專利名稱：：使用egfr抗體和src抑制劑的治療方法和相關(guān)制劑的制作方法使用EGFR抗體和SRC抑制劑的治療方法和相關(guān)制劑發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及EGFR介導(dǎo)的疾病，尤其癌癥的治療。提供了使用EGFR調(diào)節(jié)劑，尤其EGFR抗體和scr抑制劑的聯(lián)合治療癌癥的方法。提供了MAb806抗體和scr抑制劑的方法和聯(lián)合制劑。
背景技術(shù)：
：靶向癌癥治療設(shè)計(jì)用于破壞癌癥發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)所需的特定分子的功能，從而殺傷或阻止癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(JiH等人(2006)CellCycle5(18):2072-2076Equb2006年9月15日)。與傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化療相對(duì)比，此類靶向癌癥治療可能更有效并且對(duì)正常細(xì)胞損害較小。靶向癌癥治療領(lǐng)域的主要努力方向是靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的藥劑的開發(fā)。EGFR是密切相關(guān)的受體ErbB家族的成員，該家族包括EGFR(ErbB-l)、Her2/neu(ErbB曙2)、Her3(ErbB-3)和Her4(ErbB畫4)。EGFR的激活導(dǎo)致受體酪氨酸激酶的激活和介導(dǎo)下列過程的一系列下游信號(hào)事件細(xì)胞增殖、遷移、粘附、侵襲、對(duì)化療的抗性以及凋亡抑制、對(duì)癌細(xì)胞持續(xù)增殖和存活關(guān)鍵的過程。由于EGFRvIII突變體受體的表達(dá)受限于肺瘤細(xì)胞，它代表了高度特異性的抗體治療靶標(biāo)。因此，制備了對(duì)獨(dú)特的肽de2-7EGFR有特異性的多克隆和單克隆抗體。在用獨(dú)特的de2-7EGFR肽免疫之后分離的一系列小鼠mAb都顯示出在棵鼠中對(duì)平截受體和靶向的de2-7EGFR陽(yáng)性異種移植物(xenograft)生長(zhǎng)的選擇性和特異性(WikstrandCJ等人(l995)CancerRes55:3140-3148，.Okamoto，S等人(1996)BrJCancer73:1366-1372;HillsD等人(199S)IntJCancer63:537-543;ReistCJ等人(1997)CancerRes57:1510-1515;ReistCJ等人(1995)CancerRes55:4375-4382;美國(guó)專利5,401,828)。抗EGFRvIII抗體的實(shí)例包括ABX-EGF(帕尼單抗(panitumumab))、DH8.3、L8A.4和Y10。MAb806是新的鼠抗體，它最初使用表達(dá)EGFRvIII突變體的整個(gè)細(xì)胞作為免疫原制備以識(shí)別獨(dú)特的平截突變體EGFRvIII。重要的是，mAb806所識(shí)別的表位在無(wú)活性的野生型(wt)EGFR中不易接近，但是在過量表達(dá)EGFR和表達(dá)EGFRvIII的細(xì)胞中以過渡形式的wtEGFR暴露。MAb806結(jié)合EGFRvIII/A2-7EGFR突變體中存在或可用的表位，但是識(shí)別與突變體的連接肽LEEKKGNYVVTDH不同的表位。表位研究得到免疫組織化學(xué)研究的支持，該研究證明了806抗體結(jié)合膠質(zhì)瘤以及多種表皮癌癥中存在的表位，但是不結(jié)合正常人組織。這些和其他的臨床前期數(shù)據(jù)表明mAb806可能具有與西妥昔單抗(cetuximab)和其他抗EGFR抗體不同的臨床活性鐠和副作用特征。在異種移植物模型中，mAb806顯示出有效的抗腫瘤活性而不粑向正常組織。因此mAb806獨(dú)特的耙向能力代表著癌癥特異性分子靶向治療的新范例。非受體蛋白酪氨酸Src是60-kDa蛋白，它是包括Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Hck、Fgr、Blk和Yrk的9基因家族的一個(gè)成員，其在一些細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，如增殖、分化、遷移、粘附、侵襲、血管發(fā)生和免疫功能(YeatmanYJ.(2004)NatRevCancer4(6):470-80;FrameMC.(2004)JCellSci117:989-98)。Src家族激酶含有一個(gè)保守性差的結(jié)構(gòu)域和三個(gè)保守的Src同源結(jié)構(gòu)域SH2、SH3和SHI或蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。對(duì)Src調(diào)節(jié)很關(guān)鍵的是COOH-末端酪氨酸(Y530),當(dāng)其在被C末端Src激酶(Csk)磷酸化時(shí)會(huì)產(chǎn)生更多的無(wú)活性Src構(gòu)象。Src根據(jù)輸入信號(hào)而與許多蛋白相互作用。人們還認(rèn)為它的活性構(gòu)象通過Y530的去磷酸化和Y418的自磷酸化達(dá)成。Src還與結(jié)構(gòu)和信號(hào)傳導(dǎo)蛋白結(jié)合，所得的復(fù)合體對(duì)Src在多種細(xì)胞過程中的作用很關(guān)鍵。據(jù)報(bào)道Src在一些癌癥中過量表達(dá)或異常激活，如結(jié)腸癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胃癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、腦癌和血癌(DehmSM和BonhamK(2004)BiochemCellBiol2004;82:263-74)。有幾種已知的src小分子抑制劑，一些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，例如達(dá)沙替尼(dasatinib)(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PPl(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-^-嗜啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，44卜嗜啶)、PD166326。臨床上需要用于EGFR介導(dǎo)的疾病(包括癌癥)的增強(qiáng)的、更有效的并且更廣泛的有效治療方案.術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及如下的發(fā)現(xiàn)改變src表達(dá)或活性增強(qiáng)抗EGFR治療的效力。具體地，改變src表達(dá)或活性顯著增強(qiáng)抗EGFR抗體效力，尤其是mAb806抗體的活性。本發(fā)明涉及用于治療癌癥或其他EGFR介導(dǎo)的疾病的EGFR和src抑制劑的聯(lián)合制劑。本發(fā)明還提供在哺乳動(dòng)物中治療EGFR介導(dǎo)的癌癥的方法，其包括以聯(lián)合、同時(shí)、或一個(gè)接另一個(gè)的連續(xù)方式給予所述哺乳動(dòng)物src抑制劑和抗EGFR抗體。在一個(gè)方面，所述src抑制劑是酪氨酸激酶抑制劑。在一個(gè)方面，抗EGFR抗體是MAb806。在本發(fā)明方法的一具體實(shí)施方式中，抗EGFR抗體為mAb806抗體或其活性片段。MAb806包括鼠抗體、重組抗體或人源化抗體。EGFR介導(dǎo)的癌癥可以選自成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮趺癌、肝癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌癥和膀胱癌。所述癌癥還可以選自結(jié)腸癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、腦癌和血癌。具體地，所述癌癥可以是膠質(zhì)瘤。本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物中治療癌癥的方法，其包括給予所述哺乳動(dòng)物src抑制劑和抗EGFR抗體，其中所述src抑制劑和抗EGFR抗體同時(shí)、聯(lián)合或一個(gè)接另一個(gè)連續(xù)給予。在本發(fā)明方法的一個(gè)方面，所述抗EGFR抗體是識(shí)別在腫瘤發(fā)生、過度增殖或異常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而在正常細(xì)胞中檢測(cè)不到的EGFR表位的抗體。在一個(gè)具體的這種方面，所述抗EGFR抗體是mAb806或其活性片段。在本發(fā)明方法中，src抑制劑可以選自達(dá)沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PPl(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d卜嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-(1卜嘧啶)和PD166326。在本發(fā)明方法中，所述src抑制劑具體為酪氨酸激酶抑制劑。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方式中，所述src抑制劑為達(dá)沙替尼，抗EGFR抗體為mAb806。所述癌癥可以選自成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌癥、膀胱癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、胃癌、胰腺癌、腦癌和血癌。方法，其包括給予所述哺乳動(dòng)物src抑制劑和抗EGFR抗體，其中所述src抑制劑和抗EGFR抗體同時(shí)、聯(lián)合或一個(gè)接另一個(gè)連續(xù)給予。在一個(gè)具體的此種方法中，所述抗EGFR抗體是識(shí)別在肺瘤發(fā)生、過度增殖或異常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而在正常細(xì)胞中檢測(cè)不到的EGFR表位的抗體。所述抗EGFR抗體尤其為mAb806或其活性片段。本發(fā)明提供在哺乳動(dòng)物中阻斷或降低EGFR介導(dǎo)的癌癥的腫瘤生長(zhǎng)的方法，其包括給予所述哺乳動(dòng)物src抑制劑和抗EGFR抗體，其中所述src抑制劑為達(dá)沙替尼，所述EGFR抗體為mAb806。EGFR介導(dǎo)的癌癥可以選自成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、胃腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚癌、肝癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌癥和膀胱癌。本發(fā)明還提供在哺乳動(dòng)物中增強(qiáng)抗EGFR抗體效力或活性的方法，其包括給予所述哺乳動(dòng)物抗EGFR抗體和src抑制劑的聯(lián)合制劑。所述src抑制劑可以選自達(dá)沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d]-嗜啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d卜嘧咬)和PD166326。所述抗EGFR抗體尤其為識(shí)別在腫瘤發(fā)生、過度增殖或異常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而在正常細(xì)胞中檢測(cè)不到的EGFR表位的抗體。在一個(gè)具體的這種方面，所述抗EGFR抗體為mAb806。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含在藥物上可接受的載體或稀釋劑中的抗EGFR抗體和一種或多種src抑制劑。所包括的組合物為其中抗EGFR抗體為識(shí)別在腫瘤發(fā)生、過度增殖或異常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而在正常細(xì)胞中檢測(cè)不到的EGFR表位的抗體。在一個(gè)具體的這種方面，所述抗EGFR抗體為mAb806。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其他目的和優(yōu)點(diǎn)可以從參考下列例示性附圖進(jìn)行的下列說明綜述將顯而易見。附圖筒述圖1:EGFR的示意性代表圖。de2-7EGFR中缺失的胞外區(qū)域用括號(hào)標(biāo)記。de2-7EGFR的死亡激酶形式在721位處含有單個(gè)點(diǎn)突變(K—M)。de2-7EGFR的DY2形式在殘基1068和1173處具有Y—F突變，而DY5變體也具有這些取代基以及992、1086和1148取代基。圖2:不同異種移植物對(duì)EGFR特異性抗體的敏感性。通過在BALB/c棵鼠的兩側(cè)腹注射3xl(^細(xì)胞而建立異種移植物。當(dāng)異種移植物達(dá)到約100mm3的平均體積時(shí)開始抗體治療。用1mgmAb528(左欄)或mAb806(右欄)處理小鼠2周，每周3次(即，共6次注射)。數(shù)據(jù)表示為平均肺瘤體積土SE。圖3:U87MG基細(xì)胞系的異種移植物生長(zhǎng)曲線。通過在BALB/c棵鼠的兩側(cè)腹注射3xl(^細(xì)胞建立異種移植物以確定生長(zhǎng)曲線。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積+SE。圖4A和4B:U87MG.A2國(guó)7、U87MG.DK和U87MG.DY5細(xì)胞中de2國(guó)7EGFR變體的體外磷酸化。A、用mAb806、mAb528或不相關(guān)的同型匹配對(duì)照抗體免疫沉淀de2-7EGFR蛋白，并對(duì)所得樣品進(jìn)4亍免疫印跡。所有de2-7EGFR變體在Y1045處的磷酸化均為陽(yáng)性，Y1045是與泛素化和降解相關(guān)的主要位點(diǎn)(上欄)。如所預(yù)測(cè)，de2-7EGFR在Y1173位處祐:組成性磷酸化，而DK和DY5變體在此位點(diǎn)均為磷酸化陰性(中欄)。用EGFR的兔c末端多克隆抗體確定EGFR的存在(下欄)。這種c末端抗體不識(shí)別DY5變體，因?yàn)镈Y5變體含有Y1068F突變，Y1068F證明是抗體結(jié)合的關(guān)鍵殘基。因此，在(B)中總DY5蛋白的存在通過用mAb806免疫印跡來確定。圖5A-5D:表達(dá)高水平de2-7EGFR的U87MG細(xì)胞。將U87MG.厶2國(guó)7用FACS分選為低(L)、中(M)、和高(H)表達(dá)群體。A、在血清饑餓36小時(shí)后裂解細(xì)胞，通過免疫印跡分析de2-7表達(dá)(C13)和de2-7EGFR的酪氨酸磷酸化(4G10)。磷酸化水平與de2-7EGFR相關(guān)。B、通過在BALB/c棵鼠的兩側(cè)腹注射lxl()6細(xì)胞建立親代U87MG、U87MG-L、U87MG-M和U87MG-H異種移植物以確定生長(zhǎng)曲線。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積士SE。C、通過免疫印跡分析來自(B)的腫瘤的de2-7EGFR(C13)表達(dá)。D、用1mgmAb528或mAb806處理具有U87MG-H異種移植物的小鼠2周，每周三次(第4、6、8、11、13和15天)。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積士SE。圖6A-6C:用EGFR特異性抗體處理NR6.A2-7異種移植物。通過在BALB/c棵鼠的兩側(cè)腹注射3xl(^細(xì)胞而建立異種移植物。當(dāng)異種移植物達(dá)到約100inmS的平均體積時(shí)開始抗體治療。用1mgmAb806(A)或mAb528(B)處理小鼠2周，每周3次(第22、25、29、32、36和39天)，或用mAb528(C)處理3周，每周2次(第27、30、34、37、41和44天)。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積士SE。圖7A-7C:de2-7EGFR和Src之間的相互作用。(A)4吏細(xì)胞血清饑餓過夜，然后用10jiMPP1或PP2或溶媒(DMSO)處理30分鐘或24h，然后用mAb528、mAb806或不相關(guān)的同型對(duì)照進(jìn)4亍免疫沉淀。用EGFR的Y845特異性抗體進(jìn)行免疫印跡，而總de2-7EGFR用兔c末端多克隆抗體呈現(xiàn)。所示結(jié)果代表4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。(B)通過在BALB/c棵鼠的兩側(cè)腹注射lxl06細(xì)胞建立U87MG.A2-7載體對(duì)照和U87MG.A2-7j)NSrc異種移植物以確定生長(zhǎng)曲線。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積士SE。(C)通過在BALB/c棵鼠的兩側(cè)腹注射3xl(^細(xì)胞建立U87MG.A2-7oNSrc異種移植物。當(dāng)異種移植物達(dá)到約100mii^的平均體積時(shí)開始抗體治療。用lmgmAb806處理小鼠2周，每周3次(第18、20、22、25、27和29天)。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積土SE。圖8A和8B:U87MG.A2-7細(xì)萬(wàn)包中內(nèi)化的mAb806-Cy3和EEA1或lgp-120的共定位。(A)在4。C用mAb806-Cy3(紅)預(yù)孵育接種在玻璃蓋玻片上的細(xì)胞(0分鐘)。通過在37'C孵育10、20和30分鐘來刺激內(nèi)化。將細(xì)胞固定和透化，然后先后用抗EEA1、Cy2結(jié)合的驢抗小鼠抗體(綠)染色。共定位在融合圖像中用黃色指示(箭頭)。比例尺=20nm。(B)用GFP標(biāo)記的lgp-120(lgp-120-GFP;綠)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯示在lgp-120-GFP欄并由綠色箭頭顯示。轉(zhuǎn)染后，在4。C用mAb806-cy3(紅)孵育細(xì)胞(紅；0分鐘)，然后通過在37。C孵育30、60和120分鐘來誘導(dǎo)內(nèi)化。接著，固定樣品，mAb806-Cy3和lgp-120-GFP的共定位由融合圖像中黃色的存在來指示(白色箭頭)。比例尺-10nm。圖9A-9F:在U87MG.A2-7細(xì)胞中mAb806結(jié)合de2-7EGFR后網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)呑作用和胞內(nèi)mAb806運(yùn)輸?shù)碾娮语@微鏡分析。誘導(dǎo)內(nèi)化5分鐘后，在網(wǎng)格蛋白包被的凹陷(A-B)和小泡(C)中容易地檢測(cè)出了金粒(mAb806-Au;箭頭)。在類似膜小內(nèi)陷(caveolae)(空心箭頭)的結(jié)構(gòu)內(nèi)不存在金粒(D)。內(nèi)化10-15分鐘后，在類似早期內(nèi)體(E)的管狀嚢泡結(jié)構(gòu)中檢測(cè)到了金粒。在內(nèi)化較長(zhǎng)時(shí)間后，在多泡體中看到了金粒(F)。比例尺=100mn。圖10:NR6A2-7細(xì)胞中mAb806和mAb528的內(nèi)化。在4。C用mAb806-Cy3(左欄)或mAb528-Cy3(右欄)預(yù)孵育細(xì)胞(0分鐘)，然后在37。C孵育不同的時(shí)間段誘導(dǎo)內(nèi)化。示出了表示在37'C下15、30和60分鐘孵育的圖像。在內(nèi)化前用兩種抗體染色與細(xì)胞間的膜連接(藍(lán)色箭頭)和黏著斑(紅色箭頭)有關(guān)，而一些細(xì)胞顯示很少的膜染色(紅色箭頭)。較晚時(shí)間點(diǎn)內(nèi)化的抗體用白色箭頭指示。比例尺-20nm。圖11:de2-7EGFR變體與其他細(xì)胞組分相互作用的示意性代表圖。de2-7EGFR具有活性激酶，因此可以自磷酸化、磷酸根轉(zhuǎn)移或?yàn)槠渌っ噶姿峄陌袠?biāo)。相反，死亡激酶de2-7EGFR僅可以為磷酸化的靶標(biāo)。最后，DY5構(gòu)建體可以為磷酸化的靶標(biāo)并且磷酸根轉(zhuǎn)移其他細(xì)胞靶標(biāo)，如wtEGFR?？紤]到mAb528和806都抑制U87MG.DY5異種移植物，但是不抑制U87MG.DK異種移植物，表明這些抗體阻止其他細(xì)胞組分磷酸化的能力對(duì)它們的抗肺瘤活性是很關(guān)鍵的。圖12:用單獨(dú)的mAb806和達(dá)沙替尼或它們的聯(lián)合制劑進(jìn)行的U87MG.A2-7src異種移植物治療。通過在BALB/c棵鼠的兩側(cè)腹注射"106細(xì)胞而建立U87MG.A2-7src異種移植物，當(dāng)異種移植物達(dá)到約80mm3的平均體積時(shí)開始治療。用溶媒(在dH20中的4%DMSO)、PBS中的1mgmAb806、在4%DMSO(在dH20中)中的10mg/kg"達(dá)沙替尼或它們的聯(lián)合制劑處理小鼠2周，每周三次，在所指定的日期進(jìn)行。數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積士SE。在第33天，聯(lián)合處理組明顯小于僅用mAb806處理的組(p〈0.0076)。圖13:用單獨(dú)的mAb806和達(dá)沙替尼或它們的聯(lián)合制劑進(jìn)行的U87MG.A2-7src異種移植物治療。將來自上面實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成kaplan-meier存活曲線，4吏用臨死或腫瘤體積>1500mn^時(shí)的兩個(gè)端點(diǎn)通過Wilcoxon分析來進(jìn)行分析。聯(lián)合組比其他組存活時(shí)間長(zhǎng)，LogRankp<0.0001。具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)中的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的解釋。參見，例如，Sambrook等人,"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology，，第I國(guó)III巻[Ausubel，R.M.，編輯(1994)；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"第I-III巻[J.E.Celis，編輯(1994)；"CurrentProtocolsinImmunology"第I-III巻[Coligan，J.E.，編輯(1994)1;"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait編輯1984);"NucleicAcidHybridization"[B.D.Haines&S.J.Higgins編輯(1985)];"TranscriptionAndTranslation"[B.D.Hames&S.J.Higgins編輯(1984)；"AnimalCellCulture"[R.I.Freshney，編輯(1986)；"ImmobilizedCellsAndEnzymes"[IRLPress,(1986)J;B，Perbal，"APracticalGuideToMolecularCloning"(1984)。因此，如果在本文中出現(xiàn)，則下列術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有下列定義。術(shù)語(yǔ)"抗體"描述天然或部分或完全合成制備的免疫球蛋白?？贵w包括結(jié)合特異性表位的任何免疫球蛋白，包括抗體及其片段。該術(shù)語(yǔ)涵蓋多克隆、單克隆、重組、人源化和嵌合抗體。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋具有為抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或與其同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽或蛋白。此術(shù)語(yǔ)還涵蓋CDR移植抗體。由于抗體可以多種方式修飾，所以術(shù)語(yǔ)"抗體"應(yīng)理解為涵蓋含有具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何特異性結(jié)合部分或物質(zhì)。因此，此術(shù)語(yǔ)涵蓋抗體片段、衍生物、抗體的功能性等同物和同源物，其包括含有免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然或完全或部分合成的任何多肽。因此，包括融合至另一多肽的含有免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等同物的嵌合分子。嵌合抗體的克隆和表達(dá)描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023和美國(guó)專利No.4,816,397和4,816,567。據(jù)顯示，整個(gè)抗體的片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的實(shí)例為(i)由VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(iii)由單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(iv)由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb片段(Ward,E.S等人，Nature341，544-546(1989));(v)分離的CDR區(qū)；(vi)F(ab，)2片段，包含兩個(gè)相連的Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv),其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽連接子連接，所述肽連接字使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域連接以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(Bird等人，Science,242，423-426，1988;Huston等人，PNASUSA，85,5879-5883,1988);(viii)多價(jià)抗體片段(scFv二聚體、三聚體和/或四聚體(Power和Hudson,JImmunol.Methods242:193-2049(2000));(ix)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965);和(x)通過基因融合構(gòu)建的"雙功能抗體Uiabody)，，、多價(jià)或多特異性片段(WO94/13804;P.Holliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,(1993))。"抗體結(jié)合位點(diǎn)"是由特異性結(jié)合抗原的輕鏈或重鏈和輕鏈可變和高變區(qū)構(gòu)成的抗體分子結(jié)構(gòu)部分。如本文所用的各種語(yǔ)法形式的短語(yǔ)"抗體分子"涵蓋完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。示例性的抗體分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有互補(bǔ)位的那些部分，包括本領(lǐng)域內(nèi)已知的那些部分，如Fab、Fab，、F(ab，)2和F(v),這些部分優(yōu)選用于本文所述的治療方法?？贵w可以是雙特異性的，其中抗體的一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域是本發(fā)明的特異性結(jié)合部分，另一結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有不同的特異性，如募集效應(yīng)子的功能等。本發(fā)明的雙特異性抗體包括其中抗體的一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域是本發(fā)明的特異性結(jié)合部分，包括其片段，另一結(jié)合結(jié)構(gòu)域是不同的抗體或其片段，包括不同的抗EGFR抗體，例如抗體528(美國(guó)專利No.4,943,533)、嵌合和人源化225抗體(美國(guó)專利No.4,943,533和WO/9640210)、抗de2-7抗體(如DH8.3)(Hills，D.等人(1995)Int.J.Cancer63(4):537-543)、抗體L8A4和Y10(Reist，CJ等人(1995)CancerRes.55(19):4375-4382;FoulonCF等人(2000)CancerRes.60(16):4453國(guó)4460)、ICR62(ModjtahediH等人(1993)CellBiophys.1月國(guó)7月；22(1-3):129-46;Modjtahedi等人(2002)P.A.A.C.R.55(14):3140畫3148、或Wikstrand等人的抗體(WikstandC.等人(1995)CancerRes.55(14):3140-3148)。另一結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是識(shí)別或靶向特定細(xì)胞類型的抗體，如神經(jīng)或膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體。在本發(fā)明的雙特異性抗體中，本發(fā)明抗體的一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與識(shí)別特定細(xì)胞受體和/或以特定方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的其他結(jié)合結(jié)構(gòu)域或分子組合，如免疫調(diào)節(jié)因子(如，白細(xì)胞介素)、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子或細(xì)胞因子(如，腫瘤壞死因子(TNF),尤其是2002年2月13日提交的U.S.S.N,60/355，838(其全文并入本文)中所展示的TNF雙特異性形式)或毒素(如，蓖麻毒蛋白)或抗有絲分裂或凋亡的藥劑或因子。抗體分子的Fab和F(ab，)2部分可以通過熟知的方法對(duì)基本上完整的抗體分子分別進(jìn)行木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反應(yīng)來制備。參見，例如授予Theofilopolous等人的美國(guó)專利No.4，342，566。Fab，抗體分子部分也是熟知的，它由F(ab，)2部分如下制備如用巰基乙醇還原連接兩個(gè)重鏈部分的二硫鍵，接著用諸如碘代乙酰胺等試劑將所得蛋白硫醇烷基化。含有完整抗體分子的抗體在本文中是優(yōu)選的。各種語(yǔ)法形式的短語(yǔ)"單克隆抗體，，是指僅具有一種能夠與特定抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體。因此單克隆抗體通常表現(xiàn)出對(duì)與其發(fā)生免疫反應(yīng)的任何抗原的單一結(jié)合親和力。單克隆抗體還可以含有具有多個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子，每個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)不同抗原具有免疫特異性；例如，雙特異性(嵌合)單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域"描述含有特異性結(jié)合部分或整體的抗原并與其互補(bǔ)的區(qū)域的抗體部分。當(dāng)抗原很大時(shí)，抗體可以僅結(jié)合抗原的特定部分，該部分稱為表位。抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以有一個(gè)或多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。術(shù)語(yǔ)"mAb806，，、"806抗體"、"單克隆抗體806"、"ch806，，、"人源化806"以及沒有特別列出的任何變體在本文中可以互換使用，并且如在整個(gè)本申請(qǐng)和權(quán)利要求提到中所用。因此，還涵蓋了顯示出基本上等同的或改變的活性的抗體，包括重組的、嵌合的、遺傳修飾的或其他抗體。這些修飾可以是特意的，例如，通過定點(diǎn)突變獲得的修飾；或可以是偶然的，如通過在為抗體或其片段的制造者的宿主中突變而獲得的那些。術(shù)語(yǔ)"mAb806，，、"806抗體"、"單克隆抗體806"、"ch806，，、"人源化806，，還旨在包括本文具體記載的以及技術(shù)人員已知的、公開揭示的在它們范圍內(nèi)的蛋白和免疫球蛋白，以及所有基本上同源的類似物和等位變體。mAb806抗體(包括其制備、具體活性、氨基酸和核酸序列、抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、可變區(qū)序列)已公開并且是技術(shù)人員已知的，包括下列文獻(xiàn)中所提供的WO02/092771;LuworRB等人(2001)CancerRes61:5355-5361;MishimaK等人(2001)CancerRes61:5349-5354;JohnsTG等人(2002)IntJCancer98:398-408;JungbluthAA等人(2003)ProcNatlAcadSci100(2):639-644，其每一篇的全文以引用方式并入本文。應(yīng)了解還在用于本發(fā)明方法的組合物范圍內(nèi)的是編碼和/或有效表達(dá)抗EGFR抗體(尤其包括mAb806和ch806)的DNA序列，該DNA序列編碼抗EGFR抗體、其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、或其具有與mAb806抗體(如所公開的和技術(shù)人員已知的)相同的氨基酸序列的活性片段，但該序列簡(jiǎn)并成已知的mAb806序列。所謂"筒并"意指不同的三字母密碼子用來指定特定的氨基酸。短語(yǔ)"src抑制劑"涵蓋并且包括降低src表達(dá)或活性、降低src磷酸化位點(diǎn)(尤其是EGFR上的)的磷酸化、或降低src激酶級(jí)聯(lián)信號(hào)的任何調(diào)節(jié)因子。調(diào)節(jié)因子可以包括化學(xué)基團(tuán)(chemicalentity)、肽、抗體或其他此類藥劑等。調(diào)節(jié)因子可以包括激酶抑制劑、磷酸酶等。已有幾種已知的小分子src抑制劑，一些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，例如達(dá)沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4國(guó)氨基-5-(4-甲基苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3,4-d!-嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，4-d-嘧咬)、PD166326。短語(yǔ)"藥物上可接受的"是指分子基團(tuán)和組合物，其在給予人時(shí)為生理上可耐受的，并且通常不產(chǎn)生過敏或類似的不利反應(yīng)，如心嘈、眩暈等。短語(yǔ)"治療有效量"在本文中意指足以防止，優(yōu)選降低至少約20%，更優(yōu)選至少30%，仍然更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少90%的下列現(xiàn)象的量在S期靶細(xì)胞團(tuán)活性的臨床顯著改變；或靶細(xì)胞團(tuán)或腫瘤的大小或體積的顯著改變；或可能與其存在和活性有關(guān)的其他病理特征?？贵w或活性片段可以配制成治療組合物，為中和的藥物上可接受的鹽形式。藥物上可接受的鹽包括酸加成鹽(與具有多肽或抗體分子的游離氨基一起形成)以及與諸如鹽酸、磷酸等無(wú)機(jī)酸或諸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等有機(jī)酸一起形成的那些。由游離羧基形成的鹽也可以由諸如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物等無(wú)機(jī)堿以及諸如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因(procaine)等有機(jī)堿衍生。含有治療抗體或活性片段的組合物通過例如注射單位劑量而進(jìn)行常規(guī)的靜脈內(nèi)給予。術(shù)語(yǔ)"單位劑量"當(dāng)指示本發(fā)明的治療組合物時(shí)是指適合用作人的單位劑量的生理上離散的單元，各單元含有經(jīng)計(jì)算能與所需稀釋劑(即，載體或溶媒)一起產(chǎn)生所需的治療效果的預(yù)定量的活性材料。組合物以與劑量、制劑相匹配的方式以治療有效量給予。要給予的量取決于要治療的受試者、受試者的免疫系統(tǒng)利用活性成分的能力、所需的抑制程度或靶向的腫瘤質(zhì)量。需要給予的活性成分的精確量取決于執(zhí)業(yè)醫(yī)生的判斷，并且每個(gè)個(gè)體都是獨(dú)特的。然而，適宜的劑量可以介于約0.1至20，優(yōu)選約0.5至約10，更優(yōu)選1至若干毫克活性成分/千克個(gè)體體重/天，并且視給藥途徑而定。對(duì)于初始給藥和加強(qiáng)注射的適宜方案也不同，但典型的是初始給藥之后是以一個(gè)或多個(gè)小時(shí)間隔進(jìn)行重復(fù)劑量的后續(xù)注射或另行給藥。或者，構(gòu)思足以維持血液中IO納摩爾至IO微摩爾的濃度的連續(xù)靜脈內(nèi)輸注。如本文所用，"pg"意指皮克，"ng"意指納克，"ug"或"fig"意指微克，2"mg"意指毫克，"ul"或"nl"意指微升，"ml"意指毫升，"1"意指升。因此通過證明抗EGFR抗體，尤其mAb806的抗腫瘤活性提供并提出(raised)了治療和診斷應(yīng)用和方法。如之前所顯示和本文所進(jìn)一步改進(jìn)，本發(fā)明構(gòu)思了EGFR所參與的反應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)中的藥物千擾以調(diào)節(jié)與EGFR突變(包括激酶結(jié)構(gòu)域突變，原發(fā)和繼發(fā)耐性突變)相關(guān)的腫瘤發(fā)生能力。本發(fā)明還提供在哺乳動(dòng)物中治療EGFR介導(dǎo)的癌癥的方法，其包括給予所述哺乳動(dòng)物src抑制劑和抗EGFR抗體。在一個(gè)方面，src抑制劑和抗EGFR抗體同時(shí)給予。在一個(gè)方面，src抑制劑和抗EGFR抗體在傳統(tǒng)化療之前或之后同時(shí)或連續(xù)且重復(fù)給予。所述抗EGFR抗體，尤其mAb806可以在該方法中單獨(dú)給予或與其他抗EGFR抗體聯(lián)合給予。MAb806也可以連續(xù)或與包括下列的其他抗EGFRvIII抗體聯(lián)合給予西妥昔單抗、ABX-EGF(帕尼單抗)、DH8.3、L8A4和/或它們的活性片段。src抑制劑可以在該方法中單獨(dú)給予或可以與一種或多種抗EGFR抗體和任選地一種或多種src抑制劑聯(lián)合給予。所述抗EGFR抗體可以與適宜的載體一起以能通過各種方法有效給予患者的強(qiáng)度制備成藥物組合物?？梢圆捎酶鞣N給藥技術(shù)，尤其是腸胃外技術(shù)，如皮下、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)注射、導(dǎo)管插入等?？贵w或其活性片段的量可以不同，具體應(yīng)根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)師或獸醫(yī)的建議和藥方而定，包括對(duì)本文所提供的結(jié)果和數(shù)據(jù)的考慮。src抑制劑可以與適宜的載體一起以能通過各種方法有效給予患者的強(qiáng)度制備成藥物組合物?？梢圆捎酶鞣N給藥技術(shù)，尤其是腸胃外技術(shù)，如皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)注射、導(dǎo)管插入等；和/或口服給藥或經(jīng)皮給藥或涂覆。src抑制劑的量可以不同，具體應(yīng)根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)師或獸醫(yī)的建議和藥方而定，包括對(duì)本文所提供的結(jié)果和數(shù)據(jù)的考慮。還可制備適于給藥的為一種或多種抗EGFR抗體和一種或多種src抑制劑的聯(lián)合的藥物組合物。本發(fā)明的抗體可以用可檢測(cè)的或功能標(biāo)簽標(biāo)記?？蓹z測(cè)的標(biāo)記包括但不限于放射性標(biāo)記，如同位素311、"C、32P、35S、36C1、slCr、57Co、58Co、59Fe、90Y、mI、124I、125I、131I、mIn、211At、198An、67Cu、225Ac、213Bi、"Tc和^Re，它們可以使用抗體成像領(lǐng)域內(nèi)已知的常規(guī)化學(xué)方法與本發(fā)明的抗體相連。標(biāo)記還包括熒光標(biāo)記和MRI-CT圖像領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)使用的標(biāo)記。它們還包括酶標(biāo)記，如辣根過氧化物酶。標(biāo)記還包括化學(xué)部分，如生物素，其可以通過結(jié)合特定同源可檢測(cè)部分(如，標(biāo)記的親和素)而,皮檢測(cè)到。功能標(biāo)記包括經(jīng)設(shè)計(jì)靶向腫瘤部位引起腫瘤組織破壞的物質(zhì)。這種功能標(biāo)記包括細(xì)胞毒性藥物，如5-氟尿嘧啶或荒麻毒蛋白和諸如細(xì)菌羧肽酶或硝基還原酶等能夠在胂瘤部位將前體藥物轉(zhuǎn)化成活性藥物的酶。放射性標(biāo)記的抗EGFR抗體及其片段可用于體外診斷技術(shù)和體內(nèi)放射成像技術(shù)以及放射免疫治療。在體內(nèi)成像的情況下，本發(fā)明的特異性結(jié)合部分可以與成像劑而非放射性同位素結(jié)合，成像劑包括但不限于磁共振成像增強(qiáng)劑，其中，例如抗體分子用大量順磁離子通過螯和基團(tuán)加載。螯和基團(tuán)的實(shí)例包括EDTA、p卜啉、聚胺冠醚和聚肟。順磁離子的實(shí)例包括軋、鐵、錳、錸、銪、鑭(lanthanium)、鈥和鋱(ferbium)。在本發(fā)明另一方面中，放射性標(biāo)記的特異性結(jié)合部分，尤其抗體及其片段，尤其是放射免疫結(jié)合物，可用于放射免疫治療，尤其是作為放射性標(biāo)記的抗體用于癌癥治療。在又一方面中，放射性標(biāo)記的特異性結(jié)合部分，尤其抗體及其片段，可用于放射免疫引導(dǎo)的手術(shù)技術(shù)，其中它們可以在手術(shù)之前、之中或之后辨別并說明癌細(xì)胞、癌前細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和過度增殖細(xì)胞的存在和/或定位以清除這些細(xì)胞。其中本發(fā)明的特異性結(jié)合部分(尤其抗體及其片段)結(jié)合或連接到其他分子或藥劑上的本發(fā)明免疫結(jié)合物或抗體融合蛋白還包括但不限于結(jié)合至化學(xué)消融劑、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性藥劑、化療劑或藥物的結(jié)合部分。使用多種抗體免疫結(jié)合物的放射免疫治療(RAIT)已經(jīng)進(jìn)入臨床并且證明是有效的。已經(jīng)在結(jié)腸直腸癌中評(píng)價(jià)131I標(biāo)記的抗癌胚抗原(抗CEA)抗體hMN-14(BehrTM等人(2002)Cancer94(4Suppl):1373-81),評(píng)估了在甲狀腺髓樣癌中具有90Y標(biāo)記的相同抗體(SteinR等人(2002)Cancer94(1):51-61)。還評(píng)估和報(bào)道了非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)和胰腺癌使用單克隆抗體的放射免疫治療(GoldenbergDM(2001)CritRevOncolHematol39(1-2):195-201;GoldDV等人(2001)CritRevOncolHematol39(1-2)147-54)。使用特定抗體的放射免疫治療法還描述于美國(guó)專利6,306,393和6,331,175。放射免疫引導(dǎo)的手術(shù)(RIGS)也已經(jīng)進(jìn)入臨床并且證明有效和有用，它們包括4吏用抗CEA抗體和針對(duì)肺瘤相關(guān)抗原的抗體(KimJC等人(2002)IntJCancer97(4):542-7;SchneebaumS等人(2001)WorldJSurg25(12):1495-8;AvitalS等人(2000)Cancer89(8):1692-8;McintoshDG等人(1997)CancerBiotherRadiopharm12(4):187-94)。本發(fā)明的抗體可以經(jīng)由任何適宜的途徑給予需要治療的患者，通常通過注射進(jìn)血流或CSF，或直接注射進(jìn)腫瘤部位。精確的劑量取決于許多因素，包括抗體是用于診斷還是治療、腫瘤的大小和位置、抗體的確切性質(zhì)(是否完整抗體、片段、雙功能抗體等)、以及連接到抗體的可檢測(cè)的或功能標(biāo)記的性質(zhì)。在使用放射性核素治療時(shí)，適宜的最大單劑量為約45mCi/m2至最多約250mCi/m2。優(yōu)選的劑量介于15至40mCi，更優(yōu)選的劑量介于20至30mCi,或10至30mCi。這種治療可能需要骨髓或干細(xì)胞替代。用于腫瘤成像或腫瘤治療的通?？贵w劑量介于0.5至40mg，優(yōu)選l至4mgF(ab，)2形式的抗體。棵抗體的優(yōu)選給予劑量為20至1000mg蛋白/劑量、或20至500mg蛋白/劑量、或20至100mg蛋白/劑量。這是用于成年患者單一治療的劑量，它可以按比例調(diào)節(jié)用于兒童和嬰兒，還可以分子量比例調(diào)節(jié)用于其他抗體形式。治療可以按醫(yī)師的判斯以每天一次、每周兩次、每周一次或每月一次的間隔重復(fù)。src抑制劑的劑量和給藥可以由醫(yī)師或本領(lǐng)域內(nèi)其他技術(shù)人員確定和變化。參考下列非限制性實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例作為本發(fā)明的示例提供。下列實(shí)施例的列舉是為了更充分的例示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，然而，它們不應(yīng)該以任何方式理解為是對(duì)本發(fā)明范圍廣度的限制。實(shí)例1SRC失活或抑制后EGFR特異性抗體的效力增強(qiáng)影響針對(duì)EGFR的治療性單克隆抗體(mAb)效力的因素仍然不夠了解，尤其在膠質(zhì)瘤中。檢測(cè)了兩種EFGR特異性mAb(mAb806和528)抗U87MG源膠質(zhì)瘤異種移植物的效力，這種異種移植物表達(dá)EGFR變體。使用這種方法使得能夠在改變EGFR形式的同時(shí)保持遺傳背景恒定。這些變體包括在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的EGFR組成性活性突變體de2-7EGFR(或EGFRvIII)。mAb的效力與EGFR數(shù)目相關(guān)，然而最重要的因素是受體激活。盡管表達(dá)de2-7EGFR的U87MG異種移植物對(duì)治療有反應(yīng)，但展示死亡激酶de2-7EGFR的那些是不反應(yīng)的。具有激酶活性但是自磷酸化缺陷型的經(jīng)修飾的de2-7EGFR也有反應(yīng)，這表明這些mAb在表達(dá)de2-7EGFR的異種移植物中通過阻斷磷酸根轉(zhuǎn)移起作用。由于表達(dá)de2-7EGFR的U87MG還共表達(dá)wtEGFR，所以還在分離物中測(cè)試了mAv抗表達(dá)de2-7EGFR的NR6異種移植物的效力。盡管mAb806表現(xiàn)出對(duì)NR6異種移植物的抗腫瘤活性，但mAb528治療是無(wú)效的，這表明mAb528通過破壞de2-7和wtEGFR之間的相互作用介導(dǎo)其抗肺瘤活性。最后，表達(dá)de2-7EGFR的U87MG異種移植物中的基因破壞顯著增強(qiáng)了mAb806的效力。在膠質(zhì)瘤中EGFR特異性抗體的有效使用依賴于具有活化EGFR的肺瘤的鑒別。EGFR和Src抑制劑的聯(lián)合制劑提供了治療膠質(zhì)瘤的新且有效的策略。背景表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)是具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。在許多表皮腫瘤中都觀察到EGFR的過量表達(dá)，它通常與較差的臨床預(yù)后有關(guān)(l-3)。EGFR的過量表達(dá)可能由EGFR基因擴(kuò)增導(dǎo)致，尤其在膠質(zhì)瘤中(4)。在膠質(zhì)瘤中，基因擴(kuò)增與最常見的突變EGFR重排有關(guān)，該突變de2-7EGFR(或EGFRvIII)的特征在于跨越編碼序列的外顯子2至7的801個(gè)堿基對(duì)框內(nèi)缺失(4-6)。這種重排導(dǎo)致來自胞外結(jié)構(gòu)域的267個(gè)氨基酸缺失和在融合位點(diǎn)一個(gè)新的甘氨酸插入，所有這些產(chǎn)生了獨(dú)特的連接肽。盡管de2-7EGFR不能結(jié)合任何已知的配體，但是受體表現(xiàn)出低水平的組成性激活并且能夠增強(qiáng)膠質(zhì)瘤和乳腺癌異種移植物的生長(zhǎng)(7，8)。抑制EGFR是開發(fā)新的癌癥治療法的合理策略?？赡艿闹委煼òㄡ槍?duì)EGFR的單克隆抗體(mAb)(例如，C225、ABX-EGF、EMD55900)(9-ll)和EGFR的小分子量酪氨酸激酶抑制劑(TKI)(例如，ZD1839、OSI774)(12)。事實(shí)上，這些治療法的一些已在肺癌(ZD1839,Iressa)和結(jié)腸癌(C225，Erbitux)的有限臨床應(yīng)用中得到批準(zhǔn)。從這些臨床試驗(yàn)很清楚的是并非所有EGFR陽(yáng)性的患者對(duì)這些靶向治療法都有反應(yīng)(表1)。從患者的福利和經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)來看，確定引起患者對(duì)EGFR治療法易感的因素是重要的目標(biāo)。同樣理解耐EGFR治療法的性質(zhì)可以有助于確定克服它的方法。表1與對(duì)EGFR治療法敏感性相關(guān)的細(xì)胞方面<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>水平的EGFR表達(dá)。其次，在EGFR失活后，維持通過PI3激酶/Akt通路的信號(hào)傳導(dǎo)的能力降低TKI的效力(表l)。這些研究大部分在體外進(jìn)行，因此不知道這些觀察結(jié)果在體內(nèi)環(huán)境中是否仍然正確。最近，一些研究分析了用易瑞沙(Iressa)(ZD1839)治療的肺癌患者中EGFR基因的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)對(duì)治療反應(yīng)的患者通常獲得了激酶結(jié)構(gòu)域的功能突變(表l)。此外，還描述了導(dǎo)致易瑞沙抗性的繼發(fā)性激酶突變(表1)。然而最初的研究表明，這些現(xiàn)象并不普遍，而且肺癌患者中所述的突變并沒有在其他類型的腫瘤中觀察到。使用抗EGFR抗體的研究的有限數(shù)量使得很難得出任何關(guān)于對(duì)這些藥劑易感性的概括(表1)。除了缺乏體內(nèi)研究之外，這些易感性研究中的一些是用細(xì)胞板進(jìn)行的，考慮到細(xì)胞系之間信號(hào)通路以及是否存在其他ErbB家族成員不同，使得很難確定與EGFR敏感性或抗性相關(guān)的單獨(dú)因素。為了解決這些問題中的一些，我們檢測(cè)了體內(nèi)U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞系對(duì)兩種EGFR特異性抗體的易感性，該細(xì)胞系表達(dá)適中水平的野生型(wt)EGFR。然后，我們用一些wt和de2-7EGFR構(gòu)建體轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞以確定受體的數(shù)目和活化對(duì)抗體治療易感性有何影響。此研究中所用的兩種抗體為mAb806和528。MAb806是針對(duì)表達(dá)de2-7EGFR的細(xì)胞產(chǎn)生的新型抗EGFR特異性抗體(13)。有趣的是，盡管mAb806清楚地結(jié)合de2-7EGFR,但是它還結(jié)合wtEGFR的一個(gè)亞型(約10%)，該亞型在過量表達(dá)該受體的細(xì)胞表面上表達(dá)(13)。最近的分析表明所述mAb806表位僅在受體由其失活狀態(tài)向活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化時(shí)過渡存在的EGFR構(gòu)象形式中暴露(14)。與wtEGFR不同，de2-7EGFR在此過渡構(gòu)象中是組成性的，因此可用于mAb806結(jié)合。我們先前的研究已顯示用mAb806處理表達(dá)de2-7或過量表達(dá)wtEGFR的異種移植物會(huì)引起腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制(15-17)。同時(shí)，制備和分離了528抗體作為鼠源C225抗體(Erbitux)，其表現(xiàn)出了類似的性質(zhì)(18)。MAb528用作配體拮抗劑，抑制體外和體內(nèi)作為異種移植物生長(zhǎng)的表達(dá)EGFR的細(xì)胞生長(zhǎng)(18)。材料和方法細(xì)胞系和單克隆抗體U87MG轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系U87MG.A2-7、U87MG.DK、U87MG.wt、U87MG.DY5和U87MG.DY2已在其他地方有詳細(xì)描述(16，19)。A431細(xì)胞系之前也已有所描述(20)。所有細(xì)胞系都保持在含有下列物質(zhì)的DMEM(DMEM/F12;LifeTechnologies,Inc，GrandIsland,NY)或RPMI中10%FCS(CSL，Melbourne,Victoria,Australia),2mM谷氨酰胺(SigmaChemicalCo,St.Louis,MO)、和青霉素/鏈霉素(LifeTechnologies,Inc，GrandIsland,NY)。此外，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系保持在400mg/ml的遺傳霉素(LifeTechnologies,Inc，Melbourne,Victoria,Australia)中。mAb806和528在生物制備機(jī)構(gòu)(澳大利亞墨爾本的路德維格研究所)制備?？笶GFR特異性酪氨酸磷酸化位點(diǎn)的抗體和兔多克隆抗EGFR抗體得自CellSignalingTechnology(Danvers，MA)。用小鼠單克隆抗體v-src327(OncogeneResearchProducts,CA，USA)或c-SrcH-12(SantaCruzBiotechnology,Inc，CA，USA)檢測(cè)src。兔多克隆抗體PY418(BioSouceInternational,Inc"CA，USA)用于檢測(cè)磷酸國(guó)Src?？沽姿崂野彼峥贵w4G10購(gòu)自UpstateBiotechnology(LakePlacid,NY)。C13用于檢測(cè)野生型和平截的EGFR，其得自BDTransductionLaboratory(SanDiego,Ca)。U87MG.A2-7DNSrc細(xì)胞系的制備顯性負(fù)相(dominantnegative,DN)激酶死亡Src構(gòu)建體(K296R/Y528F)得自UpstateBiotechnology(LakePlacid,NY,USA)。將含有DNSrc的HindIII片段亞克隆到得自InvitrogenLifeTechnologies(Carlsvad,CA)的pcDNA3.1/Hygro(+)栽體中，所得構(gòu)建體通過電穿孔轉(zhuǎn)染到U87MG.A2-7細(xì)胞。還制備僅用pcDNA3.1/Hygro栽體轉(zhuǎn)染的第二細(xì)胞系。將lml等分試樣中的細(xì)胞鋪到96孔板上，密度為約2xl(^細(xì)胞/孔，在37'C下醉育48小時(shí)，然后添加100ng/ml潮霉素(RocheDiagnostic,Mannheim，Germany)。獲得克隆后(約兩周)，將細(xì)胞放回400照/ml遺傳霉素以及潮霉素中。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞首先通過FACS分析篩選以確定其保持de2-7EGFR的表達(dá)。然后將克隆進(jìn)行全細(xì)胞裂解或免疫沉淀，之后用Src特異性抗體(v-Src327、c-SrcH-12)進(jìn)行western印跡。鑒別并擴(kuò)增表現(xiàn)出顯著增高水平的總src(Src水平在原始細(xì)胞系中極低)的幾個(gè)克隆。然后通過用v-Src327抗體免疫沉淀35S標(biāo)記的細(xì)胞裂解物，對(duì)所得沉淀進(jìn)行SDS-PAGE和定量放射自顯影來進(jìn)一步確定增加的Src水平。選擇表達(dá)最高水平DNSrc的克隆，據(jù)顯示DNSrc在Y418位處磷酸化，這表明它凈皮正確折疊。體外生長(zhǎng)分析按照以前的詳細(xì)描述檢測(cè)體外mAb806和528的抗增殖效果。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞以lxl04細(xì)胞/孔接種在24孔板上，細(xì)胞在含有0.5%FCS的培養(yǎng)基中。4天后用胰蛋白酶移除細(xì)胞并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)?？贵w以100ng/ml的終濃度使用，該濃度與異種移植物中所得到的一致。異種移植物模型將在100plPBS中的腫瘤細(xì)胞(3xl0M皮下接種至4至6周齡的雌性棵鼠(AnimalResearchCentre,Perth,Australia)兩側(cè)腹。所有研究都4吏用如先前報(bào)道建立的腫瘤模型來進(jìn)行(15，16)。當(dāng)腫瘤達(dá)到約100mm3的平均體積時(shí)開始處理。使用公式(長(zhǎng)x寬"/2來確定肺瘤體積(mm3),其中長(zhǎng)為最長(zhǎng)的軸，寬為與長(zhǎng)呈直角的尺寸。每個(gè)處理組數(shù)據(jù)表示為平均腫瘤體積士SE。所有數(shù)據(jù)通過學(xué)生t檢驗(yàn)分析顯著性。每個(gè)研究中每組最少使用IO個(gè)異種移植物。免疫印跡將細(xì)胞在冷裂解緩沖液(30mMHEPES、150mMNaCl;10mMNaF;1%TritonX-100;200Na03V;0.4%H202和含有500AEBSF、150nM抑肽酶、1fiME-64蛋白酶抑制劑、0.5mMEDTA和1jiM亮肽酶素的蛋白酶抑制劑混合物1(Calbiochem，SanDiego,CA)，pH7.4)。用mAb806或528免疫沉淀裂解物，通過我們?cè)敿?xì)描述的免疫印跡分析所得沉淀物(21)。免疫熒光顯微術(shù)使用花青素3(Cy3)單克隆抗體標(biāo)記試劑盒(AmershamPharmaciaBiotechUKLtd，Buckinghamshire,England)根據(jù)廠家的說明用Cy3直接標(biāo)記Mab806和528。通過結(jié)合U87MG.A2-7細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析來確定成功標(biāo)記的抗體。早期內(nèi)體特異性的抗小鼠早期內(nèi)體自身抗原1(EEA1)單克隆抗體購(gòu)自Transduction實(shí)驗(yàn)室(SanDiego,CA,U.S.A.)。Cy2結(jié)合的AffiniPureF(ab，)2片段驢抗小鼠IgG二抗和未標(biāo)記的AffiniPureFab片段羊抗小鼠IgG封閉抗體購(gòu)自JacksonImmimoResearch實(shí)驗(yàn)室(WestGrove,PA，U.S.A.)。在37。C下在補(bǔ)充有10%FBS、青霉素/鏈霉素和谷氨酸鹽的MEM(GibcoBRLGrandIsland,NY，U.S.A.)中使U87MG.A2-7或NR6.A2-7細(xì)胞在12mm玻璃蓋玻片或12mmBiocoat細(xì)胞環(huán)境聚-D-賴氨酸蓋玻片(BectonDickinsonLabware，Bedford,MA，U.S.A.)上生長(zhǎng)。在存在0.25。/。牛血清白蛋白(BSA)(SigmaChemicalCo"StLouis,MO，U.S.A.)的條件下進(jìn)行抗體與細(xì)胞的結(jié)合。Cy3結(jié)合的mAb806和528分別以5ng/ml和2jig/ml的濃度4吏用，表面標(biāo)記在加濕條件下在4'C下進(jìn)行20分鐘。將細(xì)胞在冰冷的0.25y。牛血清白蛋白(BSA)/PBS中洗滌3次。表面結(jié)合抗體的內(nèi)化通過在37。C下孵育各蓋玻片而開始。在內(nèi)化不同時(shí)間段之后，將各蓋玻片從37。C移出，在水冷的BSA/PBS中洗滌3次終止內(nèi)化，將其在室溫下在4。/。PFA中固定20分鐘。然后將蓋玻片在BSA/PBS中洗滌，之后在雙蒸水(DDW)中洗滌，用fluoromountG封固劑(SouthernBiotechnology,Birmingham,AL，U.S.A.)將其封固在玻璃栽玻片上。用共聚焦顯微鏡(MkonInstechCo.,Ltd.,Kanagawa，Japan)使用適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)設(shè)置分析樣品。對(duì)于共定位研究，用0.1。/。tritonX-100將細(xì)胞透化l分鐘。然后，洗滌樣品，在室溫下用未標(biāo)記的山羊抗小鼠Fab片段孵育20分鐘以封閉所有存在的小鼠結(jié)合位點(diǎn)(即，內(nèi)化的mAb806或528)。然后在BSA/PBS中洗滌樣品，之后在室溫下用抗EEA1孵育20分鐘。最后洗滌細(xì)胞，用Cy2結(jié)合的驢抗小鼠F(ab，)2二抗片段孵育。綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的溶酶體糖蛋白120(lgp-120國(guó)GFP)的DNA載體由IraMellman教授和來自耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院(NewHaven，CT，U.S.A.)的細(xì)胞生物學(xué)系的教授友情提供。細(xì)胞生長(zhǎng)在含有包埋的14mm玻璃蓋玻片的mat-tek玻璃底微孔皿(MatTekCorp.Ashland，MA，U.S.A.)中，使用LipofectAMINE試劑(InvitrogenLifeTechnologies,Mulgrave，Vie,Australia)按照廠家的說明對(duì)這些細(xì)胞轉(zhuǎn)染過夜。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的共聚焦成像，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞在用488nm波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)發(fā)綠色熒光。結(jié)果體外和體內(nèi)敏感性之間的相關(guān)性表l中所述的許多研究已在體外進(jìn)行。我們用靶向EGFR治療的mAb和TKI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)均清楚地表明體外敏感性與體內(nèi)反應(yīng)不完全相關(guān)。事實(shí)上，我們最近公開的一個(gè)實(shí)施例中，兩種細(xì)胞系在體外表現(xiàn)出對(duì)EGFR特異性TKIAG1478類似的敏感性，但它們對(duì)相同藥劑的體內(nèi)反應(yīng)則顯著不同(22)。使用先前所述的用于C225的標(biāo)準(zhǔn)體外生長(zhǎng)抑制分析和與異種移植物部位所達(dá)到的濃度一致的抗體濃度，我們?cè)隗w外抗體抑制和體內(nèi)抗腫瘤活性之間看到了很小的相關(guān)性(參見表2)。mAb528或806在體外均不抑制U87MG.A2-7細(xì)胞的生長(zhǎng)，^f旦是兩種抗體在體內(nèi)都顯示出很強(qiáng)的抗腫瘤活性，該活性不依賴于免疫效應(yīng)子功能(參見圖2)。并且，即使一種耙向EGFR的抗體在特定細(xì)胞系顯示出體外與體內(nèi)的相關(guān)性(例如，mAb528在A431細(xì)胞和異種移植物中，表2)，這也不一定表明另一EGFR特異性抗體在相同的細(xì)胞系中是相關(guān)的(例如，mAb806在A431細(xì)胞和異種移植物中，表2)。此樣品分析與我們之前的觀察結(jié)果一起清楚地表明體外分析在確定對(duì)EGFR治療法敏感性中價(jià)值有限。表2對(duì)EGFR治療法敏感性的體外和體內(nèi)比較細(xì)胞系U87MG.A2-7A431mAb528mAb806mAb528mAb806體外--++體外*+++++*A431異種移植物的體外數(shù)據(jù)來自我們最近的論文(16)表達(dá)不同形式EGFR的U87MG膠質(zhì)瘤異種移植物的抗體治療將表達(dá)中等水平的wtEGFR的親本U87MG細(xì)胞、或用額外wtEGFR、de2-7EGFR或各種《奮飾形式的de2-7EGFR(圖1)轉(zhuǎn)染的相同細(xì)胞系皮下注射到棵鼠中以建立腫瘤異種移植物。在異種移植物達(dá)到約100mmS時(shí)開始用抗體處理。用1mgmAb528或806處理所有腫瘤2周，每周3次。選擇這樣的抗體治療劑量和方案其在我們的標(biāo)準(zhǔn)U87MG.A2-7異種移植物模型中引起強(qiáng)的抗肺瘤反應(yīng)，但是不足以有效以致于在其他U87MG源細(xì)胞系(含有不同EGFR變體)中可能看到的任何抗腫瘤活性增加不明顯。如下面所詳細(xì)討論，mAb806和528的抗腫瘤效力在所有的U87MG源膠質(zhì)瘤異種移植物中是類似的(圖2)。1、親本細(xì)胞(U87MG):盡管事實(shí)上U87MG異種移植物表達(dá)中等水平的EGFR(約5xl0"受體/細(xì)胞)，但兩種抗體都不抑制U87MG異種移植物的生長(zhǎng)(13)。2、過量表達(dá)wtEGFR的細(xì)胞(U87MG.wt):用wtEGFR轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞來增加表達(dá)(約"106受體/細(xì)胞)并不改變異種移植物的體內(nèi)生長(zhǎng)速率(圖3A)但是確實(shí)引起腫瘤變得對(duì)兩種抗體都敏感。這對(duì)于mAb806來說并不奇怪，因?yàn)樗鼉?yōu)先結(jié)合過量表達(dá)wtEGFR的細(xì)胞，而對(duì)于mAb528來說則有些出乎意料，因?yàn)檫@表明即使在不存在表型改變的條件下受體數(shù)目的增加也能誘導(dǎo)對(duì)抗體治療的反應(yīng)。在第31天，當(dāng)處死對(duì)照組時(shí)，mAb528誘導(dǎo)的抑制是顯著的(p〈0.01),溶媒組中異種移植物的平均腫瘤體積為950mm3,相比之下在mAb528處理組中的為450mm3。在第39天mAb806實(shí)驗(yàn)的分析表明抗體處理顯著抑制異種移植物生長(zhǎng)(p〈0.001)，其中PBS和mAb806組的肺瘤體積分別為960mm3和470mm3。3、表達(dá)de2-7EGFR的細(xì)胞(U87MG.A2-7):用組成活性的但不依賴于配體的de2-7EGFR轉(zhuǎn)染的U87MG異種移植物的生長(zhǎng)也^L兩種抗體抑制(圖2)。與wtEGFR過量表達(dá)不同，在內(nèi)源wtEGFR的存在下共表達(dá)de2-7EGFR會(huì)對(duì)U87MG異種移植物產(chǎn)生顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)(圖3B)。該受體的組成性磷酸化用免疫印跡來確定(圖4)。用mAb528處理顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)(p〈0.005),其中在接種后第20天溶媒組的平均腫瘤體積為1170mm3，相比之下mAb528組為510mm3。考慮到mAb528的主要功能祐:認(rèn)為是配體拮抗，其對(duì)表達(dá)不依賴配體的de2-7EGFR的異種移植物的抗肺瘤活性是意料之外的。因此，mAb528可能通過其阻斷配體能力之外的其他機(jī)制破壞EGFR信號(hào)傳導(dǎo)。同樣，在這些細(xì)胞中僅結(jié)合de2-7EGFR而不結(jié)合wtEGFR的mAb806—定不依賴于對(duì)配體相互作用的任何影響而介導(dǎo)其抗腫瘤活性，因?yàn)樗种票磉_(dá)de2-7EGFR的異種移植物生長(zhǎng)的水平與mAb528類似。在第21天，當(dāng)挑出溶媒組時(shí)，對(duì)照異種移植物的平均腫瘤體積為1500mm3,相比之下mAb806處理組中則顯著較低，為390mm3(p<0.0001)。因此兩種抗體都可以抑制表達(dá)不依賴配體4旦是為組成性活性形式的EGFR的膠質(zhì)瘤異種移植物。4、表達(dá)de2-7EGFR死亡激酶形式的細(xì)胞(U87MG.DK):用de2-7EGFR死亡激酶(DK)形式轉(zhuǎn)染的U87MG細(xì)胞作為異種移植物以類似于親本細(xì)胞的速率生長(zhǎng)(圖3B),并且生長(zhǎng)不被任一抗體顯著抑制(圖2)。這種受體缺乏與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的主要位點(diǎn)的磷酸化，但是保留著與受體內(nèi)化和降解相關(guān)的位點(diǎn)的磷酸化(圖4)。兩種抗體與這些細(xì)胞的結(jié)合在體外和體內(nèi)都與表達(dá)de2-7EGFR的細(xì)胞中所看到的類似(16)。此外，由于de2-7EGFR的DK變體僅含有單個(gè)胞內(nèi)點(diǎn)突變，結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域的mAb806和528的親和力不應(yīng)有變化。這個(gè)結(jié)果表明在體外由這些抗體介導(dǎo)的任何免疫效應(yīng)子功能不足以啟動(dòng)抗腫瘤反應(yīng)。此外，這表明抗EGFR抗體的抗肺瘤活性需要具有功能激酶結(jié)構(gòu)域的受體。5、表達(dá)2個(gè)自磷酸化主要位點(diǎn)缺失形式的de2-7EGFR的細(xì)胞(U87MG.DY2):表達(dá)在兩個(gè)主要的自磷酸化位點(diǎn)不能自磷酸化的de2-7EGFR構(gòu)建體(酪氨酸1068和1173變?yōu)楸奖彼?的U87MG異種移植物在作為腫瘤異種移植物生長(zhǎng)時(shí)被兩種抗體顯著抑制(對(duì)于mAb528和806分別為p<0.01和0.006)(圖2)。這種觀察結(jié)果結(jié)合缺乏抗U87MG.DK異種移植物的活性表明，與自磷酸化相對(duì)的激酶活性與抗體治療的反應(yīng)性相關(guān)。6、表達(dá)不能自磷酸化形式的de2-7EGFR的細(xì)胞(U87MG.DY5):表達(dá)在與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的所有5個(gè)主要自磷酸化位點(diǎn)都不能自磷酸化的de2-7EGFR構(gòu)建體(酪氨酸1173、1148、1086、1068和992變?yōu)楸奖彼?的U87MG細(xì)胞作為腫瘤異種移植物生長(zhǎng)。這種受體缺乏在與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的主要位點(diǎn)的磷酸化，但是保持在與受體內(nèi)化和降解相關(guān)的位點(diǎn)的磷酸化(圖4)。與用DY2異種移植物所獲得的結(jié)果一致，兩種抗體都顯著抑制表達(dá)DY5de2-7EGFR構(gòu)建體的異種移植物的生長(zhǎng)(對(duì)兩種抗體均為p〈0.0001)(圖2)?？紤]到這個(gè)有些出乎意料的結(jié)果，我們用兩種抗體在較低的劑量(0.5與lmg/注射)重復(fù)了此實(shí)驗(yàn)，又一次在兩種情況下都得到了腫瘤生長(zhǎng)的顯著抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。由于de2-7EGFR的DY5形式不能夠直接結(jié)合對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)很關(guān)鍵的銜接分子，這表明活性激酶結(jié)特征。表達(dá)高水平的de2-7EGFR的U87MG異種移植物的處理圖2中的數(shù)據(jù)表明異種移植物對(duì)EGFR信號(hào)傳導(dǎo)變得越依賴，其越可能對(duì)EGFR特異性抗體治療反應(yīng)。因此，我們使用FACS分選分離了表達(dá)極高水平de2-7EGFR的細(xì)胞(U87MG.A2陽(yáng)7高)(圖5A)。U87MG.A2-7高異種移植物比原始U87MG.A2-7異種移植物生長(zhǎng)得快(圖5B),這表明這些異種移植物的快速生長(zhǎng)依賴于高水平的de2-7EGFR。由異種移植物裂解物的免疫印跡測(cè)定體內(nèi)保持de2-7EGFR表達(dá)水平(圖5C)。用mAb806或mAb528處理引起顯著的U87MG.A2-7高異種移植物抑制，該抑制比任何其他U87MG源細(xì)胞系所觀察到的都強(qiáng)(圖5D)。在第18天，當(dāng)由于倫理原因處死對(duì)照組時(shí)，溶媒、mAb806和mAb528組的平均腫瘤體積分別為1760、卯和90mm3(p〈0.001)。顯著的是，雖然在任何之前的U87MG源治療研究中沒有完全的消退(圖2)，40°/。的mAb806處理的和20%的mAb528處理的U87MG.A2-7高異種移植物完全消退。mAb腫瘤中的一個(gè)在接種后第46天復(fù)發(fā)而其他的腫瘤直到第126天小鼠被處死時(shí)都沒有復(fù)發(fā)。因此通過過量表達(dá)組成活性形式的EGFR而得到的異種移植物對(duì)EGFR特異性抗體更加敏感。所建立的NR6源異種移植物的mAb806和528治療NR6鼠成纖維細(xì)胞系不內(nèi)源表達(dá)任何ErbB家族成員(23)，我們用EGFR、ErbB2和ErbB3的FACS確定該現(xiàn)象(數(shù)據(jù)未顯示)。然后用人de2-7EGFR穩(wěn)、定轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞(NR6.A2-7)。由于用于測(cè)試mAb806和528抗de2-7EGFR效力的所有U87MG源細(xì)胞系還共表達(dá)wtEGFR,所以我們估計(jì)它們?cè)诰哂兴⒌腘R6.A2-7異種移植物的小鼠中的治療效力。mAb806處理導(dǎo)致總體腫瘤生長(zhǎng)速率與溶媒相比降低，該降低在接種后第42天特別顯著(p0.003)(圖6)。治療最后一天(第39天)溶媒和mAb806處理組的平均腫瘤體積分別為1520和670mm3(圖6A)。還用mAb528處理具有所建立的NR6.A2-7異種移植物的小鼠。在接種后第56天，當(dāng)由于倫理原因處死動(dòng)物時(shí)，用mAb528處理的肺瘤大小與溶媒處理的異種移植物不同(圖6B)。我們用略微不同的程序用mAb528進(jìn)行了第二種治療實(shí)驗(yàn)，其中小鼠接受抗體3周，每周2次。在這些條件下，mAb528還是不能抑制所建立的NR6.A2-7異種移植物的生長(zhǎng)(圖6C)。因此，與mAb806不同，mAb528在不存在wtEGFR的條件下不能抑制表達(dá)de2-7EGFR的異種移植物。Src活性調(diào)節(jié)表達(dá)de2-7EGFR的異種移植物對(duì)抗體治療的反應(yīng)性由于mAb806和528抑制表達(dá)DY5形式的de2-7EGFR的異種移植物，并且由于兩種抗體在體內(nèi)作為單獨(dú)藥劑都不減少de2-7EGFR磷酸化(16)，所以4艮可能這些抗體通過破壞de2-7EGFR下游把標(biāo)的磷酸才艮轉(zhuǎn)移而介導(dǎo)它們的抗腫瘤活性。我們用NR6.A2-7異種移植物的觀察結(jié)果表明mAb528的抗肺瘤活性取決于de2-7EGFR與另一ErbB家族成員的共表達(dá)，而mAb806活性則不依賴這種相互作用。因此，我們檢測(cè)de2-7EGFR是否能與src相互作用、wtEGFR的情況下如何、以及這種可能的相互作用是否與mAb806效力有關(guān)。wtEGFR的激活導(dǎo)致Src激酶瞬時(shí)活化。Src活化以協(xié)同方式導(dǎo)致EGFR上的酪氨酸845(Y845)磷酸化，該位點(diǎn)不是自磷酸化位點(diǎn)而是src磷酸化的靶標(biāo)(24)。我們用Y845特異性的抗體檢測(cè)了de2-7EGFR中Y845的磷酸化。當(dāng)在U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，de2-7EGFR顯示出Y845的強(qiáng)磷酸化(圖7A)。通過用src家族激酶的抑制劑PP1和PP2孵育細(xì)胞快速阻斷Y845位的磷酸化，而Y1173位的自磷酸化位點(diǎn)則相對(duì)不受影響(圖7A)。考慮到de2-7EGFR似乎是Src激酶磷酸化的靶標(biāo)，其方式與wtEGFR類似，我們?cè)噲D確定這種相互作用是否是mAb806活性的關(guān)鍵。首先，我們構(gòu)建了含有Y845F取代基的de2-7EGFR,然而此蛋白在多個(gè)位點(diǎn)顯示出降低的磷酸化(Johns,未公開的觀察結(jié)果)，因此認(rèn)為不適于這些研究。因此，如材料方法中所述，我們開發(fā)了共表達(dá)de2-7EGFR和DNSrc的U87MG細(xì)胞系(U87MG.A2-7oNSrc)。U87MG.A2國(guó)7麗src異種移植物在棵鼠中作為腫瘤異種移植物生長(zhǎng)，但是速率比用載體對(duì)照轉(zhuǎn)染的U87MG.△2-7慢(圖7B)。用mAb806處理U87MG.A2-7麗^導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的強(qiáng)烈抑制(圖7C)。在接種后第34天，溶媒組的平均異種移植物體積為1220mm3,而mAb806處理組為100mm3(p<0.001)(圖7C)。此外，在mAb806處理組中所有U87MG.A2-7dn^異種移植物的60%完全消退，并且到接種后第50天尚未復(fù)發(fā)。因此抑制Src信號(hào)傳導(dǎo)增加了mAb806治療的效力(圖7Ccf圖2)。U87MG.A2-7細(xì)胞中mAb806的內(nèi)化。mAb806在結(jié)合U87MG.△2-7細(xì)胞中表達(dá)的de2-7EGFR后的胞內(nèi)運(yùn)輸通過共聚焦顯微鏡來研究。在4'C下mAb806Cy3孵育之后和在37。C下示蹤之前，結(jié)合至de2-7EGFR的mAb806沿原生質(zhì)膜定位(圖8A;0分鐘，mAb806-Cy3)。37。C下孵育之后，觀察到mAb806易位至小的、點(diǎn)狀胞質(zhì)嚢泡上。然后用鑒別早期內(nèi)體的抗早期內(nèi)體自身抗原1(EEA1)進(jìn)行免疫染色，如由黃色熒光的存在所呈現(xiàn)的，其顯示出與mAb806的部分共定位(圖84;融合)。在37°C下示蹤60分鐘后，共定位最少(圖8A;融合，60分鐘)，這表明大部分抗體已經(jīng)移出了早期胞吞區(qū)室。這些觀察結(jié)果表明mAb806在內(nèi)化后立即定位在早期胞吞區(qū)室上，然后移動(dòng)到另外的位置，之后進(jìn)入其胞內(nèi)運(yùn)輸循環(huán)。通過在用lgp-120-GFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的共定位分析，在U87MG.△2-7細(xì)胞中進(jìn)行了de2-7EGFR結(jié)合和內(nèi)化后mAb806的溶酶體共定位(圖8B)。陽(yáng)性轉(zhuǎn)染lgp-120-GFP的細(xì)胞顯示出胞質(zhì)核周綠色熒光，這與預(yù)期的定位到溶酶體區(qū)室一致(圖8B;lgp-120-GFP)。在誘導(dǎo)內(nèi)化之前，mAb806-Cy3僅在細(xì)胞表面檢測(cè)到(圖8B,0分鐘，mAb806-Cy3)，其不與lgp-120-GFP共定位(圖8B;0分鐘，融合)。在升溫至37。C達(dá)30分鐘后，觀察到了對(duì)應(yīng)于內(nèi)化mAb806的小胞內(nèi)嚢泡結(jié)構(gòu)(圖8B;30分鐘后，mAb806-Cy3)。這些結(jié)構(gòu)中的一些與lgp-120-GFP共定位，然而大部分的紅色和綠色信號(hào)仍然是分開的(圖8B;30分鐘后，融合)。在37C進(jìn)行60和120分鐘后的較長(zhǎng)時(shí)間孵育引起內(nèi)化的mAb806-Cy3與lgp-120-GFP共定位增加(圖8B;60-120分鐘后，融合)。這些觀察結(jié)果與如下的假說一致mAb806最初穿過早期內(nèi)吞區(qū)室，但長(zhǎng)時(shí)間后移入其在此聚集的溶酶體區(qū)室。在結(jié)合87MG.A2-7細(xì)胞上所表達(dá)的de2-7EGFR之后的mAb806內(nèi)化也用電子顯微鏡分析。在37。C孵育5分鐘后，在類似網(wǎng)格蛋白包被的凹陷結(jié)構(gòu)中觀察到了對(duì)應(yīng)于mAb806的金粒(圖9A和B)。還在位于胞質(zhì)內(nèi)的游離的網(wǎng)格蛋白包被的嚢泡中檢測(cè)到金粒(圖9C)。在類似膜小內(nèi)陷的結(jié)構(gòu)中沒有觀察到金粒(圖9D)。在37'C示蹤IO分鐘后，mAb806定位至類似早期內(nèi)吞區(qū)室的大的管狀嚢泡結(jié)構(gòu)(圖9E)。30分鐘的較長(zhǎng)示蹤階段引起抗體定位在類似多泡體的結(jié)構(gòu)中(圖9F)。這些觀察結(jié)果與表明mAb806與lgp-120在30與60分鐘之間共定位的免疫熒光顯微鏡數(shù)據(jù)一致。MAb806和528在NR6.A2-7細(xì)胞中的內(nèi)化考慮到mAb806和528抗NR6.A2-7異種移植物的治療效力不同，在這個(gè)細(xì)胞系中研究了每一抗體的內(nèi)化特征。此外，由于NR6.A2-7細(xì)胞不表達(dá)任何內(nèi)源的ErbB家族成員，這個(gè)細(xì)胞系可以測(cè)定這些抗體內(nèi)化是否需要wtEGFR的存在。如所預(yù)期，在4。C下用mAb806-Cy3孵育細(xì)胞顯示出膜染色沒有胞內(nèi)熒光(圖10;mAb806,0分鐘)。與U87MG.A2-7細(xì)胞相反(圖8)膜染色不均勻。更強(qiáng)的染色與細(xì)胞間的膜連接(圖10;mAb806，0分鐘)和翁著斑(圖10;mAb806，0分鐘)有關(guān)。一些細(xì)胞顯示極少的膜染色(圖10;mAb806，0分鐘)。將溫度增至37'C誘導(dǎo)內(nèi)化后，觀察到了特征性胞內(nèi)點(diǎn)狀嚢泡結(jié)構(gòu)。這些以核周形式的聚集(圖10;mAb52815至60分鐘)與迅速的溶酶體定位一致。mAb528的初始定位(圖10;mAb528，0分鐘)和隨后的內(nèi)化(圖10;mAb528，1-60分鐘)與mAb806相同。因此，兩種抗體在結(jié)合至de2-7EGFR后即4吏在不存在wtEGFR的條件下也都迅速內(nèi)化到溶酶體區(qū)室。討論mAb528,許多但并非所有的先前研究表明細(xì)胞表面的EGFR數(shù)目是影響靶向EGFR的治療法(尤其TKI)效力的一個(gè)因素(表l)。然而，這些實(shí)驗(yàn)通常比較了使用不同細(xì)胞系的抗腫瘤活性，因此沒有關(guān)于下列方面的對(duì)照遺傳背景、其他ErbB家族成員的存在和能夠調(diào)節(jié)EGFR信號(hào)通路的其他功能受體/激酶的出現(xiàn)。此外，這些研究中的許多在體外進(jìn)行，而我們已經(jīng)表明體外與體內(nèi)活性并不相關(guān)。將wtEGFR數(shù)目增加IO倍能將U87MG膠質(zhì)瘤異種移植物由mAb528抗性轉(zhuǎn)化為抗體反應(yīng)性。由于wtEGFR數(shù)目增加并不改變U87MG異種移植物的生長(zhǎng)速率，所以抗腫瘤活性的獲得并不簡(jiǎn)單地是mAb528抑制所誘導(dǎo)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的結(jié)果。U87MG.wtEGFR異種移植物中更多wtEGFR的存在幾乎一定會(huì)引起抗體在腫瘤部位定位增加。考慮到mAb528具有低、但是可檢測(cè)的免疫效應(yīng)子功能(25),抗體在腫瘤部位的水平增加可以增加補(bǔ)體沉積和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)抑制的免疫細(xì)胞募集。然而，根據(jù)我們關(guān)于U87MG.DK異種移植物的數(shù)據(jù)，mAb528在啟動(dòng)抗肺瘤活性中的免疫效應(yīng)子功能的作用似乎是不可能的。這些異種移植物具有與U87MG.wtEGFR異種移植物一樣多的mAb528結(jié)合位點(diǎn)，但是不被抗體抑制。一個(gè)有趣的可能性是wtEGFR過量表達(dá)引起了不依賴于配體的EGFR信號(hào)傳導(dǎo)(親本U87MG似乎不具有強(qiáng)的自分泌-配體環(huán))，這繼而使細(xì)胞變得對(duì)EGFR信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)更加依賴。因此，U87MG.wtEGFR異種移植物對(duì)mAb528治療反應(yīng)，因?yàn)榕c親本細(xì)胞系不同，EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路是活性且有功能的。因此，wtEGFR的過量表達(dá)是依賴EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞的代表性標(biāo)記，因此這些細(xì)胞更可能但并非一定對(duì)EGFR治療反應(yīng)(26)。據(jù)i/^為抗體(如mAb528)的抗肺瘤活性主要是由它們拮抗EGFR配體激活的能力介導(dǎo)。考慮到mAb528在不存在顯著的配體表達(dá)的情況下抑制U87MG.wtEGFR異種移植物的生長(zhǎng)，這表明其他機(jī)制可能作用于抗腫瘤效應(yīng)。此外，mAb528顯示出抗表達(dá)不依賴配體的de2-7EGFR的異種移植物的顯著效力。這種抗腫瘤活性可能不直接由mAb528結(jié)合這些異種移植物中共表達(dá)的內(nèi)源wtEGFR而引起，因?yàn)樗灰种朴H本U87MG或U87MG.DK異種移植物的生長(zhǎng)，U87MG或U87MG.DK都表達(dá)相同水平的wtEGFR。除了免疫效應(yīng)子功能之外，其他的抗腫瘤機(jī)制可能包括受體下調(diào)、不適當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)的誘導(dǎo)、受體向不適宜的膜結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移、以及受體二聚化和/或寡聚化的干擾。事實(shí)上，一些針對(duì)EGFR的TKI不僅通過抑制激酶活性起作用，而且還誘導(dǎo)能夠"掃"除過量配體的失活二聚體，這是意料之外的抗腫瘤機(jī)制(27)。有趣的是，近期在結(jié)腸患者中分析EGFR表達(dá)的免疫組織化學(xué)研究表明對(duì)C225的不同反應(yīng)，其才艮道幾個(gè)EGFR"陰性"患者對(duì)這種EGFR特異性抗體具有臨床反應(yīng)(26)。推測(cè)這些患者具有低于免疫組織化學(xué)檢測(cè)敏感性的EGFR水平，但是所存在的EGFR被激活并促進(jìn)肺瘤生長(zhǎng)/存活。這種觀察結(jié)果表明EGFR激活如果不比筒單的EGFR表達(dá)水平重要的話，至少也與其同樣重要。我們的數(shù)據(jù)顯示mAb528不抑制表達(dá)死亡激酶形式的這種平截受體(U87MG.DK)的U87MG異種移植物生長(zhǎng)，這支持EGFR特異性抗體的效力與激酶活性受體密切相關(guān)的觀點(diǎn)。如上所建議，EGFR過量表達(dá)代表這種激活可以產(chǎn)生的一種機(jī)制；組成活性突變體(如de2-7EGFR)的表達(dá)則代表了另一種。這種連續(xù)的EGFR激活使得細(xì)胞變得"陷入"EGFR信號(hào)傳導(dǎo)，這繼而使得它們對(duì)抗EGFR治療易感。這種概念與肺癌患者中的情況類似，其中大部分患者對(duì)EGFR特異性TKI反應(yīng)，該TKI攜帶著EGFR激酶結(jié)構(gòu)域中的激活性突變(28)。mAb528抑制U87MG.DY2或DY5異種移植物生長(zhǎng)的能力強(qiáng)調(diào)了與自磷酸化相對(duì)的活性激酶結(jié)構(gòu)域作為效力決定因素的重要性。因此，是活性激酶決定了對(duì)抗體治療的反應(yīng)，而不是磷酸化酪氨酸與銜接蛋白或信號(hào)傳導(dǎo)分子的直接相互作用。對(duì)這種結(jié)果的一個(gè)推論是mAb528似乎通過阻止下游靶標(biāo)的磷酸根轉(zhuǎn)移來抑制U87MG.A2-7/DY2/DY5異種移植物生長(zhǎng)(圖11)。由于所有這些U87MG源細(xì)胞系共表達(dá)wtEGFR,并且考慮到我們最近證明了de2-7EGFR可以形成二聚體和磷酸化wtEGFR(29)，wtEGFR很可能是這種二級(jí)靶標(biāo)的候選者。這種主張得到了如下事實(shí)的支持表達(dá)de2-7EGFR的NR6細(xì)胞在不存在wtEGFR的條件下完全難以控制mAb528的抗腫瘤效應(yīng)。這些研究綜合起來表明，連同其配體阻斷性質(zhì)一起，mAb528部分是通過阻止過量表達(dá)的wtEGFR的同源二聚體化和wt與de2-7EGFR之間的異源二聚體化起作用。有趣的是，C225(與mAb528極其類似的抗體)與EGFR的復(fù)合體結(jié)構(gòu)表明除了配體阻斷外，這種抗體還可以通過部分抑制EGFR釋放而阻止EGFR二聚體化(30)。mAb806。體內(nèi)U87MG源細(xì)胞系對(duì)mAb806的反應(yīng)性完全對(duì)映于用mAb528所觀察到的，這表明上述原理中的一些是適用的，但存在一些重要的差異。此研究確定并延伸了我們之前證明mAb806反應(yīng)性與EGFR激活有關(guān)的研究(16)。與mAb528和臨床評(píng)定中所有當(dāng)前的抗體不同，mAb806不靶向正常組織，如肝，因?yàn)镋GFR激活在諸如肝等器官中極低或不可檢測(cè)。很多因素可以刺激肺瘤內(nèi)的EGFR激活(參見綜述(31))。我們已經(jīng)確定了這些可以引起mAb806的反應(yīng)性因素中的至少三個(gè)EGFR過量表達(dá)(15)、自分泌環(huán)(Johns等人，在準(zhǔn)備中)的突變(17)和存在。WtEGFR過量表達(dá)與mAb806抗腫瘤活性的關(guān)系與其獨(dú)特的特異性密切相關(guān)，因?yàn)檫^量表達(dá)通過多種機(jī)制(如不依賴于配體的激活和EGFR糖基化的改變)增加被mAb806識(shí)別的瞬時(shí)的、游離形式的EGFR(21)?？紤]到此處所述的工作與用EGFR特異性TKI所獲得的臨床數(shù)據(jù)一起表明EGFR抑制劑抵抗具有激活的EGFR的腫瘤最為有效，mAb806特異性識(shí)別激活形式的EGFR的獨(dú)特能力使得其成為有利的治療法。分子模型表明mAb806結(jié)合能組止活性wtEGFR二聚體的形成(4),我們已通過解答mAb806與其表位的復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)確定了該假說(Johns等人，準(zhǔn)備中)。盡管這種mAb806在異種移植物模型中不顯著抑制de2-7或wtEGFR的磷酸化，仍強(qiáng)烈地表明除阻斷自磷酸化之外，還包括一些提出的mAb806作用機(jī)制。此外，已知的EGFR信號(hào)傳導(dǎo)下游靶標(biāo)(如Akt和MAPK)也不受mAb806抑制(T.G.Johns,未公開觀察結(jié)果)。與此假說一致的是，mAb806顯示出抗U87MG.DY2/DY5的強(qiáng)抗腫瘤活性，在這兩個(gè)模型中自磷酸化不相關(guān)。mAb806缺乏抗U87MG.DK異種移植物的效力強(qiáng)調(diào)了活性激酶和磷酸根轉(zhuǎn)移事件的存在(圖11)是導(dǎo)致敏感性的關(guān)鍵因素。與mAb528相反，mAb806能夠在不存在其他ErbB家族成員的條件下抑制表達(dá)de2-7EGFR的NR6細(xì)胞的生長(zhǎng)。這個(gè)結(jié)果表明mAb806可能破壞wtEGFR之外的de2-7EGFR磷酸根轉(zhuǎn)移的其他靶標(biāo)。有趣的是，在NR6細(xì)胞中任一抗體與表面de2-7EGFR結(jié)合后，mAb806和528的內(nèi)化和胞內(nèi)運(yùn)輸沒有明顯不同，這表明抗體運(yùn)輸不引起此異種移植物模型中效力的不同。我們?cè)诖耸状尾鹏薜懒薲e2-7EGFR上的Y845以Src依賴性方式被磷酸化。因此，我們檢測(cè)了de2-7EGFR與Src之間的相互作用是否是mAb806活性的可能耙標(biāo)。如果mAb806是通過抑制這種相互作用介導(dǎo)其部分抗腫瘤活性，則使用DNSrc從基因上破壞這種相互作用應(yīng)能夠降低mAb806的效力。與這種可能性相反的是，DNSrc的存在顯著增強(qiáng)了mAb806的抗胖瘤活性。這表明Src在限制EGFR治療的效力方面起作用，并且為使用Src與EGFR抑制劑的聯(lián)合制劑提供了基本原理。結(jié)論這些研究展示了用于分析細(xì)胞系對(duì)EGFR治療的敏感性的體內(nèi)研究相關(guān)性。與先前的研究不同，我們能夠在相同的遺傳背景下進(jìn)行我們大部分的分析，使得主要的變量為EGFR的性質(zhì)。我們使用這種方法最終顯示出了受體數(shù)目對(duì)效力的重要性。盡管EGFR數(shù)目與EGFR治療易感性相關(guān)，但僅僅這種因素是不夠的，因?yàn)槭荏w還需要含有功能激酶。事實(shí)上，盡管有些直觀，但此工作從形式上顯示通過wtEGFR過量表達(dá)或組成性活性突變體表達(dá)"迫使"細(xì)胞系使用EGFR信號(hào)傳導(dǎo)，可以將其由非反應(yīng)性轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性。因此EGFR必須不僅存在于細(xì)胞表面，它必須對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活顯著起作用。因此，選擇對(duì)EGFR治療法反應(yīng)的患者的策略應(yīng)針對(duì)鑒別高度依賴于EGFR的腫瘤，而不僅僅是受體蛋白的存在與否。此任務(wù)在一些情況下(如，當(dāng)存在de2-7EGFR、EGFR基因擴(kuò)增或激酶激活性突變體時(shí))是相當(dāng)容易的，但是很清楚的是在wtEGFR在遺傳上正常的時(shí)候較困難。在這些情況下，多種受體激酶的相互影響使得難以鑒別真正依賴于EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的那些腫瘤。要鑒別對(duì)各受體激酶獨(dú)特的靶基因的長(zhǎng)期、詳細(xì)表達(dá)特征可能是解決此問題的僅有的可行方法。參考文獻(xiàn)1.ArteagaCL.Overviewofepidermalgrowthfactorreceptorbiologyanditsroleasatherapeutictargetinhumanneoplasia.SeminarsinOncology2002;29:3畫9.2.BaselgaJ.WhytheepidermalgrowthfactorreceptorTherationaleforcancertherapy.Oncologist2002;4:2-8.3.MendelsohnJ.Targetingtheepidermalgrowthfactorreceptorforcancertherapy.JournalofClinicalOncology2002;20:1S-13S.4.FrederickL，WangXY,EleyG，JamesCD.Diversityandfrequencyofepidermalgrowthfactorreceptormutationsinhumanglioblastomas.CancerRes2000;60:1383-7.5.WongAJ，RuppertJM,BignerSH，等人.Structuralalterationsoftheepidermalgrowthfactorreceptorgeneinhumangliomas.ProcNatlAcadSciUSA1992;89:2965-9.6.SugawaN,EkstrandAJ，JamesCD,CollinsVP.Identicalsplicingofaberrantepidermalgrowthfactorreceptortranscriptsfromamplifiedrearrangedgenesinhumanglioblastomas.ProcNatlAcadSciUSA1990;87:8602-6.7.TangCK，GongXQ，MoscatelloDK，WongAJ,LippmanME.EpidermalgrowthfactorreceptorvIIIenhancestumorigenicityinhumanbreastcancer.CancerRes2000;60:3081-7.8.NishikawaR,JiXD,HarmonRC,等人.Amutantepidermalgrowthfactorreceptorcommoninhumangliomaconfersenhancedtumorigenicity.ProcNatlAcadSciUSA1994;91:7727-31.9.BaselgaJ，PfisterD，CooperMR,等人.PhaseIstudiesofanti-epidermalgrowthfactorreceptorchimericantibodyC225aloneandincombinationwithcisplatin.JClinOncol2000;18:904-14.10.StragliottoG，VegaF，StasieckiP，GroppP，PoissonM，DelattreJY.Multipleinfusionsofanti-epidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)monoclonalantibody(EMD55，900)inpatientswithrecurrentmalignantgliomas.EurJCancer1996;32A:636-40.11.LynchDH,YangXD.TherapeuticpotentialofABX國(guó)EGF:afullyhumananti-epidermalgrowthfactorreceptormonoclonalantibodyforcancertreatment.SeminOncol2002;29:47-50.12.Siegel-LakhaiWS，BeijnenJH，SchellensJH.Currentknowledgeandfuturedirectionsoftheselectiveepidermalgrowthfactorreceptorinhibitorserlotinib(Tarceva)andgefitinib(Iressa》Oncologist2005;10:579-89.13.JohnsTG,StockertE，RitterG,等人.Novelmonoclonalantibodyspecificforthede2國(guó)7epidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)thatalsorecognizestheEGFRexpressedincellscontainingamplificationoftheEGFRgene.IntJCancer2002;98:398-408.14.JohnsTG，AdamsTE,CochranJR,等人.IdentificationoftheEpitopefortheEpidermalGrowthFactorReceptor-specificMonoclonalAntibody806RevealsThatItPreferentiallyRecognizesanUntetheredFormoftheRec印tor.JBiolChem2004;279:30375-84.15.L鼎orRB，JohnsTG，MuroneC，等人.Monoclonalantibody806inhibitsthegrowthoftumorxenograftsexpressing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(dá)沙替尼(BMS354825)、AZD國(guó)0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4國(guó)甲基苯基)-7國(guó)(叔丁基)吡唑并[3，4-d-嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3,4-(1-嘧啶)和PD166326。15、如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述抗EGFR抗體是識(shí)別在腫瘤發(fā)生、過度增殖或異常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而在正常細(xì)胞中檢測(cè)不到的EGFR表位的抗體。16、如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述抗EGFR抗體為mAb806或其活性片段。17、藥物組合物，其包含在藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑中的抗EGFR抗體和一種或多種src抑制劑。18、如權(quán)利要求17所述的組合物，所述抗EGFR抗體是識(shí)別在肺瘤發(fā)生、過度增殖或異常細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)而在正常細(xì)胞中檢測(cè)不到的EGFR表位的抗體。19、如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述抗EGFR抗體為mAb806或其活性片段。20、如權(quán)利要求17所述的組合物，其中，所述src抑制劑選自達(dá)沙替尼(BMS354825)、AZD-0530、SKI-606、PP1(4-氨基-5-(4-曱基苯基)-7畫(叔丁基)吡唑并[3，4-d卜嘧啶)、PP2(4-氯苯基)-7-(叔丁基)吡唑并[3，44-嘧啶)和PD166326.21、如權(quán)利要求17所述的組合物，其中，所述src抑制劑為酪氨酸激酶抑制劑。全文摘要本發(fā)明涉及EGFR介導(dǎo)的疾病，尤其是癌癥的治療，其通過以聯(lián)合或同時(shí)方式抑制或阻斷EGFR和src來進(jìn)行。本發(fā)明涉及癌癥，尤其是EGFR介導(dǎo)的疾病的治療、預(yù)防或調(diào)節(jié)，其用一種或多種EGFR調(diào)節(jié)劑和src抑制劑的聯(lián)合進(jìn)行。本發(fā)明還涉及用抗EGFR抗體和src抑制劑進(jìn)行的癌癥治療。描述了用抗體抗EGFRmAb806與一種或多種src抑制劑以聯(lián)合或連續(xù)方式進(jìn)行癌癥治療的方法和組合物。文檔編號(hào)C12P21/08GK101688229SQ200880016152公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年3月14日優(yōu)先權(quán)日2007年3月15日發(fā)明者A·斯科特,F·福爾納里,T·G·約翰斯,W·卡夫尼申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所