專利名稱：農(nóng)作物和園藝作物品質(zhì)特征的確定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及品質(zhì)特征的標記物的確定和，與之相關(guān)的，通過分子、 生物學技術(shù)確定農(nóng)產(chǎn)品和園藝產(chǎn)品的最佳收獲時間和/或最佳釆后途 徑。
背景技術(shù)：
對于生產(chǎn)者、商業(yè)和消費者來說，測定新鮮農(nóng)產(chǎn)品和園藝產(chǎn)品的 品質(zhì)變得越來越重要。對品質(zhì)的重要性的認識也明顯增加。對可食用 產(chǎn)品的新鮮度，外部特征，氣味和香味提出了嚴格的要求。為了盡可 能的保證品質(zhì)，在商業(yè)生產(chǎn)鏈中引入了 "跟蹤與追溯"系統(tǒng)，為了滿 足這些更加嚴格的要求，對釆后途徑進行了優(yōu)化。由于運輸和儲存條 件不斷變化，迫切需要允許客觀測定質(zhì)量特性(質(zhì)量參數(shù))的測試系 統(tǒng)來確定品質(zhì)，預測將來品質(zhì)或改善品質(zhì)。
品質(zhì)是硬(很好測定)品質(zhì)因素和軟(難以測定并且經(jīng)常很主觀) 品質(zhì)因素的結(jié)合體。軟因素，例如受損壞程度，味道、氣味或香味， 癥狀和健康以及疾病的內(nèi)容有時很容易主觀上確定，但通常很難量
化。硬因素，例如顏色、酸度(pH)、硬度、糖含量，尺寸或長度以 及重量通?？杀贿m當?shù)囟繙y定。 一些品質(zhì)因素，例如休眠狀態(tài)(睡 眠深度)或發(fā)展階段只有在它們根據(jù)例如特定階段或特定狀態(tài)可測的 分子標記物是可被定量測定時才是硬因素。軟因素如果與一個數(shù)量范 圍相關(guān)才是有用的。例如其可以通過將品質(zhì)參數(shù)和參考數(shù)值進行對比 而作出，例如良好品質(zhì)被設(shè)置為100%的參考值和不好品質(zhì)被設(shè)置為 0%的參考值。然后通過測定相對于該參考值的相對值獲得該參數(shù)的 一個(部分)品質(zhì)值的數(shù)量范圍。然后確定自由巿場過程中，特定品 質(zhì)參數(shù)和特定農(nóng)產(chǎn)品和園藝產(chǎn)品的軟品質(zhì)參數(shù)和硬品質(zhì)參數(shù)，什么數(shù)
8值范圍是可以接受的。
產(chǎn)品品質(zhì)主要通過一個以上的品質(zhì)參數(shù)，經(jīng)常是很多個參數(shù)來確 定。這并非必需，因此在某一特定時刻，或在經(jīng)過特定的采后處理之 后，不同品質(zhì)參數(shù)的值全部落在該待測產(chǎn)品的最佳范圍內(nèi)。例如，最 佳的味道并不必與最佳重量或最佳顏色緊密聯(lián)系在一起。通常，總的 產(chǎn)品品質(zhì)是全部品質(zhì)因素值的折中。產(chǎn)品品質(zhì)還取決于所需巿場或在 一年中的時段。產(chǎn)品可能在當?shù)亟灰?，以致其他的品質(zhì)因素比產(chǎn)品被 儲存或運輸時更相關(guān)。而且，被認為是最佳品質(zhì)參數(shù)的范圍可以變動。 然而，根據(jù)品質(zhì)參數(shù)，數(shù)值范圍可被表示為那種特定狀況下認為是最 佳的范圍。但是，這些范圍在另外的狀況下不一定是最佳值，這是因 為總的產(chǎn)品品質(zhì)由許多品質(zhì)因素確定。在一種具體情況下， 一種特定 的質(zhì)量參數(shù)排名較低，因為在這種特定情況下另一個參數(shù)更加重要， 以致于第一個質(zhì)量參數(shù)在那時最終無法達到最佳值。
采后途徑對不同品質(zhì)參數(shù)有很大的影響。釆后途徑可以非常多樣
化，這取決于農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的品種、產(chǎn)地和/或巿場所在地。此
外，也可能是農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品在這年的一個特定時刻釆收，卻在這
年的另一個時間銷售，因此釆后途徑的持續(xù)時間也會發(fā)生變化。在采
后途徑中，可包含各種存儲方式，可在室溫存儲、降溫存儲和有時甚
至是深度凍結(jié)的存儲中變化。存儲或保藏可包含改良/控制大氣的存
儲/包裝，可添加抑制劑，例如可抵消某種植物激素作用的物質(zhì)。采
后途徑中的所有這些措施和條件都會影響農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的品質(zhì)
參數(shù)。此外，對于農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的不同品種，不同的品質(zhì)參數(shù)可
以是相關(guān)的或者最佳值可以不同。農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的最佳收獲時間
在很大程度上取決于釆后途徑，也要考慮品質(zhì)參數(shù)。對于一種具體產(chǎn)
品，與質(zhì)量參數(shù)相關(guān)的最佳收獲時間(期間收獲的產(chǎn)品的一種特定品 質(zhì)參數(shù)具有最佳值的時間段)取決于選擇的釆后途徑以及巿場設(shè)定的
標準。因此，觀察總的產(chǎn)品品質(zhì)或者一個具體的品質(zhì)參數(shù)，并不是所有的情況都在最佳收獲窗口 。最佳收獲窗口也因此由 一種情況到另一 種情況，也從一種產(chǎn)品(栽培品種或品種)到另一種產(chǎn)品(栽培品種 或品種)來進行確定。對于品質(zhì)控制，至關(guān)重要的是，釆后途徑之后 的最重要的品質(zhì)參數(shù)能在收獲時或采后途徑期間進行預測。然后，根 據(jù)該預測，確定在給定條件、給定時間下的一種具體農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn) 品的最佳收獲窗口。
對于具體的水果產(chǎn)品，有兩種熟化的水果非常知名由植物本身 (呼吸躍變型水果)產(chǎn)生的激素乙稀催熟的水果和幾乎不依賴激素催 熟的水果(非呼吸躍變型水果)。然而，最近的研究表明，似乎這種 區(qū)分太過武斷，因為一些水果種類或品種不符合這種分類而是釆取了
中間形式(Golding等.，2005, Stewart Postharvest Review 3:5)。在
成熟期間，呼吸躍變型的水果有一個乙稀實際開始產(chǎn)生的時刻。這個 時刻在從生理學上而言是采摘的最佳時刻的呼吸峰之前。然而該時刻 并不一定與商業(yè)品質(zhì)參數(shù)最佳的時刻一致，商業(yè)品質(zhì)參數(shù)例如水果的 大小、希望的甜度和顏色。如果出于這些商業(yè)原因考慮，優(yōu)選遲一些 釆摘，這對于保持品質(zhì)和保持持續(xù)時間會產(chǎn)生直接的后果。對于非呼 吸躍變型水果，采摘時刻目前主要是通過商業(yè)品質(zhì)參數(shù)來確定的。
水果釆摘后，在水果成熟待售前，即，能被消費者消費前， 一般 要花 一 些時間。這些時間大部分是為了將水果運輸?shù)郊庸?例如包裝) 地點用和為了將水果從上述地點運到出售地點，例如拍賣場，和從拍 賣場發(fā)給零售商。特別是在，如果將水果例如熱帶水果從一個洲運到 另一個洲的情況。然而，在此期間，成熟過程繼續(xù)進行，經(jīng)常發(fā)生當 準備出售時水果過熟或者相反，水果未足夠成熟無法出售的情形。第 一種情形下，水果不能出售或者僅能以低價出售，第二種情況下，水 果需要存儲直到它完全成熟。因此，兩種情形都會導致經(jīng)濟損失。釆 后途徑也極大影響不良品質(zhì)特征的發(fā)展，例如在一些梨品種中的疾 病，像"中空和褐變"或"頸無力"。因此，合適的釆收時間取決于商業(yè)參數(shù)和加工和運輸水果所需的 采后時間。然而，植物的狀況(大小、疾病的影響)以及水果生長期 間的氣候狀況(溫度、日照量)，或栽培情況(例如肥沃程度)與生 理和商業(yè)參數(shù)一樣有決定性影響。因此，永遠無法給出適于所有情形 的最佳釆收時間。此外，確定最佳采收時間對于栽培者計劃和布置人 手非常重要。由于有時，并不是水果的采后途徑而是其存儲期間或存 儲后的既往史導致了疾病的發(fā)展，因此能夠客觀地測定那些參數(shù)非常 重要。
水果的成熟由以下因素決定葉綠素的降解、色素的積聚、通過 主要由細胞壁的降解所引起的質(zhì)地變化的軟化、各種糖和有機酸的積 聚的變化，其中有機酸主要決定味道，而產(chǎn)生提供香味的揮發(fā)性物質(zhì)。 如果水果處于一個達到了完全生長的階段，其被評估為"成熟"，這 樣，在釆收和后續(xù)處理之后，品質(zhì)至少最低限度地可被最終的消費者
接受(Reid，M.S.,1992,In: Peaches,Plums和Nectarines: Growing and Handling for Fresh Market., LaRue, J.H.和Johnson, R.S. ( eds. )， Univ. Calif. Dept. Agricult. Nat. Resourc. Publ. No. 3331 ，
21-28)。為了確定這個時刻和/或?qū)ζ谕馁|(zhì)量發(fā)表意見，人們正在 尋找一個適當?shù)某墒於戎笖?shù)。多年來，已經(jīng)提議了水果的各種，經(jīng)常 是外在的特征作為這樣一個指數(shù)。Crisoto描述了，對于核果，使用 參數(shù)"大小和形狀"、"果肉的硬度"、"可溶性固形物濃度"，"酸度" 和"顏色"(Crisoto, C.H., 1994， Postharvest News和Inf.. ， 5 (6) :65N-68N)。對于蘋果，Herrera提到特征"基本色"，"可釆摘 性"'果肉硬度"，"可溶性固形物濃度"，"淀粉含量"，"從開花開始 的天數(shù)"，"紅色"和"種子的顏色"(Herrera E. , 1998 , http:〃cahe.nmsu.edu.pubs/ h/h314.html )。然而，實踐證明這些方法并 不合用，因為各個成熟度指數(shù)不夠精確或者該指數(shù)幾乎沒有任何關(guān)于 特定水果品種的期望品質(zhì)的預測值。在具體的產(chǎn)品郁金香(Tw/zi a g^"en'a"a )中，春天的時候，在
荷蘭，將球莖在休眠深度最好的時候拔出來。如果釆收過度延遲，土 壤會變得過于濕潤(通過雨)，導致感染真菌的風險大大增加，并且 機器也不能再在田里使用了。精確測定釆收時候的休眠深度非常重 要。根據(jù)天氣狀況，到休眠最深和實際上只有一個末端的時候確定收 獲窗口。在這種情況下需要在收獲時確定的品質(zhì)參數(shù)是休眠深度。最 佳的休眠確保了特定的球莖大小，以致在釆后途徑之后可以獲得具有 最大長度和厚度的花莖。在睡眠深度達到最大之后，球莖的大小不再
變化。花莖的品質(zhì)參數(shù)長度和厚度取決于收獲時的休眠深度；如果休
眠深度最大就可以獲得最佳時刻和與之相關(guān)的可能達到的最好值。目 前，在球莖外面的纖維網(wǎng)的褐變時刻被用作指示休眠深度最大，但在 許多情況下，這個似乎不太可靠。分子標記物與花莖的品質(zhì)參數(shù)長度 和厚度的值相關(guān)，并因此可以從中得出休眠深度，這在這里非常重要。 在這種情形下，郁金香球莖的采后途徑包括在較高溫度下儲存，直到 球莖的生長點從營養(yǎng)階段轉(zhuǎn)換到生長階段。接著，將球莖在較低溫度 下存儲直到休眠被寒冷的環(huán)境徹底解除。最后，在盆栽土中種植球莖 并開始生長(展開花莖然后開花)。
當球莖經(jīng)受足夠的冷凍解除休眠時，為了測定還需要進行分子實 驗。就在開始栽培的時刻進行。冷凍周期太短導致休眠解除不充分會 使得品質(zhì)較差。花莖能達到的最大長度的品質(zhì)參數(shù)在這里也比較重 要。這里也一樣，較短的冷凍時間曾經(jīng)導致花莖的長度更短。在釆后 的最終途徑中需要測定的品質(zhì)參數(shù)是休眠解除的程度。因此，在釆后 途徑期間，郁金香花莖的最大長度(和厚度)的最終品質(zhì)參數(shù)取決于 數(shù)個品質(zhì)參數(shù)。第一是釆收期間的休眠深度，然后是花莖的生長點從 營養(yǎng)階段到生長階段的完全轉(zhuǎn)化和最后通過一個降溫周期后休眠的 完全解除。類似的需要分子標記物的問題存在于其他的球根狀和塊莖
狀作物中，例如百合、水仙、風信子、小蒼蘭、洋蔥、大蒜和孤挺花。
12對于具體的產(chǎn)品插瓶花，與花蕾成熟有關(guān)的釆收時間對于測定重 要的品質(zhì)參數(shù)"插花壽命長度"非常重要。釆收期間的分子標記物， 特別是涉及花老化和與插花壽命的長度有關(guān)的基因表達程度和蛋白 質(zhì)濃度的標記物，可作為好的候選者用于期望的插花壽命長度實驗。
在釆后途徑(postharvest path)期間，應力度影響插花壽命的長度。 對幾乎所有插花來說，包括郁金香、玫瑰、六出、虹膜、百合、菊花 (菊花)、非洲菊、香石竹、小蒼蘭、大花蕙蘭和滿天星，使用分子 標記物預測插花壽命的期望值非常重要。
對于具體的產(chǎn)品盆栽植物或庭院植物來說，應力對葉老化過程的 水平有著直接影響。葉老化與葉變黃的程度直接相關(guān)。通常來說，盆 栽植物的采收與例如水果的釆收不一樣，除非這是通過插技成活發(fā)生 的，但釆收的特征在于從例如溫室中移出植物并轉(zhuǎn)運至例如拍賣場。 對幾乎所有的盆栽植物或庭院植物來說，包括竺葵，矮牽牛，菊花(菊 花)，榕樹，長壽，龍血樹，蝴蝶蘭，常春藤，秋海棠，白鶴，八仙 和一品紅，在分子標記物的幫助下測量品質(zhì)(與應力相關(guān))非常重要。
對于具體的產(chǎn)品黃瓜來說，成熟階段和應力均對黃瓜的品質(zhì)有消 極作用。對黃瓜而言的(消極)品質(zhì)因素之一是黃瓜的黃化病。對于 其他的蔬菜作物，這樣的品質(zhì)期望對于例如生菜，菊苣，韭菜，卷心 菜類，如甘藍，花椰菜，白菜，紅甘藍和其他類型的大白菜和菊苣非 常重要。對于以預切割形式、預包裝或未預包裝而出售的蔬菜作物而 言，在切割之后，通過分子標記物測量應力的作用，從而監(jiān)測這些切 割制品的質(zhì)量非常重要。
對于具體的產(chǎn)品葡萄，在特定時間在葡萄中產(chǎn)生的物質(zhì)的成分對 于產(chǎn)品(葡萄酒、port葡萄酒、香檳等)非常重要。例如port葡萄酒 的味道品質(zhì)參數(shù)可經(jīng)過例如一個嘗味小組進行量化。釆收時，或釆后 途徑期間，味道與分子標記物水平的關(guān)系對于識別在早期階段終產(chǎn)品 的品質(zhì)非常重要。這對其他作物，例如草藥和香味料、特定類型的漿果，例如橄欖和杜松漿果，以及其他農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品也適用，其中， 通過分子標記物能確定決定味道的成分的存在，這樣就可以預測最終 產(chǎn)品的味道品質(zhì)。
近年來，分子生物學技術(shù)例如基因組和轉(zhuǎn)錄組分析已經(jīng)得到大規(guī) 模應用以研究各種在產(chǎn)品品質(zhì)中起作用的方法。例如已對與水果成熟 有關(guān)的過程作了進一步研究，并且為了鑒別酶在其中所起的作用而做
出了努力(參見/"fer Golding J.B.等.，2005, Brummell, D.A., 2005， andOwino, W.O.等.，2005, all in: Stewart Postharvest Review 3:5)。上述綜述性論文中討論的結(jié)果主要用于影響不同的過程，在成 熟過程中，例如通過過表達或者阻斷表達某種編碼據(jù)稱在此過程中起 作用的酶的基因制備轉(zhuǎn)基因植物。然而，迄今為止，分子生物學技術(shù) 仍未應用于預測一種品質(zhì)參數(shù)的的期望值或用于測定給定情況的最 佳收獲窗口。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種理想的鑒別和分離分子標記物，基因或蛋白的方 法，該方法中，基因活性或者蛋白質(zhì)濃度的值分別在釆收期或釆后途 徑期的某一特定時刻與在一個具體時刻的具體品質(zhì)參數(shù)相關(guān)，和在釆 收期間或釆后途徑期間，測量該標記物值之后，預測在采收、釆后途 徑期間或釆后途徑結(jié)東時的品質(zhì)參數(shù)值，或者一種具體情況的期望值 的方法。
接下來，本發(fā)明詳細解釋了對水果，尤其是蘋果和梨的成熟預期 (或預測)和/或釆收時間的確定。當然了，也使用常規(guī)技術(shù)確定品 質(zhì)特征的標記物，以及與之相關(guān)的，通過分子、生物學技術(shù)確定水果 之外的農(nóng)產(chǎn)品和園藝產(chǎn)品的最佳收獲時間。
水果的成熟是一個過程，在此過程中，葉綠素被降解且色素開始 形成，同時水果硬度喪失，由此形成糖，并且由此形成有機酸和揮發(fā) 性的芳香物質(zhì)。這些活動要求在某些水果細胞中具有可以開啟或關(guān)閉的生化過程。代謝中研究的最多的一個改變是乙烯的產(chǎn)生和作用，其 主要在呼吸躍變型水果中起作用(例如番茄、甜瓜、蘋果、鱷梨、獼 猴桃和香蕉)。在這些水果中，乙烯是成熟的一個先決條件，因為它 像一種激素，能激活轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)而，影響細胞的基因表達(所謂的 乙烯信號通路)。
然而，特別是從本發(fā)明中可以看出，對于確定水果的成熟預期以 及合適的釆收時間而言，特別是，與水果構(gòu)造有關(guān)的基因原則上應是 一個合適的參數(shù)。不過，從上述引用的文獻，以及從本發(fā)明下述的實 施例中可以得出結(jié)論，在水果成熟期間最好對多個成熟指數(shù)進行觀 察。特別列出與水果硬度變化有關(guān)的有研究資格的基因如下卩-木糖
苷酶(Pxyl)，聚半乳糖醛酸苷酶I和II(PGI和PGII)，公認的細胞 壁過氧化物酶424/87 ( 87),木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖苷酶(XET),肌動 蛋白標記物M8，蘋果菌素和葡聚糖酶如內(nèi)切-P-l， 4-葡聚糖酶，輔 酶II依賴性D-山梨醇-6-磷酸脫氫酶(NADP-dependent D-sorbitol-6-phosphate dehydrogenase )和/或oc淀粉酶。
本發(fā)明的實質(zhì)首先是為各個品種發(fā)展一個定標線，借此在細胞成 熟期間進行上述基因(與水果成熟有關(guān)的)或其他基因(與上述提及 的其他質(zhì)量參數(shù)有關(guān)的)的表達。本發(fā)明可以確定上述基因中哪些與 途徑后的品質(zhì)特征最相關(guān)，換言之，即哪些基因決定了與該品質(zhì)特征 有關(guān)的期望值。如實施例所示，在成熟期間，-似乎一些實驗的水果 品種在任何情況下-在一個給定的時刻，不同的基因在這種情況下， 與品質(zhì)特征的硬度最相關(guān)。
測定基因和蛋白的表達曲線
為獲得可靠的結(jié)果和實驗，以可重復進行的方式釆樣是很重要 的。本發(fā)明中，基因的"表達曲線測定"按照本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法 進行，其涉及測定細胞中一種或多種基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)(mRNA)或翻 譯狀態(tài)(蛋白)的方法。對于從植物中分離出來的mRNA和蛋白來說，可使用可獲得的標準方案。大多數(shù)情況下，如果組織具有厚的細 胞壁或含有很多的糖，這些方案需要做一些修改。這些方案和修改是 本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識。根據(jù)所采用的方法，這些測定需要進行全基 因組表達的測定，而且僅需要測定幾種基因的表達曲線，這導致了"基 因表達曲線"或"表達曲線"的實現(xiàn)，這些術(shù)語將用于下文。"表達 曲線"包含與基因表達產(chǎn)物的相關(guān)存在的測定有關(guān)的一個或多個值。 這些值包括對RNA水平或蛋白濃度的測定。因此，表達曲線可包括 體現(xiàn)測定基因轉(zhuǎn)錄狀態(tài)或翻譯狀態(tài)的值。關(guān)于此點，可參閱專利號為
6, 040， 138， 5， 800, 992， 6, 020, 135， 6， 344， 316和6, 033，
860的美國專利。
樣品的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)包括RNAs的身份和相關(guān)的事件，特別是樣品中 存在的mRNAs。優(yōu)選的，測定足量的基因以確定樣品的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。 也可通過現(xiàn)有的基因表達技術(shù)測定轉(zhuǎn)錄的出現(xiàn)，而適當?shù)拇_定轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。
翻譯狀態(tài)包括樣品中構(gòu)成蛋白的身份和相關(guān)的事件，同樣的，本 發(fā)明中用于測定樣品的翻譯狀態(tài)的蛋白量是足夠的。如本領(lǐng)域技術(shù)人 員所知，轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和翻譯狀態(tài)經(jīng)?；ハ嚓P(guān)聯(lián)。本發(fā)明中測定和測量的 每個值均是代表基因的絕對或相對表達的一個量度。這些基因的表達 水平可通過本領(lǐng)域公知的用于測定樣品中RNA或蛋白水平的方法來 測定。首先，可分析大量基因的表達曲線，為此目的可使用的技術(shù)是 直接測序例如轉(zhuǎn)錄組測序(羅氏&454測序)；克.隆的單分子陣列 tm (Solexa);釆用electronic Northern計算不同樣品中的基因表達水 平；并且其是基于一組cDNA文庫中的要鑒別的特定基因的序列數(shù)量 的。與其有關(guān)的變更是基因表達系列分析(SAGE)，表達的序列標記 片段(TALEST )和cDNA AFLP (擴增片段長度多態(tài)性)的串聯(lián)排列 連接(TALEST)，其能夠檢測不同表達的轉(zhuǎn)錄。


圖1在5座果園中，梨cv. Bon Chretien隨著時間的成熟過程。圖中，使用的標記物總數(shù)(pxyl， PG和過氧化酶424/87)的平均值與時間(按日計)對應標繪。
圖2a、釆收期間標記物l(PGl)的基因表達與出售的梨cv.BonChretien的硬度的相互關(guān)系。b、短期儲存后標記物6 ( 424/87 )的基因表達和硬度的相互關(guān)系。X軸表示在存儲(壓入水果需要的壓力按N/m2計)結(jié)束時的硬度和y軸，對數(shù)的，表示標記物的表達水平。垂直線表示對于預期的巿場仍然是可以接受的硬度的臨界值。
圖3 a、釆收期間標記物6( Pxyl )的基因表達與出售的梨cv. Forelle的硬度的相互關(guān)系。b、短期儲存后標記物1 (PG1)的基因表達和硬度的相互關(guān)系。X軸表示存儲結(jié)東時的硬度和y軸，對數(shù)的，表示標記物的表達水平。
圖4在5座果園中，蘋果cv. Granny Smith隨著時間的成熟過程。圖中，使用的標記物總數(shù)((3xyl and PG)的平均值與時間(按曰計)對應標繪。
圖5a、釆收期間Pxyl的基因表達與出售的蘋果cv. Granny Smith的硬度的相互關(guān)系。b、短期儲存后pxyl的基因表達和硬度的相互關(guān)系。X軸表示存儲結(jié)東時的硬度和y軸，對數(shù)的，表示標記物的表達水平。
圖6在5座果園中，蘋果cv. Golden Delicious隨著時間的成熟
過程。圖中，使用的標記物總數(shù)(卩xyl和PG)的平均值與時間(按曰計)對應標繪。
圖7釆收期間標記物M8 (肌動蛋白)的基因表達與巿場上的硬度的相互關(guān)系，X軸表示存儲結(jié)束時的硬度和y軸，對數(shù)的，表示標記物的表達水平。垂直線表示對于預期的巿場仍然是可以接受的硬度的臨界值。
圖8在2006和2007季，每周對蘋果品種Kanzi取樣。x軸為相
17對于最佳釆收時間(用生理參數(shù)確定)的天數(shù)。y軸表示P-木糖苷酶的表達水平。
圖9釆收期間的蘋果cv.Kanzi的果肉標記物和與其對應的存儲(EOS)結(jié)東時的硬度。標記物的表達與按千克計的蘋果的硬度對應標繪。A組中是標記物PG， B組中是標記物(3-木糖苷酶。
圖IO釆收期間的梨cvConference的果肉標記物和與其對應的存儲(EOS)結(jié)東時的硬度。標記物的表達與按千克計的蘋果的硬度對應標繪。A組中是標記物PG, B組中是標記物P-木糖苷酶。
圖11郁金香中GAST的表達(y軸上)與拔出時間的關(guān)系。X軸表示拔出最佳時間的天數(shù)。標繪了四年生的cv Apeldoom和cvProminence中GAST的表達模式。
圖12玫瑰花壽命的品質(zhì)標記物。插花壽命為5.7天和8.0天的玫瑰中的GDSL-基序脂肪酶的表達(在y軸上)。保存性好的玫瑰中的標記物的表達比在保存性差的玫瑰中表達低。切割后立即釆收，4。C下在水中儲存1天和4天。
此外，有技術(shù)可用于檢測雜交的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在，例如微陣列。這種微陣列可以是DNA陣列，寡核苷酸陣列，或者籠統(tǒng)地，核酸陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從專門供應商(例如Affymetric Corp., SantaClara, CA， USA)那里獲得自行設(shè)計的陣列和相關(guān)的陣列讀數(shù)裝置。
為監(jiān)測少量轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可釆用Northem分析，其是用于檢測和量化mRNA水平的一種標準技術(shù)中。通過這種技術(shù)，可以檢測mRNA的大小和任何選擇性剪接以及多基因家族。通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)分析，由于發(fā)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的指數(shù)擴增，可高敏感度地檢測到mRNA分子，這種技術(shù)又稱為定量PCR檢測。這種技術(shù)特別適用于mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的高度精確量化。由于通過這種技術(shù)，可以分析極大數(shù)量的樣品，并且這種技術(shù)也可以實現(xiàn)自動化(AppliedBiosystems 7900HT system Foster City, USA),因此其是目前分析轉(zhuǎn)錄200880012753.7
說明 產(chǎn)物的首選。此外，也可以釆用其他技術(shù)平臺，比如PAMChip (Pamgene， Den Bosch, the Netherlands)或者BioTrove OpenArrayTM技術(shù)(BioTrove Inc., Wobum， USA)。如果技術(shù)人員不熟悉特定的平臺，可由制造商提供有關(guān)各平臺的操作知識。
在這些技術(shù)中，通過選擇性地擴增該基因，確定特定標記基因的存在。這通常借助于引物來完成。 一般而言，術(shù)語"引物"指可以開始合成DNA的DNA鏈。沒有引物，DNA聚合酶無法重新開始合成DNA:它只能在反應中延長現(xiàn)有的DNA鏈，其中以互補鏈為模板按序合成核苷酸鏈。引物用作DNA聚合酶擴增反應的起始點。因此，引物通常是長度為約10 50個核苷酸的短核苷酸鏈(寡核苷酸)。這些引物與待擴增的基因序列是互補的，因此，以單鏈形式結(jié)合單鏈DNA或RNA，通過雜交與目標序列形成雙核苷酸鏈。理想地，在雜交中需要完全互補的核苷酸鏈，然而即使不是全部核苷酸是互補的，也能夠?qū)崿F(xiàn)充分雜交，即所謂的"錯配"。除了互補的程度之外，引物與目標序列雜交的能力也與雜交發(fā)生反應的條件有關(guān)。
DNA擴增術(shù)語DNA擴增用于表示借助于PCR或類似的擴增體系體外合成雙鏈DNA分子。本發(fā)明要求的擴增可以利用多種擴增方法，比如聚合酶鏈式反應(PCR;Mullis 1987, U.S. Pat. No. 4,683,195,4,683,202和4,800,159)或連接酶鏈式反應(LCR; Barany 1991, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193; EP Appl. No. 320,308 )，自持序列復制(3SR; Guatelli等.，1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 )，鏈置換擴增(SDA; U.S. Pat. Nos. 5,270,184，和5,455,166)轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)(TAS; Kwoh等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177 )， Q-Beta復制酶(Lizardi等，1988, Bio/Technology 6:1197 ),滾環(huán)擴增(RCA; U.S.Pat. No. 5,871,921 )，基于核酸序列的擴增(NASBA)，裂解酶片段長度多態(tài)性分析(U.S. Pat. No. 5,719,028 )，等溫以及嵌合引物起始的核酸擴增(ICAN)，分歧延伸擴增方法(RAM; U.S. Pat. Nos. 5,719,028和5,942,391 )或者其他適合用于擴增DNA的方法。對于擴增引物進行DNA擴增有少量錯配的，擴增反應可以在嚴格性稍低的條件下進行(換言之，PCR反應使用38。C或在3.5mMMgCl2的條件下退火)。技術(shù)人員可以選擇適合的嚴格條件。
允許引物中少數(shù)錯配意味著用于特定目標序列的引物在測定幾種不同類型的生物體中是可用的。這是由于不同的生物體，尤其是不同種和甚至同種中的不同個體，其蛋白的氨基酸序列和/或編碼該蛋白基因的核苷酸序列經(jīng)常表現(xiàn)出差異。通過允許少量差異， 一個和相同的引物可用于測定幾種不同的生物體。在實施例中，例如所示引物很適合于測定同種的不同個體(如蘋果)和甚至不同種(如蘋果和梨)中的標記基因和/或"管家基因"。
相對轉(zhuǎn)錄水平的計量與存在于樣品中的適當?shù)膶φ沼嘘P(guān)。例如這種對照是組成型表達基因，比如特殊的"管家"酶。特別優(yōu)選的是組成型標記磷酸甘油酸激酶(PGK， EC 2.7.2.3 )或延伸因子la ( eFla )，
參見實施例。
此外，可基于蛋白圖譜測定表達譜。在本發(fā)明中，也可以運用技術(shù)同時檢測大量蛋白圖譜。它的一個實例是凝膠電泳。在這里，首先基于蛋白質(zhì)的分子量分離蛋白。隨后基于蛋白質(zhì)的等電點(pH梯度)任選采用二維電泳(2D)進行二次分離。隨即，通過質(zhì)譜分析可以測定不同表達蛋白的氨基酸序列。另一種用于同時檢測大量蛋白質(zhì)的技術(shù)是所謂的蛋白質(zhì)陣列(Ciphergen Biosystems, Fremont, CA,USA)，借此可以定量大量的不同蛋白質(zhì)和蛋白肽。在這里，借助于質(zhì)譜分析，可以測定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。在該實施方案中，表達譜中的數(shù)值是通過測定標記基因表達的蛋白產(chǎn)物的濃度而獲得的。這些蛋白產(chǎn)物的濃度可以通過使用例如這些蛋白產(chǎn)物的特定抗體而測定。本發(fā)明使用的術(shù)語"抗體"指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原結(jié)合部分。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實例，比如F(ab)和F(ab，)2片段，可通過使用酶例如胃蛋白酶處理抗體而生成。該抗
體可以是多克隆的，單克隆的，重組體和例如嵌合體或"單鏈"抗體。 通過將抗體偶聯(lián)到可檢測到的物質(zhì)(即標記抗體)上可以很方便地檢 測基因產(chǎn)物?？蓹z測到的物質(zhì)的實例，尤其是各種酶，輔基，熒光物 質(zhì)，發(fā)光物質(zhì)，生物發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適酶的實例，尤其是
辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，P-牛乳酶和乙酰膽堿脂酶；合適輔基 的實例，尤其是鏈霉親和素或抗生物素蛋白和生物素；合適熒光物質(zhì)
的實例，尤其是傘形酮，熒光素，異硫氰酸熒光素，羅丹明，二氯代
三嗪胺(dichlorotriazinylamine)熒光素，丹磺酰氯和藻紅蛋白；發(fā)光 物質(zhì)的實例，尤其是熒光素酶，蟲熒光素和水母發(fā)光蛋白；合適放射 性物質(zhì)的實例，尤其是1251, 1311, 358和3H。
目前，蛋白檢測大多借助于抗體進行和為此目的，使用不同的檢 測系統(tǒng)，比如橫向流動分析(lateral flow assays),也釆用化學發(fā)光檢 測裝置比如GeneGnome ( Syngene, Cambridge, United Kingdom )。也 可以采用例如，BiacoreTM( Biacore AB Corp., Uppsala, Sweden )或IBIS iSPR (IBIS technologies, Hengelo， the Netherlands)或順磁性的粒子 (paramagnetic particles ) ( European Pat. Applic. No. 20040744572 )來 測定抗體和蛋白之間的相互作用。根據(jù)蛋白標記的數(shù)量，由技術(shù)人員 選擇最好的檢測平臺。如果技術(shù)人員不熟悉特定的平臺，也可由制造 商提供有關(guān)各平臺的操作知識。
基本上，對于能夠客觀測定的任何品質(zhì)特征，可以確定校準線， 在校準線上將標記物的(mRNA或蛋白質(zhì))表達相對于品質(zhì)特征進行 標繪。這可以在收獲前，收獲中或收獲后進行?；跇擞浐吞卣鞯南?互關(guān)系，可以確定標記與哪個時間周期最具相關(guān)性(因此作為預測因 子最可靠)?？煽紤]品質(zhì)特征，例如水果的硬度，球根作物打破休 眠的時間和插瓶花的瓶插壽命以及引言中提到的其他參數(shù)。盡量保持 收獲前和收獲后以及后續(xù)條件的一致性當然是重要的。這可理解為，例如，在4°C下儲存水果形成的校準線和在20°C或室溫下儲存水果 形成的校準線是不同的。然而，由于測定的表達表明成熟的程度，因 此4。C下形成的校準線，可用于預測水果在其他溫度下的成熟。不能 從校準線中得出，于是產(chǎn)生誤差，因為在其他條件下儲存的時間仍是 必需的(由于成熟的速度是不同的)。因此專門用于特定環(huán)境下的校 準線是首選的。校準線應該進一步表明何時產(chǎn)物達到特定的質(zhì)量標 準。這可能意味著，例如，標記能為水果可于涼爽條件下儲存的時間， 或球莖在打破冬眠前仍需保持在寒冷條件下的時間給出一個預期。當 樣品在無對照的條件下，這對于常規(guī)釆樣以及測定表達譜以調(diào)整和優(yōu) 化預期值自然是重要的。由于樣品可能是基于不同的條件下生長得過 快，或相反地，生長得過慢。實際上，基于新環(huán)境的校準線可能更陡 峭或更平緩。應理解基于在熱、干燥的夏天成熟的水果而生成的校準 線，無法得出在涼爽、潮濕的夏天水果成熟的準確預測。然而，已經(jīng) 提到與儲存條件的不同有關(guān)，由于測定的表達值的確表明了水果的成 熟條件，仍可以基于和校準線的比較確定是否水果達到可釆摘的成熟 度。實施例中還顯示出，對于特定的品質(zhì)特征已經(jīng)生成校準線。
在插瓶花中，通過結(jié)合與收獲途徑后瓶插壽命的長短有關(guān)的花衰 老標記和應激度標記，，可以預測瓶插壽命的長短。為此目的，可以
使用半胱氨酸蛋白酶和GDSL-基序(motif)脂肪酶。
如上所述，盆栽植物葉片的泛黃是重要的品質(zhì)參數(shù)。在收獲期， 或收獲途徑后，這一不良品質(zhì)參數(shù)(其直接取決于葉片的年齡)可通 過將包含在葉片老化過程中的標記，其與葉片泛黃的程度有關(guān)，任選 地與在老葉片中比在新葉片中具有更高表達量并與葉片泛黃程度有 關(guān)的標記相結(jié)合進行預測。黃瓜中"泛黃"的品質(zhì)參數(shù)可以按照與盆 栽植物相同的方式，通過在收獲期或收獲途徑后的分子標記來預測。 相似地，對于葡萄，如果為味道提供一個可以再現(xiàn)的品質(zhì)特征， 通過結(jié)合包含在味道組分生物合成中的標記，其基因表達量與味道的程度有關(guān)，在收獲期或收獲途徑后可以預測味道。
除了適用于實施例中提到的水果種類之外，本發(fā)明測定成熟度和 收獲期的標記以及預測期望的品質(zhì)特征也適用于各種水果，其收獲時 間和成熟后持續(xù)時間對于可消費的和可得到水果的條件(運輸、儲存) 來說，是重要的因素。除了用于蘋果和梨之外，本發(fā)明還可適用于如
下種類的水果柑橘屬水果如橙，柳橙(mandarin),檸檬和蜜柑柚 (minneola)，甜瓜，番龍，杉L李子，葡萄，黑醋栗(currant),醋
栗，黑莓，木莓，櫻桃，菠蘿，芒果，獼猴桃，荔技，香蕉，紅辣椒
和鱷梨，包括全部種類及其栽培品種。
此外，本發(fā)明適用于所有農(nóng)作物或園藝作物，其品質(zhì)很大程度上 由收獲時間和收獲后途徑?jīng)Q定。達到這一標準的作物的實例是引言中 已提到的插瓶花，觀賞植物，球根植物和黃瓜，但實際上也進一步包 括其他種類的蔬菜和谷物，如萵苣，番茄，馬鈴薯，紫花苜蓿，，夢， 木薯，山藥，各種洋白菜(花椰菜，羽衣甘藍，芽甘藍，皺葉甘藍， 圓錐形甘藍等)，菊苣，(嬰兒)胡蘿卜，冬胡蘿卜，pulses ,小麥， 玉米，稻米，燕麥，大麥和用作香草的植物，如辣椒，小茴香，山蘿 卜，迷迭香等。此外，本發(fā)明適于那些不是用于消費而是用于生產(chǎn)商 業(yè)上重要產(chǎn)品的作物，如油椰子，橄欖，甘蔗，糖用甜菜，向曰葵， 大豆，咖啡豆，可可豆，木材生產(chǎn)植物和如聯(lián)合國糧食農(nóng)業(yè)組織(FAO) 網(wǎng)站(http:〃需w.fao.org/ en http:〃faostat.fao.org/)上提至'j的全部作物。
樣品中測試標記的實際應用
標記可在應用實驗室里(非現(xiàn)場)測試或在簡單的(實驗室)環(huán) 境下進行現(xiàn)場測試。
在將樣品送至應用實驗室中，存在各種可能性。 一種可能性是樣 品被完好無損地送至應用實驗室。例如送來(未受損的)水果。只要 運輸條件不是極端的(溫差，樣品受壓等)，運輸將不會影響到測試 結(jié)果。當運抵應用實驗室時，樣品需要盡快固定，例如通過在液氮中冷凍，或立即處理用于進一步分析。如果是大量樣品，抽樣，選取及 測定可以自動化進行。
第二種可能性是在現(xiàn)場檢測樣品。這將不得不限制步驟的數(shù)目和 操作的復雜性以允許未接受良好培訓的人員來進行測試。第一步，取 來樣品。在一些情況下，可涵蓋全部的產(chǎn)品，但是在大部分情況下， 涵蓋一部分產(chǎn)品。以一部分產(chǎn)品為例，這部分產(chǎn)品需要代表全部的產(chǎn) 品。因此，例如可以選擇一塊兒果肉或葉片或花朵的一部分。這樣， 以水果為例，可以取下一塊兒外皮或一塊兒果肉進行測試。如果測試 涉及到整個組中的每個產(chǎn)品的品質(zhì)，需從組中隨機選取代表性樣品。 隨機樣品量和批量決定了可靠性。確定隨機樣品量是實現(xiàn)特定可靠性 所必需的，統(tǒng)計學計算方法可摘自專業(yè)文獻。然后，基于該隨機樣品， 進行樣品混合或?qū)γ總€樣品進行不同的測試。每個樣品的單獨測定使 得該組樣品能夠被逐一測定。之后，固定并提取物質(zhì)。可通過研磨， 擠壓或結(jié)合化學物質(zhì)(如緩沖液)破壞細胞壁，確保樣品中的標記不
被破壞?？砂ㄈ鏔TA紙(Whatman International Ltd., England )，也
可包括含有蛋白酶或RNA酶抑制劑的緩沖液。這取決于樣品的類型 并可由技術(shù)人員進行操作。對于蛋白標記，通常需要提供比RNA標 記更多的物質(zhì)。在一些情況下，首先要進行標記的純化，在其他情況 下，可以直接測定標記?？焖贆z測蛋白的最適方法是橫向流動測試， 其使用抗體直接作用于待測蛋白(GenScript Corp. Piscataway， NJ， US; BioGenes GmbH Berlin, Germany )。這些測試可容易地進行操作 (Whatman International Ltd" England)，并且該技術(shù)已廣泛應用于商 業(yè)，例如消費者可以獲得的受孕測試。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還包括用于測定和預測水果中期望 的品質(zhì)特征的試劑盒，如水果的硬度，或預測期望的收獲期窗口或確 定釆摘水果的適宜時間。這種試劑盒對于特定的水果品種具有專一性 并包括量化檢測基因的方法，用于預測定水果的種類，預測品質(zhì)特征
24的期望值，連同用于特定水果品種的相關(guān)基因表達型的校準線，因此 測定的表達型可與校準線相比較，基于這種比較預測期望的成熟時間 和預測期望的釆摘時間。這些校準線也可包含在自動化系統(tǒng)中，因此， 通過測定表達譜產(chǎn)生的數(shù)值自動地標繪于這些校準線上，結(jié)果是，得 出品質(zhì)特征期望值的預測。整個過程，包括表達譜本身的測定，可在
自動化系統(tǒng)中進行。該自動化系統(tǒng)包括如下要素a)用于測定在一 種或多種水果品種中對于測定例如水果硬度非常重要的大量基因或 相關(guān)基因的表達的方法，這些相關(guān)基因，如P-木糖酶((3xyl), polygalactu歸idase I和II (PGI和PGII),過氧化物酶424/87 ( 87 ), Xyloglucan endotransglycosylase (XET)，棒曲霉素和葡聚糖酶如內(nèi) (3-l，4-葡聚糖酶，NADP-依賴的D-山梨醇-6-嫌酸脫氫酶，a淀粉酶；
b) 用于測定調(diào)控基因表達的方法，例如管家酶，如磷酸甘油酸 激酶(PGK)或延伸因子la (eFla)或其他適當?shù)幕?，如Nicot" a/" J. Exp. Botany, 56:2907-2914， 2005中描述的基因。所有這些基因 必需(可以)考慮用于測定表達型。如果其中的一個基因在全部的測 試樣品中具有相同的表達水平，則該基因適于作為組成型基因。
c) 用于測定(a)中提到的基因(相對的)表達譜的方法
d) —條或多條校準線，其表示(a)中提到的一種或多種基因表 達譜和一種或多種水果的硬度/成熟度之間的相互關(guān)系；以及
e) 用于解釋測定的與關(guān)聯(lián)的校準線有關(guān)的一種或多種水果的表 達譜的方法和基于該表達譜給出有關(guān)一種或多種水果成熟度的指示， 該指示還包括直到完全成熟時和/或收獲的最佳時間時才需要的時間 指示。
在該自動化系統(tǒng)中，可得到多條校準線，因此該系統(tǒng)可用于測定 幾種水果，而無需每次"加載"適當?shù)男示€。另外的可能性是由使 用者為系統(tǒng)提供數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)對應于上述水果收獲后的條件，如當?shù)?儲存水果的時間，運輸持續(xù)的時間等，因此系統(tǒng)可以根據(jù)這些數(shù)據(jù)而
25變化。
基于描述的方法，還可開發(fā)用于預測或確定特定的農(nóng)業(yè)或園藝產(chǎn) 品的特定品質(zhì)特征值的測試試劑盒。為了達到這一目的，必須得到下 述標記至少兩個標記，優(yōu)選兩者其一為組成型標記(利用該標記可 以完全表達)。將標記和特征間的關(guān)系繪制于模型(校準線)中。該 模型描述了即時標記的不同表達水平。該模型可用于計算機程序中以
使測定的表達水平和樣品的品質(zhì)/特征關(guān)聯(lián)起來。mRNA水平的量化 (基因表達)可以通過如定量PCR來進行(Applied Biosystems， US )。 蛋白的量化可以通過在如橫向流動免疫測定中使用抗體來進行。測定 的數(shù)據(jù)隨后進入(自動化地或相反地)到計算機模型中，然后生成測 試結(jié)果。隨后電子顯示或用其他方法顯示該結(jié)果。
本發(fā)明還包括大量例如于下述實驗中發(fā)現(xiàn)的標記，。特別包括標 記M8，其在測定水果硬度中是很重要的；標記GAST(赤霉素引發(fā) 的轉(zhuǎn)錄),其在測定提升球莖最佳時間中是很重要的；以及標記GDSL-基序脂肪酶，其在測定插瓶花的瓶插壽命中是重要的。如實施例所示， 可以僅使用這些標記的部分遺傳信息表示存在。事實是如果引物相對 于這些標記目標序列可以充足地合成，這樣標記就可以擴增并顯示 了。因此本發(fā)明包括標記序列M8, GAST和GDSL基序脂肪酶，具 有如實施例和序列表中所示的核苷酸序列(M8: SEQ ID NO: 13和 14; GAST: SEQ ID NO: 21和22; GDSL-基序脂肪酶SEQ ID NO: 27和28,其中在各實施例中第一個代表核苷酸序列，第二個代表氨 基酸序列)。如上所述，核苷酸序列和氨基酸序列都可作為標記。由 于事實上，不同種或品種的序列中可能存在較小的差異，本發(fā)明還涉 及與SEQ ID NO: 14、 22和28具有同 一性的序列，分別為高于70%, 優(yōu)選高于80%,更優(yōu)選高于90%，更優(yōu)選高于95%,更優(yōu)選高于98°/0。 在這里，"相似的序列"通常描述為百分比以及如果兩序列彼此進行 最佳地排列，涉及兩序列間相似的氨基酸殘基或核苷酸的百分比。為了達到本發(fā)明的目的，通過已知的BLAST方法(Basic Local Alignment SearchTool)測定相似序列的相同殘基或核苷酸的百分比，公眾可通 過美國國家癌癥研究所/美國國立衛(wèi)生研究院(Bethesda, Maryland) 獲得該方法，也可通過大量的出版物(參見例如Altschul等，J. Mol. Biol， 215(3)， 403-10 (1990))中的描述獲得。通過與BLASTP比較氨 基酸序列，用作BLAST的優(yōu)選參數(shù)為gap open 11.0, gap extend 1, Blosum 62 matrix。
本發(fā)明的一部分是使用標記M8， GAST和GDSL-基序脂肪酶測 定植物中的品質(zhì)參數(shù)。特別地，M8用于測定水果尤其是蘋果和/或梨 成熟度的測定，GAST用于提升球莖尤其是郁金香的最佳時間的測 定，以及MDSL-基序脂肪酶用于插瓶花尤其是玫魂花瓶插壽命的測 定。在這些應用中，可使用序列表中所示的片段，或者甚至它們逐一 的片段，而且如果它們在各自種類中自然地產(chǎn)生，可以使用整個基因 和/或蛋白?；诒景l(fā)明提供的序列信息，技術(shù)人員可以在遺傳數(shù)據(jù) 庫中容易地找到它們，或容易地將它們從生物體中分離出來。術(shù)語"抗 體"進一步涉及抗體的抗原結(jié)合形式(例如Fab， F(ab)2)。術(shù)語"抗 體"通常指基本上由專一性識別并結(jié)合抗原的免疫球蛋白基因或其片 段編碼的多肽。盡管不同的抗體片段可由完整抗體的部分進行定義， 技術(shù)人員應了解這些片段也可以化學方法或通過重組DNA方法重新 合成。因此，本發(fā)明中，術(shù)語抗體也包括抗體片段比如單鏈Fv,嵌 合抗體(即包括不同種類的恒定區(qū)和可變區(qū)的抗體)，人源化抗體(即 那些包括非來源于人類的CDR(互補決定區(qū)))的抗體以及復共軛配合 物抗體(如雙特異性抗體)。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實施例
可用作組成型基因/內(nèi)部控制的管家基因描述于Mcot等，Journalof Experimental Botany, Vol 56:2907-2914， 2005中。實施例l
確定大量蘋果和梨品種中的基因表達和水果成熟間的相互關(guān)系。在不同的果園收集兩種梨栽培品種，Bon Chretien和Forelle以及兩種蘋果栽培品種Golden Delicious和Granny Smith的數(shù)據(jù)。，所述4個栽培品種按照南非的條件(收獲，短期儲存，有條件的輸送至如歐洲巿場)在南非收獲。收獲過后(48小時內(nèi))，測定果肉中不同標記的值。為此目的，采用CTAB法從水果混合樣品中分離mRNA( PlantMolecularBiology Reporter Vol. 11 (2), 1993， pp. 113-116)。通過前面介紹的表達譜技術(shù)鑒別不同的標記并通過RT-PCR確認。使用下面設(shè)計的引物測試所有的樣品
正向引物 反向引物
PG GCCCTAATACGGACGGAATTC AATACAGTCATCACCTGTTCCTATAACC
卩XYL AACTAATTGGTGCTGCTGAGGTT GTCCGGTCTCTGAACTCTGCTT
424/87 TGGCTCAGGAACATCTTTCATG CTTGTTGAGTCCAGCAGCAGAG
M8 GGTGGCGGCATGGAGTT CCCTTTCCCGTAGGCTTCC
EFla TGGGTTTGAGGGTGACAACA TGATCAGGTCAAGAGCCTCAAG
PGK CCTGAATTCGCCAAGAAGCT TGCATGAGCCCTATGAGCAGTA
在相同的樣品中，釆用標準的方法和自動透度計，來測定水果的
硬度。另外，還測定其他的生理參數(shù)，如顏色、淀粉含量、含糖量和蘋果酸濃度。
在南非的儲藏期間(對于蘋果為幾個星期，對于梨約10天)，跟蹤原料。在儲藏期后，再一次測定標記值并且進行運輸模擬(如集裝箱運輸?shù)綒W洲)。然后，再進行生理分析。
史密斯老大娘(Granny Smith)(蘋果)在早于成熟期之前收獲，沒有完全成熟(保留適當?shù)挠捕?。Fordle梨收獲得也較早但是已經(jīng)完全成熟。如果梨沒有較早地收獲，他們會因為太重而從樹上墜落。金冠蘋果(Golden Delicious)和Bon Chretien梨在成熟過程中較晚收獲，可在樹上進一步成熟。對于梨，特別是質(zhì)地標記(3-木糖苷酶(betaxylosidase , (3xyl),多聚半乳糖醛酸酶I ( polygalacturonase I , PG1)和推定的細胞壁過氧化物酶424/87 (87) ( Cell Wall peroxidase 424/87 (87))是相關(guān)的。通過測定這些標記的基因活性何時開始升高可以確定成熟的開始和成熟的過程(見圖1)。
圖1顯示了不同的果園在不同時期開始成熟。果園BoRadyn特別早于其它果園。較晚的成熟可能是由于使用了特殊的抑制劑如保留劑(Retain)(乙烯抑制劑)。在圖1中的圖表中，所有三種標記的活性已經(jīng)整合，但是這并不是必需的。原則上，上述的每一種標記是好測量的。標記的值每 一 次都通過與結(jié)構(gòu)標記(phosphoglucerate kinase(磷酸甘油酸激酶，PGK)或延伸因子la (eFla)的活性來校正。
期望的進入巿場區(qū)域(如歐洲)時的硬度可以在收獲時預估，也可以在第一個儲藏期后，依賴于釆后處理，通過測定收獲時的或儲藏后的質(zhì)地標記的值并與校準線比對，校準線由于處理的不同(如冷凍溫度、用乙烯抑制劑處理等等)當然有所區(qū)別。看來存在有質(zhì)地標記的效力的順序，取決于成熟過程中的時期。在成熟過程的早期，Pxyl是重要的，然后是PG1，再然后是424/87。
圖2清楚地顯示出進入巿場區(qū)域時的硬度和這些測量時的質(zhì)地標記的值之間有明確的關(guān)系。在成熟早期(收獲)M1 (PG1)具有最佳值，然后是424/87 (緊隨的短暫的儲藏)。對于較早收獲的Forelle梨，首先是Pxyl具有最佳的關(guān)系，然后是PG1。
對于蘋果，原則上是一樣的。成熟期也可以通過聯(lián)合的質(zhì)地標記來測定。在此情況下，因為Granny Smith成熟進行得較慢，包含在內(nèi)的是Pxyl和PGl的聯(lián)合(見圖4)。期望的進入巿場區(qū)域時的硬度尤其可以通過在收獲期和緊隨的短暫的儲藏的Pxyl標記的基因活性的值來預估。這是因為Granny Smith的成熟過程(尤其是軟化)是十分慢的(見圖5)。在蘋果品種金冠中，也存在有相似的情形(見圖6)。標記Pxyl和PGl具有共同的重要性，當成熟進行得非?？烨以诔墒爝^程后進行收獲時，要增加這個品種的另一種標記。這個標記
M8具有下述的序列(SEQ ID NO:13):
gtacatgttcaccactactgctgaacgggaaattgtccgtgatatgaaggagaagcttgcatatgttgctctggactatgagcaagaacttgagactgccaagagcagctcttcagttgagaagaactatgagcttcccgatggccaagtcatcacaa
gactacttacaactctatcatgaagtgtgatgtggatatcagaaaagacctatatggaaacatcgtgctcagtggtgggtcaactatgttccctggtattgcagaccgtatgagccgggagatcactgctcttgctccaagcagcatgaagatcaaggttgtagctccacc3gagagaaagtacgcggggacga1:agcca^tcagaBaagLgaaaaaggcacaagtccggcaaa^atgtctgcctcagttatggcttgttccgtgagcctaaaaccatctcccttcactgttcagaagtcagcagtgagaggccttccctctctttccaggtcttctgcttcattcaaggtgcaagccagtggcgtcaagaaaatcaagactgccaccccatatgg肌ctggtggcggcatggagttgaggaacggtgttgatgcctctgggaggaagcctacgggaaagggtgtctaccagtttgta^caagta_c.
標記M8與來自于梨的肌動蛋白(actin)有很高的同源性。其NCBI登錄口是http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi val=60650116。
圖7顯示出在第一次儲藏后此基因的活性相對于硬度的關(guān)系。實施例2
通過收獲時間前后的基因表達與收獲后的花的品質(zhì)的相關(guān)性來確定空運郁金香(liftingtulips)的最佳時機。
在四年中，三種郁金香品種，品種"Apeldoom"、品種"LeenvandeMark"和品種"Prominence",每一次在相同的生長點取樣。取樣在當季的不同時期進行，在預定的空運曰期前的6-7個星期每隔2星期，在確定空運曰期前的至少l個星期，在空運時，和在隨后的l個星期。生長點的每次取樣在早晨進行，在白天的其余時間進行釆樣處理。從最外層的鱗莖片，取大小為lci^的一塊組織，立即用液氮定形。然后，在此組織中，在所有標準的季節(jié)和每一個品種中測定已確
30定的與收獲的時間有關(guān)的3個標記的可觀數(shù)量的基因的基因表達。
為了確定釆后途徑中的空運的最佳時機與產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)系，釆自野外樣品的鱗莖的部分用于儲藏。在儲藏后，這些鱗莖壓制后種植用于評定得到的花和莖的品質(zhì)和標記的值與得到的花的品質(zhì)參數(shù)的值之間的的相關(guān)性。在評定中的客觀的品質(zhì)參數(shù)是花的重量和莖的長度。
在二個另外的季節(jié)期間，標記的確認隨后進行，同時也在其他的
生長場所進行取樣。為此目的，每次取io個鱗莖的混合樣品用于分離RNA，用定量PCR確定其中標記的濃度。
在PCR過程中，釆用下述的引物化合物，其是與品種"Prominence"中分離出的三種標記的核苷酸序列相對應的標記 正向引物 反向引物
GAST 5'-GGCACCTACGGCAACTATGATAG-3' 5'-CACTTGCGAGCACCATGATG-3'EIF4a 5'-CGTCCCGTGTCACAAAGTTG-3' 5'-CCATCGTATCGGTCGTAGTGG-3'EFIA5'-TrGATArTGCIUIUrQGAAGnTGA&3' 5'-AGTTOCAGlAArCArGnCriAArGAAGrc-3'
品種"Prominence "和"Apeldoorn"的標記的組合實測值過程如圖11所示。其是從收獲的最佳時機的前三個星期直到收獲的最佳時機，在開花試驗中測定，標記的過程，繪制其基于時間的對數(shù)圖，表現(xiàn)出幾乎線性的可重現(xiàn)的圖。標記的值與開花品質(zhì)參數(shù)的值有關(guān)，決定了其中哪個標記的值達到了空運的最佳時機。對于特殊的品種，標記吻合線性過程；在品種之間，存在有線性過程的差異。通過不同年份的組合實測值，可以確定每一種品種的可靠的校準線。在此校準線基礎(chǔ)上，可以根據(jù)取自野外的在空運預計時間2個星期之間的僅僅1或2個樣品的檢測來預估新季節(jié)的空運的最佳時機。標記GAST具有下述的核苷酸序列(SEQ ID NO:21):
gatcatccagttactaagctaagcasgccctxcttcctcaacttatcaatgacttcatccacctccatcctgacatccct"tgtgcttctcttcctccttgtcggtctcgtcgagccccgcctgggigattgaacccgg朋a
31cgggatagaaaggtctcttctaggtgggctaagtaagcaactcttccgaactatcactaatcagtatgtt ggtattcttagagag犯gttaaccatagattgttatgatgatcaggctgcggtgcggcgtgcttggtgag gtgcagcgagtcatcaaggccgaatctgtgca卿gggcgtgcgggacatgctgtgcaaggtgcagctgc
ctcgcaagtgccctt犯acatga^g犯t3aMtggtgtgtcalaggtg3tg犯agtgggttcgcttgttc gatatatat3t已tgtaataaaacgttcaaacaaactcagtta^ttcgaELtaaagagg
標記GAST的表達在收獲時間的前三個星期就可以完全測量到。 在這個時間點之前不能得到此標記可靠的值。在收獲前的三個星期， 表達量呈指數(shù)增加，并且在收獲的最佳時機達到三個待測品種均一致 的值。在收獲的最佳時機之后，此標記達到恒值。
其它的標記，EIF4a和EFIA，是結(jié)構(gòu)基因，其表達量在測量的任 何時候即收獲郁金香鱗莖的前、中和后期都不會改變。這些標記的均 值用于標準化以獲得待測品種之間的比較。 實施例3
玫瑰切花品質(zhì)和基因表達量之間關(guān)系的確定
基因表達量的數(shù)據(jù)用于預估玫瑰的插瓶壽命。實際上，某些玫瑰 在消費者的花瓶僅能維持5天而其它玫瑰(同樣的品種)有時可維持 多達10天。這常是由于它們?yōu)榱苏壑杂谄焚|(zhì)而在還未成熟時收獲。
調(diào)查發(fā)現(xiàn)某個基因或某個基因的表達量和收獲的時間和品質(zhì)之 間顯示出良好的相關(guān)性。利用基因表達量數(shù)據(jù)，釆用較早提到的方法， 進行與玫瑰的插瓶壽命的相關(guān)性研究。測定在收獲中和收獲后花瓣中 的相對表達量可以大約預估玫瑰的期望的插瓶壽命。用于這個目的的 基因被認為是和結(jié)構(gòu)標記聯(lián)合的GDSL-基序(motif)脂肪酶，在此 例中，是延伸因子la ,如圖12所示。當玫瑰在4t:儲存時，插瓶壽 命的差異仍是可測的。不同品種之間、收獲的不同年份之間發(fā)現(xiàn)的值 是一致的。此標記通過RT-PCR確認。用下述的引物組合來檢測所有 的樣品正向引物 反向引物 GDSL-motif lipaseAGCMnTCAGAACAOCAAnTQC GAGnCAATGACAAQCrGAAEWGTK} EFla TGGIUICAAGCAGArGAnTQC TKXTOGlAOCITQOCmGAG
GDSL-基序脂肪酶具有下述的序列(反向互補鏈編碼基因如SEQ
丄、Vy,厶/ 〃| at /
gtactacaatactactaaataccgtattatxatattgccactccatggtggaagtagaaacatccactgtag aaagcaaaatgaagacttacctccagaatgcaattctaaacaacctaataagtaataactatacttagttgggcacaaa
cctagctttcatatattaattgaaggaaaattaaggaaactgggtcaggacacgtttgactatgtaatcagagatgatc
ccttcttatcatatacaggaaaacaaaataaggatttgagaacaccaatttgcttccaggaagctctttattgaggctg acggtcaacttattcagcttgtcattgaactccaaagccacatcgttgtaattcgaaatgcagtcatttccatccatga tattactggttctctctaatggcaagcatcccattggaggcagtxctcccacggaaattttccgagctccgagcttgta gagttccttcacgaaattcgctgcgattccgatgagaaagtcttggtattgggeiggtagtgtattggggatgatcggcc tgatggtggaaMgtgg
此標記與來源于^raZ^o; ^ (At2g04570)的GDSL-基序脂肪酶/ 水解酶有很高的同源性。在^ra6^op^中此基因在芽和氣孔中特別 地表達。
實施例4
基因表達量和大多數(shù)種類的蘋果和梨的果實成熟之間關(guān)系的確
定
收集多個果園的梨品種Conference和蘋果品種Kanzi的數(shù)據(jù)， 這2個品種由于荷蘭的位置在荷蘭收獲(收獲，有條件的儲藏(4-10 月))。在剛收獲后(48小時內(nèi))親自測定各種標記的值。
為此，從果實的混合試樣中釆用CTAB法(Plant Molecular Biology Reporter Vol. 11 (2)， 1993, pp. 113-116)分離mRNA。通過前述提到的方法確定各種標記的表達型和通過RT-PCR確認。用下述的引
物組合檢測所有的樣品
正向引物 反向引物
PG GCCCTAATACGGACGGAATTC pXYL AACTAATTGGTGCTGCTGAGGTT EFla TGGGTTTGAGGGTGACAACA PGK CCTGAATTCGCCAAGAAGCT
AATACAGTCATCACCTGTTCCTATAACC GTCCGGTCTCTGAACTCTGCTT TGATCAGGTCAAGAGCCTCAAG TGCATGAGCCCTATGAGCAGTA
在相同的樣品中，釆用標準的方法和自動透度計，來測定水果的
硬度。另外，還測定其他的生理參數(shù)，如顏色、淀粉含量、含糖量 和蘋果酸濃度。
跟蹤在荷蘭的低氧濃度的冷庫中儲藏期間的原料，在約5個月的 儲藏期后取樣。在這些樣品中，再次進行生理測定。
對于梨和蘋果，質(zhì)地標記p-木糖苷酶(Pxyl)和多聚半乳糖醛酸
酶I (PG1)特別證明是和荷蘭位置相關(guān)的。通過測定這些標記的基因 活性何時開始升高可以確定成熟的開始和成熟的過程(見圖8)。圖8 是在幾天內(nèi)的pxyl的表達量對時間的曲線。由于可以在不同年份之 間比較選用收獲的最佳時機作為起始點(用生理參數(shù)確定)。圖8可 以清楚地顯示出不同年份之間的此標記的過程幾乎是吻合的和可以 用來很好地確定收獲的最佳時機。圖8釆用了標記，但是PG的表達 量圖以同樣的方式進行并可任意和pxyl —起使用以獲得更好的分辨 率。通過比較標記和結(jié)構(gòu)標記(磷酸甘油酸激酶(PGK)或延伸因子 la(eFla)的活性來校正每一次的標記的值。
在收獲時期可以預估儲藏幾個月后離開冷庫時的預期的硬度，依 賴于采后處理，通過測定儲藏后的質(zhì)地標記的值并與校準線相比較。 校準線由于處理的不同(如冷凍溫度、用乙烯抑制劑處理等等)當然 有所區(qū)別。
圖9和圖10清楚地顯示出梨和蘋果在儲藏后的硬度和他們在收獲時的質(zhì)地標記的值之間有清晰的關(guān)系。其在PG和pxyl中再次體現(xiàn)。
權(quán)利要求
1、一種測定基因或蛋白/酶標記的方法，用于在收獲時預測農(nóng)產(chǎn)品和/或園藝產(chǎn)品在收獲期或收獲后的特定時間時的相應品質(zhì)特征的期望值，包括如下步驟a.為特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的相應品質(zhì)特征定義定量的或相對的測定值；b.在收獲之前、期間及之后的幾個時間點測定一組優(yōu)選與特定品質(zhì)特征相關(guān)的基因的表達水平或一組優(yōu)選與特定品質(zhì)特征相關(guān)的蛋白/酶的蛋白濃度；c.在收獲期間或之后的特定時間，測定b)中測出的表達水平或b)中測出的蛋白濃度與此農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的品質(zhì)特征的值(按照a)中的定義)之間的相關(guān)性；和d.從來自于b)的那些基因中找出表達水平曲線表現(xiàn)出上升或下降的，或從來自于b)的那些蛋白/酶中找出表現(xiàn)出濃度升高或降低趨勢的，并根據(jù)收獲期間或之后的特定時間的品質(zhì)因子值得出相關(guān)系數(shù)，其在0.3-1的范圍，優(yōu)選在0.4-1的范圍，更優(yōu)選在0.5-1的范圍，更優(yōu)選在0.6-1的范圍，更優(yōu)選在0.7-1的范圍，更優(yōu)選在0.8-1的范圍，最優(yōu)選在0.9-1的范圍；e.為特定采后途徑確定標準線，用最大相關(guān)系數(shù)修正1d中測定的收獲時基因的基因活性或蛋白/酶的濃度值與特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品在收獲期間或采后特定時間的特定品質(zhì)特征的值的關(guān)系；f.和在基于不同類型的采后途徑的上述過程的基礎(chǔ)上任意確定特定標準線。
2、 一種測定基因或蛋白/酶標記的方法，其用于在特定釆后途徑 期間預測此農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的相應品質(zhì)特征的期望值，其包括下述 步驟a.為特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的相應品質(zhì)特征定義定量的或相對的測定值；b. 在釆后途徑的幾個時間點測定 一 組優(yōu)選與特定品質(zhì)特征相關(guān) 的基因的表達水平或一組優(yōu)選與特定品質(zhì)特征相關(guān)的蛋白/酶的蛋白濃度；c. 在收獲之后的特定時間，測定b)中測出的表達水平或b)中 測出的蛋白濃度與此農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的品質(zhì)特征的值(按照a)中 的定義)之間的相關(guān)性；和d. 從來自于b)的那些基因中找出表達水平曲線表現(xiàn)出上升或下 降的，或從來自于b)的那些蛋白/酶中找出表現(xiàn)出濃度升高或降低趨 勢的，并根據(jù)收獲之后的特定時間的品質(zhì)因子的值得出相關(guān)系數(shù)，其 在0.3-1的范圍，優(yōu)選在0.4-1的范圍，更優(yōu)選在0.5-1的范圍，更優(yōu) 選在0.6-1的范圍，更優(yōu)選在0.7-1的范圍，更優(yōu)選在0.8-1的范圍， 最優(yōu)選在0.9-1的范圍；e. 為所述特定釆后道路確定標準線，用最大相關(guān)系數(shù)修正ld中 測定在所述釆后途徑期間的基因的基因活性或蛋白/酶的濃度值與特 定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品在收獲期間或釆后特定時間的特定品質(zhì)特征的 值的關(guān)系；f. 和在基于不同類型的釆后途徑的上述過程的基礎(chǔ)上任意確定 特定標準線。
3、 一種預測釆后途徑結(jié)東時特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的品質(zhì)特征 的期望值的方法，其包括下述步驟a. 在釆后途徑之前(如在收獲時)或在釆后道路中，測定果實 中一種或多種基因標記的表達水平或測定一種或多種蛋白/酶標記的 濃度；b. 在按照權(quán)利要求1或2確定標準線的過程的基礎(chǔ)上，預估特 定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品在采后的品質(zhì)特征的期望值，其是為特定測量時 刻以及特定的釆后場所而設(shè)置的，具有在a)中測定的基因表達量或蛋白濃度，由此，在特定表達量或蛋白濃度的基礎(chǔ)上預估的特定品質(zhì) 特征值就能從特定標準線圖上讀出。
4、 一種在釆后途徑結(jié)束時預測特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品在特定品質(zhì)特征方面的品質(zhì)期望值的方法，其包括下述步驟a. 通過巿場定義特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的特定品質(zhì)特征的可接 受的值的范圍；b. 在按照權(quán)利要求3測定的特定品質(zhì)特征的值以及a)中定義的 范圍的基礎(chǔ)上，考量預估的品質(zhì)對于該品質(zhì)特征而言是能夠接受的或 是不能接受的。
5 、 一種確定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品最佳收獲時間的時間起點和時間 終點的方法，其包括如下步驟a. 在 一 些收獲時間點測定待測農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品中具有最大相 關(guān)系數(shù)的一種或多種基因標記的表達水平曲線或一種或多種蛋白/酶 標記濃度趨勢，最大相關(guān)系數(shù)按照權(quán)利要求1步驟d)的方式測定；b. 測定特定品質(zhì)特征的值，其屬于基因的基因活性或標記蛋白/ 酶的濃度在收獲時間曲線中的值；c. 測定時間的第一階段，其中得出的特定品質(zhì)特征的值按照權(quán) 利要求4步驟a)落入可接受的品質(zhì)范圍內(nèi)，并稱該時間階段為最佳 收獲時間的時間起點；d. 測定時間的最后階段，其中得出的特定品質(zhì)特征的值按照權(quán) 利要求4步驟a)落入可接受的品質(zhì)范圍內(nèi)，并稱時間階段為最佳收 獲時間的時間終點。
6、在釆后途徑結(jié)東時預估特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品特定品質(zhì)特征 期望值的試劑盒，其包括a. —種或多種待測基因表達或一種或多種標記蛋白的濃度和一 種特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的特定品質(zhì)特征之間關(guān)系的標準線；或生成 該標準線的操作指南，b.分別測定一種或多種待測基因表達或一種或多種待測蛋白的 濃度的裝置。
7、 用于在釆后途徑結(jié)東時預測特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的特定品 質(zhì)特征期望值，或者確定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品與特定品質(zhì)特征有關(guān)的最佳收獲時間時間起點和時間終點的自動系統(tǒng)，其包括a. 測量一些重要基因在一種或多種特定農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品中的品質(zhì)特征的表達的裝置；b. 測量對照基因表達的裝置，如管家酶，如磷酸甘油酸激酶 (PGK)或延伸因子la (eFla);c. 測定a)中提及的基因的(相對)表達曲線的裝置；d. —種或多種標準線，其表現(xiàn)了一種或多種在a)中提及的基因 的表達曲線和所述品質(zhì)特征的相關(guān)性；和e. 解釋所測量的一種或多種農(nóng)作物或園藝作物關(guān)于相關(guān)的標準 線的表達曲線的裝置，以及在它的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的一種關(guān)于一種或多種 農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品的品質(zhì)特征指示器，該指示器也包括一個當時的指 示，其需要采后途徑和/或直到最佳的釆后時間點。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項中的方法或根據(jù)權(quán)利要求6中 的試劑盒或根據(jù)權(quán)利要求7中的系統(tǒng)，其中所述的農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品 選自由水果、蔬菜、馬鈴薯、種子(如谷物)、堅果、切花、鱗莖、 觀賞盆栽植物和可收獲草藥構(gòu)成的組。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8中所述的方法、試劑盒或系統(tǒng)，其中所述的 農(nóng)產(chǎn)品或園藝產(chǎn)品是水果，且選自由蘋果，梨，柑橘類水果如橙、桔、 持檬和minneola橘子，瓜，番茶，杉L李子，葡萄，黑醋粟，醋粟， 黑莓，懸鉤子(raspberry),櫻桃，菠蘿，芒果，獼猴桃，荔枝，香 蕉，紅辣椒，和鱷梨，和包括它們的所有品種和栽培變種構(gòu)成的組。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9的方法、試劑盒或系統(tǒng)，其中所述的品質(zhì)特 征選自由水果硬度、水果甜度、水果顏色、水果大小和它們的一種或多種組合構(gòu)成的組。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10的方法、試劑盒或系統(tǒng)，其中的品質(zhì)特征 是水果的硬度，且水果是蘋果或梨，并且其中的基因和/或蛋白標記選自由M8 , P-木糖苷酶(pxyl )，多聚半乳糖醛酸酶 (polygalactu腿idase ) I和II ( PGI和PGII )，推定的細胞壁過氧化物酶424/87 ( 87 ) (putative cell wall peroxidase 424/87 (87))，木葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖苷酶(xyloglucan endotransglycosylase, XET),蘋果菌素 (expansin )和如內(nèi)-P-l,4-葡聚糖酶(endo-卩-l，4-glucanase)的葡聚糖酶(glucanases),以及它們的編碼基因。
12、 根據(jù)權(quán)利要求8的方法、試劑盒或系統(tǒng)，其中所述農(nóng)產(chǎn)品或 園藝產(chǎn)品是蔬菜，且選自萵苣，番茄，馬鈴薯，木薯，山藥，所有種 類的甘藍(花椰菜，羽衣甘藍，芽甘藍，鄰葉甘藍，圓錐甘藍，及類 似品種)，小胡蘿卜(baby carrot )，冬胡蘿卜(winter carrot)和豆類
13、 根據(jù)權(quán)利要求8的方法、試劑盒或系統(tǒng)，其中的品質(zhì)特征是 切花的插瓶壽命，且切花是玫瑰，且其中的基因和/或蛋白標記包括 至少GDSL-基序脂肪酶標記和/或其編碼基因。
14、 根據(jù)權(quán)利要求8的方法、試劑盒或系統(tǒng)，其中的品質(zhì)特征是 鱗莖的最佳空運時間，且鱗莖是郁金香，且其中的基因和/或蛋白標 記包括至少GAST標記和/或其編碼基因。
15、 M8標記在測定水果成熟度，優(yōu)選在測定梨和蘋果的成熟度 中的應用。
16、 GAST標記在測定鱗莖，優(yōu)選郁金香的最佳空運時間中的應用。
17、 GDSL基序脂肪酶標記在測定切花，優(yōu)選玫瑰的插瓶壽命中 的應用。
18、 根據(jù)權(quán)利要求16, 17或18的應用，其中的標記分別包括SEQ ID NO: 14, 22或27的氨基酸序列，或至少70%與其相同的序列。
19、直接對抗標記的氨基酸序列的抗體，其中的氨基酸序列選自 SEQ ID NO: 14, 22和27。
全文摘要
本發(fā)明涉及預測農(nóng)產(chǎn)品和園藝產(chǎn)品品質(zhì)特征的期望值的方法以及通過比較農(nóng)產(chǎn)品和園藝產(chǎn)品在收獲前或在采后途徑期間與品質(zhì)特征相關(guān)的基因和/或蛋白的表達水平來預測理想的最佳收獲時間的方法，其采用預選確定的校準線。本發(fā)明還涉及標記M8，GAST和GDSL基序脂肪酶以及它們的用途，和對抗它們的抗體。
文檔編號C12Q1/68GK101680028SQ200880012753
公開日2010年3月24日 申請日期2008年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月20日
發(fā)明者伊沃·拉魯斯, 安妮·道維·狄波爾, 約斯特·約翰尼斯·西奧多勒斯·吉爾肯克, 邁克爾·約翰尼斯·馬庫斯·埃畢斯坎普 申請人:表現(xiàn)研究有限公司