專利名稱：使用帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘酯△4-去飽和酶的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的神經(jīng)酰胺的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)主張基于2007年3月30日申請(qǐng)的日本專利申請(qǐng)2007-94762以及2007年6月12日申請(qǐng)的日本專利申請(qǐng)2007-155037的優(yōu)先權(quán)。本發(fā)明涉及在酵母細(xì)胞內(nèi)等的細(xì)胞內(nèi)制造人型神經(jīng)酰胺的方法。
背景技術(shù)：
皮膚的最外層，存在著具有保持水分的保濕功能和保護(hù)肌膚不受外界刺激的屏障 功能的稱為角質(zhì)層的組織。角質(zhì)層由角質(zhì)細(xì)胞和天然保濕因子、及細(xì)胞間脂質(zhì)構(gòu)成，其中， 特別是約占細(xì)胞間脂質(zhì)一半的神經(jīng)酰胺對(duì)上述功能起著極為重要的作用。例如，特應(yīng)性皮 炎、老年性干皮病共通的特征是保濕功能顯著降低，已知其主要原因是由于脂代謝酶異常 而引起的神經(jīng)酰胺量的減少，且也已證實(shí)神經(jīng)酰胺具有增強(qiáng)屏障功能 美白作用、抑制黑素 生成的作用。神經(jīng)酰胺是可從外界補(bǔ)充的物質(zhì)。J Invest Dermatol. 96 :523_526，1991 (非專利文獻(xiàn) 1)、Arch Dermatol Res. 283 219-223，1991 (非專利文獻(xiàn)2)中公開(kāi)了《特應(yīng)性皮炎、老年性干皮病中神經(jīng)酰胺量 的減少》J Dermatol Sci. 1 :79_83，1990 (非專利文獻(xiàn) 3)、Acta Derm Venereol. 74 337-340，1994(非專利文獻(xiàn)4)中公開(kāi)了《神經(jīng)酰胺量的減少與脂代謝酶異常》；Contact Dermatitis. 45 280-285, 2001 ( # # ^lJ ^； K 5) > J EurAcad Dermatol Venereol. 16 587-594，2002 (非專利文獻(xiàn)6)中公開(kāi)了《神經(jīng)酰胺的屏障功能的恢復(fù)》；且Cell Signal 14 :779-785，2002(非專利文獻(xiàn)7)中公開(kāi)了《通過(guò)神經(jīng)酰胺抑制黑素生成》。近年來(lái)，其作為針對(duì)干燥敏感肌膚帶來(lái)的皮膚疾病的治療藥物或化妝品·美容健 康食品的材料受到極大關(guān)注。實(shí)際上，作為化妝品、食品·營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)助食品等，配合了神經(jīng)酰 胺的大量產(chǎn)品已有市售，且神經(jīng)酰胺原料市場(chǎng)的規(guī)模有持續(xù)擴(kuò)大的趨勢(shì)。作為神經(jīng)酰胺的原料，至今為止所使用的是來(lái)自牛等動(dòng)物的原料，但因被指出有 傳染病的問(wèn)題，所以目前以米、小麥、大豆、薯類等的植物性神經(jīng)酰胺為主流。最近的基礎(chǔ)研 究[J. Clin. Invest. 112 1372-1382，2003 (非專利文獻(xiàn)8)]已證實(shí)，神經(jīng)酰胺的結(jié)構(gòu)在皮膚 保濕·屏障功能上極為重要，而與人的神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)不同的植物性神經(jīng)酰胺是否是功能性 強(qiáng)的脂質(zhì)還留有疑問(wèn)。且因動(dòng)植物中存在的神經(jīng)酰胺為微量，其提取 精制較為困難，生產(chǎn) 率低、成本高，所以，強(qiáng)烈希望開(kāi)發(fā)出可克服這些缺點(diǎn)的新的生產(chǎn)技術(shù)。如圖1所示，已知神經(jīng)鞘脂類合成·代謝途徑中二氫神經(jīng)鞘氨醇(DHS: dihydrosphingosine)生物合成后的反應(yīng)在包括人的高等動(dòng)物細(xì)胞和酵母之間有很大差 異。此外，在神經(jīng)鞘脂類合成 代謝途徑中，對(duì)于各個(gè)過(guò)程中起作用的各個(gè)酶蛋白質(zhì)及編碼 該蛋白質(zhì)的基因，也已獲得了一定程度的認(rèn)識(shí)[Biochemistry. 41 :15105_15114. 2002 (非 專利文獻(xiàn) 9) J Biol Chem. 277 :25512-25518，2002(非專利文獻(xiàn) 10) ；Yeast 9:267-277， 1993 (非專利文獻(xiàn) 11) J Biol Chem 272 :29704_29710，1997 (非專利文獻(xiàn) 12) J Biol Chem 275 :31369-31378，2000(非專利文獻(xiàn) 13) J Biol Chem 275 39793-39798，2000 (非專利文獻(xiàn)14)] 。非專利文獻(xiàn)1J Invest Dermatol. 96 :523_526，1991非專利文獻(xiàn)2Arch Dermatol Res. 283 :219_223，1991非專利文獻(xiàn)3J Dermatol Sci.1 :79_83，1990非專利文獻(xiàn)4Acta Derm Venereol. 74 :337_340，1994非專利文獻(xiàn)5Contact Dermatitis. 45 280-285,2001非專利文獻(xiàn)6J Eur Acad Dermatol Venereol. 16 :587_594，2002非專利文獻(xiàn)7Cell Signal 14:779-785,2002非專利文獻(xiàn)8J. Clin. Invest. 112 1372-1382，2003非專利文獻(xiàn)9Biochemistry. 41 :15105_15114· 2002非專利文獻(xiàn)10J Biol Chem. 277 :25512-25518，2002非專利文獻(xiàn)11Yeast 9 :267_277，1993非專利文獻(xiàn)12J Biol Chem 272:29704-29710,1997非專利文獻(xiàn)13J Biol Chem 275 :31369_31378，2000非專利文獻(xiàn)14J Biol Chem 275 :39793_39798，2000非專利文獻(xiàn)15EMBO J. 9 :3153_3162，1990非專利文獻(xiàn)16J Cell Biol. 127 :653_665，1994非專利文獻(xiàn)17Science. 263 :1629_1631，1994非專利文獻(xiàn)18Cell. 79 :1199_1207，1994非專利文獻(xiàn)19Eur J Cell Biol. 64 :211_216，1994
非專利文獻(xiàn)20Annu Rev Cell Dev Biol. 12 :27_54，1996非專利文獻(xiàn)21J Cell Biol. 127 :21_28，1994非專利文獻(xiàn)22J Biol Chem. 273 :33273_33278，1998非專利文獻(xiàn)23J Cell Biol. 152 :935-944，200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題植物性神經(jīng)酰胺不僅與人的神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)不同，而且生產(chǎn)率低。為了克服這些問(wèn)題，人們迫切希望開(kāi)發(fā)出能用酵母細(xì)胞等細(xì)胞來(lái)制造人型神經(jīng)酰胺的新生產(chǎn)技術(shù)。解決課題的方法本發(fā)明者為了解決上述問(wèn)題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果想到了本發(fā)明。本發(fā)明開(kāi)發(fā)通過(guò)巧妙地控制基因重組技術(shù)和真核生物的神經(jīng)酰胺合成 代謝以及運(yùn)送系統(tǒng)來(lái)高效地生產(chǎn)功能性高的人型神經(jīng)酰胺的系統(tǒng)。因此，采用基因操作較容易且在 傳統(tǒng)的食品制造中應(yīng)用的芽殖酵母作為宿主。具體而言，以存在于人的角質(zhì)層的且在其中分布量最多、對(duì)皮膚的保濕 屏障功能 極為重要的神經(jīng)酰胺NS為目標(biāo)。神經(jīng)酰胺的結(jié)構(gòu)由細(xì)胞所具有的酶的種類來(lái)決定，因生物 種不同而不同。作為宿主使用的芽殖酵母不具有合成高等動(dòng)物的主要神經(jīng)酰胺即神經(jīng)酰胺 NS的酶。取而代之，宿主具有合成宿主特有的神經(jīng)酰胺的酶。因此，為了采用酵母來(lái)合成神 經(jīng)酰胺NS，必須抑制宿主自身的神經(jīng)酰胺合成途徑，并且向酵母導(dǎo)入必要的酶。具體地說(shuō)，如圖1所示，神經(jīng)鞘脂類合成 代謝途徑中二氫神經(jīng)鞘氨醇(DHS)生物 合成后的反應(yīng)，在包括人的高等動(dòng)物細(xì)胞和酵母之間有很大差異。即芽殖酵母(酵母屬) 中因不存在鞘脂Δ 4-去飽和酶基因(DESl)，所以不能合成DHS的C-4位上具有雙鍵的人型 鞘氨基醇?jí)A(鞘氨醇(sphingosine))(圖2)。不同的是，通過(guò)二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶 基因(SUR2 :Sphinganine C4-hydroxylase gene)編碼的酶使DHS的C-4位被羥化，合成植 物鞘氨醇(PHS)。之后，這些鞘氨基醇?jí)A轉(zhuǎn)換為神經(jīng)酰胺。本發(fā)明者認(rèn)為首先為了在酵母細(xì)胞內(nèi)制造人型神經(jīng)酰胺，重要的是使在酵母細(xì)胞 內(nèi)不存在的鞘脂Δ 4-去飽和酶在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、以及完全或部分破壞二氫神經(jīng)鞘氨醇 C4-羥化酶的酶活性。因此，首先想到了通過(guò)酵母的轉(zhuǎn)化，1)制作上述SUR2基因阻斷株，2) 在其突變株中導(dǎo)入人DESl基因。進(jìn)而，通過(guò)使導(dǎo)入的酶在最佳部位定位，能增加神經(jīng)酰胺NS的產(chǎn)量。神經(jīng)酰胺NS 的合成中所需的二氫神經(jīng)酰胺在酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成。但是，據(jù)對(duì)人型鞘脂Δ4-去飽和酶 DESl蛋白質(zhì)的C末端氨基酸序列的觀察，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)酵母典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)(例如，基于 雙賴氨酸(dilysine-based) (KKXX或KXKXX)的序列)。因此，認(rèn)為即使使人型鞘脂Δ 4_去 飽和酶DESl蛋白質(zhì)在酵母中表達(dá)也不能高效地合成人型神經(jīng)酰胺NS。本發(fā)明者認(rèn)為為了更高效地生產(chǎn)人型神經(jīng)酰胺，使作為酶的鞘脂Δ 4-去飽和酶DESl蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的方法更有效。即，為了使DESl蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位，向酵母導(dǎo) 入通過(guò)在DESl蛋白質(zhì)附加酵母典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)而得到的鞘脂Δ4-去飽和酶基因 (DESlm)。通過(guò)使導(dǎo)入的酶在最佳部位定位，能增加神經(jīng)酰胺NS的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明提供在酵母細(xì)胞內(nèi)制造人型神經(jīng)酰胺的方法，其包括1)通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘脂Δ4-去飽和酶基因 (DESlm)，該DESlm通過(guò)在鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DESl)的3’末端添加編碼酵母的內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)定位信號(hào)的堿基序列而得到；及2)通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)的表達(dá)缺失。本發(fā)明中，人型神經(jīng)酰胺是指具有如圖2的“目的產(chǎn)物”中所示的結(jié)構(gòu)式的神經(jīng)酰胺NS。與此相對(duì)，酵母型神經(jīng)酰胺即植物神經(jīng)酰胺的不同點(diǎn)是，人型神經(jīng)酰胺4位的雙鍵部 分被羥基所取代(圖3)。而且，為構(gòu)建高效生產(chǎn)人型神經(jīng)酰胺NS的系統(tǒng)，將本發(fā)明的制造方法進(jìn)行了最佳化。具體方法是，通過(guò)酵母的轉(zhuǎn)化，進(jìn)行以下3)或4)中的任一個(gè)或這些的組合，使更高效 地制造人型神經(jīng)酰胺得以成功3)為使神經(jīng)酰胺NS不被羥化，需使酵母神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶基因(SCS7)的表 達(dá)缺失；和/或4)使酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶基因(YDCl)的表達(dá)缺失。因此，本發(fā)明通過(guò)以上述1)及2)為必要條件，將3)_4)作為優(yōu)選方式的追加條 件，提供在酵母細(xì)胞內(nèi)簡(jiǎn)便且高效地制造人型神經(jīng)酰胺的方法。本發(fā)明優(yōu)選包含以下的方 式。(方式1)在酵母細(xì)胞內(nèi)制造人型神經(jīng)酰胺的方法，其包括1)通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘脂Δ4-去飽和酶基因 (DESlm)，該DESlm通過(guò)在鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DESl)的3’末端添加編碼酵母的內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)定位信號(hào)的堿基序列而得到；及，2)通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)的表達(dá)缺失。(方式2)方式1中所述的制造方法，其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨基酸序列由包含2個(gè)以上賴 氨酸殘基的4個(gè)或5個(gè)氨基酸殘基組成。(方式3)方式1或2中所述的制造方法，其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨基酸序列為VKKEK(V表 示纈氨酸殘基，K表示賴氨酸殘基，E表示谷氨酸)。(方式4)方式1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DESl)編碼下述 蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2的氨基酸序列或序列號(hào)2中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基 發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有鞘脂△ 4-去飽和酶活性。
(方式5)方式1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘脂Δ 4-去飽和酶 基因(DESlm)編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。(方式6)方式1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因 (SUR2)編碼下述蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)6的氨基酸序列或序列號(hào)6中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基 發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性。(方式7)方式1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)一步包括通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因(SCS7)的表達(dá)缺失。(方式8)方式7中所述的方法，其中，酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因(SCS7)編碼下述蛋 白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)8的氨基酸序列或序列號(hào)8中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基 發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶活性。(方式9)方式1 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)一步包括通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母 堿性二氫神經(jīng)酰胺酶基因(YDCl)的表達(dá)缺失。(方式10)方式9中所述的方法，其中，酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶基因(YDCl)編碼下述蛋白 質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)10的氨基酸序列或序列號(hào)10中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘 基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有堿性二氫神經(jīng)酰胺酶活性。(方式11)方式1 10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母從酵母屬的酵母中選擇。鞘脂Δ 4-去飽和酶基因(DESl)本發(fā)明的方法包括構(gòu)成要素1)，通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的 鞘脂Δ 4-去飽和酶基因(DESlm)，該DESlm通過(guò)在鞘脂Δ 4-去飽和酶基因(DESl)的3’末 端添加編碼酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的堿基序列而得到。并非要受局限，DESl優(yōu)選編碼如下蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2的氨基酸序列 或序列號(hào)2中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代了的氨基酸序列，且具有 鞘脂Δ 4-去飽和酶活性?？捎糜诒景l(fā)明的基因(核酸)，包括基因組DNA (也包括與其對(duì)應(yīng)的cDNA)、化學(xué)合 成的DNA、通過(guò)PCR擴(kuò)增的DNA及這些的組合。DESl優(yōu)選具有序列號(hào)1的堿基序列。其是編碼具有序列號(hào)2的氨基酸序列的人鞘 月旨Δ 4-去飽和酶蛋白質(zhì)的堿基序列，例如已在GenBanK :accession number AF466375中 公開(kāi)。1個(gè)以上的密碼子編碼同一氨基酸時(shí)，稱為遺傳密碼的簡(jiǎn)并。因此，與序列號(hào)1不完全一致的DNA序列可編碼具有與序列號(hào)2完全相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。這樣的突變 體DNA序列可從沉默(silent)突變(例如，PCR擴(kuò)增中發(fā)生)中產(chǎn)生或也可以是有目的地 對(duì)天然序列進(jìn)行誘變的產(chǎn)物。DESl優(yōu)選編碼序列號(hào)2中記載的氨基酸序列。但是，并不限于此，也可以有1個(gè)或 1個(gè)以上的氨基酸序列發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有鞘脂Δ4-去飽和酶 活性，可包括所有的同源蛋白質(zhì)。只要編碼與序列號(hào)2具有同等功能的氨基酸序列即可，不 限于序列號(hào)2?！鞍被嵬蛔儭笨梢詾? 多個(gè)，優(yōu)選1 20個(gè)，更優(yōu)選1 10個(gè)，最優(yōu)選 1 5個(gè)。由DESl編碼的氨基酸序列，具有與序列號(hào)2中記載的氨基酸序列有至少約70%、 優(yōu)選約80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性。氨基酸的同一性百分?jǐn)?shù)，可通過(guò)視覺(jué)檢查及數(shù)學(xué)計(jì)算確定?；?個(gè)蛋白質(zhì)序列 的同一性百分?jǐn)?shù)，可根據(jù) Needleman，S. B.及 Wunsch，C. D. (J. Mol. Biol.，48 :443_453， 1970)的算法，通過(guò)使用從威斯康星大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(UWGCG)獲得的GAP計(jì)算機(jī)程 序比較序列信息來(lái)確定。GAP程序的優(yōu)選默認(rèn)值中，包括(1)如Henikoff，S及Heniko， J.G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 10915-10919，1992)中記載的打分矩陣、blosum62 ； (2) 12的空位權(quán)重；(3)4的空位長(zhǎng)度權(quán)重；及(4)對(duì)末端空位無(wú)罰分。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的序列比較的其他程序。同一性的百分?jǐn)?shù)，可 使用例如 Altschul 等(Nuc 1. Acids. Res. 25.，p. 3389-3402，1997)中記載的 BLAST 程 序與序列信息比較確定。該程序可在因特網(wǎng)上National Center for Biotechnology Information(NCBI)、或 DNA Data Bank of Japan (DDBJ)的網(wǎng)站上利用。根據(jù) BLAST 程序 的同源性檢索的各種條件(參數(shù))，在該網(wǎng)站有詳細(xì)記載，可適當(dāng)變更一部分設(shè)定，但檢索 使用通常的默認(rèn)值進(jìn)行。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選鞘脂Δ 4-去飽和酶具有序列號(hào)2或與序列號(hào)2至少有70 % 同一性的氨基酸序列，且具有鞘脂Δ 4-去飽和酶活性。即使是具有同一功能的蛋白質(zhì)，由于其來(lái)源品種不同，其氨基酸序列也可存在不 同，這一點(diǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的事實(shí)。只要具有鞘脂Δ 4-去飽和酶活性，DESl也可 包含如序列號(hào)1的堿基序列的同源體、突變體。已知除序列號(hào)2的人鞘脂Δ4-去飽和酶 蛋白質(zhì)以外，還存在例如編碼與小鼠(M. musculus)、黑腹果蠅(D. melanogaster)、線蟲(chóng) (C. elegans)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等顯示同樣活性的蛋白質(zhì)的基因 (非專利文獻(xiàn)10)?！熬哂星手?-去飽和酶活性”是指，例如圖2或圖3中所示，在二氫神經(jīng)鞘氨醇 的C-4位導(dǎo)入雙鍵，合成鞘氨醇的活性。或指在二氫神經(jīng)酰胺的C-4位導(dǎo)入雙鍵，合成神經(jīng) 酰胺NS的活性。通過(guò)DESl的導(dǎo)入，在轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞內(nèi)，合成通過(guò)酵母天然代謝途徑無(wú)法合 成的鞘氨醇及/或神經(jīng)酰胺NS。本發(fā)明的優(yōu)選的鞘脂Δ4-去飽和酶基因，還包括可與序列號(hào)1的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn) 條件下，例如中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且具有鞘氨基醇△ 4-去飽和酶活性的核酸。“嚴(yán)謹(jǐn)條件下”是指在中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交。具體地說(shuō)，中度嚴(yán)謹(jǐn)條件， 例如可根據(jù)DNA的長(zhǎng)度，由具有一般技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。基本條件包括 使用如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 3 片反，第 6-7 章，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001 中所示，且與硝酸纖維素膜有關(guān)，5 X SSC、0. 5 % SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)的預(yù)洗滌溶液，約 40_50°C下、約 50%甲酰胺、2\5506\55([或 約42°C下的約50%甲酰胺中的Stark溶液(Stark's solution)等其他同樣的雜交溶液] 的雜交條件，以及例如約40°C -60°C、0. 5-6XSSC、0. 1% SDS的洗滌條件。優(yōu)選中度嚴(yán)謹(jǐn)條 件包括約50°C、6XSSC的雜交條件(及洗滌條件)。高嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如也可基于DNA的長(zhǎng)度，由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。—般此種條件，包括在比中度嚴(yán)謹(jǐn)條件高的溫度及/或低的鹽濃度下的雜交(例 如，約65°C、6XSSC 0. 2父55(，優(yōu)選6\55(，更優(yōu)選2\55(，最優(yōu)選0. 2X SSC的雜交)及 /或洗滌，例如定義為如上所述的雜交條件及同時(shí)伴隨約65°C -680.2XSSC,0. 1% SDS 的洗滌。雜交及洗滌的緩沖液中，可用SSPE(1XSSPE是0. 15M NaClUOmM NaH2PO4及1. 25mM EDTA、pH7. 4)代替SSC (1 X SSC是0. 15M NaCl及15mM檸檬酸鈉)，洗滌在雜交結(jié)束后進(jìn)行 15分鐘。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知、且如以下進(jìn)一步所記載，要通過(guò)適用控制雜交反應(yīng)和 雙鏈穩(wěn)定性的基本原理來(lái)達(dá)到所需程度的嚴(yán)謹(jǐn)性時(shí)，可將洗滌溫度和洗滌鹽濃度根據(jù)需要 進(jìn)行調(diào)整(例如，希望參照Sambrook等、2001)。使核酸與未知序列的目標(biāo)核酸雜交時(shí)，雜 交的長(zhǎng)度可假定為雜交核酸的長(zhǎng)度。使已知序列的核酸雜交時(shí)，雜交的長(zhǎng)度可通過(guò)聯(lián)配核 酸序列，鑒定具有最佳序列互補(bǔ)性的單數(shù)或多數(shù)區(qū)域來(lái)確定。預(yù)測(cè)為不足50堿基對(duì)長(zhǎng)度的 雜交體的雜交溫度，必須比雜交體的解鏈溫度(Tm)低5-25Π 」Τω由以下等式確定。對(duì)于 長(zhǎng)度不足18堿基對(duì)的雜交體，為Tm(°C) =2仏+1~堿基數(shù))+4(6+(堿基數(shù))。對(duì)于長(zhǎng)度超過(guò) 18 堿基對(duì)的雜交體，為 Tm = 81. 50C +16. 6 (Iogltl[Na+])+41 (摩爾分?jǐn)?shù)[G+C])-0. 63(% 甲酰 胺)-500/n，在此，N為雜交體中的堿基數(shù)，且[Na+]為雜交緩沖液中的鈉離子濃度(IX SSC 的[Na+] = 0. 165M)。優(yōu)選這樣的雜交核酸分別為至少8個(gè)核苷酸(或更優(yōu)選為至少15個(gè) 核苷酸、或至少20個(gè)核苷酸、或至少25個(gè)核苷酸、或至少30個(gè)核苷酸、或至少40個(gè)核苷酸、 或最優(yōu)選為至少50個(gè)核苷酸)、或其具有雜交核酸長(zhǎng)度的至少(更優(yōu)選為至少25%、 或至少50%、或至少70%、且最優(yōu)選為至少80% )的長(zhǎng)度，其與雜交核酸至少有50% (更 優(yōu)選為至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97.5%、或至 少99%、且最優(yōu)選為至少99. 5%)的序列同一性。此處的序列同一性如上述詳細(xì)記載，通 過(guò)比較使重復(fù)部分和同一性最大化，另外使序列空位最小化地進(jìn)行聯(lián)配的雜交核酸的序列 來(lái)確定。核酸同一性的百分?jǐn)?shù)可通過(guò)視覺(jué)檢查及數(shù)學(xué)計(jì)算確定?；?組核酸序列的同一性 百分?jǐn)?shù)，可通過(guò)目測(cè)檢查和數(shù)學(xué)計(jì)算確定、或更優(yōu)選為此比較通過(guò)使用計(jì)算機(jī)·程序、比較 序列信息來(lái)進(jìn)行。代表性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)·程序?yàn)檫z傳學(xué)計(jì)算機(jī)·小組(GCG ；威斯康星州麥 迪遜)的威斯康星·軟件包、10. 0 版程序 “GAP” (Devereux 等、1984、Nucl. Acids Res. 12 387)。通過(guò)此“GAP”程序的使用，除進(jìn)行2個(gè)核酸序列的比較以外，還可進(jìn)行2個(gè)氨基酸 序列的比較、核酸序列和氨基酸序列的比較。在此，“GAP”程序的優(yōu)選默認(rèn)值中包含(1) 對(duì)于核苷酸的(包括同一物為1、及非同一物為0的值)一元(unary)比較矩陣的GCG實(shí) 行、和 Schwartz 及 Dayhoff 監(jiān)修“多肽序列及結(jié)構(gòu)圖譜(Atlas of Polypeptide Sequence 及Structure) ”國(guó)立生物醫(yī)學(xué)研究財(cái)團(tuán)、353-358頁(yè)、1979中記載的Gribskov及Burgess， Nucl. Acids Res. 14 =6745,1986的加權(quán)氨基酸比較矩陣；或其他可比較的比較矩陣；(2)對(duì)氨基酸的各空位追加30的罰分和對(duì)各空位中的各記號(hào)追加1的罰分；或?qū)塑账嵝蛄?的各空位追加50的罰分和對(duì)各空位中的各記號(hào)追加3的罰分；(3)對(duì)終端空位無(wú)罰分及 (4)無(wú)對(duì)長(zhǎng)空位的最大罰分。本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的其他序列比較程序中，例如，可使 用通過(guò)國(guó)立醫(yī)學(xué)文庫(kù)的網(wǎng)站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bls. html 的 BLASTN程序、2. 2. 7版、或可使用WU-BLAST2. 0算法。對(duì)于WU-BLAST2. 0的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值的設(shè) 定，如以下因特網(wǎng)網(wǎng)站http://blast, wustl. edu中所記載。且BLAST算法使用BLOSUM62 氨基酸打分矩陣，可使用的選擇參數(shù)如下所示(A)包括將具有低組成復(fù)雜性的查詢序列 的片段[由 Wootton 及 Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)確定；也 希望參照Wootton及Federhen，1996《序列數(shù)據(jù)庫(kù)中組成偏向性區(qū)域的分析》(Analysis of compositionalIy biased regions in sequence databases)Methods Enzymo1. 266 544-71]、或短周期性的內(nèi)部重復(fù)組成的片段[由Claverie及States (Computers and Chemistry, 1993)的XNU程序確定)]用于屏蔽的過(guò)濾，及(B)根據(jù)用于報(bào)告對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)序 列的適合性的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性閾值、或根據(jù)E-分?jǐn)?shù)(Karlin及Altschul，1990)的統(tǒng)計(jì) 學(xué)模型，單純偶然發(fā)現(xiàn)的適合度的期待概率；源于某種適合度的統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異比E-分 數(shù)閾值大時(shí)，此適合度不被報(bào)告；優(yōu)選E-分?jǐn)?shù)閾值的數(shù)值為0.5、或按優(yōu)選度增加的順序 為 0.25,0.1,0.05,0.01,0.001,0. 0001、le_5、le_10、le_15、le_20、le_25、le_30、le_40、 le-50、le-75、或 Ie-IOO0同樣，本發(fā)明的鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DESl)中，包括如下核酸，其因?yàn)?個(gè)或 多個(gè)堿基發(fā)生缺失、插入或取代，所以與序列號(hào)1的堿基序列不同，但編碼具有鞘脂Δ4-去 飽和酶活性的蛋白質(zhì)。只要編碼具有鞘脂Δ4-去飽和酶活性的蛋白質(zhì)，對(duì)缺失、插入或取 代的堿基數(shù)量無(wú)特別限制，但優(yōu)選為1個(gè) 數(shù)千個(gè)、更優(yōu)選為1個(gè) 1千個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為 1個(gè) 500個(gè)、更進(jìn)一步優(yōu)選為1個(gè) 200個(gè)、最優(yōu)選為1個(gè) 100個(gè)。也可將規(guī)定的氨基酸通過(guò)例如具有同樣的物理化學(xué)特性的殘基取代。在這種保守 性取代的例子中，包括使1個(gè)脂肪族殘基相互取代，例如將lie、Val、Leu或Ala相互取代； Lys及Arg、Glu及Asp、或從Gln及Asn之間的1個(gè)極性殘基向其他殘基的取代；或用芳香 族殘基的其他殘基取代，例如將Phe、Trp或Tyr相互取代。其他保守性取代，眾所周知的 例如具有同樣疏水性特性的區(qū)域全體的取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)周知的基因工程的方 法，使用Sambrook等(2001)(上述)等中記載的，例如定點(diǎn)誘變法，實(shí)施所需的缺失、插入 或取代。帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DESlm)本發(fā)明的帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DESlm)，是通過(guò)在上述鞘 脂Δ4-去飽和酶基因(DESl)的3’末端添加編碼酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的堿基序列得到 的基因?！敖湍傅膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)”為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，在本發(fā)明的方法中，可以利用 任意的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)。例如，并非要受到局限，在以下的文獻(xiàn)中，公開(kāi)了具有由包含2個(gè)以上的賴氨酸殘基的4個(gè)或5個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸序列的典型的酵母定位信號(hào)。EMBO J. 9 :3153-3162，1990(非專利文獻(xiàn) 15)J Cell Biol. 127 :653_665，1994(非專利文獻(xiàn) 16)Science. 263 :1629_1631，1994(非專利文獻(xiàn) 17)
Cell. 79 :1199_1207，1994(非專利文獻(xiàn) 18)Eur J Cell Biol. 64 :211_216，1994(非專利文獻(xiàn) 19)Annu Rev Cell Dev Biol. 12 :27_54，1996 (非專利文獻(xiàn) 20)本發(fā)明的“酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)”優(yōu)選為“具有由包含2個(gè)以上的賴氨酸殘基的4個(gè)或5個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸序列的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)”。更優(yōu)選內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨 基酸序列含有KKX1X2或KX1KX2X3Oi表示賴氨酸殘基，X1^ X2> X3表示任意的相同或不同的氨 基酸殘基)。最優(yōu)選的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨基酸序列的方式之一，包括在本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例 中記載的VKKEK (V表示纈氨酸殘基，K表示賴氨酸殘基，E表示谷氨酸)。本發(fā)明的帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DESlm)的信號(hào)部分以外、 即鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DESl)不受特殊限制，如上述“鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DESl) ” 的項(xiàng)目中所述。優(yōu)選編碼序列號(hào)2的氨基酸序列。因此，DESlm基因編碼由序列號(hào)2的氨 基酸序列+VKKEK、即序列號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。DESlm基因的核酸序列，典型而 言由序列號(hào)3的堿基序列組成。除序列號(hào)3以外，還包含通過(guò)基因簡(jiǎn)并而編碼序列號(hào)4的 氨基酸序列的堿基序列?！敖湍傅膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)”除“具有由包含2個(gè)以上的賴氨酸殘基的4個(gè)或5個(gè)氨 基酸殘基組成的氨基酸序列的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)”以外，還已知有多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)。并非 要受到限制，例如已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的機(jī)制，可以用于本發(fā)明的方法。J Cell Biol. 127 :21_28，1994(非專利文獻(xiàn) 21)據(jù)記載，具有氨基酸序列HDEL的蛋白質(zhì)被高爾基體回收到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。與HDEL同樣， KDEL也是公知的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)。JBiol Chem. 273 :33273-33278，1998(非專利文獻(xiàn) 22)公開(kāi)了跨膜區(qū)中的決定因子(組)在向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的回收中起作用。J Cell Biol. 152 :935-944，2001(非專利文獻(xiàn) 23)據(jù)記載，高爾基體膜蛋白質(zhì)中的一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)中的回收信號(hào)相 互作用，參與向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的回收。另外，酵母細(xì)胞以外的細(xì)胞也可以作為本發(fā)明的制造方法中的轉(zhuǎn)化用宿主細(xì)胞來(lái) 使用。作為宿主細(xì)胞，包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞(人、小鼠、大鼠等)、昆蟲(chóng)細(xì)胞等。上述各種細(xì)胞 的用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的信號(hào)為已知，可以利用適合所使用的細(xì)胞的種類的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)。酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)本發(fā)明的方法包括構(gòu)成要素2)，通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇 C4-羥化酶基因(SUR2)的表達(dá)缺失。并非要受局限，但SUR2優(yōu)選編碼如下蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)6的氨基酸序 列或序列號(hào)6中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有 二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性。SUR2優(yōu)選具有序列號(hào)5的堿基序列。其是編碼具有序列號(hào)6的氨基酸序列的酵 母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶蛋白質(zhì)的堿基序列，例如，已在S⑶(Saccharomyces Genome Database, http://www. yeastgenome. org/)中&JF。SUR2優(yōu)選編碼序列號(hào)6中記載的氨基酸序列。但并不限于此，也可以有1個(gè)或1個(gè) 以上的氨基酸序列發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性，包括所有的同源蛋白質(zhì)。只要編碼與序列號(hào)6具有同等功能的氨基酸序列即可， 不限于序列號(hào)6?！鞍被嵬蛔儭睘? 多個(gè)，優(yōu)選1 20個(gè)，更優(yōu)選1 10個(gè)，最優(yōu)選1 5個(gè)?！熬哂卸渖窠?jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性”是指，例如圖2或圖3所示，在二氫神經(jīng) 鞘氨醇的C-4位導(dǎo)入羥基、合成植物鞘氨醇的活性，或在二氫神經(jīng)酰胺的C-4位導(dǎo)入羥基、 合成植物神經(jīng)酰胺的活性。本發(fā)明中，通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使SUR2的表達(dá)部分或完全缺 失，從而部分或完全地抑制在酵母天然代謝途徑中合成的植物鞘氨醇及/或植物神經(jīng)酰胺 的合成。通過(guò)SUR2基因表達(dá)的抑制和DESl基因的表達(dá)，能高效合成鞘氨醇及/或神經(jīng)酰 胺NS。由SUR2編碼的氨基酸序列，與序列號(hào)6中記載的氨基酸序列有至少約70%、優(yōu)選 約80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性。本發(fā)明的優(yōu)選酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)，還包括可與序列號(hào)5 的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，例如在中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且具有酵母二氫神經(jīng)鞘氨 醇C4-羥化酶活性的核酸。同樣，本發(fā)明的酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)包括如下核酸其因 1個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、插入或取代而與序列號(hào)5的堿基序列不同，但編碼具有二氫神經(jīng)鞘 氨醇C4-羥化酶活性的蛋白質(zhì)。對(duì)于“氨基酸及/或堿基的缺失、附加、取代”、“氨基酸及/或堿基的同一性百分 數(shù)”、雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)條件下”等共通事項(xiàng)，如上述DESl中所述。酵母神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶基因(SCS7)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括，通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化 酶基因(SCS7)的表達(dá)缺失。SCS7具有如下活性，即例如在與圖3或圖7的植物神經(jīng)酰胺、 二氫神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺NS的鞘氨基醇?jí)A以酰胺鍵結(jié)合的脂肪酸α位的碳上附加羥基，分 別合成Cer (AP)、Cer (ASa)、Cer (AS)的活性。由于SCS7活性的存在，因此即使所期望的二 氫神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺NS被合成，也會(huì)被進(jìn)一步羥化。因此，本發(fā)明優(yōu)選包括使SCS7的表 達(dá)缺失。并非要受局限，但SCS7優(yōu)選編碼如下蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)8的氨基酸序 列或序列號(hào)8中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有 神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶活性。SCS7優(yōu)選具有序列號(hào)7的堿基序列。其是編碼具有序列號(hào)8的氨基酸序列的 酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶蛋白質(zhì)的堿基序列，例如，已在S⑶(Saccharomyces Genome Database, http://www. yeastgenome. org/)中公開(kāi)。SCS7優(yōu)選編碼序列號(hào)8中記載的氨基酸序列。但并不限于此，也可以有1個(gè)或1 個(gè)以上的氨基酸序列發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有神經(jīng)鞘脂類α-羥化 酶活性，包括所有的同源蛋白質(zhì)。只要編碼與序列號(hào)8具有同等功能的氨基酸序列即可，不 限于序列號(hào)8?！鞍被嵬蛔儭睘? 多個(gè)、優(yōu)選1 20個(gè)、更優(yōu)選1 10個(gè)、最優(yōu)選1 5個(gè)?！熬哂猩窠?jīng)鞘脂類α-羥化酶活性”是指，例如圖7所示，具有在與植物神經(jīng)酰胺、 二氫神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺NS的鞘氨基醇?jí)A以酰胺鍵結(jié)合的脂肪酸α位的碳上附加羥基，分別合成Cer(AP) Xer(ASa) Xer(AS)的活性。本發(fā)明中，優(yōu)選通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使SCS7 的表達(dá)部分或完全缺失，從而抑制不期望的二氫神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺NS的羥化。由SCS7編碼的氨基酸序列與序列號(hào)8中記載的氨基酸序列有至少約70%、優(yōu)選約 80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性。本發(fā)明的優(yōu)選酵母神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶基因(SCS7)，還包括可與序列號(hào)7的堿 基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，例如在中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且具有酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥 化酶活性的核酸。同樣，本發(fā)明的酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因(SCS7)包括如下核酸其因1 個(gè)或多個(gè)堿基的缺失、插入或取代而與序列號(hào)7的堿基序列不同，但編碼具有神經(jīng)鞘脂類 α-羥化酶活性的蛋白質(zhì)。對(duì)于“氨基酸及/或堿基的缺失、附加、取代”、“氨基酸及/或堿基的同一性百分 數(shù)”、雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)條件下”等共通事項(xiàng)，如上述DESl中所述。酵母堿件二氫神經(jīng)酰胺酶基因(YDCl)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶 基因(YDCl)的表達(dá)缺失。例如如圖1-圖3所示，YDCl編碼具有分解二氫神經(jīng)酰胺、合成二氫神經(jīng)鞘氨醇的 活性的蛋白質(zhì)。YDCl活性是促進(jìn)可以說(shuō)是神經(jīng)酰胺合成的相反方向的反應(yīng)的活性，使成為 神經(jīng)酰胺NS合成的材料的二氫神經(jīng)酰胺減少。因此，本發(fā)明優(yōu)選包括使YDCl的表達(dá)缺失。并非要受局限，但YDCl優(yōu)選編碼如下蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)10的氨基酸序 列或序列號(hào)10中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具 有堿性二氫神經(jīng)酰胺酶活性。YDCl優(yōu)選具有序列號(hào)9的堿基序列。其是編碼具有序列號(hào)10的氨基酸序列 的酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶蛋白質(zhì)的堿基序列，例如，已在S⑶(Saccharomyces Genome Database, http://www. yeastgenome. org/)中&JF。YDCl優(yōu)選編碼序列號(hào)10中記載的氨基酸序列。但并不限于此，也可以有1個(gè)或1 個(gè)以上的氨基酸序列發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有堿性二氫神經(jīng)酰胺酶 活性，包括所有的同源蛋白質(zhì)。只要編碼與序列號(hào)10具有同等功能的氨基酸序列，不限于 序列號(hào)10?！鞍被嵬蛔儭睘? 多個(gè)、優(yōu)選1 20個(gè)、更優(yōu)選1 10個(gè)、最優(yōu)選1 5個(gè)?！熬哂袎A性二氫神經(jīng)酰胺酶活性”是指，例如圖1-圖3所示，具有分解二氫神經(jīng)酰 胺、合成二氫神經(jīng)鞘氨醇的活性。本發(fā)明中，優(yōu)選通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使YDCl的表達(dá)部分 或完全缺失，從而抑制不期望的二氫神經(jīng)酰胺的分解。由YDCl編碼的氨基酸序列，與序列號(hào)10中記載的氨基酸序列有至少約70%、優(yōu)選 約80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性。本發(fā)明的優(yōu)選酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶基因(YDCl)，還包括可與序列號(hào)9的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，例如中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且具有酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶活 性的核酸。同樣，本發(fā)明的酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶基因(YDCl)包括如下核酸其因1個(gè)或 多個(gè)堿基的缺失、插入或取代而與序列號(hào)9的堿基序列不同，但編碼具有堿性二氫神經(jīng)酰 胺酶活性的蛋白質(zhì)。
對(duì)于“氨基酸及/或堿基的缺失、附加、取代”、“氨基酸及/或堿基的同一性百分?jǐn)?shù)”、雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)條件下”等共通事項(xiàng)，如上述DESl中的記述。 [οπ ]誦 i寸·g 胃仆,m^mm^AMm^^在本發(fā)明中，酵母細(xì)胞內(nèi)的DESlm的表達(dá)不受限定，可使用公知方法進(jìn)行。優(yōu)選包 括用包含DESlm的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主酵母細(xì)胞，且在可使核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因酵 母細(xì)胞。并非要受局限，本發(fā)明的方法中可利用的酵母優(yōu)選來(lái)自酵母屬(Saccharomyces) 的酵母。更優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、貝 _ BJ (Saccharomyces bayanus)、胃(Saccharomyces kluyveri)。包括酵母屬的芽殖酵母在基因水平上的神經(jīng)酰胺的合成 代謝分析發(fā)展最快， 因此，可使本發(fā)明的人型神經(jīng)酰胺的制造方法迅速達(dá)到最佳化。且酵母細(xì)胞容易培養(yǎng)，可用 于傳統(tǒng)的食品制造，并可確立簡(jiǎn)便、安全、廉價(jià)地大量提取·精制神經(jīng)酰胺的方法。本發(fā)明中，為進(jìn)行基因的導(dǎo)入 表達(dá)，可使用公知的酵母表達(dá)載體。本發(fā)明的實(shí)施 例中，使用了公知的酵母用基因表達(dá)載體pRS series (p4XX) (Mumberg et al.，Gene，156， 119，1995)及 pYE22m(Ashikari et al.，Appl MicrobiolBiotechnol,30, 515,1989) 導(dǎo)入酵母時(shí)使用的載體，可使用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體 整合型(YIp 型)的任一個(gè)。例如，YEp 型載體 YEp24(J. R. Broach etal.，Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83,1983)、YCp 型載體 YCp50 (M. D. Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp 型載體 YIp5 (K. Struhl et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76，1035，1979)等的多數(shù)酵母用表達(dá)載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知， 均可用于本發(fā)明的方法中。表達(dá)載體除各基因以外，一般在宿主中增殖，所以可包含在含有可選擇性標(biāo)記及 復(fù)制起點(diǎn)的載體內(nèi)。載體中進(jìn)一步包含，優(yōu)選來(lái)自酵母的適合的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控序列根據(jù) 需要與本發(fā)明的核酸連接。調(diào)控序列的一例中，包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操作子或增強(qiáng)子、mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)、以 及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄及翻譯開(kāi)始及終止的適合的序列。核苷酸序列在調(diào)控序列與該DNA序列起作用 地相關(guān)時(shí)，可起作用地連接。因此，啟動(dòng)子核苷酸序列在該啟動(dòng)子核苷酸序列調(diào)節(jié)DNA序列 的轉(zhuǎn)錄時(shí)，可與DNA序列起作用地連接。在宿主細(xì)胞中賦予復(fù)制能力的復(fù)制起點(diǎn)、及鑒定轉(zhuǎn) 化體的選擇基因一般被轉(zhuǎn)入到表達(dá)載體。選擇標(biāo)記，可根據(jù)常法使用常用的標(biāo)記。例如四 環(huán)素、氨芐青霉素、或卡那霉素或新霉素、潮霉素或壯觀霉素等的抗生素抗性基因及HIS3、 TRPl等的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因等。酵母載體經(jīng)常含有來(lái)自2μ酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)序列、自主復(fù)制序列(ARS)、啟動(dòng) 子區(qū)域、用于多聚腺苷化的序列、用于轉(zhuǎn)錄終止的序列、及可選擇的標(biāo)記基因。載體，可通過(guò)使用常法將所需基因連接到在本技術(shù)領(lǐng)域方便獲得的重組用載體 (例如，質(zhì)粒DNA等)中來(lái)制備。在質(zhì)粒等載體中整合基因的DNA片段的方法，例如，可為 Sambrook, J.，and Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd ed. (New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press)中所記載的方法等。簡(jiǎn)便的方法， 也可使用市售的連接試劑盒(例如，寶酒造制等)。將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，一般可使用Sambrook，J.等(2001)(上述)中記載的磷酸鈣法或氯化鈣/氯化銣法、電穿孔法、電子注射法、PEG等化學(xué)處理的方法、基因槍等 的方法等。通過(guò)酵母轉(zhuǎn)化的各基因的缺失方法本發(fā)明的方法包括通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基 因(SUR2)的表達(dá)缺失。本發(fā)明的方法進(jìn)一步在優(yōu)選方式中包括通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母神經(jīng)鞘 脂類α -羥化酶基因(SCS7)的表達(dá)缺失；及通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶基因(YDCl)的表達(dá)缺失中的 任一種或這些的組合。本發(fā)明中，使各基因的表達(dá)缺失是指由各基因編碼的蛋白質(zhì)活性不能發(fā)揮之意。 如果通過(guò)阻斷酵母細(xì)胞基因組上的各基因、抑制基因的轉(zhuǎn)錄、抑制從基因向蛋白質(zhì)的翻譯、 蛋白質(zhì)即使被翻譯也抑制其活性發(fā)揮等，使由基因編碼的蛋白質(zhì)活性最終不能發(fā)揮，即達(dá) 到了本發(fā)明方法中的目的，所以也包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。缺失可以是部分缺失，也可以是 完全缺失。典型的方法，阻斷母細(xì)胞基因組上的各基因，使基因部分或完全缺失。SUR2、SCS7、YDCl的各基因的表達(dá)缺失可通過(guò)公知的方法進(jìn)行。例如，本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例中，通過(guò)使用連接了各基因的上游及下游的堿基序列、及 選擇標(biāo)記的DNA片段，與酵母天然基因組序列的同源重組，使各基因缺失?；虻淖钄啵赏ㄟ^(guò)使參與靶基因中基因產(chǎn)物的表達(dá)的區(qū)域，例如編碼區(qū)域、啟動(dòng) 子區(qū)域的內(nèi)部附加或缺失單一或多個(gè)堿基，或使這些區(qū)域的全體缺失來(lái)進(jìn)行。此種基因 阻斷的方法可參照公知文獻(xiàn)[例如，參照Yeast 10,1793(1994)、Yeast 15,1541(1999)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4951 (1979) ,Met hods in Enzymology，101，202 (1983)等]。除基因阻斷以外，為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，抑制各基因表達(dá)的方法還可為反義法 (例如參照平島及井上新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座2核酸IV基因的復(fù)制和表達(dá)(日本生化學(xué)會(huì) 編，東京化學(xué)同人)PP. 319-347，1993等)、RNAi法(參照日本特表2002-516062號(hào)公報(bào)； 美國(guó)專利公開(kāi)公報(bào)第 2002/086356A 號(hào)；Nature Genetics, 24 (2)，180-183,2000 等)、酶 性核糖核酸的方法(參照 FEBS Lett. 228 228,1988 ；FEBS Lett. 239 285,1988 ；Nucl. Acids. Res. 17 :7059，1989 等)、共抑制法(例如參照 Smyth DR :Curr. Biol. 7 :R793，1997、 Martienssen R :Curr. Biol. 6 :810，1996 等)等。神經(jīng)酰胺合成的確認(rèn)方法根據(jù)本發(fā)明的方法制造出的人型神經(jīng)酰胺(神經(jīng)酰胺NS)可使用公知方法進(jìn)行 提取·精制。本發(fā)明的方法因使用酵母細(xì)胞，所以可進(jìn)行大量的培養(yǎng)，可簡(jiǎn)便且迅速地提 取 精制神經(jīng)酰胺。經(jīng)精制的神經(jīng)酰胺，可使用公知的用于鞘氨基醇分析的方法確認(rèn)。分 析方法包括例如圖4所示的TLC、HPLC、質(zhì)譜(例如，LC-MS, LC-MS/MS、FT-MS)等。發(fā)明的效果若采用本發(fā)明的利用酶的定位控制來(lái)高效生產(chǎn)神經(jīng)酰胺NS的系統(tǒng)，則可更廉價(jià) 地制造人皮膚中功能性強(qiáng)的人型神經(jīng)酰胺。


圖1表示酵母及高等動(dòng)物細(xì)胞中神經(jīng)鞘脂類的合成代謝途徑。
圖2表示本發(fā)明的在酵母細(xì)胞內(nèi)制造人型神經(jīng)酰胺的方法的優(yōu)選方式的概要。圖3表示酵母及高等動(dòng)物的鞘氨基醇及神經(jīng)酰胺的分子種類及其結(jié)構(gòu)式。圖4示意性地表示從酵母菌體培養(yǎng)到TLC及HPLC分析的工序。圖5表示采用氚標(biāo)記(3H) D-赤式-二氫神經(jīng)鞘氨醇的酵母的神經(jīng)酰胺的TLC分析結(jié)果和使用生物影像分析儀(BAS)的放射標(biāo)記神經(jīng)酰胺的定量結(jié)果。標(biāo)記時(shí)間為16小時(shí)， 溫度為25°C。從左邊開(kāi)始，樣品1-3如下所述1.實(shí)施例6111. SUR2/SCS7雙重阻斷(實(shí)施例3) +空載體；2.實(shí)施例61. SUR2/SCS7雙重阻斷(實(shí)施例3)+DESl基因表達(dá)；3.實(shí)施例611. SUR2/SCS7雙重阻斷(實(shí)施例3)+DESlm基因表達(dá)。圖6表示采用氚標(biāo)記(3H) D-赤式-二氫神經(jīng)鞘氨醇的酵母的神經(jīng)酰胺的TLC分析 結(jié)果和使用生物影像分析儀(BAS)的放射標(biāo)記神經(jīng)酰胺的定量結(jié)果。標(biāo)記時(shí)間為16小時(shí)， 溫度為25°C。從左邊開(kāi)始，樣品1-3如下所述1.實(shí)施例6VI. SUR2/SCS7/YDC1三重阻斷(實(shí)施例4) +空載體；2.實(shí)施例6IV. SUR2/SCS7/YDC1三重阻斷(實(shí)施例4) +DESl基因表達(dá)；3.實(shí)施例6V. SUR2/SCS7/YDC1三重阻斷(實(shí)施例4) +DESlm基因表達(dá)。圖7表示通過(guò)熒光顯微鏡(OLMPUS BX51)用GFP用濾色片觀察在實(shí)施例9中制作 的融合蛋白質(zhì)的定位的結(jié)果。
實(shí)施例以下根據(jù)實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，但這些不限定本發(fā)明的技術(shù)范圍。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的記載容易地對(duì)本發(fā)明加以修飾·變更，這些均包含于本發(fā)明的技術(shù) 范圍內(nèi)。實(shí)施例1 人鞘脂△ 4-去飽和酶基因(DESl)表達(dá)載體的制備以已公開(kāi)的數(shù)據(jù)庫(kù)中的人鞘脂Δ 4-去飽和酶(sphingoid Δ 4-desaturase)基因 (DESl)的堿基序列(GenBanK :accession number AF466375)(序列號(hào) 40，其中的 CDS 為序 列號(hào)1)為參考，制備引物deslF(序列號(hào)11)及deslR(序列號(hào)12)。序列號(hào)11 :5，-CCTTCTCTAGAGGATCCATGGGGAGCCGCGTCTCGCGGGAAGAC-3，序列號(hào)12 :5，-CCTTCGAATTCCCCGGGCCAGGGGAGCTTCTGAGCATCACTGGTC-3，利用上述引物對(duì)，以人cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR。利用所得到的PCR產(chǎn)物(約 1. Ikb)的BamHI和SmaI位點(diǎn)，克隆到酵母用基因表達(dá)載體pKOll (由Kamei et al.， J. Biol. Chem.，273，28341，1998 ；Dr. K. Tanaka 提供)上。根據(jù)雙脫氧測(cè)序法進(jìn)行堿基序列確定，確認(rèn)出克隆的堿基序列與數(shù)據(jù)庫(kù)一致。利 用BamHI和Xhol位點(diǎn)，亞克隆到酵母用基因表達(dá)載體pRS series (p4XX) (Mumberg et al.， Gene, 156，119，1995)上。實(shí)施例2 酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)阻斷株的制備以已公開(kāi)的酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(SGD (Saccharomyces Genome Database, http //www. yeastgenome. org/))中的酵母二氧神經(jīng)銷氛醇〇4_尹圣化8| (sphinganineC4-hydroxylase)基因(SUR2)的堿基序列(序列號(hào)5)和含有其上游和下游區(qū)域的序列(序 列號(hào)41)為參考，制備引物sur2F(序列號(hào)13)及sur2R(序列號(hào)14)。序列號(hào)13 :5，-CTCCGGCTTCTGCGGTTTTTCTTAGTCTTTCCGCACCAATTTTCACAGGAATTCCC GGGGATCCGG-3，序列號(hào)14 :5，-GGATAATAAATACAAACGTGGGAAGTCGGAGACATTGCCTTTACCCAGCAAGCTAG CTTGGCTGCAGG-3，利用上述引物對(duì)，以質(zhì)粒pYDp_L(Berben et al. , Yeast, 7,475,1991)為模板進(jìn)行 PCR，獲得了由SUR2基因上游295bp、選擇標(biāo)記及SUR2基因下游75bp相連接的PCR產(chǎn)物。 使用此 PCR 產(chǎn)物，根據(jù)通常方法進(jìn)行 HQ 13 株(MATa，ura3，his3，leu2，lys2，trpl，barl-l) 的轉(zhuǎn)化，用營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化體，獲得SUR2基因阻斷株。使用為使正常基因與阻斷基因擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不同而設(shè)計(jì)的確認(rèn)用引物(序列 號(hào)15及16)，通過(guò)PCR法進(jìn)行SUR2基因阻斷的確認(rèn)。序列號(hào)15 :5，-CTCCGGCTTCTGCGGTTTTTCTTAGTCTTTC-3，序列號(hào)16 :5，-GGAAGTCGGAGACATTGCCTTTACCCAG-3，實(shí)施例3:酵母SUR2、及酵母神經(jīng)鞘脂類a-羥仆廉某因(SCS7)雙重陽(yáng)直株的制 備以已公開(kāi)的酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(SOT)中的酵母神經(jīng)鞘脂類a-羥化酶 (sphingolipid alpha-hydroxylase)基因(SCS7)的堿基序列(序列號(hào)7)和含有其上游及 下游區(qū)域的序列(序列號(hào)42)為參考，制備引物SCS7up280F(序列號(hào)17)及SCS7up280R_ G418(序列號(hào) 18)、scs7down280F_G418(序列號(hào) 19)及 scs7down280R(序列號(hào) 20)。序列號(hào)17 :5，-CGAATTCAGCCGAAAACAGTCTTGCTT-3，序列號(hào)18 :5，-CTCCATGTCGCTTACCACCGCTTTTAGTGC-3，序列號(hào)19 :5，-CGCTATACTGCAGCCTCGTCCAAAATTGTCA-3，序列號(hào)20 :5，-CGAATTCTTGCCAACCTGATCTGTGAA-3，利用上述引物對(duì)，以根據(jù)常法制備的酵母基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得分別相 當(dāng)于SCS7基因上游區(qū)域約280bp、下游區(qū)域約280bp的PCR產(chǎn)物。 接著，作為第二階段的PCR，將上述2種PCR片段混合，用G-50凝膠過(guò)濾柱(Quick Spin Columns for radiolabeled DNA purification，羅氏公司)將原有引物除去后，將以 Geneticin(G418)抗性基因?yàn)闃?biāo)記的pFA6a_kanMX4 (EMBL AJ002680)載體作為模板,擴(kuò)增 上述引物scs7up280F和scs7down280R的組合約2. 3kb的PCR片段。使用該最終PCR產(chǎn)物， 根據(jù)常法進(jìn)行實(shí)施例2記載的酵母SUR2阻斷株的轉(zhuǎn)化。用含有G418 300mg/L的YPD平板 培養(yǎng)基(1%酵母膏、2%聚蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂)篩選轉(zhuǎn)化體，獲得SUR2/SCS7雙重 阻斷株。將G418基因插入目標(biāo)部位，為了分析SCS7基因是否被阻斷，在SCS基因內(nèi)制作引 物SCS7 GD CheckF2(序列號(hào)21)，在G418基因內(nèi)制作引物G418 CheckR(序列號(hào)22)。對(duì) 于經(jīng)PCR有1. 2kb的片段擴(kuò)增的，確認(rèn)為基因阻斷株。序列號(hào)21 :5，-GCGCTGCATACATAGACATATACAC-3，序列號(hào)22 :5，-ATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACA-3，實(shí)施例4 酵母SUR2、酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶基因(YDC1)及SCS7三重阻斷株的制備以已公開(kāi)的酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(S⑶)中的酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶(alkaline dihydroceramidase)基因(YDCl)的堿基序列(序列號(hào)9)和含有其上游及下游區(qū)域的序 列(序列號(hào)43)為參考，制備引物ydclup280F(序列號(hào)23)和ydclup280R(序列號(hào)24) ydcldown250F(序列號(hào) 25)及 ydcldown250R(序列號(hào) 26)。序列號(hào)23 :5，-CGAATTCCCCAGAGGCAAAGATGTTA-3，序列號(hào)24 :5，-TGGATGGCACGGATCCGAAAGGCACACCTGTCATTATGG-3，序列號(hào)25 :5，-TGTGCCTTTCGGATCCGTGCCATCCATTTGAATC-3，序列號(hào)26:5' -CGAATTCCTTTTATGATGGGAGTAACTGCT-3，利用上述引物對(duì)，以通過(guò)常法制備的酵母基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得分別 相當(dāng)于YDCl基因上游區(qū)域約280bp、下游區(qū)域約250bp的PCR產(chǎn)物。引物ydclup280R和 ydcldOwn250F共有分別共通的互補(bǔ)序列，在YDCl基因的上游區(qū)域和下游區(qū)域的邊界包含 BamHI位點(diǎn)?；旌戏謩e相當(dāng)于YDCl基因上游區(qū)域約280bp、下游區(qū)域約250bp的PCR產(chǎn)物，使 用引物ydclup280F和ydcldown250R進(jìn)行PCR，獲得包含夾有BamHI位點(diǎn)的YDCl基因上下 游區(qū)域的530bp的PCR產(chǎn)物。將其預(yù)先用BamHI切割pUC19后，利用引物ydclup280F和 ydcldown250R中所含有的EcoRI位點(diǎn)，克隆到通過(guò)T4 DNA聚合酶(polymerase)平末端化 后自我連接而獲得的載體上(pYDCl-1)。1)由于接下來(lái)要導(dǎo)入的潮霉素抗性基因內(nèi)存在EcoRI位點(diǎn)，因此為了除去 ρYDCl-I 中的 EcoRI 位點(diǎn)，制備引物 YDClup280F_Sse (序列號(hào) 27)和 YDCldown250R_Sse (序 列號(hào)28)，以pYDCl-Ι為模板，進(jìn)行PCR0用限制酶Sse8387I將得到的530bp的片段酶解 后，將通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳精制·回收(GENECLEAN Turbo, Q-BIO Gene公司)得到的片段 插入PUC19的Pst I部位(pYDCl-2)。為了用限制酶Bgl II切取潮霉素抗性基因，制作 引物 GA32-2(序列號(hào) 29)和 GA32R(序列號(hào) 30)，將 pGA32 (Goldstein et al.，yeast. 15 1541 (1999))作為模板，進(jìn)行PCR，得到1. 5kb的片段。序列號(hào)27 :5，-AAACCTGCAGGCCCAGAGGCAAAGATGTTAAGTTAGATTTTC-3，序列號(hào)28 :5，-TTTCCTGCAGGCTTTTATGATGGGAGTAAC TGCTGC ATGTGT-3，序列號(hào)29 :5，-TAAGATCTGACATGGAGGCCCAGAATAC-3，序列號(hào)30 :5，-TAAGATCTCGCACTTAACTTCGCATCTG-3，將該片段插入上述pYDCl-2的BamHI位點(diǎn)，結(jié)果制成YDCl基因的上下游區(qū)域被潮 霉素抗性基因分開(kāi)的框架(pYDCl-3)。用限制酶Sse8387I將pYDCl-3酶解，將除去了 pUC19 載體部分的區(qū)域如上所述那樣通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳精制·回收，使用得到的物質(zhì)，按常法進(jìn) 行實(shí)施例3記載的酵母SUR2/SCS7阻斷株的轉(zhuǎn)化。用含有潮霉素200mg/L的YPD平板培養(yǎng) 基篩選轉(zhuǎn)化體，獲得SUR2/SCS7/YDC1三重阻斷株。2)或者，用 BamHI 將質(zhì)粒 pYDp-H(Berben et al. , Yeast, 7,475,1991)切割，將含 有HIS3基因的約1.2kb的片段插入上述含有YDCl基因的上下游區(qū)域的質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)。 將得到的含有在YDCl基因的上下游區(qū)域夾有HIS3基因的區(qū)域的質(zhì)粒用EcoRI切割，使用 得到的片段，按常法進(jìn)行實(shí)施例2記載的酵母SUR2阻斷株的轉(zhuǎn)化。用不含組氨酸的最少完 全平板培養(yǎng)基(SC-His)進(jìn)行篩選，獲得SUR2/YDC1雙重阻斷株。接著，使用實(shí)施例3中記載的具有Geneticin (G418)抗性基因的約2. 3kb的PCR產(chǎn)物，按常法進(jìn)行上述酵母SUR2/ YDCl雙重阻斷株的轉(zhuǎn)化。用含有G418 300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化體，獲得SUR2/ SCS7/YDC1三重阻斷株。 為使正常基因與阻斷基因中用PCR擴(kuò)增的片段的長(zhǎng)度不同，制備引物 YDClUPcheckF2(序列號(hào)31)和ydcl_GD_CheckR2 (序列號(hào)32)，通過(guò)PCR來(lái)確認(rèn)基因阻斷。
序列號(hào) 31 5，-CTCGTCCTCTGAACCAAAGC-3，序列號(hào)32 :5，-GGTAAATAGAACTTTTATGTGCCGC-3，實(shí)施例5帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的DESl (hDESlm)表汰裁體的制各用以下方法來(lái)構(gòu)建載體，使作為酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位酶的SUR2蛋白質(zhì)的C末端氨基酸序列VKKEK(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào))與hDESl的C末端側(cè)結(jié)合。將實(shí)施例1記載的hDESl表達(dá)載體作為模板，作為第一階段的PCR，分別擴(kuò)增引物 26SseF(序列號(hào)33)和VKKEK_R2(序列號(hào)36)的組合約1. 5kb的PCR片段和引物VKKEK_ F2 (序列號(hào)35)和426SseR(序列號(hào)34)的組合約0. 6kb的片段。序列號(hào)33 :5，-AACCTGCAGGTGGAATTGTGAGCGGATA-3，序列號(hào)34 :5，-TTCCTGCAGGTTTTCCCAGTCACGACGTT-3，序列號(hào)35 :5，-ATGGTGCTGGAGGTAAAGAAAGAGAAATAAATAT C ATTAGTGCCAAAG-3，序列號(hào)36 :5，-TAATGATATTTATTTCTCTTTCTTTACCTCCAGCACC ATCTCTCCTTT-3，接著，作為第二階段的PCR，將上述2種PCR片段混合，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳將原 有引物精制除去(GENECLEAN Turbo, Q-BIO Gene公司)，將得到的片段作為模板，擴(kuò)增引 物426SseF和426SseR的組合約2kb的PCR片段。將該2kb的片段亞克隆到pCR-Blunt II-TOPO 載體(Invitrogen 公司)。利用雙脫氧測(cè)序法進(jìn)行堿基序列確定，確認(rèn)出克隆的堿基序列(序列號(hào)37)。其 中，將DESlm的ORF部分的堿基序列作為序列號(hào)3，將序列號(hào)3編碼的氨基酸序列作為 序列號(hào)4。通過(guò)限制酶BamHI和Xho I酶解，得到約1. 3kb的片段，插入以Ura3為標(biāo)記 的 PRS426 (2 μ ) GPD 載體(Mumberg et al.，GENE, 156，119-122，1995)的同限制酶部位 (phDESlm)。實(shí)施例6具有人DESl或者帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的DESl (DESlm)表達(dá)質(zhì)粒的神經(jīng)酰 胺合成體系·代謝體系轉(zhuǎn)化株的制備使用由上述實(shí)施例3、4得到的各基因的阻斷株，制備DESl基因(實(shí)施例1)或 DESlm基因(實(shí)施例5)表達(dá)株。I. SUR2/SCS7雙重阻斷(實(shí)施例3) +DESl基因表達(dá)II. SUR2/SCS7雙重阻斷(實(shí)施例3)+DESlm基因表達(dá)III. SUR2/SCS7雙重阻斷(實(shí)施例3)+空載體IV. SUR2/SCS7/YDC1三重阻斷(實(shí)施例4) +DESl基因表達(dá)V. SUR2/SCS7/YDC1三重阻斷(實(shí)施例4) +DESlm基因表達(dá)VI. SUR2/SCS7/YDC1三重阻斷(實(shí)施例4) +空載體用實(shí)施例1的人DESl表達(dá)質(zhì)?；?qū)嵤├?中制備的帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的人型 DESl (DESlm)，根據(jù)常法進(jìn)行實(shí)施例3、4中得到的阻斷株的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體的篩選使用不含尿 嘧啶的最少完全平板培養(yǎng)基(SC-Ura)來(lái)進(jìn)行。
所得到的轉(zhuǎn)化株中的人DESl基因的表達(dá)通過(guò)如下方法來(lái)確認(rèn)將使用 RNeasy試劑盒(Qiagen公司)精制的總RNA通過(guò)使用了引物Hdes 1_R (序列號(hào)38)的 SuperscriptII (Invitrogen公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、和通過(guò)使用了反應(yīng)物Hdesl_F (序列號(hào) 39)和 Hdesl_R(序列號(hào) 38)的 Ex-taq (Takara Bio 公司)進(jìn)行 PCR(RT-PCR)。序列號(hào)38 :5，-TCCAGCACCATCTCTCCTTT-3，序列號(hào)39 :5，-AGTGGGTCTACACCGACCAG-3，t施例7(3H)D-,未式-二氡』神經(jīng)鞘Ml車的神經(jīng)酰胺的分析將上述實(shí)施例6的神經(jīng)酰胺合成體系 代謝體系轉(zhuǎn)化株在添加了組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、腺嘌呤及色氨酸的不含尿嘧啶的最少液體培養(yǎng)基中以25°C、150rpm振蕩培養(yǎng)24小 時(shí)后，回收酵母，制備懸浮于最少液體培養(yǎng)基中的懸浮液0. 5ml (160D600units/ml)。加入氚 標(biāo)記(3H)的D-赤式-二氫神經(jīng)鞘氨醇10 μ 1(10 μ Ci)，在25°C下培養(yǎng)過(guò)夜(Zanolari et al.，The EMBO Journal, 19，2824，2000)。加入 200 μ 1 250mM 的 NaF 和 250mM 的 NaN3,終止 反應(yīng)后，用冰冷卻的滅菌水洗滌3次，使菌體懸浮于66μ 1的滅菌水中。在本懸浮液中加入玻璃珠，劇烈攪拌使菌體破碎。在其中加入氯仿、甲醇使氯仿、 甲醇、懸浮液之比為10 10 3，提取脂質(zhì)。進(jìn)行提取液的離心分離，回收所得到的上清 后，吹入氮?dú)馐蛊錆饪s干燥。將樣品溶解于100 μ 1的氯仿-甲醇-水(10 10 3)中， 加入0.6Ν NaOH甲醇溶液20 μ 1，使其在30°C下反應(yīng)90分鐘后，用0.6Ν醋酸溶液中和。通 過(guò)丁醇提取來(lái)除去鹽，吹入氮?dú)馐顾玫降亩〈紝?上層)濃縮干燥。使脂質(zhì)溶解于20μ1的氯仿_甲醇(1 1)中，在事先用硼酸鹽(70mM Na2B4O7 · IOH2O甲醇溶液)處理30分鐘并干燥得到的薄層色譜(TLC)板上點(diǎn)樣，用氯仿-甲 醇(9 1)展開(kāi)(Triola et al.，Molecular Pharmacology,66，1671，2004)。展開(kāi)后，將 放射標(biāo)記神經(jīng)酰胺用生物影像分析儀(BAS)進(jìn)行分析。結(jié)果如圖5和圖6所示。具有人DES 1表達(dá)質(zhì)粒的SUR2/SCS7雙重阻斷株和SUR2/SCS7/YDC1三重阻斷株 的神經(jīng)酰胺NS(CerNS)為10 %時(shí)，帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的人DESl (DESlm)表達(dá)酵母SUR2/ SCS7雙重阻斷株的神經(jīng)酰胺NS(CerNS)增至177%，帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的人DESl (DESlm) 表達(dá)酵母SUR2/SCS7/YDC1三重阻斷株的神經(jīng)酰胺NS(CerNS)增至232%。實(shí)施例8帶EGFP的人DESl (EGFP~hDESl)或帶EGFP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的人 DESl (EGFP-hDESlm)表達(dá)載體的制備為了分析帶hDESl和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的hDESlm在酵母的細(xì)胞中定位于何處，在本 實(shí)施例中，制備在各hDESl的N末端側(cè)連接了 EGFP的框架。載體的構(gòu)建方法如下所示。從實(shí)施例1中記載的phDESl，用限制酶BamHI和 XhoI切取DESl基因，插入pRS314-GAL-EGFP-EBP2載體(具有GAll啟動(dòng)子和TDH終 止子的PRS314表達(dá)載體的EcoRI和BamHI位點(diǎn)插入了 EGFP基因、在BamHI和XhoI 位點(diǎn)插入了 EBP2基因的載體；由廣島大學(xué)Dr.Keiko Mizuta提供)的同限制酶部位 (PRS314-GAL-EGFP-DES1)。用限制酶EcoRI和XhoI切取EGFP-DES1基因，亞克隆到酵母用 基因表達(dá)載體 pRS426-GDP (Mumberg et al.，Gene, 156，119，1995) (pEGFP-hDESl)。將用限制酶EcoRI和BamHI從pEGFP-hDESl切取的EGFP基因部分約750bp片 段(EGFP-BamHI)插入實(shí)施例5中記載的hDESlm表達(dá)載體(phDESlm)的BamHI位點(diǎn) (pEGFP-hDESlm)。
實(shí)施例9具有帶EGFP的人DESl (EGFP~hDESl)或帶EGFP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的人DESl(EGFP-hDESlm)表汰裁體的DESl蛋白質(zhì)定位解析用轉(zhuǎn)化株的制各在實(shí)施例2和3得到的SUR2阻斷株和SUR2/SCS7雙重阻斷株以及實(shí)施例2中記載的Π(113株中用常法將EGFP-hDESl基因(實(shí)施例8)或EGFP-hDESlm基因(實(shí)施例8) 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體的篩選通過(guò)使用添加了組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、腺嘌呤以及色氨酸 的不含尿嘧啶的最少平板培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行。I. FKl 13 株(實(shí)施例 2)+EGFP-hDESl 基因表達(dá)II. SUR2阻斷株(實(shí)施例2) +EGFP-hDESl基因表達(dá)III. SUR2/SCS7雙重阻斷株(實(shí)施例3)+EGFP-hDESl基因表達(dá)IV. FKl 13 株(實(shí)施例 2) +EGFP-hDESlm 基因表達(dá)V. SUR2阻斷株(實(shí)施例2) +EGFP-hDES Im基因表達(dá)VI. SUR2/SCS7雙重阻斷株(實(shí)施例3) +EGFP-hDESlm基因表達(dá)實(shí)施例10具有帶EGFP的人DESl (EGFP-hDESl)或帶EGFP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的人 DESl (EGFP-hDESlm)表汰載體的DESl蛋白質(zhì)的定位分析將實(shí)施例9得到的I. EGFP-hDESl基因表達(dá)酵母FK113株、II. EGFP-hDESl 基因表達(dá)酵母SUR2阻斷株、III. EGFP-hDESl基因表達(dá)酵母SUR2/SCS7雙重阻斷株、 IV. EGFP-hDES Im基因表達(dá)酵母FK113株、V. EGFP-hDES Im基因表達(dá)酵母SUR2阻斷株、 VI. EGFP-hDESlm基因表達(dá)酵母SUR2/SCS7雙重阻斷株分別用添加了組氨酸、亮氨酸、賴氨 酸、腺嘌呤以及色氨酸的不含尿嘧啶的最少液體培養(yǎng)基在25°C下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。用熒光顯 微鏡(OLMPUS BX51)，用GFP用濾色片觀察EGFP融合蛋白質(zhì)的定位。結(jié)果如圖7所示。證實(shí)hDESlm在任一株中均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位。
權(quán)利要求
在酵母細(xì)胞內(nèi)制造人型神經(jīng)酰胺的方法，其特征在于，其包括1)通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘脂Δ4-去飽和酶基因DES1m，該DES1m通過(guò)在鞘脂Δ4-去飽和酶基因DES1的3’末端添加編碼酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的堿基序列而得到；及，2)通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因SUR2的表達(dá)缺失。
2.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨基酸序列由包含2個(gè)以上 賴氨酸殘基的4個(gè)或5個(gè)氨基酸殘基組成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨基酸序列為VKKEK， V表示纈氨酸殘基，K表示賴氨酸殘基，E表示谷氨酸。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，鞘脂Δ4-去飽和酶基因DESl編碼下 述蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)2的氨基酸序列或序列號(hào)2中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生 缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有鞘脂△ 4-去飽和酶活性。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘脂Δ4-去飽 和酶基因DESlm編碼由序列號(hào)4的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因 SUR2編碼下述蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)6的氨基酸序列或序列號(hào)6中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生 缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)一步包括通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使 酵母神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶基因SCS7的表達(dá)缺失。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因(SCS7)編碼下述 蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)8的氨基酸序列或序列號(hào)8中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生 缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶活性。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)一步包括通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使 酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶基因YDCl的表達(dá)缺失。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，酵母堿性二氫神經(jīng)酰胺酶基因YDCl編碼下述蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有序列號(hào)10的氨基酸序列或序列號(hào)10中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā) 生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有堿性二氫神經(jīng)酰胺酶活性。
11.如權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母從酵母屬的酵母中選擇。
全文摘要
本發(fā)明提供在酵母細(xì)胞內(nèi)等的細(xì)胞內(nèi)制造人型神經(jīng)酰胺的方法。本發(fā)明的制造方法包括1)通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入帶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DES1m)，該DES1m通過(guò)在鞘脂Δ4-去飽和酶基因(DES1)的3’末端添加編碼酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的堿基序列而得到；及，2)通過(guò)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)的表達(dá)缺失。
文檔編號(hào)C12P13/02GK101802209SQ200880013470
公開(kāi)日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2008年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者兒玉由紀(jì)子, 奧原宏明, 船戶耕一 申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社;國(guó)立大學(xué)法人廣島大學(xué)