時觀察到冷誘導(dǎo)。egCBFl和egCBF3基因不受低溫誘導(dǎo)。實例11從桉樹植物分離和鑒別脫水蛋白啟動子從未經(jīng)處理或已經(jīng)受低溫馴化處理、隨后暴露于冰凍溫度脅迫的鄧恩桉和毛皮桉幼苗的葉子提取總RNA。低溫馴化處理方案由在1TC下8小時光照和在2.5。C下16小時黑暗歷時5日組成。在這5日時間結(jié)束時，在-5t:下使植物經(jīng)受冰凍脅迫2小時。從4個不同物種/處理組合收集植物材料，于液氮中速凍，且轉(zhuǎn)移到-8(TC下以在RNA提取之前進(jìn)行儲存。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從植物材料中提取總RNA。使用總RNA制劑產(chǎn)生富集各桉樹物種的冷誘導(dǎo)性基因的cDNA文庫。如本文所定義的冷誘導(dǎo)性基因是由于使植物暴露于低溫(4'C)而上調(diào)的基因。使用克隆技術(shù)公司(Clontech)PCR選擇cDNA扣減試劑盒(目錄號637401，克隆技術(shù)實驗室公司(ClontechLaboratoriesInc)，加利福尼亞州芒廷維尤(MountainViewCA)，寶生物公司(TakaraBioInc)的分公司)產(chǎn)生扣減cDNA文庫。對于兩個桉樹植物物種，從未經(jīng)處理的植物與低溫處理的植物獲得的cDNA文庫的比較允許從cDNA文庫扣減兩個不受植物暴露于低溫所影響的處理組共有的那些基因。接著將基因富集池中的其余cDNA分子克隆到高拷貝質(zhì)粒中且差示篩選冷誘導(dǎo)的基因。從各桉樹文庫中選擇出100個群落且分離質(zhì)粒DNA。由DNA制劑進(jìn)行兩次點印跡法。使用96孔點印跡裝置將各DNA樣品的等分試樣點到尼龍(nylon)膜濾器上。將各DNA樣品涂覆于兩個單獨膜濾器上。通過UV交聯(lián)使DNA固定于膜濾器上，隨后探測印跡。對于各樣品，用從未經(jīng)處理的樣品分離的cDNA文庫探測1個膜濾器，且用從經(jīng)受低溫的植物獲得的cDNA文庫探測第二個膜濾器。這種差示篩選方法允許鑒別和分離經(jīng)冷誘導(dǎo)的基因。認(rèn)為與從低溫處理的植物獲得的cDNA文庫強(qiáng)烈雜交、但不與從未經(jīng)處理的植物分離的cDNA文庫雜交的基因可能是冷誘導(dǎo)性的。認(rèn)為與來自低溫處理和未經(jīng)處理的植物的cDNA文庫同等良好雜交的那些基因不受低溫處理影響且因此不受關(guān)注。認(rèn)為與未經(jīng)處理的植物的cDNA文庫強(qiáng)烈雜交、但不與從低溫處理的植物獲得的cDNA文庫強(qiáng)烈雜交的基因受冷處理而下調(diào)，且因此不受關(guān)注。從各物種選擇約10-15個含有推定冷誘導(dǎo)性基因的克隆以作進(jìn)一步分析。使所選克隆經(jīng)受序列分析，且使用序列數(shù)據(jù)搜索Entrez數(shù)據(jù)庫中的類似序列。發(fā)現(xiàn)所述克隆與若千個不同基因類似。具體來說，一些克隆的序列與脫水蛋白基因的序列同源。因為已知脫水蛋白基因是冷誘導(dǎo)性的，所以這一情況備受關(guān)注。從鄧恩桉(SEQIDNO:9)和毛皮桉(SEQIDNO:10)分離的脫水蛋白同源片段在核苷酸水平上顯示相互極高程度的一致性(>98%);盡管其并不100%—致。選擇來自各物種的單一克隆以作進(jìn)一步分析。對從各物種分離的脫水蛋白同源DNA克隆進(jìn)行的基因組步移(genomewalking)導(dǎo)致克隆約600bp的啟動子片段。來自兩個不同桉樹物種的DNA片段顯示相互極高程度的一致性，其中兩個片段之間僅有偶爾單個堿基差異。DNA片段還含有兩個保守性CBF結(jié)合基序，此表明啟動子很可能是冷誘導(dǎo)性的。實例12通過暴露于低溫來在轉(zhuǎn)基因擬南芥屬和桉樹植物中誘導(dǎo)鄧恩桉和毛皮桉脫水蛋白啟動子的活性為了研究推定脫水蛋白啟動子的活性，將如實例6中所述獲得的啟動子片段克隆到pBlueScriptIISK(+)主鏈(斯曲特基因公司(Stratagene)，加利福尼亞州拉霍亞(LaJolla,CA))的GUS基因的上游。接著將這些啟動子::GUSIN序列盒克隆到pMEN20335S-CBF2(從孟德爾公司(Mendel)獲得；用啟動子::GUSIN序列盒置換35S::CBF2序列盒)中的E9ter的上游，產(chǎn)生擬南芥屬表達(dá)載體，含有從鄧恩桉分離的啟動子(SEQIDNO:9)的pAGW14(圖6A)和含有從毛皮桉分離的啟動子(SEQIDNO:10)的pAGW15質(zhì)粒(圖6B)。將這些載體轉(zhuǎn)化到土壤桿菌屬中，且使用土壤桿菌屬克隆轉(zhuǎn)化擬南芥屬。從帶有pAGW14或pAGW15質(zhì)粒DNA的若干個品種產(chǎn)生Tl植物、Tl種子、T2植物和T2種子。使T2種子發(fā)芽且將所得幼苗轉(zhuǎn)移到9"X4"盆中。使用由此獲得的植物幼苗研究推定脫水蛋白啟動子的活性。對9個pAGW14的轉(zhuǎn)基因品種和10個pAGW15的轉(zhuǎn)基因品種分析低溫對啟動子活性的誘導(dǎo)。使各轉(zhuǎn)基因品種的個別盆暴露于4'C歷時24小時。接著沿土壤線從根部切下個別植物，置于管中，于液氮中速凍，且儲存于-8(TC下以作進(jìn)一步分析。也收集、儲存尚未暴露于低溫處理的植物且用作對照組。通過實時逆轉(zhuǎn)錄酶QRT-PCR分析，使用TaqMan化學(xué)反應(yīng)，按照試劑盒制造商的說明書(斯曲特基因公司(Stratagene)QPCR母混合物，目錄號600549;斯曲特基因公司(Stratagene),加利福尼亞州拉霍亞(LaJollaCA))來測定所收集的組織樣品中的GUS表達(dá)。用斯曲特基因公司(Stratagene)Mx3000P實時PCR儀，在如下循環(huán)條件下進(jìn)行反應(yīng)95'C下2分鐘一個循環(huán)，隨后為40個循環(huán)(95°C、10秒+58'C、30秒)。兩個經(jīng)分離的脫水蛋白啟動子在所有轉(zhuǎn)基因品種中的活性都受低溫誘導(dǎo)。當(dāng)與未經(jīng)處理的轉(zhuǎn)基因植物相比時，在低溫處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥屬植物中，從鄧恩桉分離的脫水蛋白啟動子的活性增加10到194倍，且從毛皮桉分離的脫水蛋白啟動子的活性增加3到50倍。(參見圖7)。這些結(jié)果清楚地顯示經(jīng)分離的脫水蛋白啟動子片段具有冷誘導(dǎo)活性。46也通過使用實例6中所述的方案將質(zhì)粒pAGW16(SEQIDNO:18)和pAGW17(SEQIDNO:19)轉(zhuǎn)化到赤桉中來在桉樹中測試來自鄧恩桉和毛皮桉的脫水蛋白啟動子。通過將脫水蛋白啟動子片段克隆到pABTV16中的GUSIN::E9ter的上游來形成pAGW16和pAGW17，由此用脫水蛋白啟動子置換rd29A::GUSin序列盒的rd29A啟動子。使帶有pAGW16或pAGW17的赤桉植物各兩個品種經(jīng)受馴化條件5日，包含在18'C下光照9小時，隨后在4。C下遮光15小時。在臨起始冷馴化處理之前以及在5日實驗期結(jié)束時，對于各品種收集葉樣品。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從葉子分離RNA。如上文所述，通過QPCR，使用TaqMan化學(xué)反應(yīng)來分析GUS表達(dá)量。對于各轉(zhuǎn)基因品種，將GUS表達(dá)的基礎(chǔ)量(即，非冷處理樣品中的GUS表達(dá)量)指定值1，且相對于1計算出那個品種的冷處理樣品的倍數(shù)誘導(dǎo)。用pAGW16(SEQIDNO:18)轉(zhuǎn)化的兩個測試品種具有鄧恩桉脫水蛋白啟動子的24和57倍誘導(dǎo)且用pAGW17(SEQIDNO:19)轉(zhuǎn)化的兩個品種具有毛皮桉脫水蛋白啟動子的19和18倍誘導(dǎo)(參見圖9)。實例13通過暴露于低溫而在轉(zhuǎn)基因擬南芥屬中誘導(dǎo)美洲黑楊Src2啟動子的活性通過PCR從三角葉楊(美洲黑楊)克隆WV94分離SRC2同源啟動子序列PdSrc(SEQIDNO:11)且與GUS序列融合。亞克隆所得序列盒PdSrc::GUS質(zhì)粒DNA以獲得pSrc-GUS載體。將這一載體用于擬南芥屬轉(zhuǎn)化。使含有pSrc-GUS載體的兩個擬南芥屬轉(zhuǎn)基因品種暴露于低溫(4°C)24小時。通過使轉(zhuǎn)基因植物暴露于低溫而增強(qiáng)Src2啟動子的活性(參見圖10)。實例14帶有/tZCBFl基因的轉(zhuǎn)基因桉樹植物在田野中顯示耐寒性增強(qiáng)在2005年11月，將44棵帶有ACBF2基因(pABCTEOl)的轉(zhuǎn)基因桉樹IPB1品種植物、2棵帶有GUS載體的IPB1品種植物和若干棵非轉(zhuǎn)基因IPB1植物種在亞拉巴馬州洛克斯利(Loxley，Alabama)的田野中。測試中包括各轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因品種的8個復(fù)本。在2005-2006年冬季期間兩次評估由于暴露于冰凍溫度所引起的損傷。在2005年12月14日所執(zhí)行的第一次調(diào)查中，所有轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物看上去都生長良好且長有新芽和葉子。植物高度在7英寸到15英寸范圍內(nèi)。因為植物尚未暴露于低溫，所以沒有植物顯示任何寒冷損傷跡象。在2005年11月15日與2006年2月15日之間，測試田中的溫度計記錄到21個冰凍事件，在所述事件期間環(huán)境溫度等于或低于0°C(32下)。最長冰凍事件持續(xù)11小時且最短冰凍事件持續(xù)0.25小時。在這些事件中的3個事件期間，還記錄到環(huán)境溫度低于或等于-3.89。C(25°F),但高于-6.67。C(20°F)，總共10.25小時，最長事件持續(xù)5小時且最短事件持續(xù)1小時。總的說來，在21個冰凍事件期間累積有113.75小時冰凍。2006年2月15日后，未記錄到冰凍事件。在2005年11月15日與2006年2月15日之間，根據(jù)地下氣象(WeatherUnderground)的網(wǎng)站，在亞拉巴馬州(Alabama)的莫比爾機(jī)場(MobilAirport)有52日平均溫度低于12°C(53.6下)。所述機(jī)場位于田野測試場以西約15英里。介于0°。與12°C(32.0下與53.6°F)之間的溫度施加寒冷脅迫，但不是冰凍脅迫。在2006年3月3日執(zhí)行的第二次調(diào)查中，所有非轉(zhuǎn)基因植物和一些帶有XfCBFl基因的IPB1植物出現(xiàn)頂梢枯萎，即主莖頂部的部分死亡。下表8總結(jié)從2006年3月3曰的寒冷損傷調(diào)査獲得的結(jié)果。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>*頂梢枯萎百分?jǐn)?shù)是指植物主莖頂部的死亡部分相對于植物從土壤到芽尖的總高度的百分?jǐn)?shù)。頂梢枯萎百分?jǐn)?shù)的平均值是8個復(fù)本的平均值。某一植物品種的頂梢枯萎百分?jǐn)?shù)的平均值為值100的意思是所有8棵轉(zhuǎn)基因品種植物在調(diào)查時都已死亡。"使用對成對兩個樣品的平均值進(jìn)行的t-檢驗，以統(tǒng)計學(xué)方式分析非轉(zhuǎn)基因IPB1品種與轉(zhuǎn)基因IPB1品種之間的頂梢枯萎百分?jǐn)?shù)的平均值的比較。如果樣品缺少1個復(fù)本，那么通過假定方差相等對兩個樣品進(jìn)行t-檢驗來進(jìn)行分析。如果轉(zhuǎn)基因植物品種的頂梢枯萎百分?jǐn)?shù)的平均值大于非轉(zhuǎn)基因IPB1品種的值，那么不應(yīng)用t-檢驗且將樣品標(biāo)記為"na"(未應(yīng)用)。在2005-2006年冬季期間從田野測試獲得的結(jié)果表明，當(dāng)暴露于寒冷和/或冰凍溫度時，帶有/^CBF2基因的桉樹IPBl品種植物具有增強(qiáng)的耐受性。在如上文所述的冬季條件下，當(dāng)與非轉(zhuǎn)基因IPB1品種相比時，66%帶有ACBF2基因的桉樹IPB1品種植物(44棵中的29棵)顯示高度顯著0.01)的主芽頂梢枯萎減少，且59%(44棵中的26棵)顯示極高度顯著(p50.001)的頂梢枯萎減少。在田野中，一些帶有J《BF1基因的桉樹IPB1品種植物完全沒有頂梢枯萎，而100%的非轉(zhuǎn)基因IPB1植物出現(xiàn)頂梢枯萎。再過21個月后再次分析上述品種中的5個。從2006年3月到2007年12月，測試田中的溫度計記錄到37個冰凍事件，在所述事件期間環(huán)境溫度等于或低于0'C(32下)。最長冰凍事件持續(xù)14.75小時且最短冰凍事件持續(xù)0.25小時。在這些事件中的5個事件期間，還記錄到環(huán)境溫度低于或等于-3.89。C(25°F)，但高于-6.67。C(20°F)，總共28小時，最長事件持續(xù)10.75小時且最短事件持續(xù)2.25小時?？偟恼f來，在37個冰凍事件期間累積有197小時冰凍。下表9總結(jié)在2007年12月所評估的5個轉(zhuǎn)基因品種和對照品種的存活率、高度和生長數(shù)據(jù)。表9/^#薪存薪毐度"肌沐積獵教裙^沐凈全長離度"5好全長凈生長沐積潛號率積請7""J譜7教牟牟(^Y八"渭7牟/溜97%38.2'4.14"4.60789%18.4'2.07"3.994糾27100%37.1'4.02"4.19081%18.0'2.01"3.649#化100%35.7'3.63"3.30064%18.4'1.62"2.804#470100%34.6'3.22"2.50548%17.9'1.38"2.105#柳100%36.1'4.52"5.171100%17.9236"4.57487%37.0'3.46"3.10960%18.8'1.56"2.648在2006年7月和8月將以上5個品種種在亞拉巴馬州洛克斯利(Loxley,Alabama)的同一地點的另2個盆中且在2007年12月分析其存活率和生長。在亞拉巴馬州洛克斯利(Loxley,Alabama)記錄到的冰凍事件與上文對于2006年3月到2007年12月時期所列的事件相同，在3月與8月之間未記錄到冰凍事件。下表10(2006年7月種植)和表11(2006年8月種植)總結(jié)在2007年12月所評估的轉(zhuǎn)基因品種和對照品種的存活率、高度和生長數(shù)據(jù)。表1050<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>^辨薪存薪庸度Z)肌體積獵教裙對體凈毐度生長Z)5H主長凈微微生號舉⑨積rr,J，7(7"J2卯7長牟牟o^A"渭7牟36%12.0'1.02"0.116100%7.7'0.75"3.116100%16.2'1.81"0.39496%12.6'1.81"3.394#^5100%16.5'1.84"0.411100%12.5'1.82"3.41190%13.2'1.45"0.21352%9.3'1.44"3.213#柳100%16.5'1.83"0.40197%12.6'1.83"3.401#桐100%15.4'1.45"0.23557%11.8'1.44"3.235在南卡羅來納州薩默維爾(Summerville,SC)，在2006年7月種植以上測試的相同品種且在2007年12月進(jìn)行評估。從2006年7月到2007年12月，測試田中的溫度計記錄到27個冰凍事件，在所述事件期間環(huán)境溫度等于或低于Or(32°F)。最長冰凍事件持續(xù)16.25小時且最短冰凍事件持續(xù)0.5小時。在這些事件中的3個事件期間，還記錄到環(huán)境溫度低于或等于-3.89。C(25下)，但高于-6.67。C(20下)，總共21.5小時，最長事件持續(xù)11.5小時且最短事件持續(xù)2小時。在這些事件中的l個事件中，還記錄到環(huán)境溫度低于或等于-6.67。C(20下)，但高于-9.44。C(15°F),總共5.5小時?？偟恼f來，在27個冰凍事件期間累積有188.75小時冰凍。下表13總結(jié)在2007年12月所評估的5個轉(zhuǎn)基因品種和對照品種的存活率、高度和生長數(shù)據(jù)。表13滯辨l^存菸庸度"5好體釈潛教賴對^凈庸度生長Z)fi好主長凈體祝潛數(shù)生號率積2卯7(7"J2卯7長牟牟譜7年70%13.1'0.94"O.畫21%8.5'0.89"0.100100%19.0'1.86"0.479100%14.9'1.85"0.479#W5100%17.7'1.72"0.43090%13.7'1.73"0.43070%12.3'1.06"0.22647%9.0'1.05"0.226#柳80%15.6'1.34"0.25353%11.7'1.33"0.253#桐90%14.7'1.31"0.29662%ii.r1.31"0.296在南卡羅來納州布馳纖維農(nóng)場(BurchFiberFarm,SC)，在2006年7月種植以上測試的相同品種且在2007年11月進(jìn)行評估。從2006年7月到2007年11月，測試田中的溫度計記錄到47個冰凍事件，在所述事件期間環(huán)境溫度等于或低于0'C(32下)。最52長冰凍事件持續(xù)15.25小時且最短冰凍事件持續(xù)0.25小時。在這些事件中的18個事件期間，還記錄到環(huán)境溫度低于或等于-3.89。C(25°F)，但高于-6.67。C(20T)，總共94小時，最長事件持續(xù)14.25小時且最短事件持續(xù)1.5小時。在這些事件中的5個事件期間，還記錄到環(huán)境溫度低于或等于-6.67。C(20°F)，但高于-9.44。C(15下)，總共27.25小時，最長事件持續(xù)11.75小時且最短事件持續(xù)2.25小時。在這些事件中的1個事件期間，還記錄到環(huán)境溫度低于或等于-9.44。C(15°F)，總共4.25小時?？偟恼f來，在47個冰凍事件期間累積有327小時冰凍。下表14總結(jié)在2007年11月所評估的5個轉(zhuǎn)基因品種和對照品種的存活率、高度和生長數(shù)據(jù)。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>從田野測試獲得的結(jié)果有力地表明，當(dāng)暴露于寒冷和/或冰凍溫度時，帶有ACBF2基因的桉樹IPB1品種植物具有提高的存活率。實例15盆栽桉樹植物的冷脅迫揭露桉樹物種具有不同程度的耐寒性。冷脅迫是指介于O'C與12'C之間的低溫脅迫。因為桉樹物種在耐凍性方面無差異，所以執(zhí)行冷脅迫以檢驗寒冷而非冰凍對不同桉樹物種的影響。在O'C下使盆栽植物經(jīng)受脅迫6日且接著放回溫室。所測試的物種是毛皮桉、鄧恩桉、巨桉和赤桉。各盆含有兩棵或三棵植物。實驗結(jié)果顯示在0'C脅迫條件下6日觀察到寒冷損害或損傷。在所有情況下，赤桉植物受到嚴(yán)重?fù)p傷，而毛皮桉和鄧恩桉顯示在相同條件下無損傷(參見表15)。巨桉的耐寒性優(yōu)于赤桉，但劣于鄧恩桉。表15桉樹屬(Eucalyptusspp)所測試樹的數(shù)目葉子損傷的觀察結(jié)果赤桉鄧恩桉巨桉毛皮桉4490%的嫩葉受損嫩葉無損傷50%的嫩葉受損嫩葉無損傷實例16表達(dá)CBF2基因的轉(zhuǎn)基因桉樹植物對水分脅迫的抗性增強(qiáng)測試表達(dá)CBF2基因的轉(zhuǎn)基因IPB1桉樹植物對水分脅迫的耐受性。測試2個轉(zhuǎn)基因品種，TUH000427和TUH000435。使一棵轉(zhuǎn)基因IPB1樹苗和一棵野生型(WT)IPB1樹苗在l加侖盆中生長(參見圖14)。在測試時，盆中的植物高約3英尺。溫度和相對濕度分別維持在7(TF和65%。8日不對植物澆水。在8日時間結(jié)束時，植物上的所有葉子凋萎指示，盆中的植物嚴(yán)重脫水(參見圖15)。轉(zhuǎn)基因與WT植物之間未觀察到顯著差異。盆中的土壤非常干燥。接著對植物澆水。澆水后24小時，植物恢復(fù)不顯著且在WT與轉(zhuǎn)基因植物之間未檢測到差異。接著將盆轉(zhuǎn)移到溫室中且定期澆水歷時10日。在10日時間結(jié)束時，TUH000427轉(zhuǎn)基因品種植物已從水分脅迫完全恢復(fù)且大小有所生長。相比之下，同一盆中的WT植物以及生長于不同盆中的TUH000435轉(zhuǎn)基因品種植物已死亡(參見圖16)。再用兩盆相同植物重復(fù)實驗(參見圖17)。8日不對植物澆水。在8日時間結(jié)束時，植物凋萎(參見圖18)。接著對植物澆水且24小時后轉(zhuǎn)移到溫室中。生長于同一盆中的TUH000427轉(zhuǎn)基因植物與WT植物都經(jīng)歷脅迫后存活且恢復(fù)原狀。TUH000427轉(zhuǎn)基因植物恢復(fù)較快且遭受的葉子損傷比同一盆中的WT植物小(參見圖19)。IO日后生長于同一盆中的TUH000435轉(zhuǎn)基因植物與WT植物都死亡，不過轉(zhuǎn)基因植物的葉子較長時間保持綠色且當(dāng)與WT植物相比較時凋萎跡象出現(xiàn)較遲(參見圖19)。這些結(jié)果表明表達(dá)CBF2基因的IPB1桉樹植物對水分脅迫的耐受性增強(qiáng)。權(quán)利要求1.一種包含啟動子和所需基因的DNA構(gòu)筑體，其中所述啟動子驅(qū)動樹中的所述所需基因在所述樹暴露于脅迫條件后表達(dá)，同時減少與所述樹中的所述所需基因表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述所需基因是v4fCBF2。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述啟動子是擬南芥(^y^Wo;7^■//ana)rd29A啟動子。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子且所述所需基因是ACBF2。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述樹是選自由桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。6.—種包含含有啟動子和所需基因的DNA構(gòu)筑體的經(jīng)分離的樹細(xì)胞，其中所述啟動子驅(qū)動樹中的所述所需基因在所述樹暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與所述樹中的所述所需基因表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的經(jīng)分離的樹細(xì)胞，其中所述所需基因是J/CBF2。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的經(jīng)分離的樹細(xì)胞，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的經(jīng)分離的樹細(xì)胞，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子且所述所需基因是ACBF2。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的經(jīng)分離的樹細(xì)胞，其中所述脅迫條件是冰凍溫度。11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的經(jīng)分離的樹細(xì)胞，其中所述脅迫條件是約0r到約-30'C的冰凍溫度且所述時間段是約2小時到約72小時。12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的經(jīng)分離的樹細(xì)胞，其中所述樹是選自由桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鍔梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。13.—種轉(zhuǎn)基因樹，其包含根據(jù)權(quán)利要求6所述的經(jīng)分離的樹細(xì)胞。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹，其中所述樹是選自由桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鍔梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。15.—種從根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹獲得的木漿。16.—種從根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹獲得的薄板。17.—種從根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹獲得的妥爾油(talloil)。18.—種從根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹獲得的生物燃料。19.一種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹的方法，其包含(a)用包含可操作地連接于啟動子的所需基因的DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，其中所述啟動子驅(qū)動所述所需基因表達(dá)且減少與所述樹中的所述所需基因表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)；(b)在促進(jìn)樹生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，其中所述所需基因的產(chǎn)物在所述轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞中表達(dá)，且其中所述樹是在暴露于脅迫條件一段時間后展現(xiàn)不同于同一物種的非轉(zhuǎn)化樹的表型的轉(zhuǎn)基因樹。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述所需基因是ACBF2。21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子且所述所需基因是ACBF2。23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其還包含(c)在暴露于所述脅迫條件之前冷馴化所述轉(zhuǎn)基因樹。24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述脅迫條件是冰凍溫度。25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述脅迫條件是約0C到約-3(TC的冰凍溫度a所述時間段是約2小時到約72小時。26.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述樹是選自由桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。27.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中與同一物種的非轉(zhuǎn)化樹相比，所述轉(zhuǎn)基因樹展現(xiàn)特征為耐寒性增強(qiáng)的表型。28.—種增強(qiáng)樹的耐凍性的方法，其包含(a)用包含可操作地連接于啟動子的所需基因的DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞，其中所述啟動子驅(qū)動所述所需基因表達(dá)且減少與所述樹中的所述所需基因表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)；(b)在促進(jìn)樹生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化樹細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因樹；(c)使所述轉(zhuǎn)基因樹經(jīng)受冷馴化；(d)使所述轉(zhuǎn)基因樹暴露于冰凍溫度一段時間；和(e)使所述轉(zhuǎn)基因樹在促進(jìn)所述轉(zhuǎn)基因樹生長的條件下恢復(fù)。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述所需基因是乂/CBF2。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子且所述所需基因是ACBF2。32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述冰凍溫度是約0'C到約-30'C且所述時間段是約2小時到約72小時。33.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述樹是選自由桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。34.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中與同一物種的非轉(zhuǎn)化樹相比，所述轉(zhuǎn)基因樹展現(xiàn)特征為耐寒性增強(qiáng)的表型。35.—種由根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹制造木漿的方法，其包含(a)從所述轉(zhuǎn)基因樹的木材上移除樹皮；(b)分離所述木材中的纖維素纖維；和(c)溶解所述木材中的木質(zhì)素以獲得木漿。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其還包含漂白所述木漿以產(chǎn)生紙的步驟(d)。37.—種由根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹制造薄板的方法，其包含(a)將所述轉(zhuǎn)基因樹切割成原木；(b)從所述轉(zhuǎn)基因樹的所述原木上移除樹皮；(c)使所述原木暴露于高濕度48小時；和(d)將所述原木切成薄板以獲得切制薄板。38.—種由根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹制造妥爾油的方法，其包含(a)在壓力下用氫氧化鈉和硫化鈉消化木材；(b)冷凝所揮發(fā)的氣體以得到硫酸鹽松節(jié)油；(c)濃縮由此獲得的制漿溶液使得從表面上撇取不溶性皂；和(d)酸化所撇取的皂以產(chǎn)生粗妥爾油。39.—種由根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹制造生物燃料的方法，其包含將所述轉(zhuǎn)基因樹的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料的步驟。40.—種經(jīng)分離的聚核苷酸，其包含SEQIDNO:9的核酸序列。41.一種根據(jù)權(quán)利要求40所述的經(jīng)分離的聚核苷酸的經(jīng)分離的片段或變異體，其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸的核酸序列，所述核酸序列與SEQIDNO:9至少50%—致。42.—種經(jīng)分離的聚核苷酸，其包含SEQIDNO:10的核酸序列。43.—種根據(jù)權(quán)利要求42所述的經(jīng)分離的聚核苷酸的經(jīng)分離的片段或變異體，其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸的核酸序列，所述核酸序列與SEQIDNO:10至少50%一致。44.一種DNA構(gòu)筑體，其包含可操作地連接于選自由SEQIDNO:9和SEQIDNO:10組成的群組的核酸序列或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的片段或變異體的所需基因，所述核苷酸序列與選自由SEQIDNO:9和SEQIDNO:10組成的群組的核酸序列至少50%—致，其中所述核酸序列、其片段或變異體驅(qū)動植物中的所述所需基因在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與所述植物中的所述所需基因表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述脅迫條件是冰凍溫度。46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述脅迫條件是約0°C到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段是約2小時到約72小時。47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述所需基因在選自由桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組的樹中表達(dá)。48.根據(jù)權(quán)利要求44所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述所需基因在桉樹中表達(dá)。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述所需基因在鄧恩桉(Eucalyptusdunnii)中表達(dá)。50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述所需基因在毛皮桉(Eucalyptusmacarthurii)中表達(dá)。51.根據(jù)權(quán)利要求44所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述所需基因在楊樹中表達(dá)。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述所需基因在美洲黑楊(尸叩w/wde〃o油)中表達(dá)。53.—種DNA構(gòu)筑體，其包含至少一個可操作地連接于啟動子的包含選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:7組成的群組的序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的核苷酸序列至少70%—致的片段或變異體，其中所述經(jīng)分離的聚核苷酸、片段或變異體編碼CBF多肽且其中所述啟動子驅(qū)動植物中的所述CBF多肽在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與所述植物中的所述CBF多肽表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述脅迫條件是冰凍溫度。55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述脅迫條件是約0'C到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段是約2小時到約72小時。56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。57.根據(jù)權(quán)利要求53所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述啟動子是CaMV35S啟動子。58.根據(jù)權(quán)利要求53所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述啟動子是包含選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的片段或變異體，所述核苷酸序列與選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列至少50%—致。59.—種經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求53所述的DNA構(gòu)筑體。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述啟動子是CaMV35S啟動子。62.根據(jù)權(quán)利要求59所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述啟動子是包含選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的片段或變異體，所述核苷酸序列與選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列至少50%—致。63.根據(jù)權(quán)利要求59所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述植物是選自由擬南芥屬"mWc/opwW桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。64.—種轉(zhuǎn)基因植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求59所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞。65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。66.根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述啟動子是CaMV35S啟動子。67.根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述啟動子是包含選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸的核酸序列的片段或變異體，所述核酸序列與選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列至少50%—致。68.根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是選自由擬南芥屬、桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。69.—種產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包含(a)用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含至少一個可操作地連接于啟動子的包含選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:7組成的群組的序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的核苷酸序列至少70%—致的片段或變異體，其中所述經(jīng)分離的聚核苷酸、片段或變異體編碼植物轉(zhuǎn)錄因子且其中所述啟動子驅(qū)動植物中的所述植物轉(zhuǎn)錄因子在所述植物暴露于脅迫條件一段時間后表達(dá)，同時減少與所述植物中的所述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(b)在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)錄因子在所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)，且其中所述植物是在暴露于脅迫條件一段時間后展現(xiàn)不同于同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的表型的轉(zhuǎn)基因植物。70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中在暴露于所述脅迫條件之前冷馴化所述轉(zhuǎn)基因植物。71.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述表型是耐凍性且所述脅迫條件是冰凍溫度。72.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述冰凍溫度是約0'C到約-30。C且所述時間段是約2小時到約72小時。73.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。74.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述啟動子是CaMV35S啟動子。75.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述啟動子是包含選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的片段或變異體，所述核苷酸序列與選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列至少50%—致。76.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是選自由擬南芥屬、桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。77.—種由根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物制造木漿的方法，其包含(a)從所述轉(zhuǎn)基因植物的木材上移除樹皮；(b)分離所述木材中的纖維素纖維；和(c)溶解所述木材中的木質(zhì)素以獲得木漿。78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的方法，其還包含漂白所述木漿以產(chǎn)生紙的步驟(d)。79.—種由根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物制造薄板的方法，其包含(a)將所述轉(zhuǎn)基因樹切割成原木；(b)從所述轉(zhuǎn)基因樹的所述原木上移除樹皮；(c)使所述原木暴露于高濕度48小時；和(d)將所述原木切成薄板以獲得切制薄板。80.—種由根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物制造妥爾油的方法，其包含(a)在壓力下用氫氧化鈉和硫化鈉消化木材；(b)冷凝所揮發(fā)的氣體以得到硫酸鹽松節(jié)油；(c)濃縮由此獲得的制漿溶液使得從表面上撇取不溶性皂；和(d)酸化所撇取的皂以產(chǎn)生粗妥爾油。81.—種由根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物制造生物燃料的方法，其包含將所述轉(zhuǎn)基因樹的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料的步驟。82.—種增強(qiáng)植物的耐凍性的方法，其包含(a)用DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述DNA構(gòu)筑體包含至少一個可操作地連接于啟動子的包含選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:7組成的群組的序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的核苷酸序列至少70%—致的片段或變異體，其中所述經(jīng)分離的聚核苷酸、其片段或變異體編碼植物轉(zhuǎn)錄因子且其中所述啟動子驅(qū)動植物中的所述植物轉(zhuǎn)錄因子在所述植物暴露于脅迫條件后表達(dá)，同時減少與所述植物中的所述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(b)在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物；(c)使所述轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)受冷馴化；(d)使所述轉(zhuǎn)基因植物暴露于冰凍溫度一段時間；和(e)使所述轉(zhuǎn)基因植物在促進(jìn)所述轉(zhuǎn)基因植物生長的條件下恢復(fù)。83.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述冰凍溫度是約0'C到約-30。C且所述時間段是約2小時到約72小時。84.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。85.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述啟動子是CaMV35S啟動子。86.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述啟動子是包含選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的片段或變異體，所述核苷酸序列與選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列至少50%—致。87.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是選自由擬南芥屬、桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。88.根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法，其中與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物展現(xiàn)特征為耐寒性增強(qiáng)的表型。89.—種經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其表達(dá)由可操作地連接于啟動子的包含選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:7組成的群組的序列的聚核苷酸或其與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的核苷酸序列至少70%—致的片段或變異體編碼的植物轉(zhuǎn)錄因子，其中所述植物轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在所述植物細(xì)胞暴露于脅迫條件一段時間后由所述啟動子驅(qū)動，所述啟動子減少與所述經(jīng)分離的植物細(xì)胞中的所述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述脅迫條件是冰凍溫度。91.根據(jù)權(quán)利要求89所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述脅迫條件是約0'C到約-3(TC的冰凍溫度且所述時間段是約2小時到約72小時。92.根據(jù)權(quán)利要求89所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。93.根據(jù)權(quán)利要求89所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述啟動子是CaMV35S啟動子。94.根據(jù)權(quán)利要求89所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述啟動子是包含選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的片段或變異體，所述核苷酸序列與選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列至少50%—致。95.根據(jù)權(quán)利要求89所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述植物轉(zhuǎn)錄因子包含選自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8組成的群組的氨基酸序列，或其與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的核苷酸序列至少70%—致的片段或變異體。96.—種轉(zhuǎn)基因植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求89所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞。97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是選自由擬南芥屬、桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。98.—種由根據(jù)權(quán)利要求96所述的轉(zhuǎn)基因植物制造木漿的方法，其包含(a)從所述轉(zhuǎn)基因樹的木材上移除樹皮；(b)分離所述木材中的纖維素纖維；和(c)溶解所述木材中的木質(zhì)素以獲得木漿。99.根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其還包含漂白所述木漿以產(chǎn)生紙的步驟(d)。100.—種由根據(jù)權(quán)利要求96所述的轉(zhuǎn)基因植物制造薄板的方法，其包含(a)將所述轉(zhuǎn)基因樹切割成原木；(b)從所述轉(zhuǎn)基因樹的所述原木上移除樹皮；(C)使所述原木暴露于高濕度48小時；和(d)將所述原木切成薄板以獲得切制薄板。101.—種由根據(jù)權(quán)利要求96所述的轉(zhuǎn)基因植物制造妥爾油的方法，其包含(a)在壓力下用氫氧化鈉和硫化鈉消化木材；(b)冷凝所揮發(fā)的氣體以得到硫酸鹽松節(jié)油；(c)濃縮由此獲得的制漿溶液使得從表面上撇取不溶性皂；和(d)酸化所撇取的皂以產(chǎn)生粗妥爾油。102.—種由根據(jù)權(quán)利要求96所述的轉(zhuǎn)基因植物制造生物燃料的方法，其包含將所述轉(zhuǎn)基因樹的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料的步驟。103.—種轉(zhuǎn)基因植物，其表達(dá)包含選自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8組成的群組的氨基酸序列或其與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的氨基酸序列至少70%—致的變異體或片段的轉(zhuǎn)錄因子，其中所述植物轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在所述植物細(xì)胞暴露于脅迫條件一段時間后由啟動子驅(qū)動，所述啟動子減少與所述植物中的所述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)，且其中與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比，所述轉(zhuǎn)錄因子賦予所述轉(zhuǎn)基因植物增強(qiáng)的耐凍性。104.根據(jù)權(quán)利要求103所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。105.根據(jù)權(quán)利要求103所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述啟動子是CaMV35S啟動子。106.根據(jù)權(quán)利要求103所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述啟動子是包含選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的片段或變異體，所述核苷酸序列與選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列至少50%—致。107.—種由根據(jù)權(quán)利要求103所述的轉(zhuǎn)基因植物制造木漿的方法，其包含(a)從所述轉(zhuǎn)基因植物的木材上移除樹皮；(b)分離所述木材中的纖維素纖維；和(c)溶解所述木材中的木質(zhì)素以獲得木漿。108.根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法，其還包含漂白所述木漿以產(chǎn)生紙的步驟(d)。109.—種由根據(jù)權(quán)利要求103所述的轉(zhuǎn)基因植物制造薄板的方法，其包含(a)將所述轉(zhuǎn)基因樹切割成原木；(b)從所述轉(zhuǎn)基因樹的所述原木上移除樹皮；(c)使所述原木暴露于高濕度48小時；和(d)將所述原木切成薄板以獲得切制薄板。110.—種由根據(jù)權(quán)利要求103所述的轉(zhuǎn)基因植物制造妥爾油的方法，其包含(a)在壓力下用氫氧化鈉和硫化鈉消化木材；(b)冷凝所揮發(fā)的氣體以得到硫酸鹽松節(jié)油；(C)濃縮由此獲得的制漿溶液使得從表面上撇取不溶性皂；和(d)酸化所撇取的皂以產(chǎn)生粗妥爾油。111.一種由根據(jù)權(quán)利要求103所述的轉(zhuǎn)基因植物制造生物燃料的方法，其包含將所述轉(zhuǎn)基因植物的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為燃料的步驟。112.—種由轉(zhuǎn)基因植物制造木材的方法，其包含(a)用包含可操作地連接于啟動子的所需基因的DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述啟動子驅(qū)動所述所需基因表達(dá)且減少與所述植物中的所述所需基因表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)；(b)在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述所需基因的產(chǎn)物在所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)，且其中所述植物是在暴露于脅迫條件一段時間后展現(xiàn)不同于同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和(c)由所述轉(zhuǎn)基因植物制造木材。113.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中在暴露于所述脅迫條件之前冷馴化所述轉(zhuǎn)基因植物。114.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述表型是耐凍性且所述脅迫條件是冰凍溫度。115.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述冰凍溫度是約0'C到約-3(TC且所述時間段是約2小時到約72小時。116.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。117.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述啟動子是CaMV35S啟動子。118.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述啟動子是包含選自由SEQIDN0:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的片段或變異體，所述核苷酸序列與選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列至少50%—致。119.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述所需基因是^^CBF2。120.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述所需基因是包含選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5和SEQIDNO:7組成的群組的序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的核苷酸序列至少70%—致的片段或變異體。121.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述所需基因編碼包含選自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8組成的群組的氨基酸序列或其與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的氨基酸序列至少70%—致的變異體或片段的轉(zhuǎn)錄因子，且其中與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比，所述轉(zhuǎn)錄因子賦予所述轉(zhuǎn)基因植物增強(qiáng)的耐凍性。122.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹。123.根據(jù)權(quán)利要求122所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因樹是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。124.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物。125.根據(jù)權(quán)利要求124所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。126.根據(jù)權(quán)利要求122所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求96所述的轉(zhuǎn)基因植物。127.根據(jù)權(quán)利要求126所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。128.根據(jù)權(quán)利要求112所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求103所述的轉(zhuǎn)基因植物。129.根據(jù)權(quán)利要求128所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。130.根據(jù)權(quán)利要求112所述的轉(zhuǎn)基因方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是選自由桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。131.根據(jù)權(quán)利要求130所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。132.—種由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生生物能量的方法，其包含(a)用包含可操作地連接于啟動子的所需基因的DNA構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述啟動子驅(qū)動所述所需基因表達(dá)且減少與所述植物中的所述所需基因表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)；(b)在促進(jìn)植物生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述所需基因的產(chǎn)物在所述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中表達(dá)，且其中所述植物是在暴露于脅迫條件一段時間后展現(xiàn)不同于同一物種的非轉(zhuǎn)化植物的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和(c)由所述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生生物能量。133.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中在暴露于所述脅迫條件之前冷馴化所述轉(zhuǎn)基因植物。134.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述表型是耐凍性且所述脅迫條件是冰凍溫度。135.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述冰凍溫度是約0'C到約-3(TC且所述時間段是約2小時到約72小時。136.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述啟動子是擬南芥rd29A啟動子。137.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述啟動子是包含選自由SEQIDN0:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列的聚核苷酸，或其包含具有至少30個連續(xù)核苷酸且優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的片段或變異體，所述核苷酸序列與選自由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11組成的群組的核酸序列至少50%—致。138.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述所需基因是^fCBF2。139.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述所需基因是包含選自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5禾口SEQIDNO:7組成的群組的序列的經(jīng)分離的聚核苷酸，或其與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7的核苷酸序列至少70%—致的片段或變異體。140.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述所需基因編碼包含選自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:8組成的群組的氨基酸序列或其與SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的氨基酸序列至少70%—致的變異體或片段的轉(zhuǎn)錄因子，且其中與同一物種的非轉(zhuǎn)化植物相比，所述轉(zhuǎn)錄因子賦予所述轉(zhuǎn)基因植物增強(qiáng)的耐凍性。141.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹。142.根據(jù)權(quán)利要求141所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因樹是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。143.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物。144.根據(jù)權(quán)利要求143所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。145.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求96所述的轉(zhuǎn)基因植物。146.根據(jù)權(quán)利要求145所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。147.根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是根據(jù)權(quán)利要求103所述的轉(zhuǎn)基因植物。148.根據(jù)權(quán)利要求147所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。149.根據(jù)權(quán)利要求132所述的轉(zhuǎn)基因方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是選自由桉樹、白楊樹、柑橘樹、番木瓜樹、鱷梨樹、肉豆蔻樹、阿月渾子樹、獼猴桃樹和荷荷芭樹組成的群組。150.根據(jù)權(quán)利要求149所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是轉(zhuǎn)基因桉樹或其雜交種。151.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因樹，其中所述桉樹是選自由以下組成的群組的桉樹物禾中廣口十按(￡wca/;^Mscw2/7/(/b//a)、孟力口拉按(￡wca(y/^iw邊泌按(五Mca(yp/w516e"f/za附//)、赤桉(五wca(ypwsca/wa/c/w/e/w^)、多.里高桉(五wca(yp/iwc/orn'goe/w/i1)、只卩,暨、桉、藍(lán)桉(Ewca(ypZw51g/o6w/ws)、巨桉(五wca/;;;rt^gn^nc/h)、力口扦桉(^fiVc一/7/togwrn//)、毛皮桉、亮果桉(Ewc"/少/7加rt/飾s)、尾葉桉(Ewc"(y/7加wrap/z少〃a)、多枝桉(jEwca(yp^sv/附/"a/z')、巨桉X尾口十桉(Ewca(y//uygrcmcfo1x￡wco(y/^iwra;/zy〃fl)及其雜交禾中。152.根據(jù)權(quán)利要求68所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述桉樹是選自由以下組成的群組的桉樹物種廣葉桉、孟加拉桉、邊沁桉、赤桉、多里高桉、鄧恩桉、藍(lán)桉、巨桉、加檸桉、毛皮桉、亮果桉、尾葉桉、多枝桉、巨桉X尾葉桉及其雜交種。153.根據(jù)權(quán)利要求97所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述桉樹是選自由以下組成的群組的桉樹物種廣葉桉、孟加拉桉、邊沁桉、赤桉、多里高桉、鄧恩桉、藍(lán)桉、巨桉、加檸桉、毛皮桉、亮果桉、尾葉桉、多枝桉、巨桉X尾葉桉及其雜交種。154.根據(jù)權(quán)利要求6所述的經(jīng)分離的樹細(xì)胞，其中所述脅迫條件是水分脅迫且所述時間段是約1日到約10日或直到凋萎點。155.根據(jù)權(quán)利要求19、69、112或132所述的方法，其中所述脅迫條件是水分脅迫且所述時間段是約1日到約10日或直到凋萎點。156.根據(jù)權(quán)利要求44或53所述的DNA構(gòu)筑體，其中所述脅迫條件是水分脅迫且所述時間段是約1日到約10日或直到凋萎點。157.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因樹，其中所述脅迫條件是水分脅迫且所述時間段是約1日到約10日或直到凋萎點。158.根據(jù)權(quán)利要求59或89所述的經(jīng)分離的植物細(xì)胞，其中所述脅迫條件是水分脅迫且所述時間段是約1日到約10日或直到凋萎點。159.根據(jù)權(quán)利要求64、96或103所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述脅迫條件是水分脅迫且所述時間段是約1日到約10日或直到凋萎點。全文摘要本發(fā)明提供從鄧恩桉(Eucalyptusdunnii)和毛皮桉(Eucalyptusmacarthurii)分離出的新穎脫水蛋白(dehydrin)啟動子，其是冷誘導(dǎo)性啟動子且可用于驅(qū)動包括樹等植物的CBF基因增強(qiáng)對冰凍溫度或水分脅迫的耐受性并且減少與CBF基因表達(dá)相關(guān)的不當(dāng)效應(yīng)。文檔編號C12N15/29GK101646770SQ200880010701公開日2010年2月10日申請日期2008年3月28日優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日發(fā)明者張春生,柯克·福茨,特雷莎·巴拉斯,瑪麗昂·伍德,薩曼莎·阿比蓋爾·米勒,垣趙,金伯利·安·溫克勒申請人:阿博根有限公司