專利名稱：EphB4作為診斷標記和作為卵巢癌的治療靶標的用途的制作方法
EphB4作為診斷標記和作為卵巢癌的治療靶標的用途相關申請該申請要求2007年3月12日提交的美國臨時申請?zhí)?0/906，727及2007年3月 12日提交的美國臨時申請?zhí)?0/906，764的優(yōu)先權。該引用申請的全部教導此處以其整體 引入作為參考。
背景技術：
卵巢癌是婦女中第二常見的婦科癌，在2005年美國約有22，220例新病例 (American Cancer Society，2005)。卵巢癌比女性生殖系統(tǒng)的其它任何癌引起更高的死 亡。絕大多數卵巢癌起源于上皮。卵巢癌在攜帶BRCA或錯配修復基因突變的婦女中具有 更高的發(fā)病率(MataiS-GUiU，1998)。也已經研究了雌激素在卵巢癌發(fā)展中的作用。相信雌 激素的某些代謝物可能幫助腫瘤生長，而孕酮可能具有保護作用(Seeger，2006)。不存在有 效的卵巢癌篩選工具，并且在超過80%的病例中，直至疾病晚期才能做出診斷，這使得治療 非常具有挑戰(zhàn)性。目前總體5年存活率是44% ；然而，患有該疾病的婦女的相對5年存活 率僅為29% (American Cancer Society, 2005) 0因此需要鑒定在卵巢癌發(fā)病機理中起作 用的新的分子標記，希望提供新的靶向生物療法。本公開內容的目標是提供用于抑制卵巢癌的血管發(fā)生和腫瘤生長的試劑和治療 性治療。發(fā)明概述在某些方面，本公開內容提供了治療卵巢癌的方法，所述方法包括向需要治療卵 巢癌的患者施用有效量的EphB4抑制劑。在某些實施方案中，所述抑制劑可以是多肽、多 肽類似物、擬肽、抗體、核酸、RNAi構建體、核酸類似物或小分子。在某些實施方案中，所述 EphB4抑制劑是抗體或其抗原結合片段。在某些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段選自多克隆抗體、單克隆抗體或 抗體片段、雙抗體、嵌合的或嵌合抗體或抗體片段、人源化抗體或抗體片段、去免疫化人抗 體或抗體片段、完全人類抗體或抗體片段、單鏈抗體、FV、Fd、Fab、Fab，和F(ab，)2。在某些 實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是單克隆抗體。在某些實施方案中，所述抗體或其 抗原結合片段結合EphB4的胞外域。在某些實施方案中，EphB4的存在是EphB4的可檢測水平。在某些實施方案中，樣 品選自組織樣品、血液樣品或血清樣品。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段共價連接額外的功能部分。在某些實 施方案中，所述額外的功能部分是可檢測標記。在某些實施方案中，所述可檢測標記選自熒 光標記或生色標記。在某些實施方案中，所述可檢測標記選自辣根過氧化物酶或堿性磷酸 酶。在某些實施方案中，所述額外的功能部分包含聚乙二醇(PEG)部分。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段抑制EphB4活性。在某些實施方案中， 抗體或其抗原結合片段激活EphB4激酶活性。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合到位于EphB4胞外部分中的表位 上。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合到位于人EphB4序列的氨基酸16-198內的表位上。在某些實施方案中，抗體或其抗原結合片段結合到位于人EphB4的氨基酸 327-427或428-537內的表位上。在其它實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變 區(qū)包含一個或更多個⑶R區(qū)，所述⑶R區(qū)具有選自SEQ IDNO 261, SEQ ID NO 262和SEQ ID N0:263的氨基酸序列。在另一實施方案中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區(qū)，其 中所述輕鏈可變區(qū)包含一個或更多個⑶R區(qū)，所述⑶R區(qū)具有選自SEQ ID NO :264、SEQID NO 265和SEQ ID NO 266的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述人源化抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白重鏈和免 疫球蛋白輕鏈，其中所述重鏈包含包含SEQ ID NO :8的⑶Rl、包含SEQ ID NO :9的⑶R2 和包含SEQ ID NO 10的⑶R3 ；并且其中所述輕鏈包含包含SEQ ID NO 11的⑶R1、包含 SEQ ID NO 12的⑶R2和包含SEQ ID N0:13的⑶R3。在某些實施方案中，所述人源化抗 體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈，其中所述重鏈包含包含SEQ ID NO 14 的 CDR1、包含 SEQ ID NO 15 的 CDR2 和包含 SEQ ID NO 16 的 CDR3 ；并且其中所 述輕鏈包含包含SEQ ID NO 17的CDRl、包含SEQ ID NO 18的CDR2和包含SEQ ID NO 19 的 CDR3。在另一實施方案中，EphB4抑制劑是可溶性多肽，其選自(i)包含EphB4蛋白質 胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述EphB4多肽是單體并特異性結合Ephrin B2 多肽；和(ii)包含Ephrin B2蛋白質胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述可溶性 Ephrin B2多肽是單體并以高親和力結合EphB4多肽。在某些實施方案中，所述可溶性多肽 包含EphB4蛋白質的球形結構域。在其它方面，所述可溶性多肽包含與EphB4氨基酸序列 的1-522殘基至少90%同一的序列。在另一方面，所述可溶性多肽包含與EphB4氨基酸序 列的1-412殘基至少90%同一的序列。在其它實施方案中，所述可溶性多肽包含與EphB4 氨基酸序列的1-312殘基至少90%同一的序列。此外，所述可溶性多肽包含與EphB4氨基 酸序列的1-225殘基至少90%同一的序列。所述可溶性多肽還可以是融合蛋白，或可以包 含一個或更多個修飾的氨基酸殘基。在某些優(yōu)選實施方案中，所述可溶性多肽抑制Ephrin B2和EphB4之間的相互作用，或抑制Ephrin B2和EphB4的聚集。在其它實施方案中，所述 可溶性多肽抑制Ephrin B2或EphB4的磷酸化。在其它實施方案中，所述EphB4抑制劑選自核酸化合物和核酸類似物。在某些實 施方案中，所述核酸化合物的長度為約15-100個核苷酸，在生理條件下與SEQ ID NO 267 中闡明的EphB4核酸序列雜交并降低所述EphB4的表達。在某些實施方案中，所述核酸 選自RNAi構建體和反義寡核苷酸。在某些實施方案中，所述RNAi構建體選自dsRNA或 siRNA。在某一實施方案中，所述siRNA的長度約為19-30個核苷酸。在某一實施方案中， 所述siRNA的長度約為21-23個核苷酸。在某一實施方案中，所述反義寡核苷酸的長度約 為19-30個核苷酸。在某些方面，所述siRNA序列選自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。在某些方面，EphB4抑制劑具有抗癌活性。在某些實施方案中，所述抗癌活性選自 抑制腫瘤生長、抑制癌細胞增殖、抑制癌細胞遷移、抑制癌細胞的轉移、抑制血管發(fā)生和引 起腫瘤細胞死亡。在某些實施方案中，所述腫瘤細胞死亡歸因于程序性細胞死亡。在某些 實施方案中，所述EphB4抑制劑通過胱天蛋白酶-8的活化來引起程序性細胞死亡。在某些 實施方案中，卵巢癌包含一個或更多個表達EphB4的癌細胞。在某些實施方案中，用藥學上可接受的載體配制所述EphB4抑制劑。在本公開內容方法的某些實施方案中，相比于來自相當組織的非癌細胞，卵巢癌 細胞表達更高水平的EphB4。在某些實施方案中，所述卵巢癌是轉移的。在其它實施方案 中，所述卵巢癌依賴血管發(fā)生。在其它實施方案中，所述卵巢癌不依賴血管發(fā)生。在某些方面，本公開內容的方法還包括至少一種額外的抗癌化學治療劑，其與 EphB4抑制劑以累加或協(xié)同方式抑制卵巢癌細胞。在某些實施方案中，所述化學治療劑和所 述EphB4抑制劑順序施用。在某些實施方案中，所述化學治療劑和所述EphB4抑制劑同時 施用。在某些實施方案，本公開內容的方法還包括至少一種額外的抗血管發(fā)生劑，其與 EphB4抑制劑以累加或協(xié)同的方式抑制血管發(fā)生。在某些實施方案中，所述抗血管發(fā)生劑和 所述EphB4抑制劑順序施用。在某些實施方案中，所述抗血管發(fā)生劑和所述EphB4抑制劑 同時施用。在某些方面，本公開內容提供了在受試者中降低卵巢癌生長速率的方法，所述方 法包括施用一定量的EphB4抑制劑以降低卵巢癌的生長速率。在其它方面，所述公開內容 提供了治療患有卵巢癌患者的方法，所述方法包括(a)在患者中鑒定具有表達EphB4的大 量癌細胞的腫瘤；和(b)向所述患者施用EphB4抑制劑。在某些方面，本公開內容提供了在 受試者中降低卵巢癌生長速率的方法，所述方法包括施用足以降低卵巢癌生長速率的量的 EphB4抑制劑。在某些方面，本公開內容提供了 EphB4抑制劑在制備用于治療卵巢癌的藥物中的 用途。在另一方面，本申請?zhí)峁┝藱z測受試者是否患有卵巢癌或是否具有發(fā)生卵巢癌風 險的方法，所述方法包括(a)從所述受試者中獲得樣品；和(b)評估樣品中EphB4蛋白質 和/或mRNA的水平，其中EphB4蛋白質和/或mRNA的水平升高表明所述受試者患有卵巢 癌或處于發(fā)生卵巢癌的風險中。在一些實施方案中，EphB4蛋白質或mRNA的水平是正常卵 巢組織中水平的至少兩倍。在某些實施方案中，哺乳動物是人類。在某些實施方案中，所述 卵巢癌是轉移性卵巢癌。在一些方面，在基于抗體的測定中評估EphB4蛋白質的表達水平。 在某些實施方案中，所述方法可在處于發(fā)生卵巢癌風險的受試者、患有早期疾病的受試者 和患有晚期疾病的受試者中進行辨別。在某些方面，本公開內容提供對患有卵巢癌的患者進行預后的方法，所述方法包 括(a)從所述受試者中獲得樣品；(b)評估樣品中EphB4蛋白質和/或mRNA的表達水平， 其中EphB4蛋白質和/或mRNA的水平升高表示預后不良。在某些實施方案中，EphB4蛋白 質和/或mRNA的高水平是正常卵巢組織中EphB4水平的兩倍。在某些實施方案中，EphB4 的高水平是正常卵巢組織中EphB4水平的四倍。在某些實施方案中，EphB4的高水平是正 常卵巢組織中EphB4水平的十倍。在某些實施方案中，EphB4的高水平是正常卵巢組織中 可檢測水平的EphB4。在某些實施方案中，樣品選自組織樣品、血液樣品或血清樣品。在某些實施方案中，所述哺乳動物是人類。在某些實施方案中，所述卵巢癌是轉移 性卵巢癌。在另一方面，本申請?zhí)峁〦phB4抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區(qū)和輕 鏈可變區(qū)，其中所述重鏈可變區(qū)包含包含SEQ ID NO :261的⑶R1、包含SEQ ID NO 262的CDR2和包含SEQ ID NO 263的CDR3 ；并且其中所述輕鏈可變區(qū)包含包含SEQ ID NO 264 的CDR1、包含SEQ IDNO 265的CDR2和包含SEQ ID NO 266的CDR3。在某些實施方案中， 所述重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :42的氨基酸序列，并且所述輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO: 39的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述抗體是人源化抗體或其抗體片段。在另一方面，本申請?zhí)峁┯糜谠\斷卵巢癌的試劑盒，其包含抗EphB4抗體或抗 EphB4結合抗體片段、可檢測標記和使用所述試劑盒的說明書。在某些實施方案中，所述可 檢測標記是熒光的或生色的。在某些實施方案中，所述試劑盒包含辣根過氧化物酶或堿性 磷酸酶。在某些實施方案中，所述抗體或其抗體片段結合EphB4的C末端部分。本申請涵蓋了任何上述方面和實施方案的組合。附圖簡述

圖1A-1C顯示EphB4在人卵巢腫瘤樣品中表達并與晚期、腹水存在及低存活率相 關。(A)陰性(缺少一級抗體)對照(a)、正常卵巢上皮(b)和侵入性卵巢癌(c)中EphB4 的代表性免疫組織化學過氧化物酶染色。在X200的原始放大倍數下獲取所有圖片。(B)臨 床和病理學變量與卵巢癌中EphB4的過表達之間的相關性。(C)患有侵入性卵巢癌的患者 使用log-rank統(tǒng)計方法，基于EphB4染色強度的Kaplan-Meier存活。圖2A-2D顯示卵巢癌細胞系表達受孕酮下調的功能EphB4。(A)來自各卵巢癌細 胞系的20 μ g總細胞裂解物在4-20% Tris-甘氨酸凝膠上跑膠并轉移到PVDF膜上。該膜 依次用抗EphB4、抗EphrinB2和抗β肌動蛋白抗體探測。(B)Hey細胞血清饑餓過夜并在所 示的多個時期用3 μ g/ml聚集的EphrinB2/Fc或單獨用Fc進行刺激。EphB4從100 μ g全 細胞裂解物中免疫沉淀下來并通過抗磷酸酪氨酸抗體免疫印跡(上圖)分析磷酸化狀態(tài)。 以一式兩份的膜探測EphB4，以記載免疫沉淀作用的效率(下圖)。(C)用不同劑量的孕酮 和雌激素處理Hoc-7 (卵巢癌)和MCV-50 (卵巢囊腺瘤)細胞36小時并通過免疫印跡分析 細胞裂解物的EphB4、EphrinB2和β肌動蛋白的表達。(D)將IXlO4 Hoc-7細胞接種于 48孔板的各孔中并用不同劑量的孕酮和雌激素處理72小時。通過MTT測定評估細胞活力 并將存活表述為相對于未處理細胞的吸光度的百分比。圖3A-3E顯示EphB4擊倒(knockdown)導致腫瘤細胞程序性死亡。(A)用EphB4 特異性siRNA (EphB4-siRNA)瞬時轉染Hev細胞，并在48小時后，通過免疫印跡分析20 μ g 全細胞裂解物的EphB4和β肌動蛋白水平(上圖)。用突變的EphB4 siRNA Δ或天然的 EphB4-siRNA轉染1 X IO4Hey細胞并接種于48孔板中。在48小時，通過MTT測定評估細 胞活力，并將存活表述為吸光度相對于未處理細胞的百分比(下圖)。(B)用多種劑量的 EphB4特異性ODN(AS-IO)處理Hey細胞。72小時后，通過免疫印跡分析20 μ g總細胞裂解 物的EphB4和β肌動蛋白水平(上圖)。用亂序的或AS-IO ODN處理IX IO4 Hey細胞。在 72小時，通過MTT測定評估細胞活力，并將存活表述為吸光度相對于未處理細胞的百分比。 (C)用 EphB4 特異性 siRNA(EphB4-siRNA)或突變的 siRNA (EphB4_siRNA Δ )瞬時轉染Hey 細 胞。如方法部分中詳細說明，使用全細胞裂解物通過ELISA分析程序性細胞死亡的胞質核 小體。(D)在這些細胞中通過比色分析法測定胱天蛋白酶_8和胱天蛋白酶-9的激活并將其 表述為相對于脂質轉染胺(lipofectamine)處理細胞的百分比活性。(E) wit脂質轉染胺單 獨處理(對照)或 25nM EphB4 特異性 siRNA (EphB4 siRNA)或突變體 siRNA (EphB4siRNA Δ ) 處理36小時的Hey細胞的細胞周期分析。指出了 GO、Gl、S、G2和M期中細胞的％。在三組獨立實驗中獲得了類似的結果。圖4A-4B顯示EphB4有助于腫瘤細胞遷移和侵入。(A)用塑料巴斯德吸管刮Hey 細胞的匯合培養(yǎng)物，以產生3mm寬的單層無細胞區(qū)。超過9小時后評估轉染25nM EphB4特 異性(EphB4 siRNA)或突變體siRNA(EphB4 siRNAA)后細胞遷移并閉合傷口的能力。(B) 如方法中所述，研究了 Hey細胞向基質膠(Matrigel)包被的inserts的侵入。將響應下層 室中l(wèi)Oyg/ml EGF侵入insert下面的細胞固定并用吉姆薩(Giemsa)染色。顯示了代表 性的顯微照片。圖5A-5B顯示EphB4特異性反義ODN在鼠類卵巢癌異種移植模型中抑制腫瘤生 長。㈧將2X106 Hey細胞植入10到12周大雌性Balb/C裸鼠的脅腹中，并如方法部分詳 細說明來測定腫瘤體積。從細胞植入后第4天開始每天經腹膜內向小鼠單獨施用載體(載 體)，或10mg/kg亂序ODN (亂序的)或EphB4特異性反義ODN(AS-IO)。5周后處死動物并 收集腫瘤。(B)用蘇木精/曙紅對福爾馬林固定的石蠟包埋切片的5μπι切片進行染色并 通過免疫組織化學分析Ki-67和⑶31的表達。使用原位程序性細胞死亡染色試劑盒通過 TUNEL來評估程序性細胞死亡。不知情的觀察者在5個隨機高倍視野下將陽性染色的細胞 數進行平均，并在各顯微照片中進行了說明。AS-IO與對照組之間* ρ <0.05。左下圖中的 標尺在H/E中表示200 μ m，在⑶31中表示100 μ m，在其它顯微照片中表示75 μ m。圖6顯示MAB265可變輕鏈序列與種系序列的比對。圖7顯示MAB265可變重鏈序列與種系序列的比對。圖8顯示針對EphB4產生的單克隆抗體和這些抗體表位作圖。顯示了 EphB4胞外 域的拓撲結構，包括球形結構域(G)、富含半胱氨酸的結構域(C)和兩個纖連蛋白類型3結 構域(Fl和F2)。圖9顯示了 B4ECv3蛋白質的氨基酸序列(顯示了包括未切割Eph B4前導肽的前 體序列)。圖10顯示了 B4ECv3NT蛋白質的氨基酸序列(顯示了包括未切割EphB4前導肽的 前體的序列)。圖11顯示了 B4ECv3-FC蛋白質的氨基酸序列(顯示了包括未切割Eph B4前導肽 的前體的序列)。圖12顯示了 B2EC蛋白質的氨基酸序列(顯示了包括未切割EphrinB2前導肽的 前體的序列)。圖13顯示了 B2EC-FC蛋白質的氨基酸序列(顯示了包括未切割Ephrin B2前導 肽的前體的序列)。圖14顯示了人Ephrin B2的氨基酸序列。發(fā)明詳述I.綜述本發(fā)明部分基于這樣的發(fā)現，通過印hrin/印hrin受體(印hrin/印h)途徑的信號 轉導促進卵巢腫瘤發(fā)生。申請人檢測了卵巢腫瘤組織中EphB4的表達，并開發(fā)了用于阻斷 通過eph的信號轉導的抗腫瘤治療劑。因此，在某些方面，本公開內容提供了可用于治療卵 巢癌的許多化合物(試劑)。卵巢癌是由一個或兩個卵巢生殖腺內細胞快速生長和分裂產生的疾病，在所述生殖腺中產生卵，或卵子和雌性激素。卵巢含有在正常環(huán)境下生殖以維持組織健康的細胞。當 失去了生長控制并且細胞分裂太多并太快時，就會形成細胞塊或腫瘤。如果所述腫瘤限制 在少數細胞層中，例如表面細胞中，并且它并不侵入周圍組織或器官，認為它是良性的。如 果所述腫瘤擴散到周圍組織或器官中，認為它是惡性的或癌性的。當癌細胞從最初的腫瘤 中逃選出來，經血液或淋巴管前進，并在身體其它部分內生長時，該過程稱作轉移。可以將卵巢腫瘤廣義地分為三種類別，來自表面上皮、生殖細胞和特化基質的那 些腫瘤。來自卵巢表面的腫瘤占卵巢腫瘤的絕大多數(大約80%)并被稱作表面上皮腫 瘤。這些腫瘤組成了通常認為的“卵巢癌”。表面上皮腫瘤進一步細分為三種類別良性的、 邊緣的(低惡性潛在性[LMP]或不規(guī)則增殖)和侵入性癌。良性腫瘤和侵入性癌的行為是 很好理解的，但圍繞中間(邊緣)組的診斷、預后和治療卻有大量的爭論。這些腫瘤傾向于 在更年輕的婦女中發(fā)生并可經常進行保守治療。保守治療允許婦女保持她們的生育力并保 留卵巢激素的產生，在侵入性癌治療進行時，如果去除兩個卵巢，則所述卵巢激素的產生將 會喪失。然而，保守治療依賴于正確的組織學(病理學)診斷。卵巢腫瘤診斷的大多數失 誤發(fā)生在“邊緣”腫瘤范疇內。表面上皮腫瘤基于細胞分化模式和腫瘤級別也可進行細分。 最后，手術后殘留腫瘤的階段和量提供了用于預測行為并設計后續(xù)治療的重要信息(交叉 參考)。生殖細胞腫瘤是最不常見的卵巢腫瘤，占卵巢腫瘤的大約10-15%。它們來自卵 母細胞(卵子)。這些腫瘤，像表面上皮腫瘤也可以是良性的或惡性的。然而沒有中間組。 良性腫瘤幾乎總是成熟的囊性畸胎瘤或所謂的“皮樣囊腫”，并通過去除腫瘤的同時保留未 涉及的卵巢組織而得到成功治療。其它治療不是必需的。惡性生殖細胞腫瘤在去除后需要 加強的多劑化學療法。所述治療與手術治療表面上皮腫瘤后施用的化學治療完全不同。最后，占卵巢腫瘤大約5-10%的最少見類型的卵巢腫瘤是來自卵巢基質成分的那 些腫瘤。因為激素的產生(雌性激素如雌二醇和孕酮，雄性激素如睪酮、脫氫表雄酮[DHEA] 和androstendione)在基質中發(fā)生，來自卵巢該部分的腫瘤可與性類固醇激素的異常產生 相關。這可導致在生殖年齡和絕經后婦女中異常的陰道出血和兒童的性早熟。產生雄性激 素的卵巢腫瘤可引起多毛癥(身體多個部位毛發(fā)生長增快)，并且在極端情況下會引起男 性化，其特征在于體毛增多、聲音深沉、禿頭、肌肉塊增大和陰蒂增大。 如此處所用，術語“Ephrin”和“Eph”分別用于指配體和受體。它們可來自多種動 物(例如，哺乳動物/非哺乳動物、脊椎動物/無脊椎動物，包括人類)中的任何一種。此處描述的工作(尤其是在實施例中描述的工作)指Ephrin B2和EphB4。然 而，本發(fā)明涵蓋了它們各自家族中的任何ephrin配體和/或Eph受體，所述家族在卵巢腫 瘤中表達。所述ephrin (配體)有兩種結構類型，其在序列關系的基礎上可進一步細分，并 且在優(yōu)先結合的基礎上，它們在功能上顯示出兩種相應的受體亞組。在結構上，有兩種類型 的^hrin 通過甘油磷脂酰肌醇(GPI)連接膜錨定的那些類型和通過跨膜結構域錨定的那 些類型。通常，配體分成Ephrin-A亞類，其為優(yōu)先結合EphA受體的GPI連接的蛋白質，和 Ephrin-B亞類，其為一般優(yōu)先結合EphB受體的跨膜蛋白質。Eph家族受體是受體蛋白酪氨酸激酶家族，其與Eph相關，所述Eph以其在產生促 紅細胞生成素的人類肝細胞癌細胞系中的表達命名。在它們胞外域序列的親緣關系和優(yōu)先 結合Ephrin-A蛋白質或Ephrin-B蛋白質的能力的基礎上，可將它們分成兩個亞組。優(yōu)先與Ephrin-A蛋白質相互作用的受體是EphA受體，優(yōu)先與Ephrin-B蛋白質相互作用的那些 受體是EphB受體(參閱出版的美國專利申請20050164965和20050249736)。Eph受體具有胞外域，其由配體結合球形結構域、富含半胱氨酸區(qū)域后連一對纖連 蛋白類型III重復序列組成。胞質區(qū)由含有兩個保守酪氨酸殘基的近膜區(qū)域；蛋白質酪氨 酸激酶結構域；無效的α-基序(SAM)和PDZ-結構域結合基序組成。EphB4對膜結合配體 Ephrin B2 是特異性的(Sakano，S.等 1996 ；BrambiIla R.等 1995)。Ephrin B2 屬于 Eph 配體類，所述配體具有跨膜結構域和具有5個保守酪氨酸殘基和PDZ結構域的胞質區(qū)。Eph 受體通過結合聚集的膜附著的^hrin而被激活(Davis S等，1994)，這說明Eph的激活需 要表達受體的細胞與表達配體的細胞之間的接觸。配體結合后，Eph受體二聚體化并將近膜酪氨酸殘基自磷酸化，以獲得完全的激活 (Kalo MS等，1999，Birms KS, 2000) 0除上述通過Eph受體的正向信號轉導外，反向信號轉 導可通過印hrin B發(fā)生。Ephrin的Eph銜接導致保守胞內酪氨酸的快速磷酸化(Bruckner K，1997)和PDZ結合蛋白質的些許較慢募集(Palmer A 2002)。近來，若干研究已經顯示 Eph/ephrin的高表達可能與腫瘤生長、致腫瘤性和轉移的潛力提高相關(Easty DJ, 1999 ； Kiyokawa E,1994 ；Tang XX，1999 ；Vogt T,1998 ；Liu W,2002 ；StephensonSA, 2001 ；Steube KG 1999 ；Berclaz G, 1996)。II.核酸治療劑本公開內容涉及用于抑制或降低卵巢癌中印hrin和/或^hrin受體(Eph)的基 因表達的方法?！耙种啤被颉敖档汀敝富虻谋磉_，或核酸或編碼一種或更多種蛋白質或蛋白 質亞基(如Ephrin B2和/或EphB4)的等同核酸的水平降低到在本公開內容核酸治療劑 缺失下觀察到的水平之下?！盎颉敝妇幋aRNA的核酸，例如核酸序列，包括但不限于編碼多 肽的結構基因。如此處所用，術語“核酸治療劑”或“核酸試劑”或“核酸化合物”指任何基于核酸 的化合物，其含有核苷酸并對靶基因上具有想要的作用。核酸治療劑可以是單鏈、雙鏈或多 鏈的，并可包含修飾的或未修飾的核苷酸或非核苷酸或多種混合物，及其組合。本公開內容 的核酸治療劑的實例包括，但不限于，反義核酸、dsRNA、siRNA和酶核酸化合物。在一個實施方案中，本公開內容描述了一種或更多種核酸治療劑，所述核酸治療 劑單獨或組合調節(jié)編碼Ephrin B2蛋白質(例如，Genbank登錄號NP_004084)的Ephrin B2基因或編碼EphB4蛋白質(例如，Genbank登錄號NP_004435)的EphB4受體基因的表 達。在出版的美國專利申請20050164965和20050249736中列出了可根據該申請的方法使 用的核酸構建體的實例，如下文列出的那些在本文中以其整體引入作為參考。表1.通過EphB4反義探針抑制EphB4基因表達 A.反義核酸在某些實施方案中，本公開內容涉及反義核酸?！胺戳x核酸”指非酶核酸化合物，其 通過RNA-RNA、RNA-DNA或RNA-PNA (蛋白質核酸)相互作用結合靶核酸并改變所述靶核酸 的活性(對于綜述，參閱Stein和Cheng，1993 Science 261，1004和Wool等，美國專利號 5，849，902)。通常，反義分子沿反義分子的單一相鄰序列與靶序列互補。然而，在某些實施 方案中，反義分子可形成環(huán)并結合形成環(huán)的底物核酸。因此，反義分子可與兩個(或更多) 不相鄰的底物序列互補，或者反義分子的兩個(或更多)不相鄰的序列部分可與靶序列互 補，或者兩者均可。對于目前反義策略的綜述，參閱Schmajuk等，1999，J.Biol· Chem.，274， 21783-21789，Delihas 等，1997，Nature,15，751-753，Stein 等，1997，Antisense N. A. Drug Dev.,7,151, Crooke,2000, Methods Enzymo1. ,313,3—45 ；Crooke,1998, Biotech. Genet. Eng. Rev.，15，121—157，Crooke,1997，Ad.Pharmacol.，40，1-49 此外，反義DNA通過DNA-RNA相互作用可用于靶定核酸，由此激活RNA酶H，其消化 雙鏈體中的靶核酸。反義寡核苷酸可包含一個或更多個RNA酶H激活區(qū)，其能夠激活RNA 酶H以切割靶核酸。可以化學合成反義DNA或通過使用單鏈DNA表達載體或其等同物表達 反義DNA?！癛NA酶H激活區(qū)”指能夠結合靶核酸以形成被細胞RNA酶H酶識別的非共價復 合體的核酸化合物的區(qū)域(通常長度大于或等于4-25個核苷酸，優(yōu)選長度為5-11個核苷 酸)(參閱例如Arrow等，美國專利號5，849，902 ；Arrow等，美國專利號5，989，912)。所述 RNA酶H酶結合核酸化合物-靶核酸復合體并切割所述靶核酸序列。RNA酶H激活區(qū)包含，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、5 ‘-硫代磷酸 酯、氨基磷酸酯或甲基膦酸酯骨架化學或其組合。除上述一種或更多種骨架化學外，RNA酶 H激活區(qū)還可包含多種糖化學。例如，所述RNA酶H激活區(qū)可包含脫氧核糖、阿拉伯糖、氟代 阿拉伯糖或其組合、核苷酸糖化學。本領域技術人員將認識到上述為非限制性實例，并且核 酸的磷酸、糖和堿基化學的任何組合(其支持RNA酶H酶的活性)處于RNA酶H激活區(qū)的 定義和本公開內容的范圍內。因此，本公開內容的反義核酸包括天然類型的寡核苷酸和修飾寡核苷酸，其包括 硫代磷酸酯類型的寡脫氧核糖核苷酸、二硫代磷酸酯類型的寡脫氧核糖核苷酸、甲基膦酸 酯類型的寡脫氧核糖核苷酸、氨基磷酸酯_類型的寡脫氧核糖核苷酸、H膦酸酯類型的寡脫 氧核糖核苷酸、三酯類型的寡脫氧核糖核苷酸、α異頭物類型的寡脫氧核糖核苷酸、肽核 酸、其它人造核酸和核酸修飾的化合物。
其它修飾包括寡核苷酸分子內部的或末端的那些修飾，并包括向分子添加核苷酸 間磷酸鍵，如膽固醇、膽固醇基或在氨基和末端核糖之間具有不同數目碳殘基的二胺化合 物、脫氧核糖和磷酸修飾，其切割或與相反鏈或結合的酶或結合基因組的其它蛋白質交聯(lián)。 這種修飾的寡核苷酸的實例包括具有修飾堿基和/或糖(如阿拉伯糖替代核糖)的寡核苷 酸，或3' ,5'取代的寡核苷酸，其具有在其3'和5'位置附著到除了羥基(在其3'位 置)和磷酸基團(在其5'位置)之外的化學基團的糖。糖修飾的其它實例包括核糖部分2'位置的修飾，其包括但不限于用含有1-6個 飽和或不飽和碳原子的一O-低級烷基、或--O-芳基、或具有2-6碳原子的烯丙基取代的 2' -0-，其中該一O-烷基、芳基或烯丙基可以是未被取代或被取代的(例如被鹵素、羥基、 三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基取代)，或被氨基或鹵素 取代。本公開內容的十分重要的寡核苷酸的非限制性實例在其3'、5'或31和5'末端具 有2' -0-烷基化的核糖核苷酸，其中至少4個或5個相鄰核苷酸被如此修飾。2' -0-烷 基化基團的實例包括，但不限于，2' -0-甲基、2' -0-乙基、2' -0-丙基和2' -0-丁基。在某些情況下，例如可利用ABI (Applied Biosystems Inc.)制造的381ADNA合 成儀或394DNA/RNA合成儀，根據亞磷酰胺方法進行天然類型反義核酸和修飾的反義核 酸的合成(參閱從 ABI,或 F. Eckstein, Oligonucleotidesand Analogues :A Practical Approach, IRL Press (1991)獲得的說明書)。在所述亞磷酰胺方法中，通過使用含受基 團(如氰基乙基)保護的亞磷酰胺的試劑，在修飾的脫氧核糖核苷或修飾的核糖核苷的 3'-末端與另一修飾的脫氧核糖核苷、修飾的核糖核苷、修飾的寡脫氧核糖核苷酸或修飾 的寡核糖核苷酸的5' _末端之間進行縮合來合成核酸相關分子。完成該合成的最后一個 循環(huán)，以產生具有結合到糖部分5'-末端的羥基上的保護基(例如，二甲氧基三苯甲基基 團)的產物。在室溫下合成的寡聚物從支持物上切割下來，并且其核苷酸和磷酸部分被去 保護。在該方式中，天然類型的寡核酸化合物以原始形式獲得。也可以通過亞磷酰胺方法， 使用來自ABI的合成儀以類似于上述天然類型的方式合成硫代磷酸酯類型的核酸。合成的 最后一個循環(huán)后的程序也與天然類型的相同?？梢猿Ｒ姺绞?，例如乙醇沉淀，或反相層析、高效液相層析(HPLC)中的離子交 換層析和凝膠過濾層析、超臨界流體層析來純化因此獲得的原始核酸(天然類型或被修 飾的)，并可以通過電泳進一步純化。也可以使用用于反相層析的柱體，如tClS-packed SepPak Plus (long body/ENV) (Waters)。可通過HPLC來分析天然類型的和被修飾的(例 如，硫代磷酸酯類型的)核酸的純度。在某些實施方案中，本公開內容的反義核酸例如可以作為表達質粒進行遞送， 當在細胞中轉錄時，所述表達質粒產生與細胞mRNA的至少獨特部分互補的RNA，所述細 胞mRNA編碼印hrin B2或EphB4多肽?；蛘撸鰳嫿w是寡核苷酸，其離體產生，并且 當引入細胞中時，通過與編碼^hrin B2或EphB4多肽的mRNA和/或基因組序列雜交引 起對表達的抑制。這種寡核苷酸探針是任選被修飾的寡核苷酸，其對內源核酸酶(例如 外切核酸酶和/或內切核酸酶)有抵抗力，并因此在體內是穩(wěn)定的。用作反義寡核苷酸 的示例性核酸化合物是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯類似物(也參閱美 國專利號 5，176，996 ;5，264，564 ；和 5，256，775)。此外，例如，van der Krol 等，(1988) Biotechniques 6 :958_976 ；和 Stein 等，(1988)Cancer Res 48 :2659_2668 已經綜述了構建用于核酸療法的寡聚體的一般方法。B. dsRNA 和 RNAi 構津體在某些實施方案中，本公開內容涉及雙鏈RNA (dsRNA)和RNAi構建體。如此處所 用，術語“dsRNA”指能夠RNA干擾(RNAi)的雙鏈RNA分子，包括siRNA(參閱例如，Bass, 2001，Nature,411,428-429 ；Elbashir 等，2001，Nature，411，494-498 ；和 Kreutzer 等， PCT 公布號 WO 00/44895 ；Zernicka-Goetz 等，PCT 公布號 WO 01/36646 ；Fire, PCT 公布 號 W099/32619 ；Plaetinck 等，PCT 公布號 WO 00/01846 ；Mello 和 Fire, PCT 公布號 WO 01/29058 ；Deschamps-Depaillette, PCT 公布號 WO 99/07409 ；和 Li 等，PCT 公布號 WO 00/44914)。此外，RNAi是最初應用于在植物和蠕蟲中觀察到的現象的術語，在所述植物和 蠕蟲中雙鏈RNA(dsRNA)以特異的和轉錄后的方式阻斷基因表達。RNAi提供了在體外或在 體內抑制基因表達的有用方法。如此處所用，術語“短干擾RNA”、“siRNA”或“短干擾核酸”指當適當處理細胞時能 夠介導RNAi或基因沉默的任何核酸化合物。例如，所述siRNA可以是包含自身互補的有義 和反義區(qū)的雙鏈多核苷酸分子，其中所述反義區(qū)包含與靶核酸化合物(例如Ephrin B2或 EphB4)的互補性。所述siRNA可以是具有自身互補的有義和反義區(qū)的單鏈發(fā)夾多核苷酸， 其中所述反義區(qū)包含與靶核酸化合物的互補性。所述siRNA可以是環(huán)形單鏈多肽，其具有 兩個或更多個環(huán)結構和包含自身互補的有義和反義區(qū)的莖，其中所述反義區(qū)包含與靶核酸 化合物的互補性，并且其中可以在體內或在體外處理所述環(huán)形多核苷酸，以產生能夠介導 RNAi的活性siRNA。所述siRNA也可包含與靶核酸化合物具有互補性的單鏈多核苷酸，其 中所述單鏈多核苷酸可進一步包含末端磷酸基，如5'-磷酸基(參閱例如Martinez等， 2002，Cell.，110,563-574)，或 5'，3' -二磷酸基。任選地，本公開內容的SiRNA含有核苷酸序列，所述核苷酸序列在細胞生理條件 下與待抑制的基因(“靶”基因)的mRNA轉錄物至少一部分的核苷酸序列雜交。雙鏈RNA 僅需要與具有介導RNAi能力的天然RNA足夠類似。因此，本公開內容具有能夠承受可能由 于遺傳突變、品系多態(tài)性或進化趨異而造成序列變異的優(yōu)勢。靶序列與siRNA序列之間耐 受的核苷酸錯配的數目不超過5個堿基對中1個、或10個堿基對中1個、或20個堿基對中1 個、或50個堿基對中1個。siRNA雙鏈體中心的錯配是最重要的并可能基本上破壞靶RNA的 切割。相反，與靶RNA互補的siRNA鏈3'末端的核苷酸并不顯著促進靶標識別的特異性?？?通過本領域已知的序列比較和比對算法(參閱Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer, Stockton Press，1991，及其中引用的參考文獻)并通過如BESTFIT軟件程序中實 現的 Smith-Waterma 算法(例如 University of Wisconsin Genetic ComputingGroup)使 用默認參數計算核苷酸序列之間的百分比差異來優(yōu)化序列同一性。優(yōu)選siRNA和靶基因 部分之間高于90%的序列同一性，或甚至100%的序列同一性?；蛘?，RNA的雙鏈體區(qū)可在 功能上被定義為核苷酸序列，其能夠與靶基因轉錄物的部分進行雜交(例如，400mM NaCl, 40mM PIPESpH 6. 4，ImM EDTA，50°C或 70°C雜交 12-16 小時，然后進行洗滌)?？赏ㄟ^單條自身互補的RNA鏈、兩條互補RNA鏈，或DNA鏈和互補RNA鏈形成dsRNA 的雙鏈結構。任選地，可在細胞內或細胞外開始RNA雙鏈體形成?？梢砸栽试S遞送每個細 胞至少一個拷貝的量引入RNA。更高劑量(例如，每個細胞至少5、10、100、500或1000個拷 貝)的雙鏈材料可產生更有效的抑制，而更低劑量也可用于特定應用。因為對應于RNA雙鏈體區(qū)的核苷酸序列是遺傳抑制的靶標，所以抑制是序列特異性的。如此處所用，目的SiRNA長度大約19-30個核苷酸，甚至更優(yōu)選長度為21_23個核 苷酸。所述siRNA理解為募集核酸酶復合體并通過與特異性序列配對將所述復合體引至靶 mRNA。結果，所述靶mRNA被蛋白質復合體中的核酸酶降解。在特定實施方案中，21-23個核 苷酸的siRNA分子包含3'羥基。在某些實施方案中，可通過更長雙鏈RNA，例如在切丁酶 的存在下進行加工產生所述siRNA構建體。在一個實施方案中，使用果蠅體外系統(tǒng)。在該 實施方案中，dsRNA與來自果蠅胚胎的可溶性提取物混和，由此產生混合物。在將dsRNA被 加工成約21到約23個核苷酸的RNA分子的條件下維持所述混合物?？墒褂帽绢I域技術人 員已知的許多技術來純化所述siRNA分子。例如，凝膠電泳可用于純化siRNA?；蛘撸亲?性方法，如非變性柱層析可用于純化siRNA。此外，層析(例如，大小排阻層析)、甘油梯度 離心、使用抗體的親和純化可用于純化siRNA。可通過化學合成方法或通過重組核酸技術進行目的dsRNA(例如，siRNA)的制備。 被處理細胞的內源RNA聚合酶可介導體內轉錄，或者克隆的RNA聚合酶可用于體外轉錄。如 此處所用，本公開內容的dsRNA或siRNA分子不必局限于僅含有RNA的那些分子，還包含化 學修飾的核苷酸和非核苷酸。例如，所述dsRNA可包括對磷酸-糖骨架或核苷的修飾，例如 以降低對細胞核酸酶的敏感性、提高生物利用率、改善配制特性，和/或改變其它藥物代謝 動力學性質。為了說明，可修飾天然RNA的磷酸二酯鍵以包括至少一個氮或硫雜原子?？蓪?RNA結構中的修飾進行定制，以避免在對dsRNA —般性響應的同時允許特異性的遺傳抑制。 同樣，可修飾堿基，以阻斷腺苷脫氨酶的活性?？赏ㄟ^酶促產生dsRNA或通過部分/完全的 有機合成產生dsRNA，可通過體外酶促合成或有機合成引入任何被修飾的核糖核苷酸?？?調整化學修飾RNA分子的方法用于修飾dsRNA (參閱，例如，Heidenreich等(1997) Nucleic Acids Res，25:776-780 ;Wilson 等(1994)JMol Recog 7 :89_98 ;Chen 等(1995)Nucleic Acids Res 23 :2661_2668 ;Hirschbein 等(1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7 55-61)。僅為了說明，可使用硫代硫酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合甲基膦酸酯-磷 酸二酯、肽核酸、含5-丙炔基嘧啶的寡聚體或糖修飾(例如，2’-取代的核糖核苷，a-構型) 修飾dsRNA的骨架。在某些情況下，本公開內容的dsRNA缺少含2'-羥基(2' -0H)的核 苷酸。在特定實施方案中，siRNA分子的至少一條鏈具有長度約1到約6個核苷酸的3' 突出端，然而也可以為2到4個核苷酸長。更優(yōu)選地，所述3'突出端長度為1-3個核苷酸。 在某些實施方案中，一條鏈具有3'突出端，另一條鏈是平末端或也可以具有突出端。對于 每條鏈，突出端的長度可以相同或不同。為了進一步提高siRNA的穩(wěn)定性，可將3'突出端 穩(wěn)定化以防止降解。在一個實施方案中，通過包括嘌呤核苷酸，如腺苷或鳥苷核苷酸來穩(wěn)定 RNA?；蛘?，通過修飾的類似物取代嘧啶核苷酸，例如2' _脫氧胸苷取代3'突出端尿苷核 苷酸可被耐受并且不影響RNAi的效率。2'羥基的缺失顯著增強了組織培養(yǎng)基中突出端的 核酸酶抵抗力，并可能在體內是有益的。在另一特定實施方案中，目的dsRNA也可以是長雙鏈RNA的形式。例如，所述dsRNA 為至少25、50、100、200、300或400個堿基。在一些情況下，所述dsRNA長度為400-800個 堿基。任選地，所述dsRNA在細胞內被消化，例如以在細胞中產生siRNA序列。然而，在體 內長的雙鏈RNA的使用并不總是現實的，可能是因為由不依賴序列的dsRNA響應引起的有害作用。在這樣的實施方案中，優(yōu)選使用降低干擾素或PKR效應的局部遞送系統(tǒng)和/或試 劑。在其它特定實施方案中，dsRNA是發(fā)夾結構形式(命名為發(fā)夾RNA)?？赏庠春铣?發(fā)夾RNA或通過在體內從RNA聚合酶III啟動子轉錄來形成發(fā)夾RNA。例如在Paddison 等，Genes Dev, 2002，16 :948_58 ；McCaffrey 等，Nature，2002，418 :38_9 ；McManus 等，RNA， 2002，8 :842-50 ;Yu 等，ProcNatl Acad Sci U S A，2002，99 6047-52)中描述了產生和使 用這種發(fā)夾RNA用于哺乳動物細胞中基因沉默的實例。優(yōu)選地，在細胞或動物中改造這種 發(fā)夾RNA，以保證對想要基因持續(xù)并穩(wěn)定的抑制。本領域已知的是可通過在細胞中加工發(fā)夾 RNA來產生siRNA。PCT申請WO 01/77350描述了用于轉基因雙向轉錄以在真核細胞中產生同一轉基 因的有義和反義RNA轉錄物的示例性載體。因此，在某些實施方案中，本公開內容提供了具 有以下獨特性質的重組載體其包含具有以相反方向排列的兩個重疊轉錄單位并位于目的 dsRNA的轉基因側翼的病毒復制子，其中所述兩個重疊轉錄單位在宿主細胞中從同一轉基 因片段產生有義和反義RNA轉錄物。C.酶核酸化合物在某些實施方案中，本公開內容涉及酶核酸化合物?！懊负怂峄衔?，，指在底物結 合區(qū)與特定靶基因具有互補性，并還具有有效地特異性切割靶核酸的酶促活性的核酸化合 物。理解所述酶核酸化合物能夠在分子間切割核酸，并由此滅活靶核酸化合物。這些互補 區(qū)允許酶核酸化合物與靶核酸之間充分雜交，并因此允許切割。優(yōu)選100%互補性(同一 性)，但低至50-75 %的互補性也可用于該公開內容(參閱例如Werner和Uhlenbeck，1995， Nucleic Acids Research,23,2092-2096 ；Hammann 等，1999, Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev.，9，25-31)?？稍趬A基、糖和/或磷酸基處修飾酶核酸。如此處所述，術語“酶核 酸”與短語如核酶、催化性RNA、酶RNA、催化性DNA、aptaZyme或適配體結合核酶、調節(jié)性核 酶、催化性寡核苷酸、nuCle0Zyme、DNA酶、RNA酶、內切核糖核酸酶、內切核酸酶、“小”核酶、 leadzym^oligozyme或DNA酶可互換使用。所有這些術語均描述了具有酶促活性的核酸化 合物。本申請中描述的特異性酶核酸化合物不限于在本公開內容中，并且本領域技術人員 將認識到在本公開內容的酶核酸化合物中重要的是它具有與一個或更多個靶核酸區(qū)互補 的特異性底物結合位點，并且它在賦予核酸分子核酸切割和/或連接活性的底物結合位點 內或周圍具有核苷酸序列(Cech等，美國專利號4，987，071 ；Cech等，1988，260 JAMA3030)。目前已知若干種天然發(fā)生的酶核酸。每種均可在生理條件下反式催化核酸磷酸二 酯鍵的水解(并因此切割其它核酸化合物)。通常，酶核酸首先通過結合到靶核酸上起作 用。這種結合通過酶核酸的靶結合部分發(fā)生，所述酶核酸保持在切割靶核酸的分子的酶促 部分附近。因此，所述酶核酸首先識別靶核酸，然后通過互補堿基配對結合靶核酸，并且一 旦結合到正確的位點上，其酶促切割所述靶核酸。這種靶核酸的策略切割將破壞其指導編 碼蛋白質進行合成的能力。酶核酸已經結合并切割其核酸靶標后，所述酶核酸從該核酸釋 放，以尋找另一靶標并可以重復結合并切割新靶標。在特定實施方案種，目的酶核酸是設計來催化切割mRNA轉錄物以防止mRNA翻譯 的核酶(參閱，例如PCT國際公開W090/11364，1990年10月4日公開；Sarver等，1990， Science 247 =1222-1225 ；和美國專利號5，093，246)。盡管在位點特異性識別序列處切割mRNA的核酶可用于破壞特定mRNA，但是優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶在與靶mRNA 形成互補堿基對的側翼區(qū)域指出的位置處切割mRNA。唯一需要的是所述靶mRNA具有以 下兩堿基序列5' -UG-3 ‘。錘頭狀核酶的構建和產生為本領域所熟知并在HaselofT 和Gerlach，1988，Nature, 334 585-591中有更詳盡的描述。本公開內容的核酶也包括 RNA內切核糖核酸酶(下文稱“Cech-類型核酶”)，如在嗜熱四膜蟲中天然存在并已經 被廣泛描述的一種酶(稱作IVS或L-19IVSRNA)(參閱，例如，Zaug，等，1984，Science, 224 574-578 ；Zaug 和 Cech，1986，Science,231 :470_475 ；Zaug,等，1986，Nature,324 429-433 ；UniversityPatents Inc.的國際專利申請?zhí)?W088/04300 ；Been 和 Cech, 1986， Cell,47 207-216)。在另一特定實施方案中，主題酶核酸是DNA酶。DNA酶整合了反義和核酶技術的 一些機械學特征。設計DNA酶，使得它們識別特定靶核酸序列，十分像反義寡核苷酸，然而 更像核酶，它們催化性并特異性切割靶核酸。簡言之，為了設計特異性識別并切割靶核酸的 理想DNA酶，本領域技術人員必須首先鑒定獨特的靶序列。優(yōu)選地，獨特地或大體上序列是 富含G/C的大約18到22個核苷酸。高G/C含量幫助保證DNA酶與靶序列之間更強的相互 作用。當合成所述DNA酶時，將靶定酶到信息上的特異性反義識別序列被分開，使得其包含 DNA酶的兩個臂，并且所述DNA酶環(huán)置于所述兩個特異性臂之間。制備和施用DNA酶的方法 可見于例如美國專利號6，110,462中。在某些實施方案中，本公開內容的核酸治療劑長度可以在12到200個核苷酸之 間。在一個實施方案中，本公開內容的示例性酶核酸化合物長度在15到50個核苷酸之間， 包括例如長度在25到40個核苷酸之間(例如參閱Jarvis等，1996，J. Biol. Chem.，271， 29107-29112)。在另一實施方案中，本公開內容的示例性反義分子長度在15到75個核 苷酸之間，包括例如長度在20到35個核苷酸之間(參閱例如Woolf等，1992，PNAS.，89， 7305-7309 ；Milner 等，1997，Nature Biotechnology, 15，537-541)。在另一實施方案中，本 公開內容的示例性siRNA長度在20到27個核苷酸之間，包括例如長度在21到23個核苷 酸之間。本領域技術人員將認識到所有需要的是主題核酸治療劑的長度和構型足夠并適合 催化此處涵蓋的反應。本公開內容的核酸治療劑的長度不限于所述的一般極限。III.核酸靶位點可以如Draper 等 30W0 93/23569 ；Sullivan 等，WO 93/23057 ；Thompson 等，WO 94/02595 ；Draper 等，WO 95/04818 ；McSwiggen 等，美國專利號 5，525，468 中描述來確定本 公開內容的有用的核酸化合物(例如，反義核酸、dsRNA和酶核酸化合物)的靶標。其它實 例包括疾病相關基因表達滅活的以下PCT申請WO 95/23225,WO 95/13380,WO 94/02595。 此處并非重復那些文件中提供的指導，下文提供了這些方法的特定實例，不限于本領域中 的那些。如那些申請中描述來設計這些靶標的酶核酸化合物、siRNA和反義，并同樣如所述 來合成以在體外和體內進行檢測。例如，使用計算機折疊算法來篩選人Ephrin 82和/或 EphB4RNA的序列的最佳核酸靶標位點。鑒定了潛在的核酸結合/切割位點。例如，對于本 公開內容的酶核酸化合物，通過計算機折疊(Jaeger等，1989Proc. Natl Acad. Sci. USA,86, 7706)分別對所述核酸化合物進行了分析，以評估所述序列是否折疊成正確的二級結構。如 在結合臂與催化中心之間具有不利分子內相互作用的那些核酸化合物可以不予考慮。
鑒定了目的核酸(例如，反義、RNAi和/或酶核酸化合物)結合/切割位點并將其 設計以退火至核酸靶標(例如Ephrin B2和/或EphB4)中的多個位點。本公開內容的酶 核酸化合物的結合臂與上述靶位點序列互補。設計反義和RNAi序列，以與所述核酸靶標具 有部分或完全互補性?？苫瘜W合成所述核酸化合物。所用的合成方法遵循如下文及Usman 等，1987J Am. Chem. Soc. , 109, 7845 ；Scaringe 等，1990 Nucleic Acids Res.，18，5433 ； 和 Wincott 等，1995 Nucleic Acids Res. 23，2677-2684 ;Caruthers 等，1992，Methods in Enzymology 211,3-19中所述的用于正常DNA/RNA合成的程序。此外，預計具有CpG基序的核酸治療劑引起非特異性免疫應答的可能性增加。通 常，CpG基序包括與5’方向的一個或更多個嘌呤及3’方向的一個或更多個嘧啶相鄰的 CG(胞嘧啶-鳥苷)。在本領域中可獲得已知CpG基序的列表。將選擇優(yōu)選的核酸療法，以 對靶基因具有選擇性效應(可能影響其它緊密相關的基因)，而不觸發(fā)全身免疫應答。通過 避免具有CpG基序的核酸治療劑，降低特定核酸將觸發(fā)免疫應答的可能性是可能的。IV.核酸治療劑的合成使用自動化方法合成長度超過100個核苷酸的核酸是困難的，并且這些分子的治 療成本令人望而卻步。在本公開內容中，小核酸基序(小是指長度少于約100個核苷酸，優(yōu) 選長度少于約80個核苷酸，并更優(yōu)選長度少于約50個核苷酸的核酸基序(例如，反義寡核 苷酸、酶核酸和RNAi構建體))優(yōu)選用于外源遞送。這些分子的簡單結構增強了核酸侵入 RNA結構靶區(qū)域的能力。化學合成本公開內容的示例性分子，并且可類似地合成其它分子。為了說明，如 Caruthers 等，1992，Methods in Enzymology 211,3-19, Thompson 等，國際 PCT 公布號 WO 99/54459，Wincott 等，1995，NucleicAcids Res.23，2677-2684，Wincott 等，1997，Methods Mol. Bio.，74，59，Brennan 等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，和 Brennan，美國專利 號6，001，311中所述，使用本領域已知的方案合成寡核苷酸(例如，DNA)。寡核苷酸的合 成利用常見的核酸保護和偶聯(lián)基團，如5'末端的二甲氧基三苯甲基，和3'末端的亞磷酰 胺。在非限制性實例中，在394 AppliedBiosystems, Inc.合成儀上，以2' 甲基化核 苷酸的2. 5分鐘偶聯(lián)步驟和2' _脫氧核苷酸的45秒偶聯(lián)步驟進行小規(guī)模合成?；蛘?，可 在96孔板合成儀(如由Protogene (Palo Alto, CA)生產的儀器)上，對循環(huán)做最小修改后 進行合成。任選地，可分別合成本公開內容的核酸化合物，并且例如通過連接在合成 后連接在一起(Moore 等，1992，Science 256，9923 ；Draper 等，國際 PCT 公布號 WO 93/23569 ;Shabarova 等，1991， Nucleic Acids Research 19，4247 ;Bellon 等，1997， Nucleosides&Nucleotides,16,951 ；Bellon 等，1997, Bioconj ugate Chem. 8,204)。優(yōu)選地，廣泛修飾本公開內容的核酸化合物，以通過用核酸酶抗性基團，例如 2'-氨基、2' -C-烯丙基、2'-氟、2' -0-甲基、2' -H進行修飾來提高穩(wěn)定性(對于 綜述，參閱 Usman 和 Cedergren，1992，TIBS 17，34 ;Usman 等，1994，Nucleic Acids Symp. Ser.31，163)。使用普通方法通過凝膠電泳來純化核酶或通過高壓液相層析(HPLC;見 Wincott等，上文，此處其整體引入作為參考)來純化核酶，并在水中將其重懸浮。V.優(yōu)化核酸化合物的活性具有修飾(例如，堿基、糖和/或磷酸)的核酸化合物可防止被血清核糖核酸酶降解，并由此提高它們的效能。本領域中有若干實例描述糖、堿基和磷酸修飾，其可被引 入核酸化合物，顯著提高它們的核酸酶穩(wěn)定性和功效。例如，通過用核酸酶抗性基團，例如 2'-氨基、2' -C-烯丙基、2'-氟、2' -0-甲基、2' -H、核苷酸堿基修飾來修飾寡核苷 酸，以提高穩(wěn)定性和/或增強生物活性(對于綜述，參閱Usman和Cedergren，1992，TIBS 17, 34 ；Usman 等，1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31,163 ；Burgin 等，1996, Biochemistry, 35，14090)。已經在本領域中廣泛描述了核酸化合物的糖修飾(參閱Eckstein等，PCT公 布號 WO 92/07065 ；Perrault 等 Nature, 1990，344，565-568 ；Pieken 等 Science, 1991，253， 314-317 ；Usman 和 Cedergren, Trends in Biochem. Sci. ,1992,17,334-339 ；Usman 等 PCT 公布號 W093/15187 ；Sproat，美國專利號 5，334，711 和 Beigelman 等，1995，J. Biol. Chem.， 270,25702 ；Beigelman 等，PCT 公布號 WO 97/26270 ；Beigelman 等，美國專利號 5，716，824 ； Usman 等，美國專利號 5，627，053 ；Woolf 等，PCT 公布號 WO 98/13526 ；Thompson 等，在 1998 年 4 月 20 日提交的 U. S. S No. 60/082，404 ；Karpeisky 等，1998，Tetrahedron Lett.，39， 1131 ；Earnshaw和 Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic acid Sciences), 48, 39—55 ；Verma和 Eckstein, 1998，Annu. Rev. Biochem.，67，99-134 ；和 Burlina 等，1997，Bioorg. Med. Chem.， 5，1999-2010)。類似的修飾可用于修飾本公開內容的核酸化合物。雖然用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和/或5'-甲基膦酸酯鍵進行寡核苷酸核苷酸間 鍵的化學修飾提高了穩(wěn)定性，但過度修飾可產生毒性。因此，當設計核酸化合物時，應評估 這些核苷酸間鍵的量并適當將其降到最少。這些鍵濃度的降低應降低毒性，引起這些分子 的功效提高并且特異性更高。在一個實施方案中，本公開內容的核酸化合物包括一個或更多個G-夾環(huán)核苷 酸。G-夾環(huán)核苷酸是被修飾的胞嘧啶類似物，其中所述修飾賦予雙鏈體內互補性鳥嘌呤 Watson-Crick 和 Hoogsteen 面形成氫鍵的能力，參閱例如，Lin 和 Matteucci，1998，J. Am. Chem. Soc.，120,8531-8532。寡核苷酸內單個G-夾環(huán)類似物取代可導致當與互補性寡核苷 酸雜交時實質提高的螺旋熱穩(wěn)定性和錯配辨別。本公開內容的核酸化合物中這些核苷酸的 包含導致與核酸靶標的親和力和特異性增強。在另一實施方案中，本公開內容的核酸化合 物包括一個或更多個LNA(鎖定核酸)核苷酸，如2' ,4' -C亞甲基二環(huán)核苷酸(參閱例如 Wengel 等，PCT 公布號 WO 00/66604 和 W099/14226)。在另一實施方案中，本公開內容描述了靶向Ephrin B2和/或EphB4的核酸化合 物的綴合物和/或復合物。這種綴合物和/或復合物可用于促進核酸化合物遞送至生物系 統(tǒng)，如細胞中。本公開內容提供的綴合物和復合物可通過細胞膜轉移治療化合物、改變藥物 代謝動力學和/或調整本公開內容的核酸化合物的定位來賦予治療活性。本公開內容包括設計并合成用于跨細胞膜遞送分子的新綴合物和復合物，所述分 子包括但不限于小分子、脂類、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗體、毒素、帶負電荷的聚合物和 其它聚合物，例如蛋白質、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或多胺。通常，設計所述轉運子以 單獨使用或作為多組分系統(tǒng)的一部分使用，其具有或沒有可降解接頭。預計這些化合物能 在血清存在或缺失的情況下提高本公開內容核酸化合物的遞送和/或定位至來自不同組 織的許多細胞類型中(參閱Sullenger和Cech，美國專利號5，854，038)。此處所述的分子 的綴合物可經接頭附著到生物活性分子上，所述接頭是生物可降解的，如生物可降解的核 酸接頭分子。
如此處所用，術語“生物可降解核酸接頭分子”指設計用作生物可降解接頭以連 接一個分子與另一分子(例如，生物活性分子)的核酸化合物。可通過使用核糖核苷酸、 脫氧核糖核苷酸和化學修飾的核苷酸，例如2' -0-甲基、2'-氟、2'-氨基、2' -0-氨 基、2' -C-烯丙基、2' -0-烯丙基和其它2' _修飾的或堿基修飾的核苷酸的多種組合來 調節(jié)生物可降解核酸接頭分子的穩(wěn)定性。所述生物可降解核酸接頭分子可以是二聚體、三 聚體、四聚體或更長的核酸化合物，例如長度約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或20個核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷連接，例如氨基磷酸酯或磷酸 二酯鍵的單個核苷酸。所述生物可降解核酸接頭分子也可包含核酸骨架、核酸糖，或核酸堿 基修飾。如此處所用，術語“生物可降解的，，指生物系統(tǒng)中的降解，例如酶促降解或化學降 解。外源遞送的治療性核酸化合物，如此處所述的分子在細胞內最理想為穩(wěn)定的，直 至靶RNA的翻譯已被抑制到足以降低不想要的蛋白質的水平。該時間期間根據疾病狀態(tài)為 數小時到數天之間。這些核酸化合物應該對核酸酶具有抗性，以作為有效的細胞內治療劑 起作用。在本公開內容和本領域中所述的核酸化合物的化學合成的改進已經增強了通過引 入核苷酸修飾來修飾核酸化合物以如上所述提高它們的核酸酶穩(wěn)定性的能力。在另一方面，所述核酸化合物包含5'和/或3'帽結構?！懊苯Y構”指已經 整合到寡核苷酸任一末端的化學修飾(參閱例如Wincott等，W097/26270)。這些末 端修飾保護核酸化合物免受外切核酸酶的降解，并可幫助在細胞內的遞送和/或定 位。所述帽子可存在于5'末端(5'帽子)或3'末端(3'帽子)或存在于兩個末 端。在非限制性實例中，所述5'帽子包括反向的無堿基殘基(部分)、4' ,5'-亞 甲基核苷酸；1- ( β -D-erythrofuranosyl)核苷酸、4 ‘-硫代核苷酸、碳環(huán)核苷酸；1， 5-脫水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α -核苷酸；修飾的堿基核苷酸；二硫代磷酸酯連接； threo-pentofuranosyl核苷酸；無環(huán)3 ‘，4' -seco核苷酸；無環(huán)3，4-二羥基丁基核 苷酸；無環(huán)3，5_ 二羥基戊基核苷酸、3' -3'-反向核苷酸部分；3' -3'-反向無堿 基部分；‘-2'-反向核苷酸部分；3' -2'-反向無堿基部分；1，4_磷酸丁二醇； 3'-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二硫 代磷酸酯；或橋或非橋甲基膦酸酯部分(對于更多細節(jié)參閱Wincott等，PCT
發(fā)明者A·K·索德, P·吉爾, V·卡拉斯諾佩洛夫 申請人:瓦斯基因治療公司;德克薩斯州大學系統(tǒng)董事會