專利名稱：：用于預(yù)測結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在的方法和工具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于腫瘤診斷，更具體而言用于檢測結(jié)腸直腸腺癌的存在的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于執(zhí)行這些方法的引物和探針。
背景技術(shù)：
：胃腸道的結(jié)腸直腸部分的癌癥是頻繁發(fā)生的病癥。在第一個(gè)階段，良性腫瘤(腺瘤)發(fā)生，這可以變成惡性癌癥(腺癌)。并非所有腺瘤都進(jìn)展至癌。事實(shí)上這種進(jìn)展至癌僅在小部分腫瘤中發(fā)生。基因組不穩(wěn)定性的起始是關(guān)鍵步驟，并且在結(jié)腸直腸癌中以兩種方式發(fā)生(Lengauer等人(1998)Nature,396，643-649)。導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(縮寫為MSI或MIN)的DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷已得到最廣泛的研究(diPietro等人(2005)Gastroenterology,129，1047-1059)，但僅解釋了約15%的腺瘤進(jìn)展至癌。在結(jié)腸直腸腺瘤進(jìn)展至癌的其他85%的病例中，基因組不穩(wěn)定性在染色體水平(CIN)上發(fā)生，產(chǎn)生非整倍性。盡管長期以來這些染色體異常已視為繼發(fā)于癌癥發(fā)展的隨機(jī)噪聲，但目前已充分確定這些DNA拷貝數(shù)變化以特定模式發(fā)生，并且與不同臨床行為相關(guān)(Hermsen等人(2002).Gastroenterology123,1109-1119)。在結(jié)腸直腸癌中經(jīng)常報(bào)告的染色體異常是7pq、8q、13q、20q獲得和4pq、5q、8p、15q、17p、18q缺失。顯示8q、13q和20q獲得以及8p、15q、17p和18q缺失與結(jié)腸直腸腺瘤進(jìn)展至癌相關(guān)(上文引用的Hermsen等人(2002)。染色體臂20q的獲得是在結(jié)腸直腸癌中觀察到的最常見的獲得，在超過65%的病例中改變(Meijer等人(1998)J.Clin.Pathol.51,901-909)。在20q特別是區(qū)域20ql2_ql3上的獲得在其他類型的實(shí)體腫瘤中也常常得到描述，并且已與胃和結(jié)腸直腸癌的不良結(jié)局相關(guān)。檢測這些染色體異常的方法一般基于比較基因組雜交(CGH)。Rooney等人(2004J.Pathol.204，282-288)描述了定性PCR的使用，以檢測結(jié)腸癌中的基因ZNF217的基因復(fù)制。在盡可能早的階段中鑒定上述腺瘤至腺癌的進(jìn)展具有最大限度的臨床重要性，以允許癌的早期治療，同時(shí)避免不需要的手術(shù)干預(yù)。理想地，可以在惡性細(xì)胞的存在通過活組織檢查物或切除材料的原位光學(xué)分析或顯微鏡分析無法檢測的階段時(shí)鑒定腺癌。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于癌癥診斷，更具體而言用于鑒定結(jié)腸和/或直腸中的腺癌的存在的方法和工具。更具體而言，本發(fā)明提供了具有增加的靈敏度和可靠性、允許差異檢測癌的方法和工具。腺瘤可能發(fā)展或不發(fā)展成腺癌。然而，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是基于這些細(xì)胞的差異遺傳構(gòu)成，在非常早的階段時(shí)檢測例如腺瘤內(nèi)的惡性結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞。這種篩選可以使用非常靈敏的技術(shù)來進(jìn)行，從而使得可以檢測僅少量癌細(xì)胞的存在。這允許在癌細(xì)胞可以通過回波描記術(shù)、射線照相術(shù)或MRI(磁共振成像)檢測的階段前鑒定癌細(xì)胞的存在，并且允許檢測無需活組織檢查或切除術(shù)就可以獲自結(jié)腸的材料(例如糞便)中的腺癌細(xì)胞。本發(fā)明基于結(jié)腸直腸腺瘤至腺癌的進(jìn)展與腺瘤細(xì)胞染色體內(nèi)至少一個(gè)染色體獲得或缺失區(qū)域的出現(xiàn)相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明的目的在于通過直接或間接分析方法通過檢測這些獲得或缺失而精確地檢測癌細(xì)胞的存在。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了基于檢測包含與從結(jié)腸直腸腺瘤進(jìn)展到腺癌相關(guān)的染色體獲得或缺失的遺傳物質(zhì)的存在，檢測患者中的結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在的方法。更具體而言，提供了用于檢測患者中的結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在的體外方法，所述方法包括檢測患者的測試樣品的基因組DNA中一個(gè)或多個(gè)最小重疊區(qū)域(SRO)的獲得或缺失的存在的步驟，其中包含一個(gè)或多個(gè)SRO的獲得或缺失的遺傳物質(zhì)的存在指示患者中結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在。更具體而言，在本發(fā)明的方法中，一個(gè)或多個(gè)SRO選自-染色體8上的SR0_8p_l、SR0_8p_2、SR0_8p_3和SR0_8p_4，和/或-染色體8上的SR0_8q_l、SR0_8q_2、SR0_8q_3、SR0_8q_4、SR0_8q_5和SR0_8q_6，和/或-染色體13q上的SR0_13q_l、SR0_13q_2、SR0_13q_3、SR0_13q_4、SR0_13q_5和SR0j3q—6，和/或-染色體15上的SR0_15q_l、SR0_15q_2和SR0j5q—3，和/或-染色體17上的SR0_17p_l和SR0j7p—2，和/或-染色體18上的SR0_18q_l和SR0_18q_2，禾P/或-染色體20上的SR0_20q_l、SR0_20q_2和SR0_20q_3。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的每個(gè)染色體獲得或缺失區(qū)域的至少一個(gè)SRO的獲得或缺失的檢測，更具體而言在8q、13q和20q處的染色體獲得，以及在8p、15q、17p和18q處的染色體缺失。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括至少一個(gè)染色體區(qū)域的所有所述SROs的獲得或缺失的檢測。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括每個(gè)列出的染色體區(qū)域的所有所述SROs的獲得或缺失的檢測。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使用比較基因組雜交(CGH)，特別是陣列CGH檢測染色體獲得或缺失。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使用諸如熒光原位雜交、DNA印跡或雜合性缺失分析的技術(shù)檢測染色體獲得或缺失。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括通過采用SRO特異性引物對的PCR反應(yīng)檢測染色體獲得或缺失。在具體實(shí)施方案中，所使用的SRO特異性引物對定位接近于SRO的邊界，并且允許如本發(fā)明所公開的檢測SRO的缺失或獲得?？紤]了定量和定性PCR方法。更具體而言，用于檢測染色體缺失區(qū)域的SRO的SRO特異性引物對包含位于所述SR05'的正向引物和位于所述SRO3'的反向引物。在具體實(shí)施方案中，用于檢測染色體獲得區(qū)域內(nèi)的SRO的SRO特異性引物對包含所述SRO的3'區(qū)域內(nèi)的正向引物和SRO的5'區(qū)域內(nèi)的反向引物。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括通過定量PCR檢測位于一個(gè)或多個(gè)SR0s內(nèi)的序列而檢測染色體獲得或缺失。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使用MPLA(多重連接(multiplexligation)依賴性探針擴(kuò)增)檢測染色體獲得或缺失。在具體實(shí)施方案中，對患者的測試樣品執(zhí)行用于檢測患者中的結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在的本發(fā)明方法，所述測試樣品是包含來自結(jié)腸直腸癌活組織檢查或切除術(shù)的材料的樣品。可替代地，測試樣品包含來自糞便樣品的材料。進(jìn)一步可替代考慮的是對測試樣品執(zhí)行的方法，所述測試樣品包含來自組織或液體的材料，所述液體選自血液、尿、唾液和結(jié)腸液。本發(fā)明的方法特別適合于診斷結(jié)腸直腸腺瘤進(jìn)展至腺癌。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于檢測染色體缺失或復(fù)制的試劑盒，對于表1中所示的每個(gè)染色體區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)SROs，所述試劑盒包括在嚴(yán)格條件下與所述SR0內(nèi)的序列或者與位于所述SR0邊界3'或5'最多約lMb的基因組序列內(nèi)的序列特異性雜交的一種或多種寡核苷酸。在具體實(shí)施方案中，一種或多種寡核苷酸是SRO特異性PCR引物對。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，一種或多種寡核苷酸是SRO特異性探針。在進(jìn)一步的特別實(shí)施方案中，SRO特異性引物檢測表2的一種或多種標(biāo)記基因。因此，本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及本文提供的試劑盒用于體外測定患者樣品中的結(jié)腸直腸腺瘤細(xì)胞的存在的用途。更具體而言，試劑盒在用于測定結(jié)腸直腸病變的細(xì)胞中的染色體異常的方法中使用。當(dāng)已鑒定腺瘤細(xì)胞的存在時(shí)，本發(fā)明的方法和試劑盒可以用于體外測定結(jié)腸直腸腺瘤進(jìn)展至腺癌。根據(jù)下述詳述，結(jié)合舉例說明例如本發(fā)明原理的附圖，本發(fā)明的上述和其他特性、特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。這個(gè)說明僅為了舉例而給出，而不限制本發(fā)明的范圍。下文引用的參考圖指附圖。附圖簡述圖1示意性舉例說明使用定性PCR反應(yīng)檢測多核苷酸序列中的染色體缺失(A)或獲得(B)的原理。該圖顯示了在染色體異常前和后的部分基因組DNA。箭頭代表PCR引物。PCR片段(如果產(chǎn)生)的長度顯示在基因組DNA下。實(shí)施方案的詳述本發(fā)明將根據(jù)具體實(shí)施方案且參考某些附圖進(jìn)行描述，但本發(fā)明并不限于此，而僅由權(quán)利要求限制。權(quán)利要求中的任何參考標(biāo)記不應(yīng)解釋為限制范圍。所描述的附圖僅是示意性和非限制性的。在附圖中，為了舉例說明的用途，某些元件的尺寸可以是擴(kuò)大且不是按比例描繪的。當(dāng)術(shù)語"包含"在本說明書和權(quán)利要求中使用時(shí)，它不排除其他元件或步驟。當(dāng)使用不限定或限定項(xiàng)目的情況下提及單數(shù)名詞例如"一個(gè)"或"一種"、"該"時(shí)，這包括該名詞的復(fù)數(shù)，除非具體闡述另外的意思。此外，說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語第一、第二和第三等用于區(qū)分相似元件，并且不一定用于描述順序或年代次序。應(yīng)當(dāng)理解如此使用的術(shù)語在合適的環(huán)境下可互換，并且本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案能夠以除本文描述或舉例說明外的其他序列操作。下述術(shù)語或定義僅為了幫助理解本發(fā)明而提供。這些定義不應(yīng)解釋為具有小于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的范圍。定義如本文所使用的，"腫瘤"或"贅生物"指這樣的異常組織，其通過比正常更快速的細(xì)胞增殖而生長，并且在起始新生長的剌激停止后繼續(xù)生長。術(shù)語"病變"一般是指涉及由于任何疾病或任何損傷導(dǎo)致的任何組織或器官的異常，在本文中也用于指贅生物。腫瘤、贅生物或病變可以是良性或惡性的。"癌癥"是提及任何類型的惡性贅生物的通用術(shù)語。如本文所使用的，"腺瘤"指良性上皮贅生物。腺瘤通常是良好分界的，它們可以是扁平或息肉樣的，并且贅生細(xì)胞不浸潤或侵入鄰接組織。如本文所使用的，"腺癌"指上皮細(xì)胞的惡性贅生物。最通常地，癌形成腺體或腺樣模式。同義詞是"腺癌(glandularcancers)，，禾口"腺癌(glandularcarcinomas)，，。惡性細(xì)胞通常特征在于進(jìn)行性和不受控制的生長。它們可以局部或通過血流和淋巴系統(tǒng)傳播到身體的其他部分。結(jié)腸直腸腺瘤在年長群體中是常見的，但僅這些惡變前腫瘤的小部分(估計(jì)約5%)進(jìn)展至惡性腫瘤(即結(jié)腸直腸腺癌)。"進(jìn)展的腺瘤"是已具有癌癥病灶的腺瘤并且也稱為"惡性息肉"。"結(jié)腸直腸"指結(jié)腸和/或直腸，即完整的大腸。如本文所使用的，"染色體異常"指染色體缺失或獲得，即在染色體中已缺失或復(fù)制的區(qū)域。如本文所使用的，"標(biāo)記基因"指其表達(dá)在腺瘤和腺癌細(xì)胞之間有差別(減少或增加)的基因。"表達(dá)概況"指細(xì)胞或樣品中的許多標(biāo)記基因的表達(dá)水平。關(guān)于結(jié)腸癌預(yù)防居第二位的事情是早期診斷。存在結(jié)腸癌的5個(gè)階段(0-4)。這個(gè)分期系統(tǒng)反映癌癥的浸潤階段。一般而言，階段越早，癌癥就越容易治療。本發(fā)明提供了用于區(qū)分惡性和惡變前的結(jié)腸直腸病變以及用于診斷受試者中的結(jié)腸直腸癌的存在的方法和工具。例如，本發(fā)明的診斷方法可以可靠地檢測非常早期的結(jié)腸直腸癌。雖然結(jié)腸鏡檢查和乙狀結(jié)腸鏡檢查是用于早期檢測結(jié)腸直腸癌的最常用檢查，但它們不僅對于患者非常不舒適，而且它們僅允許檢測可見病變。此外，它們的靈敏度由執(zhí)行測試的醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)決定。當(dāng)通過組織學(xué)分析鑒定息肉以證實(shí)息肉性質(zhì)時(shí)，通常執(zhí)行在結(jié)腸鏡檢查過程中切除物或活組織檢查物的獲取。最近，基于DNA微陣列的腫瘤基因表達(dá)概況已用于癌癥診斷。然而，研究已局限于少數(shù)癌癥類型，并且具有使不同數(shù)據(jù)庫中的比較復(fù)雜化的擴(kuò)展多重技術(shù)平臺(tái)。在RNA或蛋白質(zhì)水平上執(zhí)行的表達(dá)分析具有許多缺點(diǎn)，首先與樣品的來源相關(guān)，即侵入性結(jié)腸鏡檢查的需要。此外，RNA或蛋白質(zhì)樣品容易被結(jié)腸或直腸的內(nèi)容物污染，這使后續(xù)分析復(fù)雜，或?qū)е麓治龅牟牧辖到?。此外，特別對于早期診斷，當(dāng)與周圍腺瘤組織的細(xì)胞群比較，樣品可能僅包含少量腺癌細(xì)胞時(shí)，通過此種少量腺癌細(xì)胞的異?；虮磉_(dá)的貢獻(xiàn)可能不會(huì)被注意到。因此，表達(dá)分析的靈敏度被限制。本發(fā)明基于因?yàn)橐韵掠^察結(jié)果超過85%的結(jié)腸直腸癌與染色體異常的存在相關(guān)的觀察，應(yīng)當(dāng)可以在基因水平上檢查這些癌癥，避免蛋白質(zhì)或RNA表達(dá)分析的缺點(diǎn)。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及體外方法，其中通過直接分析樣品的遺傳物質(zhì)中染色體異常的存在或不存在，將基因組DNA用于檢測患者中的結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞。已發(fā)現(xiàn)結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞顯示在8q、13q和20q處的染色體獲得，而染色體缺失在8p15q、17p或18q處遇到。患者樣品中包含一種或多種所述染色體異常的遺傳物質(zhì)的存在指示該患者中的結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在。因?yàn)檫@些染色體異常的存在是腺癌細(xì)胞相對于非惡性腺瘤細(xì)胞的特征，所以本發(fā)明的方法因此允許檢測良性結(jié)腸直腸腺瘤進(jìn)展至惡性癌。在本發(fā)明方法中使用的患者樣品是包含基因組DNA，更具體而言潛在包含源于患者中存在的癌細(xì)胞的基因組DNA的樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品包含患者的結(jié)腸直腸組織，更具體而言，樣品是或包含來自結(jié)腸直腸病變的活組織檢查物或切除物的遺傳物質(zhì)。然而，考慮到本發(fā)明方法的靈敏度，還可以使用包含極少量遺傳物質(zhì)的樣品。在具體實(shí)施方案7中，對來自機(jī)體的材料執(zhí)行本發(fā)明方法的基因組分析，所述材料包含來自結(jié)腸直腸病變的完整細(xì)胞或裂解細(xì)胞，例如糞便樣品。腺癌細(xì)胞可以侵襲其他組織。因此，本發(fā)明的方法也考慮了分析除來自結(jié)腸直腸活組織檢查物或切除物和糞便樣品外的測試樣品。還考慮了可以包含腺癌細(xì)胞或這些細(xì)胞的至少部分基因組DNA的樣品例如血液、尿、唾液的分析。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括比較獲自患者的樣品的基因組分析與對照。在本發(fā)明上下文中的合適對照包括不包含來自腺癌細(xì)胞的遺傳物質(zhì)的基因組DNA。一般地，合適的對照是來自未受影響的組織或來自不包含腺癌細(xì)胞的腺瘤組織的、來自相同患者的遺傳物質(zhì)。對照材料也可以是源于另一個(gè)患者或?qū)φ栈颊叩募?不包含來自腺癌細(xì)胞的遺傳物質(zhì))的遺傳物質(zhì)。由于包含8q、13q和20q處的染色體獲得和/或8p、15q、17p或18q處的染色體缺失的DNA材料的存在，基因組DNA可以通過任何遺傳分析技術(shù)進(jìn)行分析。雜合性缺失(LOH)可以使用多態(tài)性標(biāo)記來執(zhí)行。可替代地，使用雜交方法例如CGH(比較基因組雜交)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，使用CGH執(zhí)行本發(fā)明方法中染色體缺失和插入的檢測。在本文中測試樣品的基因組DNA與代表人基因組的基因組克隆陣列進(jìn)行雜交。CGH是確立的方法，這個(gè)操作的例子在本申請的實(shí)施例部分中詳細(xì)描述。CGH基于樣品DNA與矩陣上的DNA的雜交。基因組異常的存在基于與對照DNA相比雜交模式的差異進(jìn)行檢測。為了具有可靠結(jié)果，避免非特異性雜交。這例如通過使用升高的溫度、高鹽濃度和離液劑例如甲酰胺去除非特異性結(jié)合的DNA來執(zhí)行。這些參數(shù)中每一個(gè)的值依賴序列相似性程度和雜交配偶體的長度。合適的值在CGH陣列制造商的說明書以及參考書中存在，例如Sambrook等人(2000)inMolecularCloning,ALaboratoryManual,第3片反，ColdSpringHarborPress。例子是包含約50X甲酰胺、2xSSC，pH7或0.1M磷酸鈉、0.1%NonidetP40，pH8的溶液，其中SSC濃度為0.2-0.OlxSSC。通過在從腺瘤到癌的轉(zhuǎn)變后缺失或復(fù)制的染色體區(qū)域的精細(xì)作圖，已鑒定了先前與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的染色體缺失和獲得區(qū)域的最小區(qū)域。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方案涉及用于檢測患者樣品中結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在的方法，其包括檢測至少一個(gè)最小重疊區(qū)域(SR0)的獲得或缺失的存在。已對于與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的每個(gè)染色體獲得區(qū)域，更具體而言8q、13q和20q處的染色體獲得區(qū)域，以及每個(gè)染色體缺失區(qū)域，更具體而言8p、15q、17p或18q處的染色體缺失區(qū)域鑒定了最小重疊區(qū)域(SR0)。事實(shí)上，某些變化存在于發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的染色體異常的確切大小和位置。SR0s對應(yīng)于以下這些區(qū)域當(dāng)染色體獲得或缺失在分別的染色體區(qū)域上存在時(shí)，其總是獲得或缺失，并且因此代表其對應(yīng)的染色體缺失或獲得。對于每個(gè)染色體缺失或獲得區(qū)域鑒定的SR0s在表1中提供。表1:在結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞中的染色體異常的最小重疊區(qū)域。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>#:SRO區(qū)域在各自染色體上的定位，依照UCSC2003年7月的HumanGoldenPath的限定。因此，本發(fā)明檢測方法的具體實(shí)施方案包括用于與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)染色體缺失/獲得區(qū)域的表1的一個(gè)或多個(gè)SR0s的檢測。染色體異常區(qū)域縮小到SROs內(nèi)，允許檢測界限清楚的DNA區(qū)域。這種SRO特異性檢測可以例如通過(定量或定性)PCR來進(jìn)行。PCR的特異性和靈敏度使得可以檢測僅包含微量細(xì)胞或DNA或者僅包含來自結(jié)腸直腸病變的微量基因組物質(zhì)的樣品中的SROs。例如，糞便樣品可以包含從結(jié)腸直腸病變例如腺瘤性息肉中釋放的僅微量的細(xì)胞材料。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括檢測由MLPA描述的一個(gè)或多個(gè)SROs。在這種技術(shù)中，使用在樣品DNA上彼此鄰近雜交的2種探針。其后使探針連接，并且連接的探針代替樣品通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。在具體實(shí)施方案中，選擇探針，使得鄰近探針的靶序列是在SRO內(nèi)的序列。擴(kuò)增產(chǎn)物的量反映靶序列的相對拷貝數(shù)?？商娲?，可以選擇探針，使得擴(kuò)增子的大小或存在/不存在指示染色體異常。MLPA允許使用同時(shí)與染色體的不同部分雜交的不同探針對(每個(gè)產(chǎn)生特定長度的擴(kuò)增子)。因此，可以同時(shí)檢測不同SROs(Schouten等人2002，Nucl.AcidsRes.30(12)，e57)。可替代地，界限清楚的目的基因組區(qū)域的鑒定允許CGH技術(shù)的進(jìn)一步改善，由此僅使用針對特定目的區(qū)域的探針。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過測定8p上命名為SR0_8p_l、SR0_8p_2、SR0_8p_3和SR0—8p—4的一個(gè)或多個(gè)或所有區(qū)域的染色體缺失來測定樣品中結(jié)腸直腸腺瘤細(xì)胞的存在。另外或可替代地，通過測定8q上命名為SR0_8q_l、SR0_8q_2、SR0_8q_3、SR0_8q_4、SR0_8q_5和SR0_8q_6的一個(gè)或多個(gè)或所有區(qū)域的染色體獲得來測定樣品中結(jié)腸直腸腺瘤細(xì)胞的存在。另外或可替代地，通過測定13q上命名為SR0_13q_lSR0_13q_2、SR0_13q_3SR0_13q_4、SR0_13q_5和SR0_13q_6的一個(gè)或多個(gè)或所有區(qū)域的染色體獲得來測定樣品中結(jié)腸直腸腺瘤細(xì)胞的存在。另外或可替代地，通過測定15q上命名為SR0_15q_l、SR0_15q_2和SR0_15q_3的一個(gè)或多個(gè)或所有區(qū)域的染色體缺失來測定樣品中結(jié)腸直腸腺瘤細(xì)胞的存在。另外或可替代地，通過測定17p上命名為SR0_17p_l和SR0_17p_2的一個(gè)或兩個(gè)區(qū)域的染色體缺失來測定樣品中結(jié)腸直腸腺瘤細(xì)胞的存在。另外或可替代地，通過測定18q上命名為SR0_18q_l和SR0_18q_2的一個(gè)或兩個(gè)區(qū)域的染色體缺失來測定樣品中結(jié)腸直腸腺瘤細(xì)胞的存在。另外或可替代地，通過測定20q上命名為SR0_20q_l、SR0_20q_2和SR0_20q_3的一個(gè)或多個(gè)或所有3個(gè)區(qū)域的染色體獲得來測定樣品中結(jié)腸直腸腺瘤細(xì)胞的存在。最特別地，本發(fā)明提供了基于檢測與結(jié)腸直腸癌的發(fā)生相關(guān)的任何染色體缺失或獲得區(qū)域是否可以在患者的基因組物質(zhì)中檢測到，由此可以容易地檢測患者中的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的存在的方法。因此，本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案是指用于檢測腺癌細(xì)胞的方法，其包括測定表1中提及的染色體異常8p缺失、8q獲得、13q獲得、15q缺失、17p缺失、18q缺失和20q獲得中每一種的至少一個(gè)SRO的染色體獲得或缺失。在一個(gè)非常具體的實(shí)施方案中，通過測定表1中提及的染色體異常8p缺失、8q獲得、13q獲得、15q缺失、17p缺失、18q缺失和20q獲得中每一種的所有SRO的染色體獲得或缺失來執(zhí)行這種檢測。本發(fā)明的方法允許可靠檢測患者中的結(jié)腸直腸腺瘤細(xì)胞進(jìn)展至腺癌細(xì)胞。10根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括在PCR擴(kuò)增技術(shù)中通過SRO特異性引物對檢測上文描述的一個(gè)或多個(gè)SRO。SRO特異性引物對是這樣的引物對，當(dāng)用于擴(kuò)增基因組物質(zhì)時(shí)，其將依賴是否存在涉及SRO的染色體異常(獲得/缺失)而產(chǎn)生不同的擴(kuò)增子。當(dāng)使用SRO特異性引物對時(shí)，無需使用定量PCR方法就可以鑒定一個(gè)或多個(gè)染色體獲得和/或缺失。因此，在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了這樣的引物對，其檢測與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的染色體獲得和缺失區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)SROs的復(fù)制或缺失。更具體而言，本發(fā)明提供了表1中所示的SR0s的SRO特異性引物對。此外，本發(fā)明提供了適合于檢測根據(jù)本發(fā)明的SR0s組合，更具體而言用于檢測與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的每個(gè)染色體缺失或獲得區(qū)域的一個(gè)SRO的引物對的集合。進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及包含用于檢測本發(fā)明的每一SROs的引物的引物對的集合。缺失可以定性地檢測，例如通過位于染色體缺失區(qū)域的SRO5'的正向引物和位于染色體缺失區(qū)域的SRO3'的反向引物。當(dāng)該SRO的缺失(或染色體缺失)發(fā)生時(shí)，引物之間的基因組DNA的一部分不存在，并且導(dǎo)致比野生型(無染色體缺失)中小得多的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生。由具有缺失的區(qū)域擴(kuò)增的PCR片段小于完整染色體的片段。此種更小的片段將優(yōu)先擴(kuò)增，允許非常靈敏的檢測。此外或可替代地，可以縮短PCR反應(yīng)中的延伸時(shí)間，以阻止更長PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。復(fù)制或染色體獲得的發(fā)生可以例如通過如表1中命名的SRO的3'區(qū)域中的正向引物和5'區(qū)域中的反向引物進(jìn)行檢測。因?yàn)檫@些引物彼此"遠(yuǎn)離(pointaway)"，所以在沒有復(fù)制的情況下，染色體上將不存在PCR產(chǎn)物。檢測缺失或復(fù)制的概念在圖1中舉例說明。通過計(jì)算長度、GC組成和引物和模板之間的序列同一性程度來測定關(guān)于與PCR引物一起使用的嚴(yán)格條件?；陬A(yù)測的引物解鏈溫度，修改PCR擴(kuò)增的條件。PCR反應(yīng)中的嚴(yán)格性參數(shù)在很大程度上通過選擇PCR循環(huán)中的退火溫度來決定。不同軟件程序可用于在給定DNA序列中選擇具有所需解鏈溫度的PCR引物對，其是特異的且不彼此雜交，或形成發(fā)夾。任選地，通過執(zhí)行所謂的嵌套式PCR增加PCR反應(yīng)的特異性。用于擴(kuò)增基因組DNA的試劑盒可從例如Roche或Stratagene獲得。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括通過定量PCR檢測上文描述的一個(gè)或多個(gè)SRO。使用與位于目的SRO內(nèi)的序列退火的引物，樣品中這種序列的定量表達(dá)可以與對照(對照樣品中的相同區(qū)域或其他區(qū)域)進(jìn)行比較。類似地，使用MLPA，可以使用靶向染色體缺失或獲得區(qū)域內(nèi)的序列的引物對(MLPA)，導(dǎo)致反映靶序列的相對拷貝數(shù)的相對量的擴(kuò)增子的產(chǎn)生。在本發(fā)明的上下文中鑒定的位于SR0s內(nèi)的特異性靶序列，更具體而言，表1中鑒定的SROs，可以由技術(shù)人員容易地測定。盡管基本上基因組DNA的任何部分都適合于作為用于擴(kuò)增的靶，但在具體實(shí)施方案中，基因的一部分，更具體而言至少一個(gè)外顯子的至少一部分用作用于擴(kuò)增的靶。因此，本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案涉及檢測樣品中的結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在，所述方法包括定量檢測位于與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的SRO內(nèi)的DNA序列，更具體而言位于表1的SRO內(nèi)的序列的存在。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括使用對于SR0內(nèi)的序列特異的探針(SRO特異性探針)，通過基因組篩選而檢測上文描述的一個(gè)或多個(gè)SRO。類似于CGH技術(shù)，與對照基因組物質(zhì)比較，包含染色體異常的基因組物質(zhì)與對于SRO內(nèi)的序列特異的探針集合的雜交將產(chǎn)生不同信號(hào)。在本發(fā)明上下文中鑒定的位于SROs，更具體而言，表l中鑒定的SROs內(nèi)的基因可以由技術(shù)人員容易地測定。因此，在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了允許在包含基因組DNA的樣品內(nèi)檢測基因組物質(zhì)的存在的探針，所述基因組物質(zhì)包含與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的染色體獲得和缺失區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)SROs的復(fù)制或缺失。更具體而言，本發(fā)明提供了用于表1中所示的SROs的SRO特異性探針。此外，本發(fā)明提供了包含適合于檢測根據(jù)本發(fā)明的SROs組合，更具體而言適合于檢測與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的每個(gè)染色體缺失或獲得區(qū)域，即在8q、13q和20q處的染色體獲得區(qū)域和在8p、15q、17p或18q處的染色體缺失區(qū)域的一個(gè)SR0的探針。進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及包含用于檢測每一個(gè)本發(fā)明的SROs的探針。因此，一般地，本發(fā)明提供了包含一種或多種寡核苷酸的試劑盒，所述寡核苷酸在嚴(yán)格條件下與SRO內(nèi)的序列或與位于所述SRO邊界的3'或5'最多約1Mb的基因組序列內(nèi)的序列特異性雜交，其允許特異性檢測SRO。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面提供了針對與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的染色體獲得和缺失而鑒定的SROs的標(biāo)記基因。本發(fā)明的標(biāo)記基因是位于與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的染色體獲得和缺失區(qū)域內(nèi)的SRO內(nèi)的基因。更具體而言，本發(fā)明的標(biāo)記基因是位于表l中公開的SR0s內(nèi)，并且已顯示在腺瘤細(xì)胞和腺癌細(xì)胞之間具有差異表達(dá)的基因。本發(fā)明的標(biāo)記基因列表在下表2中提供。這些基因是特別感興趣的，因?yàn)樗鼈冊试S基因組篩選和平行表達(dá)分析。因此，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案涉及用于檢測患者中的結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的方法，其包括檢測表2中所示的一種或多種基因之一的基因組DNA的缺失或獲得。表2中的登記號(hào)指Genbank中的mRNA條目?；虻臉?biāo)識(shí)符在描述后的括號(hào)中指出?；蛎騝DNA的條目得到具有不同外顯子指示的基因組序列。表2:人標(biāo)記基因及其在特定SRO內(nèi)的定位。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>SRO-8q-4BC030520類似于假定蛋白質(zhì)F33H2.2-秀麗新桿線蟲，克隆MGC:40403IMAGE:5180533，m飄，完全cds。SRO-8q-6亂0326U翻_024035NM—032862蘭—017767NM一002346AF289596NM—012162AB051475SRO—13q_l翻—001260細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8(CDK8),mRM。麗—006646WAS蛋白質(zhì)家族，成員3(WASF3)，mRNA。SRO-13q_2U50531NM-145293U50524NM-033111SRO—13q一3NM一024808麗-014832麗-006002畫-005358麗_012158麗-015057ML024546BC026126IVA型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，成員3(PTP4A3),轉(zhuǎn)錄變體1,mRNA。假定蛋白質(zhì)MGC3113(MGC3113),mRNA。tigger轉(zhuǎn)座元件衍生的5(TIGD5)，mRNA。溶質(zhì)載體家族39(鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，成員4(SLC39A4)，m濕。淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座E(LY6E)，m濕?？寺p7882未知的mRNA。F-框和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白質(zhì)6(FBXL6),轉(zhuǎn)錄變體1,mRNA。KIAA1688蛋白質(zhì)的mRNA,部分cds。BRCA2區(qū)域，mRNA序列CG030。類似于假定蛋白質(zhì)FLJ20897(LOC196549)，m隨。BRCA2區(qū)域，mRNA序歹iJCG017。CG016(LOC88523),mRNA。假定蛋白質(zhì)FLJ22624(FIJ22624)，m飄。TBC1結(jié)構(gòu)域家族，成員4(TBC1D4),mRNA。遍在蛋白羧基末端酯酶L3(遍在蛋白巰基酯酶)(UCHL3),mRNA。4又LIM結(jié)構(gòu)域7(LM07),轉(zhuǎn)錄變體l,mRNA。F-框和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白質(zhì)3A(FBXL3A)，mRNA。KUA0916蛋白質(zhì)UIAA0916),mRNA。假定蛋白質(zhì)FLJ13449(FLJ13449)，mRNA。4艮定蛋白質(zhì)KIAA1165，克隆MGC:3415IMAGE:3027907，mRM,完整cds。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>NNL004738VAMP(液泡相關(guān)膜蛋白質(zhì))-相關(guān)蛋白質(zhì)B和C(VAPB)，m飄。NNL153360假定蛋白質(zhì)FU90166(FLJ90166),mRM。腿_080425GMS復(fù)合基因座(GNAS),轉(zhuǎn)錄變體3，mRM。NM—016397TH1-樣(果蠅)(TH1L),mRNA?！觥?06886ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運(yùn)，線粒體Fl復(fù)合物，s亞基(ATP5E)，編碼線粒體蛋白質(zhì)的核基因，mRM。NM一016045染色體20可讀框45(C20orf45)，mRNA。NM一000114內(nèi)皮素3(EDN3),mRNA?！?020673RAB22A，成員RAS癌基因家族(RAB22A),m飄。SRO-20q-3麗_003185TAF4RNA聚合酶II,TATA框結(jié)合蛋白質(zhì)(TBP)-相關(guān)因子，135kDa(TAF4),mRM。測—014054染色體20可讀框40(C20orf40)，mRNA。測_152255蛋白酶體(前體，macropain)亞基，a型，7(PSMA7)，轉(zhuǎn)錄變體2,riRIU。■—007002粘附調(diào)節(jié)分子l(ADRM1),mRNA。BC003122克隆IMAGE:3357127，oiRNA,部分cds。■-016354溶質(zhì)栽體家族21(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，成員12(SLC21A12)，m飄。NM—018270染色體20可讀框20(C20orf20)，niRNA。NM一001853膠原，IX型，a3(COL9A3),mRNA。NM—006602轉(zhuǎn)錄因子樣5(基本螺旋-環(huán)-螺旋)(TCFL5)，mRNA。■_022105死亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子l(MTFl),轉(zhuǎn)錄變體l,mRM。■—017896染色體20可讀框11(C20orfl1),mRNA。NM—022082染色體20可讀框59(C20orf59)，mRNA。■—015666GTP結(jié)合蛋白質(zhì)5(推定的)(GTPBP5),mRM。NM-144498氧基固醇結(jié)合蛋白質(zhì)樣2(OSBPL2),轉(zhuǎn)錄變體2,m醒。麗一017798染色體20可讀框21(C20orf21)，mRNA?！觥?12384糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白質(zhì)2(GMEB2)，mRM?！?032527^i定蛋白質(zhì)FLJ14972(KIAA1847),mRNA。BC025345類似于LOC149651,克隆MGC:39393IMAGE:4862156，m飄,完整cds。翻_033405過氧化物酶體增殖活化受體A相互作用復(fù)合物285(PRIC285)，m飄。在具體實(shí)施方案中，對基因的一部分執(zhí)行檢測(包含基因的至少部分內(nèi)含子或外顯子的檢測)。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，基因是癌基因。癌基因是在由于這種獲得而超量表達(dá)的獲得區(qū)域內(nèi)的，并且其功能暗示在癌癥中的作用的基因(例如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期基因等)。位于染色體20q中的此種基因的例子是C20orf24、AURKA、RNPCl、THlL、ADRMl、C20orf20和TCFL5。17因此，在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于特異性檢測本發(fā)明的標(biāo)記基因，更具體而言表2的標(biāo)記基因的引物對或探針。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含用于特異性檢測一種或多種標(biāo)記基因的引物或探針組合的引物或探針的集合，它們例如針對包含與結(jié)腸直腸腺癌相關(guān)的每個(gè)染色體異常的一種基因的標(biāo)記基因的集合。進(jìn)一步的實(shí)施方案涉及位于表1中鑒定的每個(gè)SRO內(nèi)的標(biāo)記基因的引物或探針組合。進(jìn)一步的具體實(shí)施方案涉及用于檢測一種或多種標(biāo)記基因的引物/探針或引物/探針集合，與腺瘤細(xì)胞比較，所述標(biāo)記基因在腺癌細(xì)胞中超量表達(dá)。進(jìn)一步的具體實(shí)施方案涉及用于檢測選自表2的一種或多種癌基因的引物/探針或引物/探針的集合。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面的引物特別適合于定量PCR。根據(jù)一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案，本發(fā)明的特異性探針特別適合于篩選陣列中的基因組物質(zhì)。本發(fā)明的具體和優(yōu)選方面在所附的獨(dú)立和從屬權(quán)利要求中闡述。適當(dāng)?shù)夭⑶也⒎莾H僅如權(quán)利要求中明確闡述的，來自從屬權(quán)利要求的特征可以與獨(dú)立權(quán)利要求的特征組合，并且與其他從屬權(quán)利要求的特征組合。體現(xiàn)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的其他安排對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。應(yīng)當(dāng)理解盡管優(yōu)選實(shí)施方案、特定構(gòu)建體和構(gòu)型以及材料已在本文中針對本發(fā)明的裝置進(jìn)行討論，但無需背離本發(fā)明的范圍和精神即可進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)的各種變化或修飾。實(shí)施例實(shí)施例1:20q的染色體獲得區(qū)域內(nèi)的最小重疊區(qū)域的測定腫瘤樣品的選擇和制備在荷蘭阿姆斯特丹的VU-大學(xué)醫(yī)學(xué)中心(VUmc)前瞻性收集41個(gè)福爾馬林固定且石蠟包埋的進(jìn)展腺瘤(其中已存在癌的病灶，也稱為惡性息肉)和73個(gè)快速冷凍的結(jié)腸直腸腫瘤(37個(gè)未進(jìn)展的腺瘤和36個(gè)癌癥)。所有樣品順應(yīng)機(jī)構(gòu)的倫理?xiàng)l例使用。41個(gè)惡性息肉(檔案材料)對應(yīng)于38個(gè)患者(19個(gè)女性和19個(gè)男性)，因?yàn)?個(gè)患者呈現(xiàn)超過一個(gè)惡性息肉?；颊叩钠骄挲g是67歲(范圍45-86歲)。從這些息肉，分開分析腺瘤和癌組分，加入總共分析的82個(gè)檔案樣品(41x2)。73個(gè)冷凍樣品對應(yīng)于65個(gè)患者(31個(gè)女性和34個(gè)男性)。其中，6個(gè)患者具有多發(fā)性腫瘤4個(gè)患者，多發(fā)性腺瘤和2個(gè)患者，接近于癌的1個(gè)或多個(gè)腺瘤?；颊叩钠骄挲g是69歲(范圍47-89歲)。在兩組樣品中執(zhí)行陣列-CGH，并且僅對冷凍組進(jìn)行表達(dá)微陣列。DNA的分離來自檔案樣品的DNA如先前詳細(xì)描述而獲得(Hermsen等人(2002)Gastroenterology,123，1109-1119)。根據(jù)供應(yīng)商的說明書用TRIzol試劑(Invitrogen，Breda，NL)分離來自快速冷凍組織的DNA。在NanodropND-1000分光光度計(jì)(Isogen，IJsselstein，NL)中測量DNA濃度和純度，并且在1%瓊脂糖凝膠中評估完整性，用溴化乙錠染色。陣列CGHa)用于比較基因組雜交(CGH)的陣列的產(chǎn)生使用包含約5000個(gè)DNA克隆的內(nèi)部印刷的全基因組BAC陣列。陣列包含具有沿1.OMb的完整基因組的平均分辨率的Sanger1Mb克隆集合、包含對應(yīng)于200種癌癥相關(guān)基因的約600個(gè)克隆的OncoBac集合(Caltech)，以及選擇的獲自Children'sHospitalOaklandResearchlnstitute(CHORI)和/或獲自Sanger的til印ath克隆集合的目的克隆，以填充染色體6上大于1Mb的任何缺口，并且具有在染色體8q22-q23、11q23、13q2l_q31和20ql2_ql3上的完全覆蓋的重疊群區(qū)域。根據(jù)Snijders等人(Snijders等人(2001)NatGenet，29，263-264，通過連接介導(dǎo)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來完成BAC克隆DNA的擴(kuò)增。所有克隆在CodelinkTM載玻片(AmershamBiosciences,Roosendaal，NL)上以150mM磷酸鈉，pH8.5中1iig/iil的濃度上一式三份地印刷，該印刷使用配備SMP3針(TeleChemInternational,Sunnyvale,CA，USA)的OmniGrid100微陣列儀(GenomicSolutions,AnnArbor，MI，USA)。印刷后，載玻片根據(jù)制造商的方案(Codelink載玻片;AmershamBiosciences,Roosendaal,NL)進(jìn)行力口工。b)標(biāo)記和雜交300ng腫瘤和參照(從來自10個(gè)健康女性或男性個(gè)體的外周血中分離的DNA合并物)DNAs通過隨機(jī)弓l物法(BioprimeDNALabelingSystem，Invitrogen，Breda，NL)進(jìn)行標(biāo)記。用s印hadex柱(ProbeQuantG-50MicroColumns-AmershamBiosciences,Roosendaal,NL)完成未摻入的核苷酸的去除。Cy3標(biāo)記的測試基因組DNA和Cy5標(biāo)記的參照DNA進(jìn)行組合，并且通過添加0.1體積的3M乙酸鈉(pH5.2)和2.5體積冰冷的100%乙醇與100iig人Cot-IDNA(Invitrogen,Breda，NL)—起共沉淀。通過在4。C下在14，000rpm下離心30分鐘來收集沉淀物。風(fēng)干后，將團(tuán)塊溶解于13ml酵母tRNA(100mg/ml，Invitrogen)和26ml20%SDS中，小心防止形成泡沫。在室溫下溫育15分鐘后，加入91ii1主混合物[14.3%(w/v)硫酸葡聚糖(USB)、50%(v/v)甲酰胺(Invitrogen)、2.9xSSCpH7.0(Sigma)-]，并且輕輕混合。在73。C下使DNA樣品變性10分鐘，隨后在37t:下溫育60分鐘，以允許Cot-IDNA阻斷重復(fù)序列。在雜交站(HybArrayl2TM-PerkinElmerLifeSciences,Zaventem，BE)中，使陣列在37。C下與變性且阻斷的雜交混合物溫育38小時(shí)。雜交后，在45t:在包含50X甲酰胺、2xSSC，pH7的溶液中將載玻片洗滌3分鐘，隨后為在室溫下用PN緩沖液(PN:0.1M磷酸鈉、0.l%nOnidetP40，pH8)、0.2xSSC、0.lxSSC和0.OlxSSC的1分鐘洗滌步驟。通過在室溫下在1000rpm下離心3分鐘使載玻片干燥。c)檢領(lǐng)lj陣列的圖像通過掃描(AgilentDNAMicroarray掃描儀G2505B-Agilenttechnologies,PaloAlto，USA)而獲得，并且Imagene5.6軟件(BiodiscoveryLtd,MarinadelRey，California)用于自動(dòng)特征提取(2個(gè)通道Cy3和Cy5的每個(gè)點(diǎn)的點(diǎn)分段以及信號(hào)和背景強(qiáng)度的定量)。使用不良質(zhì)量點(diǎn)的減弱的缺省設(shè)置。MicrosoftExcel圖表用于從測試和參照DNA的信號(hào)中值強(qiáng)度中扣除局部背景。對于每個(gè)BAC克隆計(jì)算一式三份點(diǎn)的中值，并且通過扣除染色體1-22上的BAC克隆的模式值來標(biāo)準(zhǔn)化21og比值(腫瘤/正常參考信號(hào))。如果3個(gè)點(diǎn)的強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差大于0.2，那么克隆從進(jìn)一步的分析中排除。此外，在所有腫瘤中具有超過20%漏失值的克隆也從進(jìn)一步的分析中排除?？紤]來自UCSC2003年7月的HumanGoldenPath的限定的克隆位置，完成所有19后續(xù)分析。d)數(shù)據(jù)分析拷貝數(shù)分段為了對DNA拷貝數(shù)變化(獲得和/或缺失)分段，應(yīng)用平滑算法"aCGH-Smooth"(Jong等人(2004)Bioinformatics,20，3636-3637)。平滑的21og比值-O.15和0.15用作閾值，基于對于15個(gè)正常與正常雜交獲得的99%置信區(qū)間(99%CIs)。僅包括覆蓋至少3個(gè)鄰接BAC克隆的獲得和缺失。當(dāng)21og比值超過1.0時(shí)，調(diào)用擴(kuò)增。在修飾版本的ArrayCGHbase(Menten等人(2005)BMCBioinformatics，6，124)中對DNA拷貝數(shù)數(shù)據(jù)評分。測定每個(gè)病例的中值絕對偏差(MAD)，作為評估陣列CGH質(zhì)量的參數(shù)。簡言之，計(jì)算來自所有常染色體的所有l(wèi)og2比值的中值，然后對于每個(gè)比值計(jì)算與中值的距離，并且最后所有距離的中值得到MAD值(deWiel，未公開的數(shù)據(jù))。進(jìn)一步分析僅具有MAD<0.2的病例。陣列-CGH概況在ArraCGHbase中得到顯現(xiàn)，并且輸出不同輸出文件用于下游應(yīng)用。鄉(xiāng)充i備斤使用TIGR多實(shí)驗(yàn)觀察器(TMev)完成非監(jiān)督聚類分析，其中應(yīng)用完全連鎖且使用Euclidian距離作為量度。對于監(jiān)督分析，使用CGHMultiArray(vandeWiel等人(2005)Bioinformatics,21，3193-3194)比較兩個(gè)組。對于相同腫瘤(腺瘤和來自相同進(jìn)展的腺瘤內(nèi)的癌組分)內(nèi)的病變之間的配對分析，并且基于對于平局進(jìn)行校正的Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)使用修改版本的CGHMultiArray。為了測定染色體20上的獲得的最頻繁最小重疊區(qū)域(SRO)，在所有病例中，使用STAC-異?？截悢?shù)的顯著性檢驗(yàn)(Diskin等人(2006).GenomeRes.16，1149-1158.)。結(jié)果如本發(fā)明中公開的SR0s的測定在本文中針對在20q處的染色體獲得區(qū)域詳細(xì)舉例說明。先前通過CGH分析的(上文引用的Hermsen等人(2002)前41個(gè)進(jìn)展的腺瘤(惡性息肉)通過陣列-CGH進(jìn)行分析，以便使20q上的獲得區(qū)域變窄。如其中所述，我們分開分析惡性息肉的腺瘤和癌組分的DNA拷貝數(shù)變化。在>20%的病例中觀察到lp、4、8p、14q、15q、17p和18的缺失以及l(fā)q、6p、7、8q、13q、17q、19p、20q和22q的獲得，其中8p和18缺失以及13q和20q獲得是最頻繁的，在超過35X的病例中發(fā)生。單獨(dú)的染色體20獲得在超過60%的病例中發(fā)生。在基因組范圍，拷貝數(shù)變化模式在進(jìn)展的腺瘤中的腺瘤和癌組分之間并無不同，即在癌組分中發(fā)現(xiàn)的異常已存在于腺瘤組分上，盡管具有較低頻率或幅度。接下來，分析37個(gè)非進(jìn)展的腺瘤和36個(gè)癌癥的拷貝數(shù)變化。在73個(gè)腫瘤中，67個(gè)(34個(gè)腺瘤和33個(gè)癌癥)顯示高質(zhì)量基因組概況(對應(yīng)于8%的中途退出)，由此顯示結(jié)果。在腺瘤中，異常的頻率明顯極低。相比之下，癌顯示頻繁的(>20%的病例)^、4、8p、14q、15q、17p和18缺失以及l(fā)q、6p、7、8q、13q、17q、19p、20q和22q獲得，其中8p和18缺失以及13q和20q獲得在超過35%的病例中存在(如在進(jìn)展的腺瘤中)。染色體20獲得在小于15%的腺瘤但超過60%的癌中發(fā)生，主要影響整個(gè)染色體或長臂，如在進(jìn)展的腺瘤中。這67個(gè)腫瘤(非進(jìn)展的腺瘤和癌)在DNA拷貝數(shù)概況上的等級聚類顯示癌和腺瘤明顯分成2個(gè)不同聚類，分別為聚類1和2，其中)^檢驗(yàn)p〈0.001。在搜索非進(jìn)展的腺瘤和癌之間顯著不同(P<0.05)的那些DNA拷貝數(shù)變化中，觀察到4q、8p、8q、13q、15q、18和20是相關(guān)區(qū)域，其中在20q上的基因座最顯著不同(p<0.00001)。為了測定具有在結(jié)腸直腸癌進(jìn)展中具有作用的假定癌基因的20q內(nèi)的最相關(guān)區(qū)域，將STAC應(yīng)用于石蠟包埋的惡性息肉(n=41)和冷凍癌(n=33)的組合集合。這些樣品的分析揭示在20q上的異常拷貝獲得的3個(gè)相關(guān)區(qū)域，1個(gè)跨4Mb(32-36Mb)，1個(gè)跨3Mb(56-59Mb)，并且第3個(gè)跨2Mb(61_64Mb)。這3個(gè)區(qū)域(最小重疊區(qū)域-SRO's)仍分別包含80、35和94種基因。這對應(yīng)于表1中對于20q列出的SR0s。對于與腺癌相關(guān)的其他染色體異常區(qū)域執(zhí)行類似分析，并且對于這些區(qū)域中的每一個(gè)所鑒定的SR0s也在表1中提供。實(shí)施例2:微陣列表達(dá)分析為了研究染色體不穩(wěn)定性對結(jié)腸直腸腺瘤至癌進(jìn)展中基因表達(dá)的影響，對一系列68個(gè)結(jié)腸直腸腫瘤(37個(gè)非進(jìn)展的腺瘤和31個(gè)癌)，通過陣列-CGH，分析整個(gè)基因組拷貝數(shù)變化，并且通過微陣列分析，分析表達(dá)水平。對于最頻繁發(fā)生類型的染色體異常即20q獲得，鑒定了在結(jié)腸直腸癌的進(jìn)展中發(fā)揮作用的假定癌基因。在表2中，提供了位于表1的SROs內(nèi)的基因的概述，當(dāng)比較結(jié)腸直腸腺瘤和腺癌組織時(shí)，如通過來自活組織檢查物或切除物樣品的mRNA的微陣列分析測定的，發(fā)現(xiàn)其具有顯著不同的表達(dá)(FDR<0，1(假測定率))。2權(quán)利要求用于檢測患者中結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在的體外方法，所述方法包括下述步驟檢測所述患者的測試樣品的基因組DNA中至少一個(gè)最小重疊區(qū)域(SRO)的獲得或缺失的存在，其中所述SRO選自-染色體8p上的SRO_8p_1、SRO_8p_2、SRO_8p_3和SRO_8p_4，和/或-染色體8q上的SRO_8q_1、SRO_8q_2、SRO_8q_3、SRO_8q_4、SRO_8q_5和SRO_8q_6，和/或-染色體13q上的SRO_13q_1、SRO_13q_2、SRO_13q_3、SRO_13q_4、SRO_13q_5和SRO_13q_6，和/或-染色體15q上的SRO_15q_1、SRO_15q_2和SRO_15q_3，和/或-染色體17p上的SRO_17p_1和SRO_17p_2，和/或-染色體18上的SRO_18q_1和SRO_18q_2，和/或-染色體20q上的SRO_20q_1、SRO_20q_2和SRO_20q_3，其中一個(gè)或多個(gè)所述SROs的獲得或缺失的存在指示所述患者中結(jié)腸直腸腺癌細(xì)胞的存在。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測包括每個(gè)染色體缺失或獲得區(qū)域的至少一個(gè)SRO的獲得或缺失，即在8q、13q和20q處的染色體獲得以及在8p、15q、17p和18q處的染色體缺失的檢測。3.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測包括至少一個(gè)染色體區(qū)域的所有所述SROs的獲得或缺失的檢測。4.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述檢測包括每個(gè)列出的染色體區(qū)域的所有所述SROs的獲得或缺失的檢測。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述染色體獲得或缺失的檢測使用比較基因組雜交來執(zhí)行。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述染色體獲得或缺失的檢測通過位于所述一個(gè)或多個(gè)SROs中的至少部分基因的定量PCR檢測來執(zhí)行。7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述SRO的染色體缺失的檢測通過PCR反應(yīng)來執(zhí)行，所述PCR反應(yīng)使用包含位于所述SRO5'的正向引物和位于所述SRO3'的反向引物的SRO特異性引物對。8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述SRO的染色體獲得的檢測通過PCR反應(yīng)來執(zhí)行，所述PCR反應(yīng)使用所述SR0的3'區(qū)域中的正向引物和所述SR0的5'區(qū)域中的反向引物。9.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述SRO的染色體獲得或缺失的檢測使用多重連接依賴性探針擴(kuò)增(MPLA)來執(zhí)行。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述測試樣品是結(jié)腸直腸腫瘤切除物或活組織檢查物。11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述測試樣品是糞便樣品。12.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述測試樣品是組織或液體的樣品，所述液體選自血液、尿、唾液和結(jié)腸液。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法用于診斷結(jié)腸直腸腺瘤進(jìn)展至腺癌的用途。14.用于檢測染色體缺失或復(fù)制的試劑盒，對于表l中所示的每個(gè)染色體區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)SROs，所述試劑盒包含在嚴(yán)格條件下與所述SRO內(nèi)的序列或者與位于所述SRO邊界3'或5'最多約lMb的基因組序列內(nèi)的序列特異性雜交的一種或多種寡核苷酸。15.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸是SRO特異性PCR引物對。16.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸是一種或多種SRO特異性探針。17.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸是特異性擴(kuò)增SRO內(nèi)的核苷酸序列的引物對。18.根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述一種或多種寡核苷酸是各自特異性擴(kuò)增表2的標(biāo)記基因序列的引物對。19.根據(jù)權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的試劑盒用于體外測定結(jié)腸直腸病變的遺傳物質(zhì)中的染色體異常的用途。20.根據(jù)權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的試劑盒用于體外測定結(jié)腸直腸腺瘤進(jìn)展至腺癌的用途。全文摘要本發(fā)明公開了用于在基因水平上可靠檢測患者中的腺癌細(xì)胞的存在的方法和工具。本發(fā)明對與腺瘤進(jìn)展至腺癌細(xì)胞相關(guān)的染色體異常區(qū)域精細(xì)作圖，并且提供基于其的檢測方法和工具。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101711285SQ200880011087公開日2010年5月19日申請日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2007年4月5日發(fā)明者B·平托莫賴斯德卡瓦爾霍,G·A·梅杰申請人:基督教高等教育科學(xué)研究及病人護(hù)理協(xié)會(huì)