專利名稱：：用于鑒定碳青霉烯酶基因的組合物和方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于快速鑒定賦予抗生素抗性的克雷伯氏菌屬(J/e^/e/h)細菌的碳青霉烯酶基因的組合物和方法。
背景技術：
：腸桿菌科(Enterobacteriaceae)是一個大型的細菌科，包括較熟悉的病原體中的許多，例如沙門氏菌屬(5^7頂o/2e/")細菌和大腸桿菌(f"力eWc力/aco7/)。屬于腸桿菌科的屬的成員已獲得了這樣的名聲，即將它們置于臨床微生物學中最致病和最常遇到的生物之中。這些大的革蘭氏陰性桿菌常常與腸道感染相關，但可以在幾乎所有的天然生境中發(fā)現(xiàn)。這個科的許多成員是在人和其他動物的腸中發(fā)現(xiàn)的腸道微生物區(qū)系的正常部分，而其他成員在水或土壤中發(fā)現(xiàn)，或者是在各種不同動物和植物上的寄生物。大腸桿菌是最重要的模式生物之一，并且它的遺傳學和生物化學已得到了仔細研究。肺炎克雷伯氏菌(i7e^/e"ap/函面.se)是在口、皮膚和腸的正常微生物區(qū)系中發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性的、不動的、有莢膜的、發(fā)酵乳糖的、兼性厭氧的細菌。它是腸桿菌科的克雷伯氏菌屬的臨床上最重要的成員。肺炎克雷伯氏菌可以引起細菌性肺炎，盡管它更通常地牽涉醫(yī)院內泌尿道和傷口感染，特別是在無免疫應答的個體中。對于老年人中的泌尿道感染，克雷伯氏菌屬的排位僅次于大腸桿菌。對于具有慢性肺病、腸致病性、鼻粘膜萎縮和鼻硬結癥的患者，它還是機會致病菌。糞便是患者感染的最重要的來源，隨后為與被污染的器具接觸。隨著抗生素抗性菌抹持續(xù)出現(xiàn)，肺炎克雷伯氏菌日益成為醫(yī)院感染。克雷伯氏菌屬細菌具有染色體A類p-內酰胺酶，該酶給予其對于氨芐青霉素的固有抗性。許多菌林已獲得了超廣譜P-內酰胺酶(extended-spectrumbeta-lactamase,ESBL)，其具有另夕卜的對于羧芐青霉素、氨芐青霉素、喹諾酮類的抗性，以及逐漸增加的對于頭孢他啶的抗性。碳青霉烯抗生素已成為用于對付革蘭氏陰性感染的重要試劑，特別是當革蘭氏陰性感染由不同的醫(yī)院病原體引起時。碳青霉烯類具有任何P-內酰胺抗生素的最廣泛的活性譜，并且通常是用于在由多重抗性革蘭氏陰性細菌引起的感染的治療中使用的最合適的試劑。碳青霉烯類被認為是被選擇用于治療由于具有超廣鐠(3-內酰胺酶(ESBL)的腸桿菌科細菌而引起的感染的試劑。產(chǎn)生ESBL的肺炎克雷伯氏菌的流行已在美國出現(xiàn)，并且在某些地區(qū)中接近分離物的50°/。。當遇到這樣高比率的產(chǎn)生ESBL的生物時，碳青霉烯類成為日益重要的治療選擇。在過去數(shù)年中，已在某些地區(qū)中觀察到抗碳青霉烯的革蘭氏陰性菌的逐漸增加。在美國，碳青霉烯抗性在很大程度上歸于在鮑氏不動桿菌(Jc//7"o^"er6a謹脂7)、銅綠假單胞菌(戶se"cTo/z70/2asaerw^7j70W)和罕見地肺炎克雷伯氏菌的分離物中C類頭孢菌素酶的表達和外膜孔蛋白的喪失。罕見地在肺炎克雷伯氏菌中回收到了水解碳青霉烯的P-內酰胺酶(碳青霉烯酶)。然而，最近在美國東北部鑒定了具有碳青霉烯酶KPC-1、KPC-2和KPC-3的分離物。這些分離物通常對于多種抗生素類別具有抗性，從而給臨床醫(yī)生呈現(xiàn)了非常有限的治療選擇。引起感染暴發(fā)的高抗性生物的出現(xiàn)是微生物學和傳染病界已研究了數(shù)年的重大問題。目前，可以將碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌的出現(xiàn)添加至正在增長的高抗性生物列表中。2005年在紐約市的多個醫(yī)院中發(fā)生的碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌感染的爆發(fā)將廣泛的關注帶至這些生物。KPC酶是介導對于超廣鐠頭孢菌素類的抗性以及對于碳青霉烯類的抗性的P-內酰胺酶。2001年在NorthCarolina首次才艮道了這些碳7青霉烯酶，但目前已在美國各個部分中分離出了它們，最經(jīng)常地在東海岸。產(chǎn)生碳青霉烯酶的分離物的檢測對于療法的更好管理和對于感染控制是重要的。發(fā)明概述提供了用于快速且靈敏地檢測賦予抗生素抗性的碳青霉烯酶基因的組合物和方法。所述組合物包含用于檢測樣品中該基因的存在情況的寡核苷酸新型引物和探針組。這些引物和探針組可以在擴增方法(例如PCR，特別是定量PCR)中使用，并且包裝到試劑盒中以用于在擴增方法中使用，以便為了檢測測試樣品，特別是患者樣品中碳青霉烯酶基因的存在情況，由此檢測到該基因表明所述樣品包含對于碳青霉烯類具有抗性的細菌。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20中所示的新型寡核苷酸引物，以及SEQIDNO:3、6、9、16和19中所示的新型寡核苷酸探針序列。這些序列可以在用于檢測樣品中的碳青霉烯酶基因的方法中使用，所述碳青霉烯酶基因的存在表明所述樣品包含具有碳青霉烯抗性的細菌。進一步提供了可用于檢測樣品中的碳青霉烯酶基因的試劑盒，其中所述試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的組合物。所述試劑盒可以進一步包含關于在基于聚合酶的擴增反應(例如，PCR或QPCR)中使用所提供的組合物的指導說明書。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及通過使用在該細菌中存在的靶核酸區(qū)域的基于聚合酶的擴增，來檢測樣品中的碳青霉烯酶的方法，所述方法包括(a)提供懷疑包含具有碳青霉烯抗性的腸細菌的測試樣品，(b)在足以提供基于聚合酶的核酸擴增產(chǎn)物(其包含編碼碳青霉烯酶的核苷酸序列的靶核酸區(qū)域)的條件下，使所述樣品與本發(fā)明的組合物接觸；和(c)檢測所述核酸擴增產(chǎn)物的存在情況，作為測試樣品中碳青霉烯酶的存在情況的指示。在各種實施方案中，所述測試樣品是直接樣品，并且本發(fā)明的方法和組合物能夠在這樣的細菌濃度下檢測該直接樣品中碳青霉烯酶的存在情況，所述細菌濃度處于在從被那種細菌感染的受試者中收集的樣品中通常發(fā)現(xiàn)的細菌負荷范圍之內。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的引物的用途，其中所述引物或探針具有根據(jù)在SEQIDNO:1-9和14-20和14-20中所定義的序列中任一序列的序列。附圖筒述圖1:關于標準PCR的靈敏度實驗。還將相同的DNA稀釋方案(20ng至2fg)用于標準PCR引物?？煽康年栃耘凶x(call)基于在所有3個重復內可靠地檢測出條帶的能力。使用這個標準，對于標準PCR引物而言可靠的陽性是32pg，并因此靈敏度是32pg(l，OOO個基因組等價物)。圖2:關于標準PCR的直接樣品實驗。還將從尿和血液樣品中提取的DNA用于接種標準PCR反應。在這個凝膠中未展示的是尿陰性對照樣品，其在分開的凝膠上走樣并且不包含任何條帶。除了陽性模板對照(positivetemplatecontrol,PTC)夕卜，沒有樣品產(chǎn)生條帶。發(fā)明詳述/艦本文提供了用于檢測在懷疑具有產(chǎn)生碳青霉烯酶的細菌的樣品中碳青霉烯酶的存在情況的新型方法和組合物。由于有時低水平的酶表達或不易與其他抗性機制(例如，不滲性或靶修飾)相區(qū)分，當使用常規(guī)易感性測試方法時，就碳青霉烯酶產(chǎn)生來篩選分離物是困難的。用于檢測/鑒定碳青霉烯酶的某些表型方法已在文獻中進行了描述，但它們通常不是標準化的，并且由于所需的專業(yè)水平和/或專門設備，有些對于常規(guī)臨床實驗室測試來說是不可行的?？茖W委員會(例如CLSI)目前未給出關于用于碳青霉烯酶檢測的方法的推薦。因此，對于用于篩選包含碳青霉烯酶的細菌的快速且可靠的測試存在著需要。本發(fā)明的方法和組合物旨在檢測和/或定量質粒承載的(plasmid-borne)p-內酰胺酶基因，更具體地，碳青霉烯酶抗生素抗性基因的質粒，并且允許快速地鑒定這種抗生素抗性基因。在測試樣品中檢測到該基因表明所述樣品包含產(chǎn)生碳青霉烯酶的細菌。該方法涉及使用基于聚合酶的擴增方法，特別是聚合酶鏈式反應。如本文中所使用的，"聚合酶鏈式反應"或"PCR"是指用于擴增特定多核苷酸模板序列(或"靶核酸")的體外方法。碳青霉烯酶代表了在腸桿菌科細菌中重要的新出現(xiàn)的抗性機制。因此，本發(fā)明的方法可用于檢測腸桿菌科成員中的碳青霉烯抗性，所述成員包括但不限于，銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(A7e^/e/7a)、腸桿菌屬物種(A/^ero6acter)、腸沙、門氏菌(《^/邁0/26//3e/2ter2'ca)、大腸桿菌等。碳青霉烯酶賦予針對碳青霉烯類抗生素的抗性，所述碳青霉烯類抗生素包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南。本發(fā)明的組合物和方法提供了快速且有效的測試，以用于檢測樣品中的編碼碳青霉烯酶或水解碳青霉烯的P-內酰胺酶的基因，并因此檢測碳青霉烯酶的存在情況。碳青霉烯酶的檢測給臨床實驗室提出了問題，因為碳青霉烯酶與陽性超廣譜P-內酰胺酶(ESBL)確證測試(由克拉維酸鹽加強的頭孢曲松、頭孢他咬、頭孢吡胛和氨曲南的活性)相關。因此，無法識別對亞胺培南或美羅培南易感的分離物中減少的碳青霉烯易感性的意義可以導致這些分離物被不正確地鑒定為ESBL產(chǎn)生者。//.逸合#核苷酸序列來自幾種肺炎克雷伯氏菌分離物的碳青霉烯酶的核苷酸序列提供10在SEQIDNO:10-13中。還將本發(fā)明的引物和探針序列提供為SEQIDNO:1-9和14-20。所述引物和探針組包括SEQIDNO:l中所示的正向引物，SEQIDNO:2中所示的反向引物，和SEQIDNO:3中所示的核酸探針；SEQIDNO:4中所示的正向引物，SEQIDNO:5中所示的反向引物，和SEQIDNO:6中所示的核酸探針；SEQIDNO:7中所示的正向引物，SEQIDNO:8中所示的反向引物，和SEQIDNO:9中所示的核酸探針；SEQIDNO:14中所示的正向引物，SEQIDNO:2中所示的反向引物，和SEQIDNO:3中所示的核酸探針；SEQIDNO:4中所示的正向引物，SEQIDNO:15中所示的反向引物，和SEQIDNO:16中所示的核酸探針；SEQIDNO:20中所示的正向引物，SEQIDNO:8中所示的反向引物，和SEQIDNO:9中所示的核酸探針；以及SEQIDNO:17中所示的正向引物，SEQIDNO:18中所示的反向引物，和SEQIDNO:19中所示的核酸探針。這些引物和探針組可以在基于聚合酶的擴增方法(例如，實時PCR方法)中使用，以用于快速地鑒定碳青霉烯酶抗生素抗性基因。所述引物和探針組是通用的，因為它們可以識別肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)基因的所有已知的同種型，以及檢測其他腸細菌中的碳青霉烯酶基因。盡管鑒定了特定的引物和探針序列，但應當認識到所述序列可以通過核苷酸的添加或置換而發(fā)生改變。樣品來源可以在實踐本發(fā)明的方法中使用的代表性生物樣品包括鼻拭子、咽喉拭子、糞便、皮膚拭子、血液(包括血液培養(yǎng)物)、痰、細支氣管肺泡灌洗液、支氣管吸出物、肺組織和尿。生物樣品的收集和貯存方法是本領域技術人員已知的?？梢酝ㄟ^鋪板和使細菌生長來對生物樣品進行加工。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述樣品是直接樣品，并且使所述直接樣品直接與PCR反應組分和合適的寡核苷酸接觸。所述方法特別可用于檢測體液例如血液和尿中碳青霉烯酶的存在情況。"直接樣品"是這樣的樣品，其收集自受試者并且無需從樣品中分離或培養(yǎng)細菌而在PCR反應中進行篩選。直接樣品在篩選前一般僅最低限度地進行加工。在各種實施方案中，樣品可以使用本領域已知的任何可接受的方法來進行裂解，并且進行離心以去除細胞碎片。保留上清液用于篩選。在另一個實施方案中，在PCR方法中進行篩選之前，使核酸形成粒狀沉淀，洗滌，并重懸浮于合適的緩沖液中。寡核苷酸引物在本發(fā)明的一個實施方案中，將寡核苷酸引物提供用于檢測樣品中的碳青霉烯酶抗生素抗性基因。如本文中所使用的，"引物"是指這樣類型的寡核苷酸，其具有或包含與在碳青霉烯酶基因中存在的或衍生自碳青霉烯酶基因的靶多核苷酸互補的序列，并且其通過堿基配對與靶多核苷酸雜交。在一個實施方案中，本發(fā)明的正向和反向引物是包含SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20中所示的核苷酸序列的那些。術語"寡核苷酸"是指短的多核苷酸，長度通常小于或等于150個核苷酸(例如，長度為5-150個，優(yōu)選地10-100個，更優(yōu)選地15-50個核苷酸)。然而，如本文中所使用的，該術語還意欲包括更長或更短的多核苷酸鏈。本發(fā)明的引物和探針組被設計為用于檢測編碼碳青霉烯酶的核酸分子。本發(fā)明的組合物被設計為用于檢測編碼碳青霉烯酶的核酸序列的5'、3'和中間部分。本發(fā)明的引物和探針組中的每一個可以識別碳青霉烯酶基因的所有已知的同種型。本發(fā)明的引物和探針序列可以通過在5'或3'末端處包含另外的核苷酸來進行修飾。為了確定用于延伸引物或探針序列的核苷酸，使用SEQIDNO:10-13(其包含了KPC碳青霉烯酶基因的全長序列)和表2(其包含有在碳青霉烯酶序列內的引物和探針序列的位置)，通過使引物和探針序列與碳青霉烯酶編碼序列進行比對并確定引物或探針序列的5'和3'區(qū)域處的核苷酸堿基，本領域技術人員可以設計出延長的引物序列。同樣地，引物和探針序列可以通過在所述序列內具有被置換的核苷酸來進行修飾。應當認識到，引物和探針序列必須包含足夠的互補性，以特異性地與碳青霉烯酶核酸序列雜交。以這種方式，可以置換至少1、2、3、4或直至約5個核苷酸。如本文中所使用的，術語"靶多核苷酸"和"靶核酸"是指待在樣品中測定其存在的多核苷酸。在本發(fā)明中，靶核酸相應于編碼能夠水解碳青霉烯的|3-內酰胺酶(碳青霉烯酶)的核酸。肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)的4種同種型的核苷酸序列顯示在SEQIDN0:10-13中。所述序列的任何部分可以通過本發(fā)明的方法來進行鑒定。因為碳青霉烯酶序列的相似性，所以本發(fā)明的引物探針組能夠鑒定任何腸細菌中的碳青霉烯酶序列。如本文中所使用的，術語"互補"是指兩條多核苷酸鏈的區(qū)域之間或者同一多核苷酸鏈的兩個區(qū)域之間的序列互補性。如果當兩個區(qū)域以反向平行方式進行排列時，第一個區(qū)域的至少一個核苷酸能夠與第二個區(qū)域的堿基進行堿基配對，那么多核苷酸的第一個區(qū)域與相同或不同的多核苷酸的第二個區(qū)域互補。因此，并不要求兩個互補的多核苷酸在每一個核苷酸位置處都堿基配對。"完全互補"是指第一多核苷酸與第二多核苷酸100%或"完全"互補，并因此在每一個核苷酸位置處形成堿基對。"部分互補"還指第一多核苷酸不是100%互補的(例如，90%或80%或70%互補的)，并且在一個或多個核苷酸位置處包含錯配的核苷酸。如本文中所使用的，在關于互補的(包括部分互補的)多核苷酸鏈的配對時，使用術語"雜交"。雜交和雜交強度(即，多核苷酸鏈之間的結合強度)受到本領域眾所周知的許多因素的影響，包括多核苷酸之間的互補性程度，所涉及的條件的嚴緊性，其受到諸如下列的條件的影響鹽濃度、所形成的雜合體的解鏈溫度(Tm)、其他組分的存在(例如，聚乙二醇的存在或不存在)、雜交鏈的體積摩爾濃度和多核苷酸鏈的G:C含量。在一個實施方案中，如此地設計引物，即使得該組中的一個引物的Tm在該組中的另一個引物的Tm的2"C之內。關于核酸雜交的詳盡指導可在下列文獻中找到Tijssen(1993)#/^r/"za〃0"『"力iVwc2e/c戶ro6es，第I部分，第2章(Elsevier,NewYork);和Ausubel等人，編輯(1995)C"rre/r13戶rotoco/s/i7M/eci;/arA/o/og/，第2章(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)。參見Sambrook等人，(1989)#o/ecw/a_rC7oy2//7fJZa6or"oiy#a/7ua/(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview，NewYork)?？梢允褂帽绢I域已知的技術來制備本發(fā)明的引物，所述技術包括但不限于，合適序列的克隆和消化以及直接的化學合成。Narang等人，(1979)/力^/7z7/o/o^768:90所描述的磷酸三酯法，由Brown等人，(1979)#e^o&//^2z/zzo/o^f68:109所7^開的褲酸二酉旨,法，由Beaucage等人，(1981)refra/edro/Zeffers22:1859所公開的氨基磷酸二乙酯法，和在美國專利號4，458，066中所描述的固體支持物法。此處還考慮使用自動化寡核苷酸合成儀來制備本發(fā)明的合成寡核苷酸引物。此外，需要時，可以使用本領域已知的和下文所描述的技術來對引物進行標記。寡核苷酸探針本發(fā)明的一種或多種寡核苷酸引物可以與一種或多種探針序列一起使用，或者可以包含一種或多種探針序列。所述探針可以與所述寡核苷酸引物分開("雙分子探針")，或者附著至所述寡核苷酸引物("單分子探針，，或"有尾探針(tailedprobe)")。參見例如，Whitcombe等人，(1999)A"a^reA/ofec力"o/.17:804-807和美國專利號6，326，145中所描述的自身探測序列(self-probingsequence)(例如，SCORPIONS引物，也稱為"有尾探針")，所述兩篇參考文獻通過提及而以其整體合并入本文。如本文中所使用的，術語"探針，，是指由于探針中的至少一個序的;核普酸。"引物延伸產(chǎn)物"意指由;寡核苷酸引物的基于聚合酶的延伸(使用靶核酸作為模板)而產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物，所述寡核苷酸引物包含在本文中公開為SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20的序列。探針的多核苷酸區(qū)域可以由DNA和/或RNA和/或合成的核苷酸類似物組成。優(yōu)選地，探針不包含與上文所描述的寡核苷酸引物序列互補的序列。理想地，本發(fā)明的探針的長度小于或等于約50個核苷酸，例如長度小于或等于約40個、約30個、約20個或小于約IO個核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的探針序列是在本文中公開為SEQIDNO:3、6、9、16和19的序列。如本文中所使用的，"Tm"和"解鏈溫度"是可互換的術語，其是一群雙鏈多核苷酸分子的50%解離成單鏈時所處的溫度。用于計算多核苷酸的Tm的等式是本領域眾所周知的。例如，Tm可以通過下述等式來計算Tm=69.3+0.41x(G+C)%-650/L，其中L是以核苷酸表示的探針的長度。雜合體多核普酸的Tm也可以通過使用根據(jù)在1M鹽中的雜交測定法而調整的公式來進行估計，并且常常用于計算PCR引物的Tm:[(A+T的數(shù)目)x2'C+(G+C的數(shù)目)x4°C]，參見例如，Newton等人，(1997)(第2版;Springer-Verlag，NewYork)。在本領域中存在有其他更復雜的計算，其考慮了結構以及序列特征以用于計算Tm。計算出的Tm僅是估計值；最佳溫度常常憑經(jīng)驗來確定。標記本發(fā)明的引物和/或探針可以進一步包含一種或多種標記，以有助于監(jiān)測擴增反應。如本文中所使用的，術語"標記"或"經(jīng)標記的"是指這樣的任何原子或部分，其可以用于提供可檢測的(優(yōu)選地，可定量的)信號，并且可以附著至多核苷酸、寡核苷酸引物或探針。廣泛多樣的標記和綴合技術(包括直接和間接標記法)是已知的，并且在科學和專利文獻中詳盡地進行了報道?？梢允褂玫臉擞浀睦影ǚ派湫院塑账?、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、嵌入劑、化學發(fā)光部分、磁性顆粒等。教導了此類標記的使用的專利包括美國專利號3,817,837;3,850,752;3,939,350;3,996,345;4,277,437;4，275，149;和4，366，241,所述專利通過提及而以其整體合并入本文。i7/.方法本文進一步提供了用于檢測樣品中具有碳青霉烯抗性的細菌的快速且靈敏的方法。所述方法可用于診斷具有碳青霉烯抗性的受試者，以及開發(fā)對于具有細菌感染的受試者合適的治療方案，其中所述治療基于碳青霉烯抗性的存在或不存在來確定。所述方法包括基于PCR(特別是QPCR)的碳青霉烯酶的擴增和檢測方法，其中使用本文所描述的引物和探針。在各種實施方案中，本文所公開的方法能夠在處于生理范圍內的細菌濃度(即在從被所述細菌感染的受試者中收集的樣品中的細菌濃度)下檢測碳青霉烯酶的存在情況。因此，無需分離、濃縮或擴展(例如培養(yǎng))細菌群體，樣品可以直接進行篩選以檢測碳青霉烯酶的存在情況。在各種實施方案中，本文所公開的方法能夠從具有約1x103CFU/ml，約1x104CFU/ml，約1x105CFU/ml，或約1x106CFU/ml的細菌濃度的樣品中檢測碳青霉烯酶的存在情況?；诰酆厦傅臄U增眾多不同的PCR或QPCR方案是本領域已知的并在本文下面中例示，并且可以直接應用于或經(jīng)調整而用于通過使用本文所描述的組合物來檢測樣品中的碳青霉烯酶。一般地，在PCR中，通過與至少一種寡核苷酸引物或寡核苷酸引物對反應來擴增靶多核苷酸序列。所述引物與靶核酸的互補區(qū)雜交，并且DNA聚合酶延伸所述引物從而擴增出靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸擴增產(chǎn)物的條件下，有著一種大小的核酸片段在反應產(chǎn)物中占優(yōu)勢(作為擴增產(chǎn)物的靶多核苷酸序列)。重復擴增循環(huán)以增加該單一靶多核苷酸序列的濃度。所述反應可以在任何常常用于PCR的循環(huán)變溫器中進行。然而，優(yōu)選的是具有實時熒光測量能力的循環(huán)儀，例如SMARTCYCLER(Cepheid，Sunnyvale,CA)、ABIPRISM7700(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)、ROTOR-GENE(CorbettResearch,Sydney,Australia)、LIGHTCYCLER(RocheDiagnosticsCorp,Indianapolis,IN)、ICYCLER(BioradLaboratories,Hercules,CA)和MX4000(Stratagene，LaJolla，CA)。定量PCR(QPCR)(也稱為實時PCR)在某些情況下是優(yōu)選的，因為它不僅提供定量測量，而且還減少時間和污染。如本文中所使用的，"定量PCR"(或"實時QPCR")是指PCR擴增過程的直接監(jiān)測，正如它無需反應產(chǎn)物的反復取樣而發(fā)生。在QPCR中，可以經(jīng)由發(fā)信號機制(例如熒光)來監(jiān)測反應產(chǎn)物，正如產(chǎn)生了它們并且在信號升高超過背景水平之后但在反應達到平臺之前跟蹤它們。達到可檢測或"閾值"熒光水平所需的循環(huán)數(shù)目(本文稱為循環(huán)閣值(cyclethreshold)或"CT，，)直接隨著在PCR過程開始時可擴增靶的濃度而改變，使得能夠測量信號強度從而提供樣品中乾核酸的量的實時測量。在一個優(yōu)選的實施方案中，將經(jīng)標記的探針用于檢測通過PCR擴增而產(chǎn)生的延伸產(chǎn)物?？梢允褂美媒?jīng)標記的包含本發(fā)明序列的探針的任何探針形式，例如本領域已知的或本文其他地方描述的SC0RPI0NSTM探針、日出探針(sunriseprobe)、TAQMAN⑧探針、或分子信標探針。PCR條件用于建立PCR反應的方法是本領域技術人員眾所周知的。反應混合物最低限度包含模板核酸(除了在下文所描述的陰性對照的情況下之外)和寡核苷酸引物和/或探針(與合適的緩沖液、鹽等相組合)，以及合適濃度的核酸聚合酶。如本文中所使用的，"核酸聚合酶"是指催化核苷三磷酸的聚合的酶。一般地，所述酶將會在與靼序列退火的引物的3'-末端處起始合成，并且將會以5'-方向沿著模板前行直至合成終止。合適的濃度包括在本文所描述的方法中催化這種反應的濃度。已知的DNA聚合酶包括例如，大腸桿菌DNA聚合酶I、T7DM聚合酶、嗜熱棲熱菌(r力er邁"sMer即/7力27ws)(Tth)DNA聚合酶、嗜熱月旨肪芽《包軒菌(^2c///w<ysfe<3iT^^er/z70/7A//i^)DNA聚合酵、海濱熱球菌(7Te層coc譜/"ora7/"DNA聚合酶、7JC生棲熱菌(f力er層agua〃ci^y)(Taq)DNA聚合酶和激烈火球菌(戶/rococcws/7/Wows)(Pfu)DNA聚合酶。除了上述組分外，本方法的反應混合物還包含引物、探針和脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。通常地，反應混合物將進一步包含相應于4種天然存在的核苷堿基的4種不同類型的dNTPs，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本發(fā)明的方法中，每種dNTP通常將會以約10-5000luM，經(jīng)常約20-lOOOjnM,約100-800jiM，或約300-600|iM的量存在。在本發(fā)明方法的第一個步驟中制備的反應混合物進一步包舍水性緩沖介質，其包含單價離子來源、二價陽離子來源和緩沖劑。可以采用任何方便的單價離子來源，例如氯化鉀、乙酸鉀、乙酸銨、谷氨酸鉀、氯化銨、硫酸銨等。二價陽離子可以是鎂、錳、鋅等，其中該陽離子通常將會是鎂?？梢圆捎萌魏畏奖愕逆V陽離子來源，包括氯化鎂、乙酸鎂等。緩沖液中存在的鎂的量可以是0.5-10mM，并且可以是約1-約6mM，或約3-約5mM?？梢源嬖谟诰彌_液中的代表性緩沖劑或鹽包括Tris、Tricine、HEPES、M0PS等，其中緩沖劑的量通常將會是約5-150mM，通常約10-100mM，和更通常約20-50mM,其中在某些優(yōu)選的實施方案中，緩沖劑將會以足以提供約6.0-9.5的pH,例如約pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5的量存在?？梢源嬖谟诰彌_介質中的其他試劑包括螯合劑，例如EDTA、EGTA等。在制備反應混合物中，各種組成組分可以以任何方便的順序相組合。例如，緩沖液可以與引物、聚合酶相組合，隨后與模板核酸相組合，或者所有各種組成組分可以同時相組合，以產(chǎn)生反應混合物。備選地，商購可得的預混合的試劑可以根據(jù)制造商的指導在本發(fā)明的方法中利用，或者進行修飾以改善反應條件(例如，必要時，改變緩沖液濃度、陽離子濃度或dNTP濃度)，包括例如TAQMANUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems)、0MNIMIX⑧或SMARTMIX(Cepheid)、IQSupermix(Bio-RadLaboratories)、LIGHTCYCLERFastStart(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)或BRILLIANTQPCRMasterMix(Stratagene，LaJolla，CA)。在制備反應混合物后，使反應混合物經(jīng)歷引物延伸反應條件("足以提供基于聚合酶的核酸擴增產(chǎn)物的條件")，即使得能夠通過使用模板鏈作為模板經(jīng)由向引物分子的末端添加核苷酸來進行由聚合酶介導的引物延伸的條件。在許多實施方案中，引物延伸反應條件是擴增條件，所述條件包括多個反應循環(huán)，其中每個反應循環(huán)包括(l)變性步驟，(2)退火步驟，和(3)聚合步驟。反應循環(huán)的數(shù)目將會依據(jù)所施行的應用而改變，但通常將會是至少15個，更通常至少20個，和可以高至60個或更高，其中不同循環(huán)的數(shù)目通常將會是約20-40個。對于其中施行超過約25個，通常超過約30個循環(huán)的方法，可以方便的是或可以希望，將另外的聚合酶引入反應混合物中，從而使得維持了適合于酶促引物延伸的條件。變性步驟包括將反應混合物加熱至升高的溫度，并且使混合物維持在該升高的溫度下一定的時間段，所述時間段足夠用于使反應混合物中存在的任何雙鏈或雜交的核酸解離。關于變性，反應混合物的溫度將會通常升高至并維持在約85-100°C，通常約90-98。C，和更通常約93-96t:下，并保持約3-120秒，通常約3秒的時間段。在變性后，反應混合物將會經(jīng)歷這樣的條件，所述條件足以使引物與在該混合物中存在的模板核酸(如果存在)退火，并且使核苷酸聚合至引物末端，從而通過使用引物所與之雜交的核酸作為模板來以5'至3'方向將引物延伸；即，對于引物延伸產(chǎn)物的酶促產(chǎn)生而言足夠的條件。在這個實施方案中，退火和延伸過程在同一步驟中發(fā)生。通常將會對為了達到這些條件而將反應混合物降低至的溫度進行選擇，以提供最佳效率和特異性，并且一般將會是約50-75°C，通常約55-70°C,和更通常約60-68°C，更特別地大約6(TC。退火條件將會維持約15秒-30分鐘，通常約20秒-5分鐘，或約30秒-l分鐘，或約30秒的時間段。這個步驟可以任選地包括退火步驟和延伸步驟中每一個之一，其中對于每個步驟進行溫度和時間長度的變化和優(yōu)化。在兩步式退火和延伸中，允許退火步驟如上進行。在引物與模板核酸退火后，進一步地使反應混合物經(jīng)歷足以提供核苷酸向引物末端的聚合的條件(如上)。為了達到聚合條件，反應混合物的溫度通常將會升高至或維持在約65-75。C,通常約67-73。C的溫度，并且維持約15秒-2Q分鐘，通常約30秒-5分鐘的時間段。上述的變性、退火和聚合的循環(huán)可以通過使用自動化裝置(通常稱為熱循環(huán)儀)來執(zhí)行。可以釆用的熱循環(huán)儀在本文其他地方以及在美國專利號5，612，473;5，602，756;5,538,871;和5,475，610中進行描述；這些專利的公開內容通過提及而合并入本文。本發(fā)明的方法還可以在非基于PCR的應用中使用，以檢測靶核酸序列，其中此類靶可以固定在固體支持物上。用于使核酸序列固定在固體支持物上的方法是本領域已知的，并且在Ausubel等人，編輯(1995)C"rre力f戶rc^oco/s//#o/ecw_/ar"/o/o^y(GreenePublishingandWiley-Interscience，NY)中以及在由制造商所提供的方案中進行了描述，例如對于膜PallCorporation,Schleicher&Schuell;對于磁珠Dynal;對于培養(yǎng)平板Costar，Nalge纖c;對于珠陣列平臺Luminex和BectonDickinson;和對于才艮據(jù)本發(fā)明有用的其他支持物CPG,Inc。核酸擴增領域中的技術人員知曉存在有其他快速擴增程序，例如連接酶鏈式反應(LCR)、基于轉錄的擴增系統(tǒng)(TAS)、自動維持序列復制(3SR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、鏈置換擴增(SDA)和分支DNA(訓A)(Persing等人，(1993)Z^a《廳〃c淑ecw7"#/cro6/o7og/../V/nc/z^esa/^/」/7/7//c"/o/7S(AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC))。本發(fā)明的范圍并不局限于使用通過PCR的擴增，而是包括使用任何快速核酸擴增方法或任何其他程序，其與本發(fā)明的序列一起可用于檢測和/或定量碳青霉烯酶抗生素抗性基因。此外，導致相似的擴增或檢測/定量結果的對于各種試劑的確切量和對于PCR或其他合適的擴增程序的條件(例如，緩沖條件、循環(huán)時間等)的變化是本領域技術人員已知的，并且被視為是等價的。在一個實施方案中，目標QPCR檢測具有檢測出樣品中少于50個拷貝(優(yōu)選地少于25個拷貝，更優(yōu)選地少于15個拷貝，更加優(yōu)選地少于10個拷貝)的靶核酸(即碳青霉烯酶核酸)的靈敏度。在一個實施方案中，施行熱啟動PCR反應(例如，通過使用熱啟動TaqDNA聚合酶)，以便通過減少來自非特異性擴增的背景來改善PCR反應，并且增加所希望的延伸產(chǎn)物的擴增。對照本發(fā)明的PCR或QPCR反應可以包括各種對照。此類對照應當包括"無模板"陰性對照，其中引物、緩沖液、酶和其他必需試劑(例如氯化鎂、核苷酸)在不存在添加的測試樣品的情況下進行循環(huán)。還應平行地運行包括已知的靶核酸的陽性對照。陽性對照和陰性對照都可以被包括在擴增反應中。單個反應可以包含陽性對照、陰性對照或樣品模板，或者單個反應可以包含樣品模板和陽性對照兩者。除了"無模板"對照外，陰性對照還可以包括使用在反應中所包括的非特異性靶核酸的擴增反應，或者可以是通過使用樣品制備的任何或所有步驟(從核酸提取到擴增制備)但不添加測試樣品(例如，每個步驟不使用測試樣品或使用已知不含碳青霉烯酶的樣品)而制備的樣品。陽性和陰性對照可用于設定參數(shù)，在所述參數(shù)內測試樣品將會被分類為具有或不具有碳青霉烯抗性。例如，在QPCR反應中，可以將在其下在陽性對照樣品中檢測出碳青霉烯酶的循環(huán)閾值用于設定用于將樣品分類為"陽性"的閾值，并且可以將在其下在陰性對照樣品中檢測出碳青霉烯酶的循環(huán)閾值用于設定用于將樣品分類為"陰性"的閾值。可以將來自單個反應的CT用于每種對照，或者可以使用重復樣品的中值或平均值。在另外一個實施方案中，可以使用歷史對照值。通常將關于陰性和陽性對照中每一個的最低檢測水平設定在多個反應間的平均CT的95%置信區(qū)間的下端。這個值可以依據(jù)診斷測定法的要求來進行調整。引物延伸產(chǎn)物的證實需要時，可以通過使用標準分子技術(包括(例如)Southern印跡測定法)來證實引物延伸或擴增產(chǎn)物的身份。在Southern印跡測定法中，通過電泳來分開擴增產(chǎn)物，轉移至膜(即硝化纖維素、尼龍等)，與寡核苷酸探針或目的核酸序列的任何部分反應。然后，對探針進行修飾以使得能夠進行檢測。修飾方法可以是摻入經(jīng)放射性標記的核苷酸或任何數(shù)目的非放射性標記(例如生物素)。在Southern印跡測定法中使用的寡核苷酸探針源自所述核酸序列，并因此對于該碳青霉烯酶抗生素抗性基因是特異的，并且可以是包含SEQIDNO:3、6、9、16或19中所示的序列的探針。在Southern印跡測定法中使用的探針可以使用常規(guī)的標準方法來制備。例如，探針可以通過使用本領域已知的常規(guī)技術來進行分離、克隆和限制酶切，或者可以通過使用本文先前所描述的化學合成方法來制備。備選地，可以使用斑點印跡分析來檢測擴增產(chǎn)物。斑點印跡分析涉及使寡核苷酸探針(例如先前所描述的那種)附著至硝化纖維素或固體支持物，例如但不限于，珠(例如但不限于聚苯乙烯珠、磁珠或非磁性珠等)、反應托盤(reactiontray)的壁、細條(strip)(例如但不限于硝化纖維素細條)、試管。加入包含經(jīng)標記的擴增產(chǎn)物的樣品，進行反應，進行洗滌以去除未結合的樣品，并且通過使用本領域已知的常規(guī)技術來顯現(xiàn)附著至探針的、經(jīng)標記的、擴增出的產(chǎn)物。一種用于驗證引物延伸產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物的更嚴格的方法是通過使用本領域眾所周知的技術的直接測序。試劑盒本發(fā)明容易地適合于制備"試劑盒"，其包含對于施行本發(fā)明方法而言所必需的要素。此類試劑盒可以包含承載物，所述承載物被區(qū)室化以便在其中以緊密約束的形式接受一個或多個容器，例如管或小瓶。容器之一可以包含至少一種未標記的或經(jīng)可檢測地標記的本發(fā)明的DNA引物。必要時，經(jīng)標記的DNA引物可以以凍干形式或者在合適的緩沖液中存在。一個或多個容器可以包含待在PCR反應中使用的一種或多種酶或試劑。這些酶可以單獨地，或者以混合物、以凍干形式或在合適的緩沖液中存在。最后，所述試劑盒可以包含對于施行本發(fā)明的技術而言所必需的所有另外的要素，例如緩沖液、提取試劑、酶、移液管、平板、核酸、核苷三磷酸、濾紙、凝膠材料、轉移材料、放射自顯影供應物等。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒將會至少包含(a)經(jīng)標記的寡核苷酸，其中所述試劑盒包含兩種或更多種可區(qū)別的寡核苷酸，例如與編碼碳青霉烯酶的核苷酸序列雜交的寡核苷酸；和(b)關于在高保真度擴增(例如PCR)反應中使用所提供的經(jīng)標記的寡核苷酸的指導說明書。在一個實施方案中，所述兩種可區(qū)別的寡核苷酸選自SEQIDNO:1-9和14-20。目標試劑盒可以進一步包含另外的試劑，所述另外的試劑對于被在包括在于本發(fā)明方法的過程中所制備的反應混合物之中而言是必需的或者方便和/或希望的，其中此類試劑包括一種或多種聚合酶；水性緩沖介質(以其組成組分制備或存在，其中所述組分中的一種或多種可以預混合或者所有組分可以是分開的)等。試劑盒的各種試劑組分可以存在于分開的容器中，或者可以全部預組合成試劑混合物以用于與模板核酸相組合。除了上述組分外，所述試劑盒將會進一步包含關于實踐本發(fā)明方法的指導說明書。這些指導說明書可以以各種形式存在于試劑盒中，所述形式中的一種或多種可以存在于試劑盒中。這些指導說明書所可以存在的一種形式是作為在合適的介質或基質上的印刷信息，例如其上印刷有信息的一張或多張紙，在試劑盒的包裝中，在包裝插入物中等。另外一種手段是在其上已記錄了信息的計算機可讀的介質，例如軟盤、CD等?？梢源嬖诘牧硗庖环N手段是可以經(jīng)由因特網(wǎng)使用的網(wǎng)址，以訪問在遠處地點處的信息。任何方便的手段可以存在于試劑盒中。提供了下列實施例，這是為了舉例說明而不是限制。實驗材料和方法下文提及的參考文獻(1)-(6)在實驗部分結束時列出。細菌菌林通過由CLSI所描述的培養(yǎng)液微稀釋法(brothmicrodiluUon)從BDID/AST微生物庫中鑒定出碳青霉烯抗性克雷伯氏菌屬細菌和大腸桿菌(1)。在所述實驗的自始至終，將野生型(氨節(jié)青霉素敏感的)大腸桿菌ATCC25922(菌抹ID300960)用作陰性對照。將事先被確定為包含KPC-1、KPC-2和KPC-3的三種菌林(菌林ID301916=KPC-1,301917=KPC-2，301918=KPC-3)用作陽性對照(4)。還篩選出ESBL陽性克雷伯氏菌屬細菌和大腸桿菌，以用于證明所述實時測定法的特異性。通過使用CLSI所推薦的培養(yǎng)液微稀釋測定法來鑒定ESBL陽性菌抹(2)。在任何加工或提取之前，將所有菌林在包含5%綿羊紅細胞的胰胨豆胨瓊脂(TrypticaseSoyAgar，TSA)(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD)平板上進行劃線培養(yǎng)，并且在35。C下生長過夜?？刮⑸飫┟舾行栽囼炄鏑LSI所描述的，使用Mueller-Hinton培養(yǎng)，液(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD)來進^f亍抗孩吏生物齊寸敏感性試驗(l)。從下列公司獲得抗微生物粉劑；氨千青霉素Ump)和頭孢瘞肟(CTX)(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO)、頭孢他梵(CAZ)(EHLilly,Indianapolis,IN)、克拉維酸(Smith-Kline，KingofPrussia,PA)、亞胺培南(固)(Merck&Co.，Rahway，NJ)。DNA提取和標準化使用標準熱裂解方案來進行細菌DNA分離。在這個方案中，將來自TSA分離平板的菌落的一部分放置到50"1分子生物學級水中。然后，在同時于800rpms進行搖動的情況下，使樣品在95。C下溫育10分鐘(rain)。通過短暫的離心步驟(14，000rpms(20，800xg)，5分鐘)來回收DNA。移出包含DNA的上清液并放置到干凈的管中。樣品經(jīng)歷分光光度法，并且將核酸標準化至100ng/ja1，在具有1mMEDTA的10mMTris-HCL(TE)緩沖液(pH8.0)中。通過分析260/280吸光度比率來測定DNA純度；純的DNA具有>1.7的比率。實時PCR方案在PCR分析之前將所有經(jīng)純化的DNA(100ng/jal)稀釋至少1/20，以稀釋掉在經(jīng)熱裂解的樣品中存在的任何抑制性蛋白質。將DNA樣品的5ng等分試樣放置到20n1PCR主混合物中，所述PCR主混合物包含250nM的每種引物、125nM的經(jīng)雙重標記的探針和TaqManUniversalFastPCRMasterMix(AppliedBiosystemsFosterCity,CA)。在所述實時測定法中所使用的引物和探針的序列可以在表2中找到。所有引物和探針由IntegratedDNATechnologies,Inc.在該計劃的指導下進行合成。用5'6-FAM/3'BHQO2XHPLC(純化的)來合成經(jīng)雙重標記的水解探針。樣品在AppliedBiosystems(ABI)7500FastRea卜TimePCRSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上運行，在此使用2階段2步PCR程序，其中存在有20秒(sec)酶激活階段，以及由3秒95。C變性步驟和30秒60"退火/延伸步驟(40個循環(huán))組成的2步PCR階段。所述PCR程序的平均運行時間是35分鐘。測序通過使用在Yigit等人，2001(3)和Bratu等人，2005(5)中所描述的引物來進行擴增子測序，以核實在實時PCR測定法中鑒定的KPC陽性菌林。將DNA樣品的100ng等分試樣放置到15m1PCR主混合物中,所述主混合物包含O.2pmol的每種引物和Qiagen⑧MultiplexPCRMasterMix(Qiagen，Valencia,CA)。反應在MJResearchPTC-200熱循環(huán)儀(BioRad，Hercules,CA)中進行擴增，其中使用由售賣者(Qiagen)描述的循環(huán)參數(shù)。PCR反應根據(jù)ExoSap-IT(USBCorporation,Cleveland,OH)方案來進行清理(cleanup)。測序反應和循環(huán)參數(shù)根據(jù)ABIBigDyeTerminatorvl.l循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)來執(zhí)4亍。才艮才居制造商提供的方案，使用DyExTM2.0SpinKit(Qiagen，Valencia,CA)來純4匕觀'J序反應產(chǎn)物，并在ABI3130GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上進行分析。使用來自國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)的BLAST算法，將從KPC擴增子測序中獲得的序列與GenBank中的非豐余序列進行比較。結果KPC比對和測定法設計從NCBI獲得KPC及其相關的變體。使用DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison,WI)序列分析軟件中的ClustalW算法來對所有獨特的KPC變體進行比對，以揭示與KPC同種型相關的所有核苷酸變體。在所述比對中鑒定出的所有KPC變體連同其GenBank登錄號和儲存物種一起在表l中列出。然后，將經(jīng)比對的序列用作用于引物和探針設計的參考。就其識別所有KPC變體的能力來特別地選擇實時測定法。來自實時測定法的大多數(shù)引物和探針不與已知的KPC變體重疊，除了KPC-758測定法外。KPC-758測定法中的反向引物在核苷酸位置814處與KPC-3變體重疊。用KPC-758測定法來檢測KPC-3變體，而在靈敏度方面無明顯損失(參見下表4中的CT值)。借助于PrimerExpressv3(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)來設計引物和探針，其中采用這樣的標準，即所有引物必須在彼此的2度之內和在60。C的最佳Tm(解鏈溫度)的2度之內。探針的Tm比引物對高10度，以增加探針退火的特異性(表2)。使用來自NCBI的BLAST算法，將KPC實時引物和探針與GenBank中的非豐余序列進行比較。所有實時測定法以>100%的覆蓋和〉100。/。的序列同一性匹配可利用的GenBankKPC序列，并且與該數(shù)據(jù)庫中的任何其他基因不具有任何顯著的同一性。表l.KPC核苷酸變體。從GenBank下載序列，使用DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)中的ClustalW算法進行比對，以鑒定與每種KPC同種型相關的特定核苷酸變異和位置。還注明了關于KPC基因的某些儲存物種。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>KPC-2***_AY034847肺炎克雷伯氏菌*核苦酸位置基于KPC基因的開放讀碼框或編碼序列。**堿基變化是與在那個位置處的共有堿基相比較而言的變化。***通過缺乏任何上文提及的變化來確定KPC-2變體。表2.關于KPC的實時測定法。就其識別所有KPC變體的能力來特別地選擇實時測定法。引物被設計為在彼此的2度之內和在60X:的最佳Tm的2度之內，并且探針的Tm被設計為比引物對高10度。"起始"和"終止"是指相應的在KPC編碼序列(參見，SEQIDN0:10-13)內的核苷酸位置。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>篩選水解碳青霉烯和產(chǎn)生ESBL的菌林用由CLSI所描述的培養(yǎng)液微稀釋法，就碳青霉烯抗性克雷伯氏菌屬細菌和大腸桿菌來對BDID/ASTMicrobialBank進行篩選(2)。選擇克雷伯氏菌屬物種(>{7e6We/7a)和大腸桿菌，這是因為它們是質粒承載的KPC基因的主要儲存物種。基于標準微培養(yǎng)液稀釋法，在2-16pg/ral的范圍內評價IPM的最小抑制濃度(MIC),其中^16iLig/ml被視為對IPM具有抗性(2)。根據(jù)CLSI標準，表3中的24種菌林中的3種(顯示為有下劃線的)對于IPM具有抗性(>16jjg/ml)。由于文獻中的一些報道提出產(chǎn)生KPC的分離物與陽性ESBLCLSI證實性測試相關(6)并且已發(fā)現(xiàn)某些產(chǎn)生KPC的分離物低于^16jig/ml的IPM抗性點(6)，因而篩選出非IPM抗性的但ESBL陽性的另外的克雷伯氏菌屬物種和大腸桿菌菌林。包括了這些另外的ESBL菌抹，以用于證明所述實時測定法的靈敏度和特異性。使用CLSI所推薦的培養(yǎng)液微稀釋測定法來鑒定ESBL陽性菌林(2)。簡而言之，這種培養(yǎng)液微稀釋測定法具有在抗微生物劑的規(guī)定范圍之間的兩倍稀釋方案。例如，當抗微生物劑的規(guī)定范圍是2-16jag/ml時，孔之間的兩倍稀釋由O.25、0.5、1、2、4、8和16jag/ml代表。為了鑒定ESBL陽性菌林，在包含單獨的或與克拉維酸相組合的處于跨越規(guī)定范圍的這些各種兩倍稀釋度的目的抗微生物劑的孔中評價生長，以便測定單獨的或與克拉維酸相組合的抗微生物劑的MIC。向抗微生物劑添加克拉維酸可以減少該試劑的MIC，例如，從而使得微生物的生長在包含liug/ml試劑+克拉維酸的孔中受到抑制，而微生物的生長在包含8jLig/ml單獨的該試劑的孔中被抑制。這個具體例子等同于MIC減少了3個孔(其在每個這些孔之間具有兩倍稀釋)，并且MIC的這種類型的減少保證了該微生物被判讀為ESBL陽性。因此，相比于單獨測試時它的兩倍濃度減少，是所述微生物為ESBL陽性的指示(例如，CAZMIC-8jug/ml;CCZ(克拉維酸+頭孢他啶(CCZ))MIC=1jag/ml)。根據(jù)CLSI標準，表3中的24種菌林中的11種是ESBL陽性的(參見表3，在關于每個測定法的列內，其中指明了ESBL陽性菌林的結果用星號指示)。還篩選了野生型大腸桿菌菌林ID300960，并且用作關于所有實時測定法的陰性對照。表3.抗微生物劑敏感性試驗。如CLSI所描述的，使用Mueller-Hinton培養(yǎng)'液(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD.)來進4亍抗孩i生物劑敏感性試驗(l)。IPM抗性菌林(》16ug/ml)是有下劃線的，和ESBL陽性菌株(使用CLSI標準)用星號指示。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>ESCC0L=大腸桿菌CCX-克拉維酸+頭孢噻肟KLEOXY-產(chǎn)酸克雷伯氏菌CCZ-克拉維酸+頭孢他啶KLEPNEP-肺炎克雷伯氏菌KPC實時PCR測定法使用在"材料和方法"中概述的熱裂解方案，從在表3中所列出的菌抹中分離出總DNA。在實時PCR分析之前將總DNA稀釋至少1/20，以稀釋掉在經(jīng)熱裂解的樣品中存在的任何抑制性蛋白質。將DNA樣品的等分試樣放置到PCR主混合物中，所述PCR主混合物包含每種引物、經(jīng)雙重標記的探針和TaqMan⑧UniversalFastPCRMasterMix(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)。在所述實時測定法中所使用的引物和探針的序列可以在表2中找到。樣品在AppliedBiosystems(ABI)7500FastRea卜TimePCRSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上運行，在此使用2階段2步PCR程序(40個循環(huán))。所有測定法一式兩份地運行，并且根據(jù)用戶定義的基線和CT，使用ABISequenceDetection軟件vl.3.1(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)來計算樣品的循環(huán)閾值(CT)的值。對于陽性對照，將CT設定在曲線的線性或指數(shù)期中。將關于所述分析的基線設定在不具有任何與該CT相交的樣品的區(qū)域中(第3-12個循環(huán))。為了測定關于陽性或陰性判讀的CT范圍，分析了陽性和陰性對照。表4中可見的范圍(即最小CT判讀或最大CT判讀)被計算為距離平均CT+/-6標準差(StdDev)，所述平均CT通過使用所有KPC測定法(87，289，和758)從陽性或陰性對照中計算出來。這些陽性和陰性判讀范圍用于對所有菌林進行評分。表4:關于KPC實時測定法的判讀范圍。所有測定法一式兩份地運行，并且才艮據(jù)用戶定義的背景和CT，使用ABISequenceDetection軟件來計算所有樣品的CT值。將最小CT判讀(MinCTCa11)和最大CT判讀(MaxCTCall)計算為距離陽性或陰性對照的平均CT(來自所有KPC測定法)+/-6StdDev。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>在給定KPC測定法內的所有重復的陽性反應為彼此的O.3StdDev。表5包含關于經(jīng)測試的所有24種菌抹的判讀；通過使用對于給定菌林跨越所有KPC測定法而計算出的平均CT值來產(chǎn)生這些判讀。在所測試的24種菌抹中，總共10種菌林被判讀為陽性。在表6中，對于所有陽性和陰性菌抹，使用來自表5的判讀和平均(Avg)CT值來計算平均(Avg)CT內(Intra-CT)距離(最大陽性/陰性AvgCT-最小陽性/陰性AvgCT)、平均CT、和平均CT間(Inter-CT)距離(陽性AvgCT-陰性AvgCT)。在陽性菌林中的AvgIntra-CT距離在彼此的4.4CT內，并且AvgInter-CT距離比陰性對照小14.4CT。這些結果表明，這些測定法可以以許多數(shù)量級(為精確的214'4)來將陽性菌林與陰性菌林相區(qū)別，假定所述測定法是100。/fl有效的(E=2，即每個循環(huán)產(chǎn)生2個拷貝)。作為對所述測定法進行優(yōu)化的一部分，所述測定法的效率已確定為>98%。表5:關于碳青霉烯抗性的且產(chǎn)生ESBL的菌林的CT值。對于表3中所列出的所有菌抹，一式兩份地進行KPC實時PCR測定法。根據(jù)用戶定義的背景和CT,使用ABISequenceDetection軟件來計算CT值。對于待判讀的樣品，CT值必須在任一對照的6StdDev之內。經(jīng)測試的所有樣品在已知的陽性和陰性對照的6StdDev之內。在所測試的24種中鑒定出了總共10種陽性菌林。菌林IDCT-KPC-87CT-KPC-289CT-KPC-758AvgCT判讀30096030.30.023328.7228.0429.29.679729.5陰性300967is-020914.061414,14.726114.6陽性30099618,18,566617.3717.4418.18.163318.1陽性30100832.33.170731.830.7133.0632.1232.2陰性30188817,17,597116.17.520217.17.446117.3陽性30189133.34.932432.9533.2632.33.119733.4陰性30189217,17.738716.17.740217.17.495517.4陽性30189416.16.270615.15.081116.17.630216.0陽性30189631.9832.1730,31,4825so-so.999731.3陰性30189833.1634.0232.9232.8531.9834.1633.2陰性30189932.131.5731.0630.9632.3331.3531.6陰性30190519.19.353918.3618.5419.0619.0719.0陽性30191616.6416.5715.6615.5516.8216.9316.4陽性30191719.0118.5817.7217.9318.7518.9418.5陽性30191816.2516.1815.2415.3217.1817.1416.2陽性30191931.3830.8530.0629.7230.7530.7630.6陰性30192031.5931.6531.2231.1931.7132.1931.6陰性30192129.9930.0128.7528.530.6429.829.6陰性30192231.932.2930.8830.7431.8330.9431.4陰性30336432.6532.2931.231.7433.2932.4732.3陰性30336531.9632.5331.1530.0231.4731.4831.4陰性30336931.1931.0930.1530.1431.0330.5330.7陰性<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*使用在表5中找到的平均CT值來計算這些值。在給定KPC測定法內的所有重復的陽性反應為彼此的O.3StdDev。如先前指出的，由于在使用KPC-3變體的測定法的反向引物中具有一個堿基對錯配，因而在KPC-758測定法中不存在靈敏度的減少。這可以在表4中看出，請觀察與KPC-1菌株301916(AvgCT=16.4)或KPC-2菌抹301917(AvgCT=18.5)相比較，經(jīng)序列驗證的KPC-3菌林301918的AvgCT(AvgCT-16.2)。對實時陽性菌株進行測序為了核實所述實時測定法，對所有陽性判讀進行序列驗證。通過使用擴增KPC基因的整個開放讀碼框或編碼序列的引物(Yigit等人，2001(3);和Bratu等人，2005(5))來進行標準PCR。如在"材料和方法"中所描述的，對PCR擴增子進行清理和測序。對PCR擴增子的反向鏈進行測序和修整?；谕ㄟ^SequencingAnalysis軟件v5.1(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA)中的KBbasecaller而評估的品質值(qualityvalue)來對序列進行修整。將具有〉20的品質值的堿基用于NCBI比較。讀數(shù)的平均長度為〉500bp。通過使用來自NCBI的BLAST算法，將所述序列與GenBank中的非豐余序列進行比較。來自實時測定法的所有陽性以>99%的覆蓋和>99%的序列同一性匹配可利用的GenBankKPC序列，并且與任何其他基因不具有任何顯著的同一性。因此，這個菌林攻擊組中的這些KPC實時測定法以100%的靈敏度和100%的特異性來進行，而采用處于>16jug/ml的IPM抗性的CLSI標準微培養(yǎng)液稀釋法具有58.8%的靈敏度(7個假陰性-菌林ID300996、301888、301892、301894、301905、301916、301917)和100%的特異性性能(2)。靈敏度實時PCR測定法使用陽性對照菌林(菌株ID301916)來建立5倍DNA稀釋方案(20ng至2fg)。在每個實驗內使用陰性對照(菌株ID300960)來對于每個測定法建立陰性CT閾值。將95%置信區(qū)間(CI)應用于陰性CT閾值。為了計算CI，將表4中列出的歷史標準差(StdDev)(0.9)乘以3(0.9x3=2.7或3CT)，從而使得用于將樣品判讀為陰性的CT閾值被計算為3CT減去最低陰性對照CT。根據(jù)Yigit等人，2001和Woodford等人，2004，使用標準PCR反應和引物(正向#5和反向#10)。使標準PCR反應體系在凝膠電泳上走樣，并且使用溴化乙錠和凝膠成像系統(tǒng)(geldocumentationsystem)(KodakIDv3.6，NewHaven，CT.)來進行顯現(xiàn)。直接樣品測定法將陽性(菌林ID301916)和陰性(菌林ID300960)菌林在包含5%綿羊紅細胞(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD)的TSA平板上進行劃線培養(yǎng)，并且在35'C下生長過夜。將每種菌林的純菌落》丈置到胰胨豆胨培養(yǎng)液(TrypticaseSoyBroth,TSB)(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD.)中，使用法度計(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD.)進行定量，并且在無菌的尿中稀釋至l.0E+°6、1.0E+。5、1.0E,和1.0E+°3CFU/ml。通過離心來收集細菌，并且使用在"DNA提取方法"中所描述的標準熱裂解來分離出DNA。在實時PCR和標準PCR反應中使用5微升的包含DNA的上清液。根據(jù)Yigit等人，2001和Woodford等人，2004，使用標準PCR反應和引物(編號取自Yigit等人，正向#5和反向#10)。將純的陽性和陰性菌落接種到包含5ml無菌血液的Bactec需氧瓶中，并且放置到Bactec儀器(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD.)中。當該儀器將瓶判讀為陽性時，從所述瓶中取出IOOjal等分試樣，并且放置到1.5ml管中。通過離心來收集細菌，并且使粒狀沉淀直接熱裂解，或者用100jul85%鹽水洗滌兩次并隨后進行熱裂解。在實時PCR和標準PCR反應中使用5微升的包含DNA的上清液。在每個測定法中運行從純的菌落中分離的陽性(菌林ID301916)和陰性(菌林ID300960)模板對照，以確保施行PCR反應。用于計算基因組拷貝或等價物的公式如下[拷貝數(shù)=(量(ng)*6.022x1023)/(長度*lx109*650)]。經(jīng)估計的菌抹ID301919肺炎克雷伯氏菌的基因組大小或長度是2，900，000bp。結果KPC實時PCR靈敏度測定法為了測定相比于已知的測定法而言本文所描述的實時測定法的靈敏度，建立了靈敏度測定法比較。為了建立這些實驗，使用上文在"材料和方法，，中概述的熱裂解方案，從來自KPC陽性(菌抹ID301916)和陰性(菌林ID300960)菌林的純菌落中分離出總核酸。將核酸標準化至在TE緩沖液中IOOng/jal，然后無菌稀釋(5倍稀釋方案)至20ng-2fg的范圍。將核酸樣品的5jil等分試樣放置到實時PCR測定法(KPC-87和KPC-758)和標準(Std)PCR測定法中(引物來自YigU等人，2001)。所有PCR測定法一式三份地運行。在ABI7500FastRea卜timePCRSystem(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCUy，CA.)上運行實時測定法，在此使用2階段2步PCR程序(40個循環(huán))。標準PCR反應在ABI2720ThermalCycler(AppliedBiosystems,FosterCity,CA.)上運行,其中使用在Yigit等人，2001中概述的PCR程序。使標準PCR反應體系在凝膠電泳上走樣，并且使用溴化乙錠和凝膠成像系統(tǒng)(KodakIDv3.6，NewHaven,CT.)來進行顯現(xiàn)(圖1)。根據(jù)用戶定義的基線和CT，使用ABISequenceDetection軟件vl.3.1(AppliedBiosystems,FosterCity,CA.)來計算實時PCR測定法的循環(huán)閾值(CT)的值。對于陽性對照，將CT設定在曲線的指數(shù)期中。將關于所述分析的基線設定在不具有任何與該CT相交的樣品的區(qū)域中(第3-12個循環(huán))。為了測定關于陰性判讀的CT范圍，在該實驗內分析了陰性對照。僅基于在該實驗中同時運行的陰性對照，而不是基于表4中可見的歷史陰性CT閾值，來設定陰性CT閾值。這一策略背后的原因是，在這些實驗中使用的試劑(例如，商購可得的主混合物)未對這些引物探針測定法進行特別地優(yōu)化，并且陰性對照的性能可能基于這些試劑而改變。這個陰性對照變化可以對于測定這些測定法的靈敏度具有顯著的影響。為了建立關于陰性對照閾值的95%置信區(qū)間(CI)，將表4中列出的歷史標準差(StdDev)(0.9)乘以3(0.9x3-2.7或3CT)，從而使得用于將樣品判讀為陰性的CT閾值被計算為3CT減去最低陰性對照CT。通過對于表7中列出的每個實時測定法使用最低陰性對照CT值減去3CT(CI)，對于該實驗中的每個測定法計算出陰性CT閾值?；谶@個公式，關于KPC-87的陰性CT閱值是〉35CT,和關于KPC-758的陰性CT閾值是〉30CT。因此，KPC-87和KPC-758測定法的可靠的靈敏度位于來自陽性KPC菌林的1，3E—°3ng或1.3pg的核酸濃度。為了將這個值轉變成基因組拷貝或等價物，必須假定核酸輸入是所有基因組DNA，然后使用在上文的"材料和方法"部分中找到的等式。使用這個公式，我們計算出，所述實時測定法可以可靠地檢測出42個基因組等價物。與所述實時測定法相比較而言，StdPCR測定法具有在來自陽性KPC菌林的3.2E—°2ng或32pg的核酸濃度時在所有所述三個重復內可靠地檢測出條帶的能力。我們計算出，StdPCR測定法可以可靠地檢測出1，000個基因組等價物。因此，本文所描述的實時測定法的靈敏度比在YigU等人，2001和Woodford等人，2004中所描述的StdPCR測定法更靈敏至少l個數(shù)量級。表7:關于KPC-87和KPC-758的靈敏度實驗。使用陽性對照菌林(301916)來建立DNA稀釋方案(20ng至2fg)。通過使用最低陰性對照CT值(300960)減去3CT(CI)，對于每個測定法建立陰性CT閾值(對于KPC-87為〉35CT，和對于KPC-758為>30)?；谶@些標準，對于KPC-87的可靠檢測極限是<31CT，和對于KPC-758是〈29.5CT。這將所述兩個測定法的靈敏度置于l.3pg(42個基因組等價物)。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>ND(未檢測出)在40個循環(huán)內，熒光信號未與CT相交。直接樣品分析為了測定實時測定法(KPC-87和KPC-758)檢測原始或直接樣品(血液和尿)中的KPC的能力，和為了將該能力與StdPCR測定法相比較，進行直接樣品比較測定法。為了建立尿直接樣品實驗，將每種菌林(301916和300960)的純菌落放置到胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD.)中，使用法度計(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD.)進行定量，并且隨后在無菌的尿中稀釋至l.0E+°6、1.0E+°5、1.OE,和l.0E+°3CFU/ml。通過離心來收集細菌，并且使用在"DNA提取方法"中所描述的標準熱裂解來分離出DNA。將核酸樣品的5ja1等分試樣放置到實時PCR測定法(KPC-87和KPC-758)和標準(Std)PCR測定法中(引物來自Yigit等人，2001)。所有PCR測定法一式三份地運行。如先前所描述的，運行并分析實時測定法和標準PCR反應?；诒?中列出的陰性對照CT值，使用關于每個測定法的最低陰性CT值減去3CT(CI),對于每個測定法建立陰性CT閾值。基于這些標準，對于KPC-87和KPC-758的陰性CT閾值是〉35CT。對于這個實驗，由于KPC-87不具有CT，因而將關于KPC-758測定法的最低CT用作關于陰性對照的守恒值(conservativevalue)。因此，對于KPC-87的可靠陽性CT判讀或檢測極限是〈33CT,和對于KPC-758是<32CT，這轉變成在尿樣品中l(wèi).0E+°4CFU/ml的可靠檢測水平。由于與尿道感染(UTI)相關的平均生物負荷是l.0E+°5CFU/ml，所以這個水平是非常重要的。隨著進一步優(yōu)化，可以使該靈敏度更加低。還使用StdPCR引物來分析從這些尿樣品中提取的相同核酸。沒有一個樣品產(chǎn)生條帶，除了陽性模板對照(PTC)外。因此，在YigU等人，2001和Woodford等人，2004中所描述的StdPCR測定法不能在直接尿樣品中起作用。在每個測定法中運行從純菌落中分離的陽性(菌林ID301916)和陰性(菌林ID300960)模板對照，以確保施行PCR反應。為了建立血液直接樣品實驗，將每種菌株(菌株301916和菌林300960)的純菌落接種到包含5ml無菌血液的Bactec需氧+瓶中，并且放置到Bactec儀器(BDDiagnosticSystems,Sparks,MD.)中。當該儀器將瓶判讀為陽性時，從所述瓶中取出100yl等分試樣，并且放置到1.5ml管中。通過離心來收集細菌，并且使粒狀沉淀直接熱裂解，或者進行洗滌并隨后熱裂解。將核酸樣品的5jal等分試樣放置到實時PCR測定法(KPC-87和KPC-758)和StdPCR測定法(Yigit等人，2001)中。所有PCR測定法一式三份地運行。如先前所描述的，運行并分析實時測定法和標準PCR反應。計算出的對于KPC-87和KPC-758的陰性CT閾值是>33CT。因此，對于KPC-87的可靠陽性CT判讀或檢測極限是〈30CT，和對于KPC-758是〈28CT。使用表7中的標準曲線信息，在血液中這兩種測定法的檢測水平是約6.4pg或2，OOO個基因組等價物。當考慮到從陽性Bactec瓶中將血液稀釋了1/100(100|il樣品(1/10),并且分析了總共50jal中的5ml(1/10))，那么陽性Bactec瓶中的起始CFU/ml為2.0E+°5CFU/ml。由于包含克雷伯氏菌屬物種的陽性Bactec瓶的平均CFU/ml在理論上是1.OE+°5-l.0E+°6CFU/ml，所以這個結果是非常重要的。如從圖2中看出的，StdPCR引物不產(chǎn)生可見的條帶，除了陽性模板對照(PTC)夕卜。因此，在Yigit等人，2001和Woodford等人，2004中所描述的StdPCR測定法不能在陽性血液培養(yǎng)物樣品中起作用。在每個測定法中運行從純菌落中分離的陽性(菌林ID301916)和陰性(菌抹ID300960)模板對照，以確保施行PCR反應。表8:關于KPC-87和KPC-758的直接樣品實驗。如在方法中所描述的，將陽性(301916)和陰性對照(300960)刺入無菌血液或尿樣品中。對于這兩個實時測定法建立尿陰性CT閾值〉35CT?；谶@些標準，對于KPC-87的可靠陽性CT判讀是〈33CT，和關于KPC-758是〈32CT，這轉變成在尿樣品中l(wèi).OE+"CFU/ffll的可靠檢測水平。對于這兩個實時測定法建立血液陰性CT閾值〉33CT，并且對于KPC-87的可靠陽性CT判讀或檢測極限是<30CT，和對于KPC-758是<28CT。使用來自表7的標準曲線CT信息，在血液中這兩種測定法的檢測水平是約6.4pg或2，OOO個基因組等價物。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>NA(不可用)沒有計算出CFU(菌落形成單位)值，ND(未檢測出)在40個循環(huán)內，熒光信號未與CT相交。參考文獻1.ClinicalandLaboratoryStandardInstitute.2006.MethodsforDilutionAntimicrobialSusceptibilityTestsforBacteriaThatGrowAerobically;ApprovedStandard—SeventhEditionM7—A7.ClinicalandLaboratoryStandardInstitute,Wayne,Pa.2.ClinicalandLaboratoryStandardInstitute.2007.PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting;SeventeenthInformationalSupplementM100-S17.ClinicalandLaboratoryStandardInstitute,Wayne,Pa.3.Yigit等人，2001.Novelcarbapenem-hydrolyzingp—lactamase,KPC-l，fromacarbapenem-resistantstrainofi7e6s/e//3/7i7ei/邁oo/ae.J/2f/瓜/cro6.jge/7fsC力e/zc^力er45:1151-1161.4.Moland等人，2003.Plasmid-mediated，carbapenem-hydrolysingb-lactamase，KPC-2，ini7e6We/7a/we咖on/aeisolates./owiV7a/o尸y4/7〃/z/cro6/a/C力e/Z7c^力erap/51:711—714.5.Bratu等人，2005.Carbapenemase-producingi7eZ^y/e"a/wei7/z70/z/aeinBrooklyn,NY:molecularepidemiologyandactivityofpolymyxinBandotheragents,/ow/vzs/o尸y4/7〃/z^'ci"o62.a7C力e邁o^era//56:128—132.6.Bratu等人，2005a.Rapidspreadofcarbapenem-resistantiT/e^/eZ/ap/7e咖0/7/aeinNewYorkCity:anewthreattoourantibioticarmamentarium,」rc力/"fer"165(12):1430—5.域的技術人員的水平。所有出版物和專利申請通過提及而合并入本文，就如同每一單個出版物或專利申請被明確和單獨地說明通過提及而合并入本文一樣。盡管已通過舉例說明和實施例一定程度地詳細描述了前述的發(fā)明(為了清楚理解的目的)，但顯而易見的是可以在所附權利要求的范圍內實踐某些改變和修飾。權利要求1.用于鑒定包含碳青霉烯酶的細菌的分離的核酸分子，所述核酸分子選自SEQIDNO1-9和14-20。2.權利要求1的核酸分子，其中所述分子可在PCR反應中用作引物。3.權利要求2的核酸分子，其中所述分子是選自SEQIDNO:1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20的核酸分子。4.權利要求l的核酸分子，其中所述分子可用作探針。5.權利要求4的核酸分子，其中所述分子是選自SEQIDNO:3、6、9、16和19的核酸分子。6.對于碳青霉烯酶特異的PCR引物組，所述引物組包含具有SEQIDNO:l和SEQIDNO:2，SEQIDNO:4和SEQIDNO:5，SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，SEQIDNO:14和SEQIDNO:2,SEQIDNO:4和SEQIDNO:15，SEQIDNO:20和SEQIDNO:8，或者SEQIDNO:17和18中所示的序列的寡核苷酸對，其中所述引物在用于檢測樣品中包含碳青霉烯酶的細菌的存在情況的PCR測定法中是有效的。7.通過使用在編碼碳青霉烯酶的核苷酸序列中存在的靶核酸區(qū)域的基于聚合酶的擴增，來檢測樣品中具有碳青霉烯抗性的細菌的存在情況的方法，所述方法包括a)提供懷疑包含所述碳青霉烯抗性細菌的測試樣品；b)在足以提供包含所述靼核酸區(qū)域的基于聚合酶的核酸擴增產(chǎn)物的條件下，使所述樣品與至少第一和第二寡核苷酸引物接觸，其中所述至少第一和第二寡核苷酸引物選自i)包含SEQIDNO:1的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:2的第二寡核苷酸引物；ii)包含SEQIDNO:4的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:5的第二寡核苷酸引物；iii)包含SEQIDNO:7的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:8的第二寡核苷酸引物；iv)包含SEQIDNO:14的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:2的第二寡核苷酸引物；v)包含SEQIDNO:4的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:15的第二寡核苷酸引物；vi)包含SEQIDNO:20的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:8的第二寡核苷酸引物；vii)包含SEQIDNO:17的第一寡核普酸引物和包含SEQIDNO:18的第二寡核苷酸引物；和c)檢測擴增出的產(chǎn)物。8.權利要求7的方法，其中所述樣品是直接樣品。9.權利要求7的方法，其中所述基于聚合酶的核酸擴增是實時定量擴增。10.用于檢測來自患者的樣品中包含碳青霉烯酶的細菌的存在情況的方法，所述方法包>^:(a)提供來自所述患者的樣品；(b)從所述樣品中分離和純化出核酸；(c)形成聚合酶鏈式反應溶液，其包含來自步驟(b)的核酸的至少部分、核苷三磷酸單體的混合物、緩沖溶液中的酶Taq聚合酶、和PCR引物組，所述PCR引物組選自i)包含SEQIDNO:1的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:2的第二寡核苷酸引物；ii)包含SEQIDNO:4的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:5的第二寡核苷酸引物；Hi)包含SEQIDNO:7的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:8的第二寡核苷酸引物；iv)包含SEQIDNO:14的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:2的第二寡核苷酸引物；v)包含SEQIDNO:4的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:15的第二寡核苷酸引物；vi)包含SEQIDNO:20的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:8的第二寡核苷酸引物；vii)包含SEQIDNO:17的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:18的第二寡核苷酸引物；和(d)對所述PCR反應溶液施行聚合酶鏈式反應，以擴增出任何編碼所述碳青霉烯酶的核苷酸序列；(e)就碳青霉烯酶PCR產(chǎn)物的存在情況來分析在所述聚合酶鏈式反應中獲得的核酸，其中所述產(chǎn)物的存在是所述樣品中存在有所述細菌的指示。11.權利要求10的方法，其中所述聚合酶鏈式反應是實時定量PCR。12.用于治療感染的方法，所述方法包括(a)從懷疑具有感染的患者中獲得樣品；(b)通過PCR就碳青霉烯酶基因的存在情況來測試所述樣品，其中使用選自下列的引物組i)包含SEQIDNO:1的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:2的第二寡核苷酸引物；或ii)包含SEQIDNO:4的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:5的第二寡核苷酸引物；或iii)包含SEQIDNO:7的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:8的第二寡核苷酸引物；或iv)包含SEQIDNO:14的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:2的第二寡核苷酸引物；或v)包含SEQIDNO:4的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:15的第二寡核苷酸引物；或vi)包含SEQIDNO:20的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:8的第二寡核苷酸引物；或vii)包含SEQIDNO:17的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:18的第二寡核苷酸引物；其中陽性測試表明有著顯示出碳青霉烯抗性的細菌菌株，并且對所述患者給予備選的抗生素。13.權利要求12的方法，其中所述樣品是直接樣品。14.權利要求12的方法，其中所述PCR是實時定量PCR。15.用于檢測具有碳青霉烯抗性的細菌菌抹的試劑盒，其包含選自下列的引物組a)包含SEQIDNO:1的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:2的第二寡核苷酸引物；或b)包含SEQIDNO:4的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:5的第二寡核苷酸引物；或c)包含SEQIDNO:7的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:8的第二寡核苷酸引物；或c)包含SEQIDNO:14的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:2的第二寡核苷酸引物；或d)包含SEQIDNO:4的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:15的第二寡核苷酸引物；或e)包含SEQIDNO:20的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:8的第二寡核苷酸引物；或f)包含SEQIDNO:17的第一寡核苷酸引物和包含SEQIDNO:18的第二寡核苦酸引物。16.權利要求15的試劑盒，其中所述試劑盒進一步包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一種選自SEQIDNO:3、6、9、16和19的核酸分子。全文摘要提供了用于快速且靈敏地檢測樣品中的碳青霉烯酶的組合物和方法。所述組合物包括新型引物和探針組合物，其用于檢測樣品中這種酶的存在情況，特別是通過使用PCR方法。這些引物和探針組可以在擴增方法(例如，PCR，特別是定量PCR)中使用，并且包裝到試劑盒中以用于在擴增方法中使用，以便為了檢測測試樣品，特別是患者樣品，特別是直接樣品中的碳青霉烯酶。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了SEQIDNO1、2、4、5、7、8、14、15、17、18和20中所示的新型寡核苷酸引物，以及SEQIDNO3、6、9、16和19中所示的新型寡核苷酸探針序列。這些序列可以在用于檢測樣品中的碳青霉烯酶的方法中使用。文檔編號C12Q1/68GK101680034SQ200880016405公開日2010年3月24日申請日期2008年4月7日優(yōu)先權日2007年4月6日發(fā)明者C·C·懷特福特,C·于申請人:貝克頓·迪金森公司