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適于選擇產(chǎn)生目標(biāo)多肽的文庫克隆的表達(dá)克隆方法

文檔序號:528849閱讀:484來源:國知局

專利名稱::適于選擇產(chǎn)生目標(biāo)多肽的文庫克隆的表達(dá)克隆方法適于選擇產(chǎn)生目標(biāo)多肽的文庫克隆的表達(dá)克隆方法序列列表與保藏的微生物序列列表本發(fā)明包含序列列表。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及適于篩選可產(chǎn)生目標(biāo)多肽的文庫克隆的表達(dá)克隆方法。
背景技術(shù)
:已經(jīng)公開了幾種在酵母中構(gòu)建目標(biāo)多核苷酸序列文庫的方法,其中在用選擇的多核苷酸轉(zhuǎn)化工業(yè)相關(guān)的絲狀真菌宿主細(xì)胞之前,在酵母中篩選文庫。但是通常地,當(dāng)轉(zhuǎn)化進(jìn)入與生產(chǎn)相關(guān)的絲狀真菌細(xì)胞中時(shí),通過在酵母或細(xì)菌中篩選而鑒定的多核苷酸序列不能表達(dá)或者在低水平表達(dá)。這可以歸于多個(gè)原因,包括密碼子用途的差別、mRNA水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)位裝置、翻譯后修飾機(jī)制(例如,半胱氨酸橋、糖基化和?;J?等。A.Aleksenko和A.J.Clutterbuck(1997.FungalGeneticsandBiology21:373-387)公開了自主復(fù)制載體或自主復(fù)制序列(ARS)用于基因克隆和表達(dá)研究的用途。AMA1(在曲霉屬中自主維持)是所述質(zhì)粒復(fù)制元件之一。它由基因組重復(fù)指定的MATE1(活動的曲霉屬轉(zhuǎn)化增強(qiáng)子)的兩個(gè)反向拷貝組成,兩個(gè)拷貝由0.3kb中心間隔序列分隔。AMA1促進(jìn)質(zhì)粒復(fù)制,同時(shí)很少進(jìn)行重排、多聚化或染色體整合?;贏MA1的質(zhì)粒為在絲狀真菌中進(jìn)行基因克隆和文庫生成提供兩個(gè)優(yōu)勢。第一個(gè)是轉(zhuǎn)化的高效率,其可增加潛在的文庫大小。第二,通過為基因表達(dá)提供相當(dāng)穩(wěn)定而標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境,轉(zhuǎn)化體的性質(zhì)將是一致的(WO00/24883;NovozymesA/S)。WO94/11523和WO01/51646公開了包含完全受損的共有Kozak或"殘缺"的共有Kozak序列的表達(dá)載體。WO03/070956公開了用于表達(dá)克隆的克隆載體,其包含AMA-1序列和殘缺的翻譯啟動序列。如在絲狀真菌中的表達(dá)克隆目前是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法的一部分,然而這種方法的使用是工業(yè)相關(guān)的,效率、性能或經(jīng)濟(jì)上即使微小的增加也是非常令人感興趣的。發(fā)明概述理想的是在絲狀真菌宿主細(xì)胞中篩選多核苷酸文庫,獲得具有目標(biāo)性質(zhì)的多肽,篩選方式可以快速而簡單地表征獲得的多肽。目前通過在轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主細(xì)胞后減少表達(dá)載體拷貝數(shù)的變化來進(jìn)一步改進(jìn)WO03/070956中描述的方法。這已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明,通過降低表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組的非同源重組的頻率而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于產(chǎn)生目標(biāo)重組多肽的方法,所述方法包括如下步驟a)提供編碼一種或多種目標(biāo)多肽的多核苷酸文庫,其中所述文庫在包含至少下述元件的表達(dá)克隆載體中制備i)編碼選擇性標(biāo)記的多核苷酸;ii)真菌復(fù)制起始序列,優(yōu)選自主復(fù)制序歹'J(ARS);和iii)以連續(xù)順序包含下述的多核苷酸源自真菌細(xì)胞的啟動子、可將所述文庫克隆入其中的克隆位點(diǎn),和轉(zhuǎn)錄終止子;b)用所述文庫轉(zhuǎn)化親本絲狀真菌宿主細(xì)胞的突變體,其中與親本相比,突變體中非同源重組的頻率降低;c)在適合表達(dá)所述多核苦酸文庫的條件下培養(yǎng)(b)中獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主纟田月包;和d)選擇可產(chǎn)生目標(biāo)多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用表達(dá)克隆方法時(shí)的一個(gè)潛在問題,即在將文此使篩選過程更加困難。幾個(gè)因素可能產(chǎn)生這種觀察到的不均勻表達(dá)水平。以前已經(jīng)通過如上所述改進(jìn)組成表達(dá)載體的元件而解決了這個(gè)問題,例如通過將AMAl-序列并入載體或通過使用殘缺的"共有"Kozak序列。根據(jù)本發(fā)明,現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn),通過降低表達(dá)宿主細(xì)胞中非同源重組的頻率可獲得顯著改善。在一個(gè)方面,本發(fā)明因此涉及用于產(chǎn)生目標(biāo)重組多肽的方法,所述方法包括步驟a)提供編碼一種或多種目標(biāo)多肽的多核苷酸文庫,其中在包含至少下述元件的表達(dá)克隆載體中制備文庫i)編碼選擇性標(biāo)記的多核苷酸;ii)真菌復(fù)制起始序列,優(yōu)選自主復(fù)制序列(ARS);和iii)以連續(xù)順序包含下述的多核苷酸源自真菌細(xì)胞的啟動子、可將文庫克隆入其中的克隆位點(diǎn),和轉(zhuǎn)錄終止子;b)用所述文庫轉(zhuǎn)化親本絲狀真菌宿主細(xì)胞的突變體,其中與親本相比,突變體中非同源重組的頻率降低;c)在適合表達(dá)所述多核苷酸文庫的條件下培養(yǎng)(b)中獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)"包;和d)選擇可產(chǎn)生目標(biāo)多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在篩選轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后,編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸可以可選地分離自步驟(d)的宿主細(xì)胞,以鑒定突變,然后重新將突變基因轉(zhuǎn)化進(jìn)干凈的宿主細(xì)胞中,確保沒有發(fā)生來自其他變體的交叉污染。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中,在適于產(chǎn)生多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中,并在篩選多拷貝選擇性標(biāo)記的條件下,使用本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)細(xì)胞。例如,可以在24、96、384或1536孔4效孔板中,通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng),和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?;虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的成分制備(例如,在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中,該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中,其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收。可以使用本領(lǐng)域已知的對于所述多肽是特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如,酶試驗(yàn)(enzymeassay)可用于測定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如,多肽可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收,所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽,所述方法包括但不限于層析(例如,離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如,制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如,硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見,例如,尸rafe/"Pwr折c加'o",J.-C.Janson和LarsRyden編,VCHPublishers,NewYork,1989)。非同源重組在真核生物中,由重組而整合進(jìn)基因組可以通過兩種不同的途徑發(fā)生一個(gè)是通過同源重組(HR),一個(gè)是通過非同源重組(NHR)。在酵母中,優(yōu)選的條件是HR,而在絲狀真菌中大多數(shù)整合事件通過NHR發(fā)生。WO02/052026公開了將DNA序列整合進(jìn)基因組的靶向效率提高的釀酒酵母OSacc^ara^ycescewv/w'ae)突變體。這些突變體缺乏參與NHR的KU70。已經(jīng)分離了缺乏KU70的哺乳動物細(xì)胞(Pierce等,GenesandDevelopment,2001,15:3237-3242),然而,這種突變體未表現(xiàn)出與增加同源定向靶標(biāo)整合相同的性狀。在絲狀真菌黑曲霉中,KU70中的突變導(dǎo)致向基因組中靶向整合的效率提高(WO2005/095624)。根據(jù)酵母研究,已經(jīng)揭示了NHR途徑中的幾個(gè)基因KU70、KU80、RAD50、MRE11、XRS2、LIG4和SIR4(vandenBosch等,2002,Biol.Chem.383:873-892和Allen等,2003,Mol.CancerRes.1:913-920)。也可參見WO02/052026中23頁的表2。還已經(jīng)在絲狀真菌中鑒定了這些基因的功能等同物,WO2005/095624,其描述了來自黑曲霉的KU70和KU80同源物/刷和/z^S,和Ishibashi,K.,Suzuki,K.,Ando,Y.,Takakura,C.和Inoue,H.,2006,PNAS,USA.103(40):14871-14876,其公開了脈孢菌中的MUS-53(LIG4同源物)。特別地,根據(jù)本發(fā)明的絲狀真菌宿主細(xì)胞是導(dǎo)致非同源重組的頻率降低的突變體。與NHR有關(guān)的組件包含酵母KU70、KU80、RAD50、MREII、XRS2、LIG4或SIR4的絲狀真菌功能等同物,或相關(guān)組件。因?yàn)榛虻拿ㄔ谏矬w之間不同,所以本文定義的功能等同物或功能和/或其功能性片段,能執(zhí)行(功能,不是數(shù)量)至少酵母基因KU70、KU80、RAD50、MREII、XRS2、LIG4或SIR4的至少一種功能。這些基因中一些基因的功能等同物已經(jīng)在絲狀真菌中鑒定,特別是在曲霉屬(hdfA和hdffl)和脈孢菌(MUS-53),如上所述。因此在一個(gè)實(shí)施方案中,突變體絲狀真菌宿主減少或不表達(dá)或者缺乏至少一個(gè)內(nèi)源基因,所述基因是參與NHR途徑的酵母基因之一的功能等同物,所述酵母基因選自下組KU70、KU80、RAD50、MREII、XRS2、LIG4和SIR4。這還包括相同基因的變體,其產(chǎn)生無活性或活性降低的蛋白質(zhì)。更特別地,基因選自下組KU70和KU80,和特別是來自米曲霉或黑曲霉的功能等同物。在一個(gè)實(shí)施方案中,基因是hdfA和hdffl或其同源物。在一個(gè)優(yōu)選的方面,KU70等同物包含與SEQIDNO:14具有至少70%,優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少85%,最優(yōu)選至少90%,和甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面,KU70等同物包含SEQIDNO:14的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面,KU70等同物由SEQIDNO:14的核香酸序列組成。在另一個(gè)優(yōu)選的方面,KU80等同物包含與SEQIDNO:15具有至少70%,優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少85%,最優(yōu)選至少90%,和甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面,KU70等同物包含SEQIDNO:15的核苦酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面,KU70等同物由SEQIDNO:15的核苷酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面,KU70等同物包含與SEQIDNO:16具有至少70%,優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少85%,最優(yōu)選至少90%,和甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面,KU70等同物包含SEQIDNO:16的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面,KU70等同物由SEQIDNO:16的核苦酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面,KU80等同物包含與SEQIDNO:17具有至少70%,優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少85%,最優(yōu)選至少90%,和甚至最優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列。在最優(yōu)選的方面,KU70等同物包含SEQIDNO:17的核苷酸序列。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面,KU70等同物由SEQIDNO:17的核香酸序列組成。根據(jù)本發(fā)明,將文庫克隆進(jìn)表達(dá)克隆載體,然后轉(zhuǎn)化進(jìn)突變體絲狀真菌中,所述突變體在至少一個(gè)參與NHR途徑的內(nèi)源基因中進(jìn)行修飾,與親本絲狀真菌相比,降低突變體中非同源重組的頻率?,F(xiàn)在已經(jīng)表明,NHR頻率的降低顯著改善了表達(dá)克隆的穩(wěn)定性,并產(chǎn)生更均勻的表達(dá)水平,確保更穩(wěn)定地篩選目標(biāo)克隆。術(shù)語"修飾"在本文中定義為基因或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件中一個(gè)或多個(gè)核苷酸的導(dǎo)入、取代或去除,以及參與NHR途徑的至少一個(gè)內(nèi)源基因的基因破壞、基因轉(zhuǎn)化、基因缺失,或隨機(jī)或特異性突變。這些基因的缺失可以是部分或全部缺失。修飾導(dǎo)致參與NHR途徑的至少一個(gè)內(nèi)源基因的表達(dá)降低或消除。在一個(gè)優(yōu)選的方面,修飾導(dǎo)致選自下組的至少一個(gè)基因的表達(dá)的降低或消除KU70、KU80、RAD50、MREII、XRS2、LIG4或SIR4,或它們的功能等同物。這種修飾導(dǎo)致缺陷型絲狀真菌宿主細(xì)胞。術(shù)語"缺陷型"在本文中定義為絲狀真菌突變體菌抹,當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí),與親本絲狀真菌菌抹相比,產(chǎn)生的參與NHR途徑的基因產(chǎn)物的量不可檢測,或者,當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí),與親本絲狀真菌菌抹相比,產(chǎn)生量優(yōu)選至少減少25%,更優(yōu)選至少減少50%,甚至更優(yōu)選減少至少75%,和最優(yōu)選減少至少95%。由本發(fā)明的絲狀真菌突變體菌林產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的水平可以使用本文所述或本領(lǐng)域已知的方法確定??梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的方法通過減少或消除參與NHR途徑的基因,例如,插入、破壞、取代或缺失來構(gòu)建"缺陷型"絲狀真菌突變體菌抹。在一個(gè)優(yōu)選的方面,所述核苷酸序列是失活的。待修飾或失活的核苷酸序列可以是,例如,編碼區(qū)或表達(dá)編碼區(qū)必需的調(diào)節(jié)元件。這種調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實(shí)例可以是啟動子序列或其功能部分,即,足以影響所述基因表達(dá)的部分。用于可能的修飾的其它調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活子。可以通過基因缺失技術(shù)構(gòu)建絲狀真菌突變體菌林,消除或降低參與NHR途徑的至少一個(gè)基因的表達(dá)。基因缺失技術(shù)能部分或全部去除基因,從而消除它們的表達(dá)。在這種方法中,基因的缺失可以使用質(zhì)粒通過同源重組而完成,所述質(zhì)粒經(jīng)過構(gòu)建,連續(xù)地包含基因側(cè)翼的5'和3,區(qū)域。用于下調(diào)指定列置換,所述修飾序列的表達(dá)產(chǎn)物沒有功能。缺失和置換優(yōu)選通過EP0357127Bl中所述基因置換技術(shù)進(jìn)行。也可以通過在基因或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件中導(dǎo)入、取代和/或去除一個(gè)或多個(gè)核苷酸而構(gòu)建絲狀真菌突變體菌抹。例如,核香酸可以插入或去除,從而導(dǎo)致終止密碼子的導(dǎo)入、起始密碼子的去除,或開放閱讀框的移碼。可依照本領(lǐng)域已知的方法通過定點(diǎn)誘變或PCR-產(chǎn)生的誘變來實(shí)現(xiàn)這樣的修飾。參見,例如Botstein和Shortle,1985,5We膨229:4719;Lo等,1985,尸raceW,o/V/zeA^ow""CG(iew3/<q/\SWe"cayt/S^81:2285;Higuchi等,1988,/dd^16:7351;Shimada,1996,她仇Mo/.腸/.57:157;Ho等1989,G匿77:61;Horton等,1989,G騰77:61;及Sarkar和Sommer,1990,所o7fec/2m々w&s8:404。也可通過基因破壞技術(shù)通過在目的基因中插入含有與所述基因同源的核酸片段的整合質(zhì)粒(這會產(chǎn)生同源性區(qū)域的重復(fù)(duplication)并將載體DNA并入重復(fù)的區(qū)域之間)來構(gòu)建絲狀真菌突變體菌抹。如果插入的載體將基因的啟動子與編碼區(qū)域分割,或者阻斷編碼序列而產(chǎn)生無功能的基因產(chǎn)物,則這種基因破壞能消除基因表達(dá)。破壞構(gòu)建體可以僅僅是伴有與基因同源的5'和3,區(qū)域的選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記可以鑒別包含已破壞基因的轉(zhuǎn)化體。也可以通過基因轉(zhuǎn)化過程(參見,例如,Iglesias和Trautner,1983,Mo/ecw/"rGewera/189:73-76)構(gòu)建絲狀真菌突變體菌抹。例如,在基因轉(zhuǎn)化方法中,將對應(yīng)于基因的核苷酸序列在體外突變,產(chǎn)生缺陷型核苷酸序列,然后將所述缺陷型序列轉(zhuǎn)化進(jìn)親本絲狀真菌菌^^,產(chǎn)生缺陷型基因。通過同源重組,缺陷型核苦酸序列替換內(nèi)源基因。理想的是,缺陷型基因或基因片段還包含標(biāo)記,其可用于篩選包含缺陷型基因的轉(zhuǎn)化體。還可以使用與基因的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列,通過已建立的反義技術(shù)構(gòu)建絲狀真菌突變體菌抹(Parish和Stoker,1997,F(xiàn)£MSM/craWo/ogyZ^故ra154:151-157)。更特定地,由絲狀真菌菌抹進(jìn)行的基因的表達(dá)可以通過導(dǎo)入與基因的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列而降低或消除,所述導(dǎo)入的序列可以在菌抹中轉(zhuǎn)錄,并且能與菌林中產(chǎn)生的mRNA雜交。在允許互補(bǔ)反義核苷酸與m函A雜交的條件下,因此翻譯的蛋白質(zhì)的量降低或消除??梢允褂帽绢I(lǐng)域^^知的方法,包括,但不限于,化學(xué)突變(參見,例如,Hopwood,r/zeZso/加'owo/M齒wtoinMd/zocfeM/craZ^,o/ogy(J.R.Norris和D.W.Ribbons編)363-433頁,AcademicPress,NewYork,1970)和轉(zhuǎn)座(參見,例如,Youngman等,1983,尸rac.Ato/.力cad751480:2305-2309),通過向親本細(xì)胞施以誘變,并且選擇其中已將所述基因的表達(dá)減少或消除的突變體菌林來進(jìn)行基因修飾。誘變可能是特異性的或隨機(jī)的,可以通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行,通過使用合適的寡核苷酸進(jìn)行,或通過將所迷DNA序列進(jìn)行PCR產(chǎn)生的誘變。此外,可以通過使用這些誘變劑的任何組合來進(jìn)行誘變。適合于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、N-曱基-N,-亞硝基胍(NTG)、O-曱基羥胺、亞硝酸、乙基曱烷磺酸酯(ethylmethanesulphonate)(EMS)、亞硫酸氫鈉、曱酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些試劑時(shí),通常通過如下方法來進(jìn)行所述誘變在合適條件下存在優(yōu)選的誘變劑時(shí)孵育待誘變的親本菌林,并篩選和/或選擇顯示基因表達(dá)減少的或無基因表達(dá)的突變體。重組頻率的確定可以確定重組頻率,以確定與野生型相比,突變體中的NHR/HR的比例是否發(fā)生了改變??梢曰救鐚?shí)施例4中所述或者如WO2005/095624第6-7頁所述確定NHR效率。文庫文庫根據(jù)本發(fā)明編碼目標(biāo)多肽,其對于絲狀真菌宿主細(xì)胞可能是天然或異源的。編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸可能源自能產(chǎn)生目標(biāo)多肽的任何生物體,包括多細(xì)胞生物體和微生物例如細(xì)菌和真菌。多核香酸的起源還可能是合成的,意味著文庫可以由例如編碼相同多肽的密碼子優(yōu)化的變體組成,或者文庫可以包含通過本領(lǐng)域已知的改組技術(shù)獲得的變體。真菌復(fù)制起始序列如本文所使用的,術(shù)語"真菌復(fù)制起始序列"定義為核酸序列,其能支持染色體外分子,例如,DNA載體如質(zhì)粒,在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的自主復(fù)制,通常DNA-載體不發(fā)生結(jié)構(gòu)重排,或者不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組。復(fù)制起始序列可能是任何來源,只要它能介導(dǎo)真菌細(xì)胞中的復(fù)制啟動活性。例如復(fù)制起始序列可能是人類起源的調(diào)聚物,其賦予質(zhì)粒在曲霉中復(fù)制的能力(Aleksenko和Ivanova,Mol.Gen.Genet.260(1998)159-164)。優(yōu)選地,復(fù)制起始序列獲得自絲狀真菌細(xì)胞,更優(yōu)選曲霉屬、鐮孢屬或鏈格孢屬04/feman'a)的菌林,并且甚至更優(yōu)選地,構(gòu)巢曲霉、米曲霉、黑曲霉、尖鐮孢或」/feman'aa/加齒的菌抹??梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的方法鑒定真菌復(fù)制起始序列。例如,可以在源自所述生物體的基因組片段中將能支持酵母中的自主復(fù)制的序列鑒定為所述序列(Balance和Turner,Gene,36(1985),321-331),這是在絲狀真菌細(xì)胞中自主復(fù)制能力的表征。還可以通過用期望的質(zhì)粒復(fù)制基因轉(zhuǎn)化真菌并篩選具有不規(guī)則形狀的菌落,確定指定序列在真菌中的復(fù)制啟動活性,其中不規(guī)則形狀說明出現(xiàn)扇形質(zhì)粒丟失,從而篩選在質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的基因時(shí),能導(dǎo)致在選擇性培養(yǎng)基上不能生長(Gems等,Gene,98(1991)61-67)。以這種方法分離了AMA1。分離復(fù)制起始序列的另一種方法是分離天然產(chǎn)生的質(zhì)粒(例如,如Tsuge等,Genetics146(1997)111-120針對j/^w"〃'"所公開的)。真菌復(fù)制起始序列的實(shí)例包括,但不限于,構(gòu)巢曲霉的ANSI和AMA1序列,例如,分別如Cullen,D.等(1987,NucleicAcidsRes.15:9163-9175)和Gems,D.等,(1991,Gene98:61-67)所述。優(yōu)選的實(shí)施方案涉及本發(fā)明的第一方面的方法,其中步驟(ii)的真菌復(fù)制起始序列包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所列的核酸序歹ll(要了解與這些序列有關(guān)的更詳細(xì)的內(nèi)容,請參閱WO00/24883SEQIDNO:1和2),或者是其功能性衍生物,優(yōu)選地,功能性衍生物與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少80%相同。術(shù)語"復(fù)制啟動活性,,在本文中以其常規(guī)含義使用,即表示序列能支持染色體外分子如質(zhì)?;駾NA載體,在真菌細(xì)胞中的自主復(fù)制。術(shù)語"沒有質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)重排,,在本文中用于表示不缺失質(zhì)粒的任何部分,或者將其插入質(zhì)粒的另一部分,也不向質(zhì)粒插入任何宿主基因組DNA。在本發(fā)明的方法中要使用的復(fù)制起始序列是與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的核酸序列至少50%相同的核苷酸序列,并且能啟動真菌細(xì)胞中的復(fù)制,或(a)或(b)的亞序列,其中取代能啟動真菌細(xì)胞中的復(fù)制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,核苦酸序列與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中的核苦酸序列具有的同一性程度應(yīng)該不變,優(yōu)選至少50%,更優(yōu)選至少60%,甚至更優(yōu)選至少70%,甚至更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%,并且最優(yōu)選至少97%(下文稱作"同源多核苷酸")。同源多核苷酸還包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的亞序列,其在真菌細(xì)胞中具有復(fù)制啟動活性。同一性參數(shù)"同一性"描述兩個(gè)氨基酸序列的相關(guān)性。就本發(fā)明而言,兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度通過使用來自EMBOSS軟件包(http:〃emboss.org)2.8,0版的Needle程序而確定。Needle程序執(zhí)行Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453中所述的全局比對算法。使用的取代矩陣為BLOSUM62,缺口開放罰分為10,和缺口延伸罰分為0.5。如下計(jì)算氨基酸序列("發(fā)明序列")和不同的氨基酸序列("外源序列")之間的同一性程度兩個(gè)序列比對中完全匹配的數(shù)目,除以"發(fā)明序列"的長度或"外源序列"的程度中最短的。結(jié)果用百分比同一性表示。當(dāng)"發(fā)明序列"和"外源序列"在重疊的相同位置具有相同的氨基酸殘基時(shí),即發(fā)生了完全匹配。序列的長度是序列中氨基酸殘基的數(shù)目。就本發(fā)明而言,兩個(gè)核苷酸序列之間的同一性程度通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman,1983,/VoceW"g^o/AeiV""owa/^4cacfem_yo/*SWewceWS^80:726-730),使用LASERGENETMMEGALIGNtm軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)確定,使用同一性表和下述多重比對參凄史缺口罰分10和缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)為K元組^3,缺口罰分=3,和窗口=20。用于分離或克隆核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的,包括從基因組DNA分離,從cDNA制備,或其組合。可通過例如使用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段,從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA進(jìn)4亍克隆(參見,例》口,Innis"a/.,1990,尸C7,'」GW^toM^/zoAJ/7///c""o",AcademicPress,NewYork)??梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法,比如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,復(fù)制起始序列具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所列的核酸序列,或其各自的功能性亞序列。例如,SEQIDNO:l的功能性亞序列是由SEQIDNO:1或SEQIDNO:2包含的核酸序列,除了從5,和/或3,末端缺失了一個(gè)或多個(gè)核苷酸。優(yōu)選地,亞序列包含至少100個(gè)核苷酸,更優(yōu)選至少1000個(gè)核苷酸,和最優(yōu)選至少2000個(gè)核苷酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中,SEQIDNO:1的亞序列包含至少SEQIDNO:2中所示的核苷酸序列。殘缺的翻譯啟動基因序列術(shù)語"翻譯啟動基因序列"在本文中定義為多肽編碼合適序列的開放閱讀框的啟動基因或起始密碼子緊接著(nextto)上游的十個(gè)核苷酸。啟動基因密碼子編碼氨基酸甲硫氨酸,所謂的"起始"密碼子。啟動基因密碼子通常為ATG,但是也可能是任何功能性起始密碼子如GTG。本領(lǐng)域公知的是,在RNA中,尿嘧咬(尿苷),U,取代脫氧核苷酸胸腺嘧啶(胸苷),T。在根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案中,如上所述的方法能通過使用下述序列作為表達(dá)載體上包含的標(biāo)記基因的翻譯啟動起始位點(diǎn)而改善。NYNNATGYNN(SEQIDNO:3)其中位置-3中的"Y"是嘧啶(胞啶或胸苷/尿苷),"N"是任何核苷酸,并且相對于標(biāo)記的起始密碼子"ATG,,(用粗體表示)的第一個(gè)核香酸而指定數(shù)字編號。術(shù)語"翻譯啟動基因序列"在本文中定義為多肽編碼核酸序列的開放閱讀框的啟動基因密碼子緊接著上游的十個(gè)核苷酸,其中啟動基因序列在-3位置包含T,并且在-1、-2和-4位置中的一個(gè)或多個(gè)包含T。因此,在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中,序列SEQIDNO:3在-3位置包含胸苷(尿苷),甚至更優(yōu)選地,序列SEQIDNO:3進(jìn)一步在位置-l、-2和-4中的一個(gè)或多個(gè)位置包含胸苷(尿苷)。術(shù)語"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型,其中將調(diào)控序列,例如,殘缺的翻譯啟動基因序列,置于相對于編碼序列的合適位置,使得調(diào)控序列指導(dǎo)由編碼序列編碼的多肽的表達(dá)。術(shù)語"編碼序列"在本文中定義為當(dāng)置于合適的調(diào)控序列的控制之下時(shí)轉(zhuǎn)錄為可翻譯成多肽的mRNA。編碼序列的邊界通常由下述密碼子確定位于mRNA的5'末端的開讀框起始處的起始密碼子,和位于mRNA開讀框的3,末端的終止密碼子。編碼序列可以包括,但不限于,基因組DNA、cDNA、半合成、合成和重組核酸序列。殘缺的翻譯序列導(dǎo)致編碼選擇性標(biāo)記的基因的翻譯不充分。當(dāng)在篩選多拷貝的選擇性標(biāo)記的條件下培養(yǎng)攜帶表達(dá)載體(包含編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸,其與第二個(gè)多核芬酸實(shí)際相連接,第二個(gè)多核普酸包含與編碼選擇性標(biāo)記的基因可操作連接的殘缺的翻譯啟動基因序列)的真菌宿主細(xì)胞時(shí),多肽編碼多核苷酸克隆進(jìn)載體的拷貝數(shù)也增加。術(shù)語"選擇性標(biāo)記"在本文中定義為基因,其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等,其允許簡單篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞中的選擇性標(biāo)記包括,但不限于,aw必(乙酰胺酶)、(鳥氨酸氨曱酰基轉(zhuǎn)移酶)、(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、/z;^B(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、m'al)(硝酸還原酶)(nitratereductase),;少K7(導(dǎo)'U青酸才亥香-5,-石粦酸脫羧酶)(orotidine-5,-phosphatedecarboxylase),(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和化pC(鄰氨基苯曱酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的am(iS和/^K7基因和吸7K《連霉菌0Sy^ptow;Kcas/zygnwco//cw"的6ar基因。這些選擇性標(biāo)記的功能性衍生物也是本發(fā)明的目標(biāo),特別是那些活性降低或穩(wěn)定性降低從而在不增加選擇性物質(zhì)濃度的情況下篩選更高拷貝數(shù)表達(dá)載體的功能性衍生物。因此,優(yōu)選的實(shí)施方案是第一方面的方法,其中步驟(i)的選擇性標(biāo)記選自下組標(biāo)記麵必、arg仏Zw、ZiygB、m'oD、,G、sC和印C;優(yōu)選地,步驟(i)的選擇性標(biāo)記是/;;K7或其功能性衍生物,更優(yōu)選地,步驟(i)的選擇性標(biāo)記是pyrG的功能性衍生物,其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代,和最優(yōu)選地,衍生物包含氨基酸取代T102N。數(shù)目。確定基因拷貝數(shù)的方法在本領(lǐng)域中已知,并且包括Southern分析、定量PCR或?qū)崟r(shí)PCR。真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選包含至少兩個(gè)拷貝,更優(yōu)選至少十個(gè)拷貝,甚至更優(yōu)選至少一百個(gè)拷貝,最優(yōu)選至少五百個(gè)拷貝,和甚至最優(yōu)選至少一千個(gè)拷貝的表達(dá)克隆載體。編碼多核苦酸的多肽目標(biāo)多肽對于目標(biāo)絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是天然的或異源的。術(shù)語"異源多肽,,在本文中定義為對宿主細(xì)胞不是天然的多肽,進(jìn)行了修飾以改變天然序列的天然多肽,或作為通過重組DNA技術(shù)對宿主細(xì)胞操作的結(jié)果其表達(dá)在量上改變的天然多肽。編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸可以源自能產(chǎn)生目標(biāo)多肽的任何生物體,包括多細(xì)胞生物體和微生物,例如細(xì)菌和真菌?;蛘叨嗪塑账峥梢允呛铣僧a(chǎn)生的多核苷酸,例如密碼子經(jīng)過優(yōu)化的多核苷酸或改組的多核香酸。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及第一方面的方法,其中步驟(a)的能產(chǎn)生一種或多種目標(biāo)多肽的生物體是真核生物,優(yōu)選地,真核生物是真菌,和最優(yōu)選為絲狀真菌。術(shù)語"多肽,,在本文的意思不是指特定長度的編碼產(chǎn)物,并且因此包含肽、寡肽和蛋白質(zhì)。優(yōu)選地,目標(biāo)多肽是酶、酶變體或其功能性衍生物,更優(yōu)選地,酶或酶變體是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶;和最優(yōu)選地,酶或酶變體是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氬酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。優(yōu)選蛋白質(zhì)是激素或激素變體或其功能性衍生物,受體或受體變體或其功能性衍生物,抗體或抗體變體或其功能性衍生物,或報(bào)道蛋白(reporter)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,所述多肽向胞外分泌。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中,多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中,多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、(3-半乳糖香酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苷酶、P-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。編碼目標(biāo)多肽的核酸序列可以獲得自任何原核、真核或其他來源。就本發(fā)明而言,用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語"獲得自",意思是多肽由所述來源產(chǎn)生,或由其中插入了來自所述來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。用于合成、分離或克隆編碼目的多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的,且包括從基因組DNA分離,從cDNA制備,或它們的組合??赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆目的多核苷酸。參見,例如,Innis等,1990,尸C7尸ratoc血'^GWcfetoM函o^sawd々p//cato",AcademicPress,NewYork??寺〔襟E可以涉及包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段的切除與分離,向載體分子中插入片段,和將重組載體并入突變芽孢桿菌屬細(xì)胞,其中將復(fù)制多個(gè)拷貝或克隆的核酸序列。DNA可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的,或它們的任意組合。在本發(fā)明的方法中,多肽也可以包括融合或雜合多肽,其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼一種多肽的核苷酸序列(或其部分)與編碼另一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合而產(chǎn)生融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的,且包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中,并且使融合多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的控制下。雜合多肽可以包含獲得自至少兩個(gè)不同多肽的部分或完整多肽序列的組合,其中一個(gè)或多個(gè)多肽對于突變體真菌細(xì)胞可以是異源的。一旦已經(jīng)篩選到可以更加本發(fā)明的方法產(chǎn)生目標(biāo)多肽的已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,則可以從篩選到的已轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞分離編碼多核苦酸,并且可以設(shè)計(jì)經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)。因此,優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一方面的方法,其中在步驟(d)后,從步驟(d)篩選到的已轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中分離編碼目標(biāo)多肽的多核普酸。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列可操作地連接,所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。表達(dá)應(yīng)理解為包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟,包括,但不限于,轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾,和分泌。"核酸構(gòu)建體,,在本文中定義為單鏈或雙鏈的核酸分子,其分離自天然存在的基因,或?qū)⑵湫揎椧员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有編碼目標(biāo)多肽的第二個(gè)多核苷酸和其表達(dá)所需的全部調(diào)控序列時(shí),術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語表達(dá)載體同義。可以用各種可提供多肽表達(dá)的方式進(jìn)一步操作編碼多肽的分離的多核苷酸。依賴于表達(dá)載體,在插入載體之前對核苷酸序列的操作可以是期望的或必需的。使用重組DNA方法用于修飾核苷酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域中公知。在本發(fā)明的方法中,核苷酸序列可以包含一個(gè)或多個(gè)天然的調(diào)控序列,或者一個(gè)或多個(gè)天然的調(diào)控序列可以用對于核苷酸序列是異源的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列取代,用于改善宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)。術(shù)語"調(diào)控序列,,在本文定義為包括利于表達(dá)目標(biāo)多肽或表達(dá)所必需的所有組分。各種調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的,或各種調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、本發(fā)明的殘缺的翻譯啟動序列、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況,調(diào)控序列包括翻譯啟動序列,和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可提供有用于導(dǎo)入特異性限制位點(diǎn)或克隆位點(diǎn)的接頭,所述特異性限制位點(diǎn)或克隆位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苦酸序列編碼區(qū)的連接。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列,其是由用于表達(dá)核苷酸序列的宿主細(xì)胞識別的核苦酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子區(qū)可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列,其包括突變的、截短的和雜合的啟動子,并可獲得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實(shí)例是從下述獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(i^/zowwcw脂'e/ze/)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/"力、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢(Fwsan'wwve恥"aww)淀粉葡糖苷酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787),以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體);和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在第一方面的特定實(shí)施方案中,步驟(iii)的啟動子是來自編碼來自公開與WO89/01969中的黑曲霉的基因(NA2)的中性淀粉酶的啟動子。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中,啟動子是NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)啟動子的未翻譯前導(dǎo)序列的雜合體)。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列,是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3'末端可"t喿作地連接??梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一方面的方法,其中步驟(iii)的轉(zhuǎn)錄終止子是來自黑曲霉的葡糖淀粉酶(AMG)編碼基因的終止子(Boel,E.;Hjort,I.;Svensson,B.;Norris,F.;Norris,K.E.;Fiil,N.P"GlucoamylasesGlandG2fromAspergillusnigeraresynthesizedfromtwodifferentbutcloselyrelatedmRNAs.EMBOJ.3:1097(1984》。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列,其是對于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5,-末端??梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。優(yōu)選的實(shí)施方案涉及第一方面的方法,其中啟動子,位于步驟(iii)的克隆位點(diǎn)上游,與編碼來自構(gòu)巢曲霉的丙糖磷酸異構(gòu)酶的前導(dǎo)肽的多核苷酸可操作地連接(McknightGL.,O'HaraRJ.,ParkerM丄.,"NucleotidesequenceofthetriosephosphateisomerasegenefromAspergillusnidulans:Implicationsforadifferentiallossofintrons",Cell46:143-147(1986))。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列,其是與核苷酸序列的3'末端可操作地連接的序列,并且在轉(zhuǎn)錄時(shí),宿主細(xì)胞將其識別為將聚腺普殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號??梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苦酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū),其編碼與多肽的氨基末端相聯(lián)的氨基酸序列,并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5,端可固有地包含信號肽編碼區(qū),其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中??晒┻x擇的是,編碼序列5'端可含有對于所述編碼序列異源的信號肽編碼區(qū)。異源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不天然地含有信號肽編碼區(qū)時(shí)可能是必需的?;蛘?,外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地取代天然信號肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而,指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉(/^/m'co/az'rao/era)纖維素酶和疏棉狀腐質(zhì)霉(/Z畫/co/a/""wg/ww")月旨肪酵。調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū),其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))。前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化成成熟活性多肽??梢詮目莶菅挎邨U菌(5"c/〃w^&///力堿性蛋白酶(ap^:)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶("pr7)、釀酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉(Myce//op/^/zoraAem2op/7//a)漆酶(WO95/33836)的基因獲得前肽編碼區(qū)。當(dāng)信號肽和前肽區(qū)二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時(shí),將前肽區(qū)置于緊接著多肽氨基末端,并且將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。表達(dá)載體本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體,所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核苷酸序列。可供選擇的是,可以通過在合適的用于表達(dá)的載體中插入包含殘缺的翻譯啟動基因序列和/或所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達(dá)本發(fā)明的核苦酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中,將編碼序列置于載體中,從而將該編碼序列與本發(fā)明的殘缺的翻譯啟動基因序列和一個(gè)或多個(gè)用于表達(dá)的合適的調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如,質(zhì)?;虿《?,其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟,并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體,即,作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體,其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制,例如,質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)。本發(fā)明的載體還含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記,其進(jìn)一步包含使質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的來源。在特定的實(shí)施方案中容易篩選,如早前所述。為了自主復(fù)制,載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn),其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。在特定的實(shí)施方案中,ARS是如上所述的AMA-1序列。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見,例如,Sambrook"a/"1989,見上文)。宿主細(xì)月包宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的方法中有用的任何真菌細(xì)胞。"真菌"用在本文包括以下門子嚢菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和才妄合菌門(Zygomycota)(長口由Hawksworth等,J/ravwW/z朋d5&6y;D/c"'owo^yo/77zeFw"g/,第8版,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,見上,171頁中所引用),和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfUngi)(Hawksworth等,1995,見上)。括真菌門(Eumycota)和卵菌門的亞門(如由Hawksworth等,1995,見上文,所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進(jìn)行營養(yǎng)生長,而碳分解代謝是專性需氧的。相反,酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行,而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在一個(gè)優(yōu)選的方面,絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、鬼傘屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬(Mag"opoW/ze)、毛霉屬(Mwcor)、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬或木霉屬細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面,絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉(^s/7erg/〃^avramw7')、臭曲霉(血/erg/〃wsyb幼'^s)、日本曲霉(A/erg7'〃wsy"/om'cw力、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中,曲霉屬宿主細(xì)胞是米曲霉或黑曲霉。在另一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中,絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢(Fwsan'Mw6a"nWo/(ie力、禾谷嫌孑包(Fusan'wwcerea//》、庫威嫌孑包(Fusan'wmcraojbve〃era)、大刀鐮孑包(FwsaWwmcw/morwm)、禾本牙牛鐮孑包(Fwsan'wwgram/"eflrww)、禾赤鐮孑包(Ft^a〃'wmgram/wwm)、異孑包鐮孑包(Fi^"n'MW/zetem^on/m)、合歡木鐮孑包CFkyar/wmweg柳W)、尖鐮孑包、多枝鐮孑包(尸wsan'wwre&cw/a/w附)、4分纟工鐮孑包CFwsar/wmrasewm)、才妄骨木鐮孑包(Fwsfln'w附sam6wc/"wm)、月夫色鐮孑包(FMS"Wwms"rcoc/2rawm)、扣乂分才支孑包鐮孑包(F^yor/wws/ora^7'c/z/o/(iey)、石危色鐮孑包CFYww/wmsw///zi#*ewm)、圓鐮孑包(Fus"Wwmtora/osww)、4以絲孑包鐮孑包CF^an'wwWc/zoAedoWe力或鑲片鐮孢細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中,鐮孢屬宿主細(xì)胞是尖鐮孢。在另外最優(yōu)選的方面,特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、米赫毛霉(Mwcor/m'e/^')、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌(iVewmsjwracra^a)、產(chǎn)紫青霉(尸ew/c/〃/wwpwrpwrogewwm)、7TH.e/av/afer&stni、p合茨木霉(7>7.c/zo<ierwa/z"rz/a"畫)、康寧木霉(7Wc/zocfew2flA:o"/"g7'/)、長枝木霉(7Hc/zocferma/o"gArac/n'a^w)、里氏木霉或綠色木霉(7Hc/zo&m7(3v/n'血)細(xì)胞。在特定的實(shí)施方案中,宿主細(xì)胞是里氏木霉。在甚至最優(yōu)選的實(shí)施方案中,鑲片鐮孢細(xì)胞是鑲片鐮孢A3/5,其起初作為禾谷鐮孢ATCC20334保藏,近來由Yoder和Christianson,1998,Fw"ga/GeMeWcsawe/23:62-80和O'Donnell等,1998,Fwwga/Gewe""23:57-67重新分類為鑲片鐮孢;以及鑲片鐮孢的分類等同物(不管當(dāng)前已知為哪個(gè)種)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,鑲片鐮孢細(xì)胞是鑲片鐮孢A3/5或鑲片鐮孢ATCC20334的形態(tài)突變體,如WO97/26330中所^>開的??梢詫⒄婢?xì)胞通過涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等,1984,尸raceWwgso/f/ze7Va"'o"a/爿c"dem;/5We"ceyf/5^81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等,1989,78:147-156和WO96/00787描述。通過以下實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述。實(shí)施例材料與方法菌抹米曲霉NBRC4177:可由Instituteforfermentation,Osaka;17-25JusoHammachi2-ChomeYodogawa-Ku,Osaka,Japan得到。米曲霉Jal355(amy-,alp-,NPr,CPA-,KApyrG)是米曲霉A1560的衍生物,其中如WO98/01470所述將;,G基因失活,轉(zhuǎn)化規(guī)程如WO00/24883所述。米曲霉PFjo218(amy-,alp-,Npl-,CPA-,KA-,pyrG-,ku7(T)在實(shí)施例1中描述。米曲霉PFjo220(am/,alp-,Npl-,CPA-,KA-,pyrG-,ku70::PyrG)在實(shí)施例1中描述。質(zhì)粒pENI2344在WO2003/070956中描述。pENI2155在WO2003/070956中描述。pIC19H在Marsh等,1984,Gene32:481-485中描述。pJaL554在專利WO2001068864的實(shí)施例8中描述。pJaL925在實(shí)施例4中描述。pJaL575在實(shí)施例1中描述。pDV8在專利WO0168864的實(shí)施例8中描述?;騪yrG:這個(gè)基因編碼5,-磷酸-乳清酸核苷脫羧酶,這是參與尿香生物合成的酶。wA:這個(gè)基因編碼聚酮合酶,這是參與孢子(分生孢子)顏色形成的酶。破壞wA基因會產(chǎn)生白色孢子。轉(zhuǎn)化米曲霉JaL355和PFio218將16-20小時(shí)的培養(yǎng)物收獲于Mira濾布中并用0.6MMgS04洗滌。將菌絲體轉(zhuǎn)移至包含10mlMgS04、10mMNaH2P04,pH5.8、50-100mgGlucanex的100ml塑料管中。加入十二毫克BSA,并在輕微震蕩下在37。C溫育溶液2小時(shí)。通過Mira濾布收獲原生質(zhì)體,并在原生質(zhì)體上加一層5mlST(0.6M山梨醇,100mMTris-Cl,pH7.0)。在2500rpm離心15分鐘后,收獲界面處的原生質(zhì)體,并轉(zhuǎn)移至新管中。加入兩倍體積的STC(1.2M山梨醇、10mMTris-Cl,pH7.5、10mMCaCl2),然后在2500rpm離心5分鐘。在5mlSTC中洗滌原生質(zhì)體兩次并最終重懸于STC中。向100(il原生質(zhì)體中加入約1-4嗎DNA,然后加入300(il60%PEG4000。在室溫溫育原生質(zhì)體20分鐘,然后在1.2ml山梨醇中稀釋,并在2500rpm離心10分鐘。將轉(zhuǎn)化體重懸于100pi山梨醇中并涂布在選擇性培養(yǎng)基(WO00/24883)上。PCR擴(kuò)增所有的PCR擴(kuò)增以50微升的體積進(jìn)行,其在Expand高保真緩沖液中包含1.75單位的Expand高保真PCR系統(tǒng)(Roche)、約U殷克DNA、250微摩爾每升每種dNTP和IO皮摩爾每種上述底物,以及1.5mMMgCl2。在MJResearchPCT-220DNAEngineDyadPeltier熱循環(huán)儀中進(jìn)行擴(kuò)增,并由下述組成94。C2分鐘的一個(gè)循環(huán),然后是94°C30秒鐘、55°C1分鐘和72°C1.5分鐘的25個(gè)循環(huán),然后是72°C5分鐘的額外延伸。脂肪酶實(shí)驗(yàn)將待進(jìn)行脂肪酶活性實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化體接種于包含l*Vogel培養(yǎng)基和2%麥芽糖的96孔微量滴定板中(參見Enzymology,vol.17,p.84中的方法)。在34°C生長4天后,使用pnp-戊酸酯作為脂肪酶底物,測試培養(yǎng)液的脂肪酶活性。向微量滴定板的孔中加入來自每個(gè)孔的培養(yǎng)基的IO微升等分試樣,所述微量滴定板的孔中包含200微升0.018%對硝基苯基戊酸酯的脂肪酶底物、0.1%TritonXTM-100、10mMCaCl2、50mMTrispH7.5。歷時(shí)五分鐘,每隔15秒鐘,用分光光度法,使用動力學(xué)微量滴定板讀板儀(MolecularDeviceCorp.,SunnyvaleCA),采用標(biāo)準(zhǔn)的酶學(xué)規(guī)程(例如,EwzymeAT/"e"c^,PaulC.Engel編,1981,ChapmanandHallLtd.)測定脂肪酶活性。簡而言之,在底物周轉(zhuǎn)(tumover)的初始速率階段測量產(chǎn)物的形成,并將產(chǎn)物形成定義為每隔15秒鐘,在5分鐘之內(nèi)根據(jù)405nm處的吸光度計(jì)算的曲線斜率。對于每組轉(zhuǎn)化體,計(jì)算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。基因組DNA制備將真菌菌絲體(在10mlYPD中生長2天后收獲)在真空離心儀(speedyvac)中干燥并將菌絲體破碎。加入1ml裂解緩沖液(裂解援沖液100mMEDTA、10mMTris-pH8.0、1%TritonX100、500mMGuanidinium-HCl、200mMNaCl),混合,加入2微升(10mg/ml)RNAseA,在37。C溫育30分鐘。加入5微升蛋白酶K(20mg/ml)?;旌喜⒃?0。C溫育2小時(shí)。在20000g旋轉(zhuǎn)10分鐘。將上清液加入質(zhì)粒旋轉(zhuǎn)杯(來自QIAprep⑧Miniprepkit,Qiagen)中并按照試劑盒規(guī)程操作。洗脫基因組DNA于100微升。實(shí)施例1KU70缺失的米曲霉菌抹的構(gòu)建引物<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>通過連續(xù)的兩輪剪切,各自使用限制性內(nèi)切酶去除pDV8中單一的限制性位點(diǎn)BamHI和BgIII,并通過用Klenow聚合酶和四種脫氧核糖核苷酸處理而填平游離的懸突末端,并連接產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL504。由pJaL504,通過PCR,使用172450和172449(SEQIDNO:11和12)擴(kuò)增2514bp片段,并克隆入載體pCR②4Blunt-TOPO,產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL575。pPFJo118由pUC19(GenBank/EMBL登錄號L09137)組成,其中包含側(cè)翼為額外拷貝的啟動子的米曲霉pyrG基因的1185bpHindlII-Asp718片段克隆入相同的位點(diǎn)(參見下面的pyrG+重復(fù)的序列)。用引物#315和#316PCR擴(kuò)增1kb的KU70的3'側(cè)翼區(qū),并通過BDIn-FusionTM克隆試劑盒(BDBiosciencesClontech)克隆入用五coRI切開的(opened)pPFJo118,產(chǎn)生pPFJo209。用引物#313和#314PCR擴(kuò)增1kb的KU70的5'側(cè)翼區(qū)域,插入pCR⑧4Blunt-TOPO⑧載體(使用來自Invitrogen的用于測序的BluntTOPOPCR克隆試劑盒)中。由此用五coRI切去KU705,末端,使用Klenow片段填平末端(室溫30分鐘),最后克隆入用///"dn切開、并如針對KU705,末端片段所述填平末端的pPFJo209。這產(chǎn)生pPFJo210質(zhì)粒。用iWM切開pPFJo210,填平末端并連接至來自pJaL575的五coRI-五coRI片段,pJaL575中包含HSV-tk反選"t奪盒,也填平末端——這產(chǎn)生最終的KU70缺失構(gòu)建體pPFJo247。用由5wXI線性化的pPFJo247轉(zhuǎn)化約40份(40xl00微升)JaL355。在包含核苷酸類似物5-氟-2,-脫氧尿苷(FDU)的蔗糖培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體,這使得不選擇其中只發(fā)生單交換的轉(zhuǎn)化體——因?yàn)樵诖嬖贔DU的情況下,由HSV-tk盒的表達(dá)對于細(xì)胞是致命的。轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)19個(gè)轉(zhuǎn)化體,并在37。C培養(yǎng)10天后在新的蔗糖+FDU平板上再分離。由這些轉(zhuǎn)化體分離基因組DNA,并使用基因組區(qū)域中用于缺失的側(cè)翼以外的一個(gè)引物(#3340)和側(cè)翼之間pyrG標(biāo)記中的一個(gè)引物(#126),進(jìn)行初步的PCR篩選。由這次PCR篩選,10個(gè)轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生正確的1114bp的PCR條帶,通過Southern印跡分析對這10個(gè)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行控制。為進(jìn)行Southern印跡,如材料和方法中所述制備基因組DNA。用Xhol-Pvul和XhoI-BgIII消化基因組DNA,對于正確缺失KU70的菌林,當(dāng)使用KU703,末端作為探針時(shí)(使用引物#315和弁316進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生1002bp的產(chǎn)物),得到的條帶在Southern印跡上分別與5417bp和3448bp的條帶雜交。野生型基因組DNA分別產(chǎn)生4659bp和2142bp的條帶。測試的全部10個(gè)轉(zhuǎn)化體都證明被正確地破壞。選擇轉(zhuǎn)化體WaL355/pPFJo247-19并命名為PFJo220。將這個(gè)轉(zhuǎn)化體在斜面上劃線,并由斜面洗下孢子液,將濃稠的孢子懸浮液涂布在5-FOA平板上(包含5-氟乳清酸),從而選擇其中pyrG基因出環(huán)(loopout)的菌株——留下缺失ku70和pyrff的菌林。分離一個(gè)這樣的菌林并命名為PFJo218。實(shí)施例2JaL355和PFio218中脂肪酶的表達(dá)如上所述用pENI2344轉(zhuǎn)化曲霉屬菌抹Jal355和PQo218。pENI2344在WO2003/070956中(實(shí)施例2)詳細(xì)描述,并包含脂肪酶基因作為報(bào)道基因和pyrG作為選擇標(biāo)記。pENI2344上的pyrG基因包含點(diǎn)突變T102N,使拷貝數(shù)增力口。將來自每個(gè)菌林的11個(gè)轉(zhuǎn)化體接種于200pi培養(yǎng)基(logel,2。/。麥芽糖)中。在34。C生長4天后,將接種物轉(zhuǎn)移至平板并在37。C生長3天,將每個(gè)菌抹的11個(gè)轉(zhuǎn)化體接種于200(il酵母蛋白胨+2°/。麥芽糖中并在34。C生長4天。如上文和WO2003070956中所述,使用脂肪酶底物pnp-戊酸酯測定10(xl培養(yǎng)基。結(jié)果顯示,在11個(gè)獨(dú)立的JaL355曲霉屬轉(zhuǎn)化體的脂肪酶表達(dá)水平之間有34%的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。在11個(gè)獨(dú)立的PFjo218轉(zhuǎn)化體中脂肪酶表達(dá)水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為18%。這表明ku70基因的缺失/失活產(chǎn)生更均一的表達(dá)水平,這是篩選基因變體文庫時(shí)所期望的。實(shí)施例3脂肪酶在JaL355h和PFio218中的表達(dá)用包含脂肪酶報(bào)道基因的質(zhì)粒pENI2155轉(zhuǎn)化米曲霉菌4木Jal355和Pgo218。質(zhì)粒pENI2155包含/^K7基因的殘缺kozak區(qū)上游,并如WO2003/070956(實(shí)施例1)所述構(gòu)建。質(zhì)粒基本上與pENI2344相同,除了pfG基因是野生型。構(gòu)建的詳細(xì)過程可以在WO2003/070956(實(shí)施例l)中找到。來自每個(gè)菌林的約10個(gè)轉(zhuǎn)化體接種于200)il培養(yǎng)基(2。/。麥芽糖+YP)中。在34。C生長4天后,使用pnp-戊酸酯測定培養(yǎng)基的脂肪酶活性。將4妾種物轉(zhuǎn)移至平板并在37t生長3天。在總共生長14天后第二次重復(fù)脂肪酶實(shí)驗(yàn)。將每個(gè)菌抹的約10個(gè)轉(zhuǎn)化體接種于200(il酵母蛋白胨+2%麥芽糖中并在34。C生長3天。在34。C生長4天后,使用pnp-戊酸酯測定培養(yǎng)基的脂肪酶活性(W02003070956)。將接種物轉(zhuǎn)移至平板并在37t:生長3天。最后,在總共生長21天后第三次重復(fù)脂肪酶實(shí)驗(yàn)。將每個(gè)菌抹的約10個(gè)轉(zhuǎn)化體接種于200^酵母蛋白胨+2%麥芽糖中并在34"生長4天。在34。C生長4天后,使用pnp-戊酸酯測定培養(yǎng)基的脂肪酶活性(W02003070956)。結(jié)果脂肪酶實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)數(shù)據(jù)示于下表中。很明顯,當(dāng)使用ku70缺失菌林時(shí)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低。在篩選突變體文庫時(shí),表達(dá)水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較低是理想的。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例4KU70缺失菌抹中NHR/HR頻率的確定為了測試KU70菌抹背景對于同源重組的行為,可以選擇不同的容易選擇的耙標(biāo)作為測試?yán)0袠?biāo)可以為wA-其被破壞時(shí)會產(chǎn)生雪白的孢子,adeB-其被破壞時(shí)產(chǎn)生紅色菌絲,和niaD-以硝酸鹽作為唯一氮源時(shí)不能在平板上生長,而所有菌株都能在作為唯一氮源的亞硝酸鹽上生長。wA的結(jié)果示于下表中。A.米曲霉wA缺失質(zhì)粒pJaL925的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL901包含來自米曲霉NBRC4177的4658bpBglII片段,其編碼pIC19H中的wA基因(SEQIDNO:13)。用Asp718和SnaBI消化質(zhì)粒pJaL901,并純化5501bp片段。將來自pJaL554的側(cè)翼重復(fù)的pyrG選擇標(biāo)記純化為2027bp的Asp718-Smal片段。連接這兩個(gè)片段,得到質(zhì)粒pJaL925。由此用pyrG基因替換wA基因的1861bpAsp718-SnaBI編碼部分,而且pyrG基因的側(cè)翼為wA的5'末端的685bp片段和wA的3'末端的2105bp片段。B.用pJaL925轉(zhuǎn)化JaL355和PFJo218如前所述用pJaL925轉(zhuǎn)化JaL355和PFJo218。下表所示的結(jié)果清楚地表明,KU70缺失菌抹中NHR降低。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>權(quán)利要求1.用于產(chǎn)生目標(biāo)重組多肽的方法,所述方法包括步驟a)提供編碼一種或多種目標(biāo)多肽的多核苷酸文庫,其中在包含至少下述元件的表達(dá)克隆載體中制備所述文庫i)編碼選擇性標(biāo)記的多核苷酸;ii)真菌復(fù)制起始序列,優(yōu)選自主復(fù)制序列(ARS);和iii)以連續(xù)順序(insequentialorder)包含下述的多核苷酸源自真菌細(xì)胞的啟動子、可將文庫克隆入其中的克隆位點(diǎn),和轉(zhuǎn)錄終止子;b)用所述文庫轉(zhuǎn)化親本絲狀真菌宿主細(xì)胞的突變體,其中與親本相比,突變體中非同源重組的頻率降低;c)在適合表達(dá)所述多核苷酸文庫的條件下培養(yǎng)(b)中獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;和d)選擇產(chǎn)生目標(biāo)多肽的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法,其中所述突變絲狀真菌宿主細(xì)胞在選自下組的基因座中被修飾ku70、ku80、rad50、mrell、xrs2、lig4、sir4或它們的功能等同物。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中基因座是ku70或ku80或它們的功能等同物。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中ARS是AMAl-序列或其功能性衍生物。5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法,其中所述編碼標(biāo)記的序列的翻譯啟動起始位點(diǎn)包含下述序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中位置-3中的"Y"是胸腺嘧啶(尿嘧啶),"N"是任何核苷酸,并且相對于所述標(biāo)記的起始密碼子"ATG"(以粗體表示)的第一個(gè)核苷酸指定數(shù)字編號;6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中序列在位置-1、-2和-4中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步包含胸腺嘧啶(尿嘧啶)。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法,其中步驟(i)的選^^性標(biāo)記選自下組謹(jǐn)必、arg5、6ar、/y^、WoD、/jvrG、禾口印C。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法,其中步驟(i)的選擇性標(biāo)記是/^K或其功能性衍生物。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法,其中步驟(i)的選擇性標(biāo)記是;,(7的功能性衍生物,其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代,優(yōu)選地,該衍生物包含氨基酸取代T102N。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法,其中步驟(ii)的真菌復(fù)制起始序列包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:2中所列的核苷S吏序列,或是其功能性衍生物,優(yōu)選地,該功能性衍生物與SEQIDNO:1或SEQIDNO:2至少80%相同。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法,其中步驟(iii)的啟動子是來自黑曲霉C4^e/^'〃wsm'取r)的中性淀粉酶編碼基因(NA2)的啟動子。12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法,其中啟動子是NA2tpi啟動子。13.根據(jù)權(quán)利要求l的方法,其中步驟(iii)的轉(zhuǎn)錄終止子是來自黑曲霉的葡糖淀粉酶編碼基因(AMG)的終止子。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法,其中所述絲狀真菌宿主細(xì)胞是才支頂孑包屬(Jcremom'wm)、曲審屬(J^pez-g^/MS)、鬼傘屬(Copn'"w"、嫌孑包屬(T^k"W臓)、腐質(zhì)霉屬(/7w柳-co/Q)、毛霉屬(Mwcor)、毀絲霉屬(聊ce/—Aora)、月永孑包菌屬(7Vewos^W(2)、青審屬(尸em'c/〃/wm)、才炎孑包殼屬(777/e/aWa)、彎頸審屬(7b/少/7oc/a&wm)或木霉屬(7h'c/zo^w^)的絲狀真菌宿主細(xì)月包。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述細(xì)胞是米曲霉(A/7er^7/wW7加e)、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉(^/erg7'〃^"油/cms)、灰蓋鬼傘(Copn'm^"'wewws)、尖嫌孑包(Fwsar/wmo;qy5porwm)或里氏木霉(7>7'£^0<^/-附(3re^se/)的纟田月包。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法,其中目標(biāo)多肽是酶、酶變體或它們的功能性衍生物。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法,其中酶或酶變體是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的方法,其中酶或酶變體是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苦酶、P-葡糖香酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。19.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法,其中目標(biāo)多肽是激素或激素變體或它們的功能性衍生物,受體或受體變體或它們的功能性衍生物,抗體或抗體變體或它們的功能性衍生物,或者報(bào)道蛋白。20.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法,其中所述目標(biāo)多肽是異源多肽。21.根據(jù)權(quán)利要求14的方法,其中所述絲狀真菌宿主細(xì)胞選自米曲霉或黑曲霉。22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法,其中在步驟(d)后將編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸從由步驟(d)的選擇的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中分離。全文摘要本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生目標(biāo)重組多肽的方法,所述方法包括步驟a)提供編碼一種或多種目標(biāo)多肽的多核苷酸文庫,其中在包含至少下述元件的表達(dá)克隆載體中制備文庫i)編碼選擇性標(biāo)記的多核苷酸;ii)真菌復(fù)制起始序列,優(yōu)選自主復(fù)制序列(ARS);和iii)以連續(xù)順序包含下述的多核苷酸源自真菌細(xì)胞的啟動子、可將文庫克隆入其中的克隆位點(diǎn),和轉(zhuǎn)錄終止子;b)用文庫轉(zhuǎn)化親本絲狀真菌宿主細(xì)胞的突變體,其中與親本相比,降低了在突變體中非同源重組的頻率;c)在適合表達(dá)多核苷酸文庫的條件下培養(yǎng)(b)中獲得的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞;和d)選擇可產(chǎn)生目標(biāo)多肽的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。文檔編號C12R1/685GK101679993SQ200880015244公開日2010年3月24日申請日期2008年5月7日優(yōu)先權(quán)日2007年5月9日發(fā)明者杰斯珀·文德申請人:諾維信公司
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