專利名稱：蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物穩(wěn)定金屬蛋白酶洗滌劑制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
與在液體中儲存期間(例如，使用前)維持酶穩(wěn)定性相關(guān)的問題是公 知的。 一般而言，蛋白酶造成更大的穩(wěn)定性問題，因?yàn)樗鼈兊拇呋钚越?解制劑中的其它蛋白質(zhì)，以及在自溶(即，自降解)過程中降解該蛋白酶自 身。然而，由于絲氨酸蛋白酶(例如，枯草桿菌蛋白酶)的穩(wěn)定相對容易以 及為增加穩(wěn)定性的工程化突變的開發(fā)，這一類蛋白已在洗滌劑制劑中廣泛 應(yīng)用。實(shí)際上，由于它們在洗滌劑中的應(yīng)用，枯草桿菌蛋白酶是商業(yè)上最 重要的蛋白酶之一。中性金屬蛋白酶仍然面臨自溶降解的普遍性的蛋白酶問題，所述
用金屬蛋白酶(或任意酶)的相對高成本需要最小化使用前的活性損失，以 使得它們作為洗滌劑組分具有商業(yè)利益。顯然，任何用于最小化金屬蛋白 酶自溶降解的組合物和/或方法必須不再通過在使用期間抑制期望的酶活 性(即，降解污斑蛋白成分)而增加太高的成本。因此，必須取得一個脆弱 的平衡，以使得最小化洗滌劑儲存期間的自溶活性，而不降低使用時的期 望酶活性。因此，需要這樣的方法、化合物、制劑和組合物，其能穩(wěn)定中 性蛋白酶不被降解，尤其是當(dāng)將它們摻入洗滌劑制劑和其它洗滌組合物中 時更時如此。
發(fā)明概述
09]本發(fā)明提供了組合物和洗滌劑制劑，其包含金屬蛋白酶和金屬蛋白酶抑制劑，并且其由此展示出針對降解的增加的穩(wěn)定性。本發(fā)明還提供本文所使用的術(shù)語"蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物"是指通過水解任何類型或種類的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的水解產(chǎn)物。可以水解任意已知的蛋白質(zhì)以產(chǎn)生在本申請中如何使用該術(shù)語的意思范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。可通過酶以及非酶方法產(chǎn)生"蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物"，并且其可包括大小在2至100或更多個氨基酸范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)片段(即，多肽)。此外，本文所使用的"蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物"不限于單個產(chǎn)物化合物，而是可包括水解產(chǎn)物(例如，多種蛋白質(zhì)片段)的異質(zhì)分布或混合物。其還可包括水解產(chǎn)物的同質(zhì)化合物或純化的級分。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的優(yōu)選實(shí)施方案包括HyPep 460仃氣來自小麥谷蛋白的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物)、Amisoy (大豆蛋白酸水解產(chǎn)物)、Amicase (來自牛奶的酪蛋白酸水解產(chǎn)物)、標(biāo)蛋白胨(來自植物蛋白的酶水解產(chǎn)物)。本文中所使用的"織物，，包括任何紡織品材料。因此，該術(shù)語意在包括衣物、以及織物、紗、纖維、無紡材料、天然材料、合成材料和任何其他紡織品材料。金屬蛋白酶是在細(xì)菌、真菌及高等生物中發(fā)現(xiàn)的不同類型的蛋白酶。在金屬蛋白酶活性部位結(jié)合的金屬離子允許水分子的催化活性。然后水分子作為親核試劑起作用以切割肽鍵的羧基。在該類中存在大量不同的
序列和結(jié)構(gòu)，但是大多數(shù)金屬蛋白酶包括結(jié)合在活性部位的鋅離子。在一些金屬蛋白酶中，鋅離子可被另一金屬離子，諸如鈷或鎳取代而不喪失活性。如當(dāng)前所理解的那樣，金屬蛋白酶的催化機(jī)制包括通過攻擊被該酶切割的鍵的羧基上的鋅結(jié)合水分子而形成的非共價四面體中間產(chǎn)物。就功能和穩(wěn)定性而言，最佳表征的中性金屬蛋白酶可能是嗜熱菌 蛋白酶和TLP。許多研究集中于工程化枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)嗜 熱菌蛋白酶，以增加它們的熱穩(wěn)定性(例如，參見Vriend等，In， Tweel等(編 輯)，Stability and Stabilization of Enzymes, Elsevier, pp. 93-99 [1993)。已
進(jìn)行了許多的努力以通過改變可阻止局部解折疊過程的結(jié)構(gòu)決定因素(通 過分子建模確定)來增加TLP的穩(wěn)定性，所述的局部解折疊過程增強(qiáng)了在 高溫下的自溶和變性。(例如，參見van den Burg等，在Hopsu-Havu等，(編 輯)，Proteolysis in Cell Functions Manipulating the Autolvtic Pathway of a Bacillus Protease. Biomedical and Health Research,巻13, IOS Press [1997p. 576.)。已報道釣離子能夠幫助阻止中性金屬蛋白酶自溶。已通過 添加4丐穩(wěn)定了嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus)中性蛋白酶對抗 自溶和蛋白酶水解降解(參見D13rrschmidt等，F(xiàn)EBS J.， 272:1523-1534 [2005)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明預(yù)期應(yīng)用位點(diǎn)定向誘變以工程化中性
金屬蛋白酶活性部位，其中特定蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物將在該位點(diǎn)展示出抑制劑 結(jié)合特性，其對改善在洗滌劑制劑中的穩(wěn)定性更有利。用于產(chǎn)生突變體的 中性金屬蛋白酶"位點(diǎn)評價文庫"(SEL)公開于2006年10月12日提交的美 國專利申請11/581,102號，其在此通過引物并入本文作為參考。按照本發(fā)明，可以應(yīng)用這些SEL以產(chǎn)生中性金屬蛋白酶的活性位點(diǎn)突變體文庫，然 后可針對改良的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(或其它抑制劑)結(jié)合特征篩選該文庫，其 改善了應(yīng)用這些抑制劑以在洗滌劑制劑和清潔組合物中針對自溶降解進(jìn) 行穩(wěn)定的能力。
作為抑制劑和穩(wěn)定劑的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含中性金屬蛋白酶 和抑制劑的抑制劑穩(wěn)定的中性金屬蛋白酶制劑，其中所述的抑制劑是由所 述酶產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，并且制劑中的抑制劑濃度是該蛋白質(zhì)水解產(chǎn) 物與該中性金屬蛋白酶的表觀Ki的至少約5倍。在一個實(shí)施方案中，表觀 Kj是約5 mM至約15 mM，并且在制劑中使用的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物濃度是至 少約25mM，約35mM，約50mM或更高。2006年10月12日提交的美國專利申請11/581，102(在此引入作 為參考)公開了將來自解淀粉芽孢桿的中性金屬蛋白酶NprE重組克隆至質(zhì) 粒載體，并引入到枯草芽孢桿菌宿主中表達(dá)和發(fā)酵的技術(shù)。在本發(fā)明的一 個實(shí)施方案中，使這一 NprE表達(dá)系統(tǒng)適于共表達(dá)NprE酶的蛋白質(zhì)底物。 在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，共表達(dá)蛋白質(zhì)底物是酪蛋白。
洗滌劑制劑和清潔組合物除了本文公開的之外，2006年10月12日提交的美國專利申請 11/581,102號(引物本文作為參考)公開了適于與本發(fā)明的抑制劑穩(wěn)定的金 屬蛋白酶應(yīng)用的大量洗滌劑制劑和清潔組合物。在另 一 實(shí)施方案中，這一 簡單的洗滌劑制劑還可包含選自以下的各種附加物質(zhì)(即，輔助材料)額外的表面活性劑、增效助劑、螯合劑、 染料轉(zhuǎn)移抑制劑、沉淀助劑、分散劑、額外的酶、酶穩(wěn)定劑、催化材料、 漂白活化劑、漂白增效劑、過氧化氫、過氧化氫源、預(yù)先形成的過酸、聚 合分散劑、粘土除去/抗再沉積劑、光亮劑、抑泡劑、染料、芳香劑、結(jié)構(gòu) 伸縮劑、織物柔軟劑、載劑、水溶增溶劑、加工助劑和/或顏料。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的HDL洗滌劑制劑包含約20%至約50%重量的表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，該HDL制劑包含選自以下的表面活性劑的混合物C12乙氧基化物(Alfonic 1012-6、 HetoxolLA7、HetoxolLA4)、烷基^^酸鈉(例如，Nacconol 90G)、月桂基聚氧乙烯醚硫酸鈉(例如，SteolCS-370)、和它們的任意組合物。在一些實(shí)施方案中，該HDL制劑包含選自烷基苯磺酸鹽、烷基醚石克酸鹽和烷基聚氧乙烯醚的一種或多種表面活性劑。
0126在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的HDL洗滌劑制劑包含約35%至約52%重量的水，以及約24%至約40%重量的表面活性劑，其中所述的表面活性劑包含Nacconol 90G、 Alfonic 1012-6和Steol CS-370。在另一實(shí)施方案中，HDL制劑(假設(shè)總共卯份)中水和表面活性劑的具體體積比為約30份水、17份Nacconol卯G、 13份Alfonic 1012-6和10份SteolCS-370。本領(lǐng)域沖支術(shù)人員將能立即認(rèn)識到可應(yīng)用類似量的等同表面活性劑制備本發(fā)明中有用的備選的HDL制劑。、 LUXSIL⑧和SPHERICEU [Potters Industries, Inc., Carlstadt， NJ and Valley Forge, PA)。
清潔添加物制劑在一些低pH清潔組合物實(shí)施方案(例如，具有約3至約5凈pH 的組合物)中，該組合物一般不含有烷基乙氧基化物硫酸鹽，因?yàn)閾?jù)信在此 類酸性條件下，這一類表面活性劑可被該組合物水解。在以下的實(shí)驗(yàn)公開中，應(yīng)用了以下簡寫。C(攝氏度)；rpm或 RPM(每分鐘轉(zhuǎn)速)；Da(道爾頓)，kDa(千道爾頓)；g(克)；ng和ug(微克)； mg(毫克)；ng(納克);nl和ul(微升);ml(毫升)；mm(毫米);nm(納米)； Hm和um(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；nM和uM(孩傳爾)；U(單位)； MW(分子量)；sec(秒);min(分鐘)；hr(小時);OD280 (在280 nm的光密 度)；OD4()5 (在405 nm的光密度)；OD咖(在600 nm的光密度);PAGE(聚丙 烯酰胺凝膠電泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸緩沖鹽水[150 mM NaCl， 10 mM 磷酸鈉緩沖液，pH 7.2)；SDS(十二烷基硫酸鈉)、Tris (三(羥甲基)氨基甲 烷)；TAED (N，N，N，N'-四乙酰乙二胺)；MES(2-嗎啉代曱磺酸； 一水合物; f.w. 195.24; Sigma # M畫3671)); CaCl2 (氯化鉀，無水；f.w. 110.99; Sigma #C畫4卯l); DMF (N，N-二曱基甲酰胺，f.w. 73.09， d = 0.95); w/v (重量比體積); v/v (體積比體積)；NprE (中性金屬蛋白酶)；PMN (純化的MULTIFECT 金屬蛋白酶)。
在下述實(shí)施例中使用了以下測試法。A. 用于NprE濃度確定的應(yīng)用96孔微量滴定板(MTP)的布來得福特 觀'J試法(Bradford assay)。
酶儲存溶液用酶稀釋緩沖液將純化的NprE酶稀釋至約1 ppm (1 fig/mL)的濃度。將MULTIFECT⑧中性金屬(野生型NprE)稀釋至低于6 ppm(6jig/mL)的濃度。優(yōu)選系列稀釋。溶液在室溫下穩(wěn)定l小時，但對于 更長時間的儲存，在冰上維持該溶液。[0177底物儲存溶液-在DMF中48 mM Abz-AGLA-Nba:將約28 mg 的Abz-AGLA-Nba置于小管中。將其溶解于約1 mL DMF中(根據(jù) Abz-AGLA-Nba質(zhì)量，體積將不同)并且漩渦震蕩若干分鐘。將該溶液避 光儲存于室溫。將Abz-AGLA-Nba溶解于DMF中并且在其制備當(dāng)天使用。[0178底物稀釋緩沖液畫50 mMMES、 2.5 mM CaCl2、 5% DMF、 pH 6.5:將5 mL純DMF加入到95 mL儲存MES緩沖液中。應(yīng)用這一緩沖 液以確定動力學(xué)參數(shù)。[0179測試溶液-50 mM MES， 2.5 mM CaCl2, 5% DMF， 2.4 mM Abz-AGLA-Nba pH 6.5:將1 mL底物儲存溶液加入到19 mL底物稀釋緩 沖液中并蝸旋震蕩。避光室溫保存溶液。測試法過程[0180制備所有的緩沖液、儲存液和工作溶液。除非另外指出， 一式 三份地測試每一酶稀釋液。當(dāng)不完全滿時，*的左邊開始以滿豎列排列 酶工作溶液儲存孩i板(以適應(yīng)板讀數(shù)器)。類似地設(shè)置相應(yīng)的測試板。如之 前描述的那樣設(shè)置孩史板熒光分光計(jì)。[0181首先，將200 nL等分測試溶液置于96孔微量板的孔中。在控 制溫度的微量板混合器中避光在25。C溫育該板10分鐘。通過將10nL工作 酶溶液從儲存微板轉(zhuǎn)移至混合器中的測試微量板中開始該測試。最佳地使 用96孔移液或使用8孔多通道移液管從最左邊一列開始轉(zhuǎn)移。使溶液劇烈 混合15秒(在Eppendorf Thermomixer中卯0 rpm)。馬上將測試微量板轉(zhuǎn) 移至^L量板熒光分光計(jì)上并開始在350 nm激發(fā)和415 nm的發(fā)射的熒光測 量的記錄。熒光分光計(jì)軟件對毫RFU/分鐘的線性回歸線計(jì)算每一孔熒光 增加的反應(yīng)比率。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)讀取第一塊板時，將第二塊板置 于微量板混合器中用于溫度平衡。0182初始速率就直至0.3 mM產(chǎn)物的產(chǎn)物濃度(即，釋i文的2-氨基苯 曱酰熒光)而言是線性的，其相應(yīng)于約22,000 RFU的背景熒光下的以2.3 mM Abz-AGLA-Nba開始的溶液中的約50,000 RFU。實(shí)施例1在較高儲存濃度下升高的NprE穩(wěn)定性[0183這一實(shí)施例證實(shí)當(dāng)在較高濃度下和/或10。/。丙二醇(PPG)和 CaCl2的存在下維持中性金屬蛋白酶時，發(fā)生了該酶穩(wěn)定性的升高。[0184以在pH8.0的10 mM HEPES(N-(2-羥乙基)哌喚-N'-(2-乙磺酸)) 緩沖液中625至10000ppm的濃度范圍，制備含有中性金屬蛋白酶NprE 的樣本。除了 6MppmNprE濃度的一個對照之外，所有的樣本包括10% PPG和0.5 mM CaCl2。在32。C的溫度溫育所有的樣本超過6小時。在不 同的時間點(diǎn)應(yīng)用AGLA活性測試法測量樣本的NprE活性。結(jié)果[0185如

圖1所示，具有625 ppm NprE且沒有添加PPG和CaCl2的 對照樣本在開始的2小時內(nèi)幾乎喪失了其全部活性。相反，其它樣本的 NprE活性維持了多數(shù)與較高蛋白質(zhì)濃度相關(guān)的活性。在10,000 jig/mL (或 ppm) NprE的濃度下，在喪失活性前，該酶幾乎維持完全活性達(dá)1.5小時。 與之相比，625、 1250和2500 ppm的蛋白質(zhì)樣本顯示出降低的活性(在1.5 hr時約60。/。)。與對照樣本相比，高濃度樣本顯示出儲存穩(wěn)定性的顯著升高。從Sigma Chemical (St. Louis, MO)獲得以下蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物， 并且不經(jīng)過進(jìn)一步純化即使用來自小麥谷蛋白的HyPep 4601^蛋白質(zhì)水 解產(chǎn)物(目錄號弁H6784》Amisoy，大豆蛋白酸水解產(chǎn)物(目錄號# S l674); Amicase，牛奶酪蛋白酸水解產(chǎn)物(目錄號# A 2427)，以及脈蛋白胨，來自 植物蛋白的酶水解產(chǎn)物(目錄號# P 0431)。來自牛奶的酪蛋白(目錄號# C7078; Sigma Chemical, St. Louis, MO)用于通過NprE水解。
蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物儲存溶液—般而言，用10 fiL 50 mg/mL NprE儲存溶液與20 fiL抑制劑 儲存溶液預(yù)混合。然后，將220 fiL在10 mM HEPES中的10% DW-CT 洗滌劑制劑加入到每一樣本中，使得終NprE濃度為2 mg/mL。在32。C在 Thermomixer (Eppendorf)中的微量滴定板中溫育樣本。在穩(wěn)定性測試法溫育期間的終點(diǎn)(t = 200 min),取10 pL每一樣 本并用200 nL 1 N HC1淬滅。馬上加入200 jiL 5% TCA。在冰上進(jìn)行TCA 沉淀20分鐘。通過離心收集沉淀并且進(jìn)一步用水冷的卯％丙酮洗滌。然 后將該沉淀重懸于1.5x樣本上樣緩沖液中，并在95。C加熱5分鐘。然后將 樣本上樣至4-12% SDS-PAGE凝膠。應(yīng)用本領(lǐng)域公知的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn) 方案進(jìn)行電泳以及用考馬斯藍(lán)染料進(jìn)行的凝膠可視化。
結(jié)果本發(fā)明已在本文中進(jìn)行了廣泛和一般性地描述。落在該上位描 述中的每一個較窄的下位和次上位概念也形成本發(fā)明的一部分。這包括帶 有從中去除任何主題的條件或負(fù)面限制的本發(fā)明的上位描述，無論該去除 的主題是否在本文中曾有過具體述及。
權(quán)利要求
1.液體洗滌劑制劑，其包含(a)約1％至約75％重量的表面活性劑；(b)約10％至約95％重量的水；(c)約0.01％至約5％重量的中性金屬蛋白酶；以及(d)一定量的中性金屬蛋白酶抑制劑，使得在使用前該抑制劑與至少約90％的中性金屬蛋白酶分子結(jié)合，并且其中該洗滌劑制劑的合適稀釋導(dǎo)致該抑制劑從至少約25％的結(jié)合的中性金屬蛋白酶分子解離。
2. 權(quán)利要求l的制劑，其中所述洗滌劑制劑的合適稀釋導(dǎo)致所述抑制劑從至少約45%的結(jié)合的中性金屬蛋白酶分子解離。
3. 權(quán)利要求1的制劑，其中抑制劑的量為約0.01%至約15%重量之間。
4. 權(quán)利要求1的制劑，其中所述的抑制劑在約pH 7.5至約pH 9.5之間以約5 mM至約15 mM的表觀Kj竟?fàn)幮缘匾种扑鲋行越饘俚鞍酌浮?br> 5. 權(quán)利要求l的制劑，其中所述的中性金屬蛋白酶分離自芽孢桿菌屬(5"C/〃M51 5/7. )o
6. 權(quán)利要求5的制劑，其中所述的中性金屬蛋白酶是NprE。
7. 權(quán)利要求l的制劑，其中所述的抑制劑是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。
8. 權(quán)利要求7的制劑，其中所述的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物選自小麥谷蛋白水解產(chǎn)物、大豆蛋白酸水解產(chǎn)物、來自牛奶的酪蛋白酸水解產(chǎn)物、來自植物蛋白的酶水解產(chǎn)物、和它們的任意組合。
9. 權(quán)利要求l的制劑，其中所述的抑制劑包含通過用至少一種中性金屬蛋白酶消化蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水解產(chǎn)物。
10. 權(quán)利要求9的制劑，其中所述的水解產(chǎn)物包含少于約5000 Da的蛋白質(zhì)片段。
11，權(quán)利要求9的制劑，其中所述的蛋白質(zhì)是酪蛋白。
12. 權(quán)利要求1的制劑，其中所述的洗滌劑制劑包含重垢洗滌液體(HDL)制劑。
13. 權(quán)利要求1的制劑，其中所述液體洗滌劑制劑還包含約5%至約10%的聚丙二醇。
14. 權(quán)利要求1的制劑，其中所述的液體洗滌劑制劑還包含約0.5 mM至約5mM4丐離子。
15. 權(quán)利要求1的制劑，其中所述的液體洗滌劑制劑不包含硼。
16. 抑制劑穩(wěn)定的中性金屬蛋白酶組合物，其包含(a)約0.00iy。至約10%重量的中性金屬蛋白酶；以及(b)竟?fàn)幮砸种苿?，其中該竟?fàn)幮砸种苿┡c至少約卯％的所述中性金屬蛋白酶分子結(jié)合。
17. 權(quán)利要求16的組合物，其中所述的竟?fàn)幮砸种苿┦堑鞍踪|(zhì)水解產(chǎn)物。
18. 權(quán)利要求17的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物選自小麥谷蛋白水解產(chǎn)物、大豆蛋白酸水解產(chǎn)物、來自牛奶的酪蛋白酸水解產(chǎn)物、來自植物蛋白的酶水解產(chǎn)物、和它們的任意組合。
19. 權(quán)利要求17的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是通過用至少一種中性金屬蛋白酶消化蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水解產(chǎn)物。
20. 權(quán)利要求19的組合物，其中所述的水解產(chǎn)物包含少于約5000 Da的蛋白質(zhì)片段。
21. 權(quán)利要求19的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是酪蛋白。
22. 權(quán)利要求16的組合物，其中所述的組合物在包封的顆粒中。
23. 權(quán)利要求16的組合物，其中所述的抑制劑在約pH 7.5至約pH 9.5之間以約5 mM至約15 mM的表觀Kj竟?fàn)幮缘匾种扑鲋行越饘俚鞍酌浮?br> 24. 權(quán)利要求16的組合物，其中所述的中性金屬蛋白酶分離自芽孢桿菌屬。
25. 權(quán)利要求16的組合物，其中所述的中性金屬蛋白酶是NprE。
26. 用于制備抑制劑穩(wěn)定的液體洗滌劑制劑的方法，其包括(a)在約pH 6.5至約pH 11的含水緩沖液中、在約22。C至約37。C的溫度溫育包含至少 一種中性金屬蛋白酶和蛋白質(zhì)底物的混合物，由此通過所述中性金屬蛋白酶消化該底物蛋白質(zhì)產(chǎn)生水解產(chǎn)物；(b)分離分子量少于約5000 Da的水解產(chǎn)物；和(c)將步驟(b)的水解產(chǎn)物與包含約0.001。/。至約10%重量的中性金屬蛋白酶的液體洗滌劑制劑合并。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述的溫育混合物包含約0.001%至約10%重量的中性金屬蛋白酶和約5%至約20%重量的蛋白質(zhì)底物。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述中性金屬蛋白酶是NprE且蛋白質(zhì)底物是酪蛋白o(hù)
29. 權(quán)利要求26的方法，其中所述洗滌劑制劑包含HDL洗滌劑制劑。
30. 用于制備抑制劑穩(wěn)定的液體洗滌劑制劑的方法，其包括將蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物與包含約0.001%至約10%重量的中性金屬蛋白酶的液體洗滌劑制劑合并，其中如下制備所述的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物在約pH6.5至約pH11的含水緩沖液中、在約22。C至約37。C的溫度溫育包含至少一種中性金屬蛋白酶和蛋白質(zhì)底物的混合物，由此通過所述至少 一種中性金屬蛋白酶消化該底物蛋白質(zhì)產(chǎn)生水解產(chǎn)物，并且其中在與所述中性金屬蛋白酶合并前分離分子量少于約5000 Da的水解產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含金屬蛋白酶和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物抑制劑的組合物和制劑，其展示出升高的儲存穩(wěn)定性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一種金屬蛋白酶(例如，芽孢桿菌屬中性金屬蛋白酶)的液體洗滌劑制劑，其中所述至少一種金屬蛋白酶通過在該洗滌劑制劑中包含的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物來穩(wěn)定。本發(fā)明也提供了通過用金屬蛋白酶消化蛋白質(zhì)底物來制備用于穩(wěn)定洗滌劑制劑的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的方法。
文檔編號C12P21/06GK101675160SQ200880014264
公開日2010年3月17日 申請日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日
發(fā)明者D·S·溫特茨基, S-K·李 申請人:丹尼斯科美國公司