專利名稱：在植物中通過調(diào)節(jié)ZmPKT的產(chǎn)量增強的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及在植物中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄
和改善產(chǎn)量的組合物和方法。
背景技術(shù)：
借助常規(guī)育種法的谷粒產(chǎn)量改善已經(jīng)在玉米中幾乎達(dá)到一個平臺期。隨后自然 要探索可能用來獲得進(jìn)一步產(chǎn)量提高的備選、非常規(guī)方法。由于玉米中的收獲指數(shù)已經(jīng) 在過去百年左右對谷粒產(chǎn)量選擇的期間基本上保持不變，產(chǎn)量改善已經(jīng)因提高每單位土地 面積的總生物量生產(chǎn)而實現(xiàn)(Sinclair等人(1998)Crop Science 38 :638—643 ;Duvick 等人(1999)CropScience 39 :1622-1630 ;和Tollenaar等人(1999)Crop Science39 : 1597-1604)。這種提高的總生物量已經(jīng)通過增加植物密度實現(xiàn)，這導(dǎo)致適應(yīng)性表型變更，如 葉片角減小和玉米穗狀花序大小降低，前者導(dǎo)致減少對下部葉子的遮蔽并且后者可能提高 收獲指數(shù)(Duvick等人，(1999) CropScience 39 :1622-1630)。 ZmPKT (ZmPTK-具有TPR重復(fù)序列的玉米蛋白激酶)屬于含有TPR的蛋白激酶家 族，它們在包括稻屬、擬南芥屬(arabidopsis)和大豆在內(nèi)的植物中發(fā)現(xiàn)。ZmPKT以中等水 平表達(dá)在多種組織中，所述的組織包括營養(yǎng)組織(葉)和繁殖組織(玉米穗、玉米穗狀花 序、谷粒)。ZmPKT編碼具有兩個保守結(jié)構(gòu)域(PK)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(PS50011)和(T)三 角四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域(Tetratricop印tide r印eat domain)TPR的植物蛋白。具蛋白激酶結(jié) 構(gòu)域的酶屬于一個龐大的蛋白質(zhì)家族，所述蛋白質(zhì)共有絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸蛋白激酶 均具備的一個保守性催化核心。TPR(三角四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域) 一般含有大約34個氨基酸， Blatch和Lassie (1999) BioEssays 21:932-939。 TPR結(jié)構(gòu)域參與包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相 互作用在內(nèi)的多種功能；參與分子伴侶、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運復(fù)合體。TPR基序的 數(shù)目在蛋白質(zhì)之間是變化的。5個至6個串聯(lián)重復(fù)序列產(chǎn)生一個具有兩親性通道的右手螺 旋結(jié)構(gòu)，其中認(rèn)為所述的兩親性通道容納靶蛋白的a-螺旋。已經(jīng)提出TPR蛋白優(yōu)選地與 WD-40重復(fù)序列蛋白質(zhì)相互作用。在多種情況下，幾個TPR蛋白似乎聚集成如在幾種細(xì)胞周 期蛋白依賴性激酶中所觀察到的多蛋白復(fù)合體。TPR基序可能代表一種已經(jīng)由不同的蛋白 質(zhì)采納并適應(yīng)于特定功能的遠(yuǎn)古蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用模塊(Blatch和Lassie (1999) BioEssays21 :932-939)。 當(dāng)前對ZmPKT基因的研究表明該基因統(tǒng)計顯著地影響植物組織生長。我們的數(shù)據(jù) 證實組成型地過量表達(dá)ZmPKT基因?qū)χ参镏袔追N重要的產(chǎn)量性狀產(chǎn)生強烈的正效應(yīng)。
本領(lǐng)域需要可以使用此類序列來調(diào)節(jié)植物中植物生長和產(chǎn)量的方法和組合物。
發(fā)明簡述 提供了用于調(diào)節(jié)花器官發(fā)育、葉形成、趨光性、頂端優(yōu)勢、果實發(fā)育、根發(fā)端和用于 提高植物中產(chǎn)量的組合物和方法。所述組合物包括ZmPKT序列。本發(fā)明的組合物包含選自 SEQ ID NO :1和2的氨基酸序列和核苷酸序列及其變體和片段。 在用于目的植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體中提供了編碼ZmPKT基因的核苷酸序列。還 提供了包含本發(fā)明序列的表達(dá)盒、植物、植物細(xì)胞、植物部分和種子。在具體的實施方案中，多核苷酸與組成型啟動子有效連接。 提供了用于調(diào)節(jié)植物或植物部分中ZmPKT序列的水平的方法。所述方法包括將包 含本發(fā)明的ZmPKT序列、蛋白激酶(PK)結(jié)構(gòu)域或三角四肽重復(fù)(TPR)結(jié)構(gòu)域的異源多核苷 酸導(dǎo)入植物或植物部分?？梢蕴岣呋蚪档蚙mPKT多肽的水平。此方法可以用來提高植物中 的產(chǎn)量；在一個實施方案中，該方法用來提高谷類中的谷粒產(chǎn)量。
附圖簡述

圖1提供了幾個來自玉米(Zea mays)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、稻 (0ryza sativa)和大豆(Glycine max)的ZmPKT序列的比對。下劃線的氨基酸(SEQ ID NO :5)代表共有的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(PS50011)，而雙下劃線的氨基酸(SEQ ID NO :6)代表共 有的三角四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域(TPR)，其中所述的TPR參與包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在內(nèi)的
多種功能；參與分子伴侶、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運復(fù)合體。
發(fā)明詳述 現(xiàn)在將參考附圖在下文中更充分地描述本發(fā)明，其中顯示了一些，但非全部的本 發(fā)明實施方案。實際上，這些發(fā)明可以以多種不同形式體現(xiàn)并且不得解釋為限于本文中所 述的實施方案；相反，提供了這些實施方案，從而本公開內(nèi)容將滿足適用的法律要求。
這里所述的本發(fā)明的眾多修改和其他實施方案將是得益于在前面描述和相關(guān)附 圖中所展示教導(dǎo)的這些發(fā)明所涉及領(lǐng)域的技術(shù)人員可想起的。因此，應(yīng)當(dāng)理解所述發(fā)明不 意圖限于所公開的具體實施方案并且修改和其他實施方案將意圖被包含于所附權(quán)利要求 書的范圍中。盡管本文中使用了具體術(shù)語，不過它們僅在一般性和描述性意義上使用并且 其目的不在于限制。
I.概述 提供在植物中促進(jìn)花器官發(fā)育、根發(fā)端及產(chǎn)量和用于調(diào)節(jié)葉形成、趨光性、頂端優(yōu) 勢、果實發(fā)育等的方法和組合物。本發(fā)明的組合物和方法通過調(diào)節(jié)植物中至少一種ZmPKT 多肽或具有本發(fā)明ZmPKT多肽的生物學(xué)活性變體或片段的多肽的水平導(dǎo)致植物或作物產(chǎn)
量改善。 II.組合物 本發(fā)明的組合物包含參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的ZmPKT多核苷酸和多肽及其變體和片段。 ZmPKT編碼具有兩個保守結(jié)構(gòu)域(PK)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(PS50011)和(T)三角四肽重復(fù)結(jié) 構(gòu)域TPR的植物蛋白。ZmPKT中的TPR結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :4)對應(yīng)于ZmPKT (SEQ ID NO :2) 的氨基酸位置第371至482位氨基酸殘基，而本文中命名為"PK結(jié)構(gòu)域"(SEQ ID NO :3)的 一個獨立但高度保守的結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于ZmPKT (SEQ ID NO :2)的氨基酸位置第69至134位氨 基酸殘基。"對應(yīng)于"意指對于每個結(jié)構(gòu)域的所提到的氨基酸位置涉及所提到SEQ ID NO的 氨基酸位置并且意指包含這些結(jié)構(gòu)域的多肽可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)比對方法比對所述多肽與 所提到SEQ ID NO :而找到。 如本文中所用，"ZmPKT"或"ZmPKT"序列包含編碼具有PK和/或TPR結(jié)構(gòu)域或 該PK和/或TPR結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性變體或片段的多肽的多核苷酸或具有PK和/或TPR 結(jié)構(gòu)域或該PK和/或TPR結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性變體或片段的多肽。見，例如Jurata和 Gill (1997)Mol. Cell. Biol. 17 :5688-98和Franks等人(2002) Development 129 :253-63。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含如SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的分離的ZmPKT多肽及其片段和變體。還提供了包含SEQ ID NO :1中所示核苷酸序列的多核苷酸和 包含編碼PK結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :3)或TPR結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :4)的多核苷酸的序列。在 一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含編碼PK結(jié)構(gòu)域和TPR結(jié)構(gòu)域這兩者的序列。
本發(fā)明包括分離的或基本上純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)組合物。"分離的"或"純 化的"多核苷酸或蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含這樣的組分，其中所述 組分通常伴隨或與該多核苷酸或蛋白質(zhì)相互作用，如在該組分天然存在環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的那 樣。因此，分離的或純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時基本上不含其他細(xì)胞材 料或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。最佳地，"分離的"多核 苷酸不含在衍生該多核苷酸的生物的基因組DNA中天然分布于該多核苷酸側(cè)翼(即位于 該多核苷酸的5'或3'端)的序列(最佳地是蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在多個實施方案 中，這種分離的多核苷酸可以含有在衍生該多核苷酸的細(xì)胞的基因組DNA中天然分布于該 多核苷酸側(cè)翼的小于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或O. lkb的核苷酸序列?；旧喜缓?細(xì)胞材料的蛋白質(zhì)包括具有小于約30%、20%、10%、5%或1% (干重)雜質(zhì)蛋白的蛋白質(zhì) 制品。當(dāng)重組地產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)或生物學(xué)活性部分時，培養(yǎng)基最佳地出現(xiàn)小于約30%、 20%、10%、5%或1% (干重)的化學(xué)前體或非目的蛋白質(zhì)化學(xué)品。 ZmPKT結(jié)構(gòu)域或ZmPKT多核苷酸及其所編碼蛋白質(zhì)的片段和變體也被本發(fā)明的方 法和組合物包括。"片段"意指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分。多核苷酸的片段 可以編碼仍保留天然蛋白生物學(xué)活性并且因而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)片段。例如，多肽片段將 包含PK結(jié)構(gòu)域(SEQ IDN0:3)或TPR結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :4)。在一些實施方案中，該多肽 片段將包含PK結(jié)構(gòu)域和TPR結(jié)構(gòu)域這兩者。備選地，用于抑制ZmPKT序列或使其沉默(即 降低表達(dá)水平)的片段不需要編碼蛋白質(zhì)片段，但仍將保留抑制此靶序列表達(dá)的能力。另 外，用作雜交探針的片段通常不編碼仍保留生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)片段。因此，核苷酸序列的 片段可以具有至少約18個核苷酸、約20個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸、以及 多達(dá)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的全長多核苷酸。 編碼PK結(jié)構(gòu)域、TPR結(jié)構(gòu)域和/或ZmPKT多肽的多核苷酸的片段將編碼至少15、 25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、675、700、725、750、775、 800、825個連續(xù)氨基酸或多達(dá)全長PK或TPR結(jié)構(gòu)域或ZmPKT蛋白(即SEQ ID NO :2)中存 在的氨基酸總數(shù)。用作雜交探針、PCR引物或用作抑制構(gòu)建體的PK或TPR結(jié)構(gòu)域或ZmPKT 多核苷酸的片段一般不需要編碼ZmPKT蛋白或ZmPKT結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性部分。
可以通過如下方式制備包含PK或TPR結(jié)構(gòu)域或ZmPKT蛋白的多肽的生物學(xué)活性 部分，即通過分離ZmPKT多核苷酸的一部分，表達(dá)ZmPKT蛋白的編碼部分(例如通過體外重 組表達(dá))并評估ZmPKT蛋白的該編碼部分的活性。作為ZmPKT核苷酸序列的片段或作為包 含TPR和PKT結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列的片段的多核苷酸包含了至少16、20、50、75、100、150、 200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1， 000、1， 100、1， 200、1， 300、 1， 400、1， 500、1， 600、1， 700、1， 800、1， 900、2， 000、2， 050、2， 100、2， 150、2， 200、2， 250、 2， 300、2， 350、2， 400、2， 450、2， 500個連續(xù)核苷酸或多達(dá)全長TPR和PK結(jié)構(gòu)域中或ZmPKT多 核苷酸(即SEQ ID N0:l，1984個核苷酸)中存在的核苷酸數(shù)目。"變體"意指基本上相似的序列。對于多核苷酸而言，變體包含一個或多個核苷酸 在天然多核苷酸內(nèi)部一個或多個內(nèi)部位點處的缺失和/或添加和/或一個或多個核苷酸在天然多核苷酸中一個或多個位點處的置換。如本文中所用，"天然"多核苷酸或多肽分別包
含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。對于多核苷酸而言，保守性變體包括這些序列，其
中所述序列因遺傳密碼的簡并性而編碼ZmPKT多肽之一或TPR和PK結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。
可以使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定天然存在的等位基因變體，例如用下文說明的聚合酶
鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體多核苷酸也包括合成方式衍生的多核苷酸，例如通過位點
定向誘變產(chǎn)生、不過仍編碼包含TPR或PK結(jié)構(gòu)域(或這兩者)的多肽或能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或能
夠降低(即抑制或沉默)ZmPKT多核苷酸之表達(dá)水平的ZmPKT多肽的那些多核苷酸。通常，
本發(fā)明的特定多核苷酸的變體將與該特定核苷酸具有如通過本文其他地方描述的序列比
對程序和參數(shù)所確定的至少約40% 、45% 、50% 、55% 、60% 、65% 、70% 、75% 、80% 、85%、
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。 本發(fā)明的特定多核苷酸(即參照多核苷酸)的變體也可以通過比較在變體多核苷
酸所編碼的多肽與這種參照多核苷酸所編碼的多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評價。因
此，例如公開了一種分離的多核苷酸，其編碼與SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO :2的多肽具有
給定序列同一性百分?jǐn)?shù)的多肽?？梢允褂迷诒疚钠渌胤矫枋龅男蛄斜葘Τ绦蚝蛥?shù)計算
任意兩個多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)。在本發(fā)明任意給定的多核苷酸配對通過比較由所
述多核苷酸編碼的兩個多肽所共有的序列同一性百分?jǐn)?shù)而進(jìn)行評價的情況下，這兩個編碼
的多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)是至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。"變體"蛋白質(zhì)意指從天然蛋白中通過在該天然蛋白中一個或多個內(nèi)部位點處缺 失或添加一個或多個氨基酸和/或在該天然蛋白中一個或多個位點處置換一個或多個氨 基酸而衍生的蛋白質(zhì)。由本發(fā)明包括的變體蛋白質(zhì)是有生物學(xué)活性的，即它們繼續(xù)具有該 天然蛋白的想要的生物學(xué)活性，即如本文中所述調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。此類變體可以例如因遺傳多態(tài) 性或因人操作產(chǎn)生。本發(fā)明的ZmPKT蛋白的生物學(xué)活性變體或TPR或PK結(jié)構(gòu)域的生物學(xué) 活性變體將與ZmPKT蛋白的氨基酸序列或共有的PK(SEQ ID NO :5)和TPR(SEQ ID NO :6) 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有如通過本文其他地方描述的序列比對程序和參數(shù)所確定的至少 約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。本發(fā)明的ZmPKT蛋白的或PK或TPR結(jié) 構(gòu)域的生物學(xué)活性變體可以與該蛋白質(zhì)具有少至1-15個氨基酸殘基，少至1-10個，如6-10 個，少至5個，少至4、3、2個或甚至1個氨基酸殘基的不同。 本發(fā)明的多核苷酸可以按照多種方式進(jìn)行改變，所述的方式包括氨基酸置換、缺 失、截短和插入。用于此類操作的方法通常是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過在DNA中突變 來制備ZmPKT蛋白或TPR PK結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體和片段。用于誘變和多核苷酸變更 的方法是本領(lǐng)域熟知的。見，例如，Kunkel， (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol. 154 :367-382 ;美國專利號4,873， 192 ;Walker 禾口 Gaastra編著 (1983)， Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,紐約)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的 適宜氨基酸置換的指導(dǎo)可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found. ， Washington, D. C.)的模型中找到，所述文獻(xiàn)在本文中引用作為參考。保守性置換，如將一個氨基酸交換為具有相似特性的另一個氨基酸，可以 是最佳的。 因此，本發(fā)明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突變形式。同樣，本發(fā)明 的蛋白質(zhì)包括天然存在的蛋白質(zhì)以及其改變和修飾的形式。此類變體將繼續(xù)具有想要的活 性(即，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或降低靶ZmPKT序列的表達(dá)水平的能力)。在具體的實施方案中，將于編 碼該變體的DNA中產(chǎn)生的突變未使該序列不符合可讀框并且不產(chǎn)生可能產(chǎn)生二級mRNA結(jié) 構(gòu)的互補性區(qū)域。見，EP專利申請
發(fā)明者L·紐曼, O·丹尼萊夫斯卡亞, W·B·布魯斯 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司