專利名稱：還原酶、其基因及其利用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型還原酶和編碼該還原酶的DNA、包含該DNA的重組 載體、和用該重組栽體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體等。本發(fā)明還涉及使用新型還原 酶或該轉(zhuǎn)化體的作為光學(xué)活性醇的光學(xué)活性苯乙醇酸化合物的制造方法。
背景技術(shù)：
光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物是在醫(yī)農(nóng)藥等的制造中有用的 化合物，迄今為止提出了使用不對(duì)稱還原試劑的制造方法等，在國(guó)際公開(kāi) 號(hào)WO0210101號(hào)記載的方法中，為了提高光學(xué)純度而在>^應(yīng)后進(jìn)一步進(jìn) 行再結(jié)晶等，在有機(jī)快報(bào)(Organic Letters), 2005，第7巻，24號(hào)，5425-5427 頁(yè)中記栽的反應(yīng)中，反應(yīng)的光學(xué)收率也未必可以稱為充分。另外，迄今為 止還不知道使用微生物等將鄰位上具有取代基的立體上處于復(fù)雜環(huán)境的 苯乙醛酸化合物的酮基還原，從而不對(duì)稱還原為光學(xué)活性的苯乙醇酸化合 物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供以良好的光學(xué)收率將鄰位上具有取代基的苯乙醛酸化合物 還原為光學(xué)活性的苯乙醇酸化合物的方法。
更具體而言，本發(fā)明提供能夠?qū)⑧徫蝗〈谋揭胰┧峄衔锊粚?duì)稱還 原、以良好的光學(xué)收率制造光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的蛋白 質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的DNA(以下，簡(jiǎn)稱為本發(fā)明DNA)、包含該DNA的轉(zhuǎn) 化體、從該DNA制造該蛋白質(zhì)的方法以及使用該蛋白質(zhì)對(duì)鄰位取代的苯 乙醛酸化合物進(jìn)行不對(duì)稱還原從而制造對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯 乙醇酸化合物的方法。
即，本發(fā)明提供如下所述等，即
1.由下述的任何;^^序列構(gòu)成的DNA:
a)對(duì)用序列編號(hào)1表示的Jl^酸序列進(jìn)行編碼的M序列；和b)用序列編號(hào)2表示的磁Jjf列。
2. —種DNA，其特征在于，通過(guò)將能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的啟動(dòng)子與具有下述a) d)中的任何^^^序列的DNA以能夠發(fā)揮功能的形式連接而形成
a) 對(duì)用序列編號(hào)1表示的JL^酸序列進(jìn)行編碼的磁基序列；
b) 相對(duì)于由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的磁J^序列構(gòu)成的DNA具有至少卯％序列同源性的DNA的M序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；
c) 在嚴(yán);fMHf下與由編碼序列編號(hào)1所示的JtJ^酸序列的M序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA的g序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和
d) 用序列編號(hào)2表示的磁基序列。
3. —種重組載體，其特征在于，包含上述第1或2項(xiàng)所述的DNA。
4. 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過(guò)將上述第2項(xiàng)所述的DNA或上述第3項(xiàng)所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成。
5. 根據(jù)上述第4項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為微生物。
6. 根據(jù)上述第4項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
7. —種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含具有下述的任何^序列的DNA:
a) 對(duì)用序列編號(hào)1表示的M酸序列進(jìn)行編碼的a序列；
b) 相對(duì)于由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的磁Jjf列構(gòu)成的DNA具有至少卯％序列同源性的DNA的M序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的Jl&酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；
c) 在嚴(yán)^H^下與由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的磁基序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA的M序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的^J^^列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙眵酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和
8d)用序列編號(hào)2表示的堿J^序列。
8. —種轉(zhuǎn)化體的制造方法，其特征在于，包括將上述第3項(xiàng)所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的步驟。
9. 一種蛋白質(zhì)，具有下述的任何M酸序列
a) 用序列編號(hào)l表示的M酸序列；和
b) 用序列編號(hào)1表示的M酸序列中缺失或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的M酸序列，并且是由具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力的蛋白質(zhì)的JL^酸序列構(gòu)成的JLi^列。
10. —種重組載體，其特征在于，包含1)由下述&)~3)中的任何>1*^序列構(gòu)成的DNA和ii)具有對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的M酸序列進(jìn)行編碼的^序列的DNA，所述蛋白質(zhì)具有將氧化型P-煙酖胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型p-煙酰胺腺噪呤二核普酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力
a) 對(duì)用序列編號(hào)1表示的JL^酸序列進(jìn)行編碼的M序列；
b) 相對(duì)于由對(duì)序列編號(hào)1所示的JL^酸序列進(jìn)行編碼的磁基序列構(gòu)成的DNA具有至少90%序列同源性的DNA的堿J^序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的M酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；
c) 在嚴(yán);^件下與由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的磁基序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA的M序列，并Jol對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的^^^列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和
d) 用序列編號(hào)2表示的磁Jjf列。
11. 根據(jù)上述第10項(xiàng)所述的重組載體，其特征在于，具有將氧化型p-煙酰胺腺噪呤二核普酸或氧化型l3-煙酖胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力的蛋白質(zhì)，為葡萄糖脫氫酶。
12. 根據(jù)上述第11項(xiàng)所述的重組載體，其中，具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白質(zhì)為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)來(lái)源的葡萄糖脫氫酶。
13. 將上述第10 ~ 12項(xiàng)所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體。
14. 根據(jù)上述第13項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主細(xì)胞為微生物。15. 才艮據(jù)上述第13項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
16. —種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含由下述8)~"中的任何>^^序列
的DNA，所述蛋白質(zhì)具有將氧化型|3-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型|3-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力，
a) 編碼用序列編號(hào)1表示的M酸序列的磁基序列；
b) 相對(duì)于由對(duì)序列編號(hào)1所示的M酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列構(gòu)成的DNA具有至少90%序列同源性的DNA的磁J^序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的JL^,列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；
c) 在嚴(yán)^MHf下與由編碼序列編號(hào)1所示的Jl^酸序列的4^序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA的M序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的M,列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和
d) 用序列編號(hào)2表示的磁基序列。
17. —種光學(xué)活性的醇化合物的制造方法，其特征在于，使上述第9項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)、或上述第4~7、 13~16項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體、或其處理物，與前手性g化合物接觸。
18. 式(2)所示的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的制造方法，其特征在于，使式(l)所示的鄰位取代的苯乙醛酸化合物，與具有將式(l)的化合物不對(duì)稱還原為光學(xué)活性的式(2)的化合物的能力且由下述a) f)中的任何M^列構(gòu)成的蛋白質(zhì)接觸，
■COR,
(1)
式(1)中，&表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代的Cl國(guó)8烷基，
10<formula>formula see original document page 11</formula>(2)
式(2)中，&和R2表示與上i^目同的含義，帶*標(biāo)記的碳原子為不對(duì)稱碳 原子，
所述M,列為
a) 用序列編號(hào)1表示的M酸序列；
b) 相對(duì)于由序列編號(hào)2所示的磁Jjf列構(gòu)成的DNA具有至少卯％ DNA的序列同源性的磁基序列所編碼的"ltj^酸序列；
。在嚴(yán)*件下與由序列編號(hào)2所示的g序列構(gòu)成的DNA雜交的 DNA的磁J^序列所編碼的M酸序列；
d) 用序列編號(hào)1表示的M酸序列中缺失、置換或附加1個(gè)或多個(gè)氨 基酸的Jl^酸序列；
e) 在嚴(yán)^Hf下與由編碼序列編號(hào)1所示的^酸序列的4序列構(gòu) 成的DNA雜交的DNA的4^序列所編碼的M酸序列；和
f) 用序列編號(hào)l表示的JL^酸序列中缺失、置換或附加l個(gè)或多個(gè)氨 基酸的M酸序列。
19.根據(jù)上述第17項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述前手性m匕合物 為式(l)所示的鄰位取代苯乙醛酸化合物，所述光學(xué)活性的醇化合物為式 (2)所示的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物，
(i)
式(l)中，&表示可被取代的^J^或可被取代的烷IL^， R2表示可被取代 的Cl-8烷基，<formula>formula see original document page 12</formula>
式(2)中，Ri和R2表示與上i^目同的含義，帶*標(biāo)記的碳原子為手性碳原 子。
根據(jù)本發(fā)明，能夠以良好的光學(xué)收率制造以(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯H^ 甲基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙跣胺為代表的、有用的光學(xué)活性的鄰位取代的 苯乙醇酸化合物。
具體實(shí)施例方式
首先，對(duì)本發(fā)明DNA進(jìn)行說(shuō)明，本發(fā)明DNA可以是天然的DNA, 或者也可以是通過(guò)在天然的DNA中導(dǎo)入變異(位點(diǎn)定向誘變法、突變處理 等)而制成的DNA。在對(duì)天然的DNA進(jìn)行檢索時(shí)，以具有將鄰位取代的苯 乙醛酸化合物、例如鄰位取代的苯乙醛酸化合物的酖胺或酯化合物不對(duì)稱 還原為對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物、具體為光學(xué)活性的 鄰位取代的苯乙醇酸的酰胺或酯化合物的能力的微生物為對(duì)象即可，更具 體而言，以具有例如將2-(2-(2,5-二甲基苯氡基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙 酰胺不對(duì)稱還原而產(chǎn)生(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氡基甲基)苯基)-N-甲基-2-羥 基乙酰胺的能力的微生物為對(duì)象即可，例如可以從野油菜黃單胞菌 (Xanthomonas campestris)IF013551菌林等歸屬于黃單胞菌屬的微生物中 獲得。本發(fā)明的DNA可以是所述天然的DNA，或者也可以是通過(guò)以下說(shuō) 明的方法在所述天然的DNA中導(dǎo)入變異(位點(diǎn)定向誘變法、突變處理等) 而制成的DNA。
在本發(fā)明DNA中，"在嚴(yán)^ft下與由編碼序列編號(hào)1所示的氨基酸 序列的減基序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA"，是指下述DNA:例如在"克 隆與序列"(cloning and sequence)(渡邊格主編，杉浦昌弘編輯，1989年， M文化公司發(fā)行)等中記載的Southern雜交法中，(1)通it^高離子濃度 下[例如可以舉出6xSSC(900mM的氯化鈉、卯mM的檸檬酸鈉)、65〔下 進(jìn)行雜交，與由 碼序列編號(hào)1所示的JL^酸序列的M序列構(gòu)成的DNA形成DNA-DNA雜交體，(2)即使在低離子濃度下例如可以舉出 0.1xSSC(15mM的氯化鈉、1.5mM的檸檬酸鈉)]、65C下保溫30分鐘后， 該雜交體仍能維持。
具體而言，例如可以舉出由編碼序列編號(hào)1所示的JL^酸序列的M 序列構(gòu)成的DNA、由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的磁基序列中一部 分4^S^缺失、置換或附加的堿J^序列構(gòu)成的DNA、相對(duì)于由編碼序列編號(hào) 1所示的#^酸序列的磁基序列構(gòu)成的DNA具有至少90%序列同源性、 優(yōu)選至少95%序列同源性、更優(yōu)選至少99%序列同源性的DNA等。
所述DNA可以是從自然界中存在的DNA中克隆的DNA，可以是在 該克隆的DNA的堿基序列中人工導(dǎo)入部分堿基的缺失、置換或附加而得 到的DNA，也可以是人工合成的DNA。序列同源性可以使用例如帶有 UWGCG軟件包的BESTFIT程序(Devereux等(1984)，核酸研究12， 387-395頁(yè))、PILEUP或BLAST算法(Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36: 290-300; Altschul S. F.(1990) JMol Biol 215: 403-10)等序列分析用工具算 出。
本發(fā)明的DNA例如可以如下制備。
從野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)等歸屬于黃單胞菌屬的 微生物等中，按照通常的基因工程的方法(例如，"新細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)方法"(東 京大學(xué)醫(yī)科學(xué)研究所制癌研究部編，秀潤(rùn)公司，1993年)中記載的方法)， 制備DNA文庫(kù)，以制備的DNA文庫(kù)作為模板，并且使用適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行 PCR，由此能夠擴(kuò)增由編碼序列編號(hào)1所示的JL^酸序列的磁基序列構(gòu)成 的DNA、由對(duì)序列編號(hào)1所示的M酸序列中缺失、置換或附加1個(gè)或多 個(gè)氨基酸的M酸序列進(jìn)行編碼的g序列構(gòu)成的DNA和/或具有序列編 號(hào)2所示的磁基序列的DNA等，從而制備本發(fā)明的DNA。另外，通過(guò)以 所述DNA文庫(kù)作為;^板，并且4吏用具有序列編號(hào)6所示的^序列的寡 核苷酸和具有序列編號(hào)7所示的磁J^序列的寡核普酸作為引物進(jìn)行PCR， 能夠擴(kuò)增由序列編號(hào)2所示的磁Jjf列構(gòu)成的DNA,從而制備本發(fā)明的 DNA。
作為該P(yáng)CR的^ff，例如可以舉出下述^ft:將4種dNTP各2(HiM、 2種寡核苷酸引物各15pmo1、 Taq聚合酶1.3U及作為;^板的DNA文庫(kù)混
13合而成反應(yīng)液，94X:加熱該反應(yīng)液2分鐘后，以94t:(10秒)-65"C(30秒)-72 n(卯秒)為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，接著以94匸(10秒)-65"C(30秒)-72t: (1分鐘+ 5秒/循環(huán))為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，再在72匸下保持7分鐘。 另外，該P(yáng)CR中使用的引物的5，末端側(cè)和/或3，末端側(cè)可以附加限制性 內(nèi)切酶識(shí)別序列等。
另外，通過(guò)以所述DNA文庫(kù)作為模板，^J1具有從編碼序列編號(hào)1 所示的M酸序列的堿基序列中選擇的部分M序列的寡核苷酸等(例如， 由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的5，末端側(cè)的約14個(gè)威基以上的堿 基序列構(gòu)成的寡核苷酸)和由與DNA文庫(kù)構(gòu)建中使用的載體的DNA插入 位點(diǎn)附近的g序列互補(bǔ)的磁基序列構(gòu)成的約14個(gè)威基以上的寡核苷酸 作為引物進(jìn)行PCR，由此能夠擴(kuò)增具有對(duì)序列編號(hào)1所示的M酸序列進(jìn) 行編碼的磁J^序列的DNA、具有對(duì)序列編號(hào)1所示的M酸序列中缺失、 置換或附加1個(gè)或多個(gè)M酸(優(yōu)選1個(gè)M酸)的Jl^酸序列進(jìn)行編碼的 >5*Jjf列的DNA等，來(lái)制備本發(fā)明的DNA。
將如上所述擴(kuò)增的DNA，按照"分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版"(1989), 冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，"最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編"(1987)，約翰'威 利父子公司，ISBNO-471-50338-X等中記載的方法克隆到載體中，能夠得 到本發(fā)明的載體。作為所用的載體，具體例如可以舉出pUC119(寶酒造/〉 司制)、pTV118N(寶酒造7〉司制)、pBluescript II( +、洋紡乂>司制)、 pCR2.1-TOPO(英杰公司制)、pTrc99A(法瑪西亞公司制)、pKK223-3(法瑪 西亞公司制)等。
另外，本發(fā)明的DNA也可以通過(guò)下述方法獲得例如，以由具有從 編碼序列編號(hào)1所示的JtJ^^列的磁基序列中選擇的部分4^^序列的約 15個(gè)威基以上的磁-^序列構(gòu)成的DNA作為探針，4吏其在后述的務(wù)ff下與 向微生物或噬菌體來(lái)源的載體中插入的DNA文庫(kù)雜交，檢測(cè)該探針特異 性結(jié)合的DNA，由此獲得。作為使探針與染色體DNA或DNA文庫(kù)雜交 的方法，例如可以舉出菌落雜交或噬菌斑雜交，可以根據(jù)在文庫(kù)的制作中 使用的載體的種類來(lái)選擇方法。在所用文庫(kù)是使用質(zhì)粒載體制作而成的情 況下，可以利用菌落雜交。具體而言，通過(guò)將文庫(kù)DNA導(dǎo)入宿主微生物， 得到轉(zhuǎn)化體，對(duì)所得轉(zhuǎn)化體進(jìn)##釋后，將該稀釋物接種到瓊脂培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)到出現(xiàn)菌落為止。在所用的文庫(kù)是使用噬菌體載體制作而成的情況下，可以利用噬菌斑雜交。具體而言，將宿主微生物和文庫(kù)的噬菌體在能 夠感染的條件下混合，進(jìn)一步與軟瓊脂培養(yǎng)基混合后，將該混合物接種在 瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)到出現(xiàn)噬菌斑為止。
接著，無(wú)論在何種雜交的情況下，在進(jìn)行了所述培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基上 鋪設(shè)膜，使轉(zhuǎn)化體或噬菌體吸附、轉(zhuǎn)印到該膜上。對(duì)該膜進(jìn)行堿處理后，
進(jìn)行中和處理，接著進(jìn)行將DNA固定在該膜上的處理。更具體而言，例 如，在噬菌斑雜交的情況下，在所述瓊脂培養(yǎng)基上鋪設(shè)硝酸纖維素膜或尼 龍膜(例如，Hybond-N+(安瑪西亞公司注冊(cè)商標(biāo)))，靜置約1分鐘，使噬菌 體粒子吸附、轉(zhuǎn)印到膜上。接著，將該膜在堿溶液(例如1.5M氯化鈉、0.5M 氫氧化鈉)中浸漬約3分鐘，使噬菌體粒子溶解，由此將噬菌體DNA從膜 上洗脫下來(lái)，然后在中和溶液(例如，1.5M氯化鈉、0.5MTris-鹽酸緩沖溶 液卩117.5)中浸漬約5分鐘。接著用洗滌液(例如，0.3M氯化鈉、30mM杼 檬酸、0.2MTris-鹽酸緩沖液pH7.5)洗滌該膜約5分鐘，然后例如通過(guò)在約 80匸下加熱約卯分鐘而使逸菌體DNA固定在膜上。使用如此制備的膜， 以上述DNA作為探針進(jìn)行雜交。雜交例如可以按照J(rèn).Sambrook， E.F.Frisch， T.Manlatis著"分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版(1989)"冷泉港 實(shí)驗(yàn)室出版社等的記載來(lái)進(jìn)行。用作探針的DNA可以是用放射性同位素 標(biāo)記的DNA，也可以是用熒光色素標(biāo)記的DNA。作為用放射性同位素來(lái) 標(biāo)記用作探針的DNA的方法，例如可以舉出通過(guò)利用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑 盒(Random Primer Labeling Kit)(寶酒造公司制)等將PCR反應(yīng)液中的 dCTP替換為(a-32p)dCTP，以用作探針的DNA為模板進(jìn)行PCR的方法。 另外，在使用熒光色素來(lái)標(biāo)記用作探針的DNA的情況下，例如可以使用 安瑪西亞制造的ECL核酸直接標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng)等。
雜交例如可以如下進(jìn)行。按照相對(duì)于1 112如上制作的膜為50 ~200^1 的比例準(zhǔn)備預(yù)雜交液，所述預(yù)雜交液含有450 卯0mM氯化鈉及45 ~ 卯mM檸檬酸鈉、0.1 ~ 1.0重量。/。濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)、 0~ 200nl/ml濃度的變性非特異DNA，根據(jù)情況還可以含有白蛋白、Ficoll、 聚乙烯基吡咯烷酮等各O ~ 0.2重量％濃度，所述預(yù)雜交液優(yōu)選含有900mM 氯化鈉、卯mM梓檬酸鈉、1.0重量。/。SDS及100pl/ml變性小牛胸腺DNA， 將所述膜浸漬在該預(yù)雜交液中，在42 651C保溫1~4小時(shí)。接著，將例 如含有450 ~卯OmM氯化鈉及45 ~卯mM檸檬酸鈉、0.1 ~ 1.0重量％濃度 的SDS、 0 ~ 200嗎/ml濃度的變性非特異DNA以及根據(jù)情況可以含有的白
15蛋白、Ficoll、聚乙烯基吡咯烷酮等各0~0.2重量％濃度的雜交溶液(優(yōu)選 含有卯OmM氯化鈉、卯mM檸檬酸鈉、1.0重量。/。SDS及100嗎/ml變性 小牛胸腺DNA的雜交溶液)，與通過(guò)前述方法制備而得的探針(相當(dāng)于lcm2 膜為1.0 x 104 ~ 2.0 x 106cpm的量)混合而得到溶液，按照相對(duì)于1 112膜為 50 ~ 200^11的比例準(zhǔn)備上述溶液，將膜浸漬于該雜交溶液中，在42 651C 保溫12 ~ 20小時(shí)。該雜交后，將膜取出，用含有15 ~ 300mM氯化鈉、1.5 ~ 30mM檸檬酸鈉及0.1 ~ 1.0重量％的SDS等的42 ~ 65匸的洗滌液(優(yōu)選含 有15mM氯化鈉、1.5mM杼檬酸鈉及1.0重量％的SDS的65匸的洗滌液) 等進(jìn)行洗滌。洗滌過(guò)的膜用2xSSC(300mM氯化鈉、30mM檸檬酸鈉)輕輕 沖洗后，進(jìn)行干燥。對(duì)該膜進(jìn)行例如放射自顯影等，檢測(cè)膜上的探針的位 置，由此在原來(lái)的瓊脂培養(yǎng)基上確定與所用探針雜交的DNA的膜上位置 所對(duì)應(yīng)的克隆，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行挑菌，分離出具有該DNA的克隆。對(duì)如此 得到的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，從得到的培養(yǎng)菌體能夠制備本發(fā)明的DNA。按照"分 子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版"(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，"最新分子 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編"(1987),約翰'威利父子公司，ISBNO-471-50338-X 等中記載的方法，將如上所述制備的DNA克隆到栽體中，能夠得到本發(fā) 明的重組載體。作為使用的載體，具體而言，例如可以舉出pUC119(寶酒 造公司制)、pTV118N(寶酒造公司制)、pBluescriptII(東洋紡公司制)、 pCR2.1-TOPO(英杰公司制)、pTrc99A(法瑪西亞公司制)、pKK223-3(法瑪 西亞公司制)等。另外，所述DNA的^Jjf列可以通過(guò)F.Sanger 、 S.Nicklen、 A.R.Coulson著，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(1977)74: 5463-5467頁(yè)等中記載的 雙脫氧終止法(dideoxy terminator method)等進(jìn)行分析。^J^序列分析 用試樣的制備可以使用例如珀金埃爾默公司的ABI PRISM熒光標(biāo)記終止 物循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒等市售的試劑。
如上操作得到的DNA編碼的是如下所述的蛋白質(zhì)的M酸序列，所 述蛋白質(zhì)具有具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物(例如，2-(2-(2，5-二甲基 苯氧基曱基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不對(duì)稱還原而產(chǎn)生光學(xué)活性的鄰 位取代的苯乙醇酸化合物(例如，(R)隱2-(2畫(huà)(2,5畫(huà)二甲基苯ft^曱基)苯基)國(guó)N誦 甲基-2-幾基乙酰胺)的能力，這一結(jié)果的確認(rèn)例如可以如下進(jìn)行。首先，將 如上操作得到的DNA如后所述按照與能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子 的下游連接的方式插入栽體中，將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中而獲得轉(zhuǎn)化體。 接著，使該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物與鄰位取代的笨乙醛酸化合物(例如，2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)作用。對(duì)反應(yīng)生成物中光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物(例如，(R)-2-(2-(2，5-二曱基苯氧基甲 基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺)的量進(jìn)行分析，由此能夠確認(rèn)所得DNA編 碼的是具有所述能力的蛋白質(zhì)的Jl^酸序列。
為了使本發(fā)明DNA在宿主細(xì)胞中表達(dá)，例如將能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮 功能的啟動(dòng)子與本發(fā)明DNA以能發(fā)揮功能的形式連接而成的DNA導(dǎo)入宿 主細(xì)胞中。此處，"以能發(fā)揮功能的形式"是指在通過(guò)將該DNA導(dǎo)入宿 主細(xì)胞中來(lái)使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，本發(fā)明DNA處于與啟動(dòng)子結(jié)合以便在啟 動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行表達(dá)的狀態(tài)。作為啟動(dòng)子，可以舉出大腸桿菌的乳糖操 縱子的啟動(dòng)子、大腸桿菌的色氨酸操縱子的啟動(dòng)子、或者tac啟動(dòng)子或trc 啟動(dòng)子等能夠在大腸桿菌內(nèi)發(fā)揮功能的合成啟動(dòng)子等，也可以利用在野油 菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)中對(duì)本發(fā)明DNA的表達(dá)進(jìn)g控的 啟動(dòng)子。
一般而言，將以能發(fā)揮功能的形式與能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng) 子連接而成的DNA插入到前述的栽體中而得到重組載體，將所得的重組 載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。另外，作為載體，使用含有篩選標(biāo)記基因(例如，卡 那霉素抗性基因、新霉素抗性基因等賦予抗生素抗性的基因等)的載體時(shí)，
擇。作為導(dǎo)入以能發(fā)揮功能的形式與能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子連 接而成的本發(fā)明DNA、或本發(fā)明重組載體等的宿主細(xì)胞，例如可以舉出歸 屬于埃希氏菌(Escherichia)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、棒狀桿菌 (Corynebacterium )屬、葡萄球菌 (Staphylococcus )屬、鏈霉菌 (Streptomyces )屬、酵母菌 (Saccharomyces )屬、克魯維酵母 (Kluyveromyces )屬、畢赤酵母(Pichia)屬、紅球菌(Rhodococcus ) 屬及曲霉(Aspergillus)屬的微生物等。
將以能發(fā)揮功能的形式與能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子連接而成 的本發(fā)明DNA或本發(fā)明重組栽體等導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，根據(jù)所用的宿 主細(xì)胞采用通常使用的導(dǎo)入方法即可，例如可以舉出"分子克隆實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)第二版"(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，"最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方 法匯編，，(1987)，約翰.威利父子公司，ISBNO-471-50338-X等中記載的氯 化鉀法、或"電穿孔法基因脈沖/;tM桿菌脈沖系統(tǒng)"伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)室，(1993) 等中記載的電穿孔法等。要篩選導(dǎo)入有以能發(fā)揮功能的形式與能在宿主細(xì) 胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子連接而成的本發(fā)明DNA或本發(fā)明重組載體等的轉(zhuǎn)
17化體，例如以前述的栽體中所含的篩選標(biāo)記基因的表型作為指標(biāo)進(jìn)行篩選
即可。該轉(zhuǎn)化體含有本發(fā)明DNA這一點(diǎn)，可以通過(guò)例如按照"分子克隆 實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版"(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社等中記栽的通常的方法 進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的確認(rèn)、堿基序列的分析、Southern雜交、 Western雜交等來(lái)確認(rèn)。
下面對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)進(jìn)行說(shuō)明。
本發(fā)明蛋白質(zhì)，例如可以通過(guò)對(duì)包含本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng) 來(lái)制造。作為用于培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基，例如可以使用在微生物等宿主 細(xì)胞的培養(yǎng)中通常使用的適當(dāng)含有碳源、氮源、有機(jī)鹽、無(wú)機(jī)鹽等的各種 培養(yǎng)基。作為碳源，例如可以舉出葡萄糖、糊精、蔗糖等糖類、甘油等糖 醇、富馬酸、檸檬酸、丙酮酸等有機(jī)酸、動(dòng)物油、植物油及糖蜜。關(guān)于這 些碳源在培養(yǎng)基中的添加量，相對(duì)于培養(yǎng)液通常為約0.1~30%(w/v)。作 為氮源，例如可以舉出肉提取物、蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、大 豆粉、玉米漿(Corn Steep Liquor)、棉##、千燥酵母、S^白M酸等 天然有機(jī)氮源、氨基酸類、硝酸鈉等無(wú)機(jī)酸的銨鹽、氯化銨、硫酸銨、磷 酸銨等無(wú)機(jī)酸的銨鹽、富馬酸銨、檸檬酸銨等有機(jī)酸的銨鹽及尿素。其中， 有機(jī)酸的銨鹽、天然有機(jī)氮源、氨基酸類等在多數(shù)情況下也可以作為碳源 使用。關(guān)于這些氮源在培養(yǎng)基中的添加量，相對(duì)于培養(yǎng)液通常為約0.1 ~ 30%(w/v)。
作為有機(jī)鹽或無(wú)機(jī)鹽，例如可以舉出鉀、鈉、鎂、鐵、錳、鈷、鋅等 的氯化物、硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽及磷酸鹽。具體而言，例如可以舉出 氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈷、硫酸鋅、硫酸銅、 乙酸鈉、碳酸鉤、磷酸二氫鉀及磷酸氫二鉀。關(guān)于這些有機(jī)鹽和/或無(wú)機(jī)鹽 在培養(yǎng)基中的添加量，相對(duì)于培養(yǎng)液通常為約0.0001 ~5%(w/v)。
進(jìn)而，在導(dǎo)入有tac啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子及l(fā)ac啟動(dòng)子等異乳糖誘導(dǎo)型 的啟動(dòng)子與本發(fā)明DNA以能發(fā)揮功能的形式連接而成的基因而得的轉(zhuǎn)化 體的情況下，作為用于誘導(dǎo)本發(fā)明蛋白質(zhì)產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑，例如也可以在培 養(yǎng)基中少量添加異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)。
含有本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)，可以按照在微生物等宿主細(xì)胞的 培養(yǎng)中通常使用的方法來(lái)進(jìn)行，例如可以舉出試管振蕩式培養(yǎng)、往返式振 蕩培養(yǎng)、搖瓶(JarFermenter)培養(yǎng)、酵罐培養(yǎng)等液體培養(yǎng)及固體培養(yǎng)。
18培養(yǎng)溫度可以在該轉(zhuǎn)化體能夠生長(zhǎng)的范圍內(nèi)適當(dāng)改變，通常為約15 ~ 40X:。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約6 8的范圍。培養(yǎng)時(shí)間因培養(yǎng)條件而異，通 常優(yōu)選為約1天~約5天。
作為從含有本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中純化本發(fā)明蛋白質(zhì)的方 法，可以應(yīng)用在通常的蛋白質(zhì)純化中使用的方法，例如可以舉出如下方法。 首先，通過(guò)離心分離等從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中收集細(xì)胞后，通過(guò)超聲波處理、 dino mill處理、弗氏壓碎處理等物理破碎法或者使用表面活性劑或溶菌酶 等的化學(xué)破碎法等將其破碎。通過(guò)離心分離、膜濾器過(guò)濾等從所得破碎液 中除去雜質(zhì)，由此制備無(wú)細(xì)胞抽提液，適當(dāng)使用陽(yáng)離子交換層析、陰離子 交換層析、疏7jC層析、凝膠過(guò)濾層析、金屬螯合層析等分離純化方法將其 分為不同組分，由此能夠純化本發(fā)明蛋白質(zhì)。
作為層析中使用的載體，例如可以舉出導(dǎo)入了羧曱(CM)基、二乙基氨 基乙基(DEAE)、苯基或丁基的纖維素、糊精或瓊脂糖等不溶性高分子載體。 也可以使用市售的填充完載體的層析柱，作為所述市售的填充完載體的層 析柱，例如可以舉出Q-Sepharose FF、 Phenyl-S印harose HP(商品名，均 為安發(fā)瑪西亞生物技^^>司制)、TSK-gel G3000SW(商品名，東曹公司制) 等。
另外，要篩選含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的組分，以將鄰位取代的苯乙醛酸化 合物(例如，2-(2-(2,5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺)不對(duì) 稱還原而優(yōu)先產(chǎn)生光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物(例如， (R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺)的能力作為 指標(biāo)進(jìn)行篩選即可。
對(duì)式(l)的鄰位取代苯乙醛酸化合物及式(2)的鄰位取代苯乙醇酸化合 物中的&進(jìn)行如下說(shuō)明。
作為&所示的可被取代的氛基，除了M之外，例如可以例示甲基氨 基、乙基M、丙基M、異丙基M、 丁基M、異丁基M、叔丁基 氨基、戊基氨基、己基JL^等Cl-6烷基M。另外，作為可被取代的烷 例如可以舉出甲M、乙M、丙fL&、異丙lL^、 丁lL^、戊氧 基、己氧基、庚氧基和辛氧基等Cl-8烷氧基。
下面，對(duì)R2所示的取^RJ^進(jìn)行如下說(shuō)明。
作為R2所示的可被取代的Cl-8烷基中的Cl-8烷基，例如可以例示甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基等。
作為所述Cl-8烷基的取M，可以例示可^L取代的烷H基和可^L取代
的芳IL^。
作為R2所示的可被取代的烷lL^烷基，例如可以例示甲氡基曱基、甲 IL^乙基、甲緣丙基、甲猛丁基、甲緣戊基、甲猛己基、甲猛 庚基、甲lL^辛基、乙絲曱基、乙緣乙基、乙猛丙基、乙猛丁基、
乙SJ^戊基、乙Il^己基、乙IL^庚基、乙IL^辛基、丙猛甲基、丙氧 基乙基、丙IL^丙基、丙狄丁基、丙猛戊基、丙IL^己基、丙IL^庚 基、丙氧基辛基、丁氧基甲基、丁氧基乙基、丁氧基丙基、丁氧基丁基、
丁lL&戊基、丁氧基己基、丁SJ^庚基、丁氧基辛基等由Cl-4烷^L&取 代的Cl-8烷基。
作為可被取代的芳氡基，可以例示式(3)所示的芳氡基。
(式中、A、 B和C相同或相互不同，表示氫原子、烷基、烯基、炔基、 環(huán)U、環(huán)烯基、烷lL^、卣代烷基、羥基烷基、烷IU^烷基、M^、 烷基M烷基、鹵原子、硝基、IL^、可被烷^J^代的芳烷基、可被選 自卣原子和烷IL^的取代g代的芳基、烷M基、M、烷基M)
對(duì)式(3)中的A、 B或C所示的取4^進(jìn)行如下說(shuō)明。
作為烷基，例如可以例示甲基、乙基、丙基、丁基等Cl-4烷基。
作為烯基，例如可以例示乙烯基、烯丙基、丁烯基等C2-4烯基。
作為炔基，例如可以例示乙炔基、丙炔基、丁炔基等C2-4生基。
作為環(huán)烷基，例如可以例示環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基等C3-6環(huán)烷基。
作為環(huán)烯基，例如可以例示環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基等C5-6環(huán)烯基。
作為烷氡基，例如可以例示甲氡基、乙氡基、丙氡基、丁HJ^等Cl-4 烷猛。作為卣代烷基，例如可以例示三氟甲基、三氯甲基、二氟甲基、氯甲
基、2-溴乙基、1，2-二氯丙基等Cl-3卣代烷基。
作為羥基烷基，例如可以例示羥基甲基、l-， 2-羥基乙基等羥基取代 的Cl-2烷基。
作為烷lL^烷基，例如可以例示甲氡基甲基、甲氡基乙基、乙氡基甲 基、乙氧基乙基等Cl-2烷IU^代的Cl-2烷基。
作為JL&烷基，例如可以例示氨基曱基、l-， 2-氨基乙基等單M取 代的Cl-2烷基，或二^J^代的Cl-2烷基。
作為烷基M烷基，例如可以例示甲基氣基甲基、二甲基氣基甲基、 二乙基氨基甲基等單(C1-2)烷基^J^代的Cl-2烷基、或二(Cl-2)烷基氨 基取代的Cl畫(huà)2烷基。
作為卣原子，例如可以例示氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
作為可被烷氧基取代的芳烷基，例如可以例示芐基、苯乙基、4-甲氧 基芐基等可被Cl-2烷IL^取代的C7-8芳烷基。
作為可被選自卣原子和烷氧基的基團(tuán)取代的芳基，例如可以例示2-， 3畫(huà)，4-氯^^基、2-， 3-， 4-曱基^J^、 2-， 3-， 4-甲M^^、苯基、l-萘基、 2-萘基等可被選自鹵原子(氟原子、氯原子、溴原子和碘原子)和Cl-2烷氧 基的基團(tuán)取代的C6-10芳基。
作為烷1A^，例如可以例示甲琉基、乙減基、丙減基等Cl-3烷^i^?；?br> 作為烷基M,例如可以例示甲基氛基、乙基M、丙基氣基、異丙 基氨基、丁基氨基、異丁基氨基、叔丁基氨基、戊基氨基、己基氨基等Cl-6 烷基絲等，
從具有所述可被取代的芳氡基的用式(l，)表示的鄰位取代苯乙醛酸化 合物，能夠得到式(2')所示的化合物。
<formula>formula see original document page 21</formula>(式(l，)中、&表示可被取代的#^或可被取代的烷氧基，A、 B和C 相同或相互不同，表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、烷 緣、鹵代U、羥基烷基、烷IL^烷基、#Jj^&、烷^Jl^烷基、鹵
原子、硝基、M、可皿IU^代的芳烷基、可被選自卣原子和烷SJ^ 中的取^J^取代的芳基、烷1^&、 M、烷基JLfe
(式(2，)中、Rp A、 B和C表示與上^目同的含義，帶*標(biāo)記的碳原 子為不對(duì)稱碳原子)
式(i)和(r )的化合物中，作為&所示的可被取代的氨基，優(yōu)選甲基
氨基，作為可被取代的烷氡基，例如優(yōu)選甲H^或乙氡基。另夕卜，作為R2 所示的可被取代的Cl-8烷基，優(yōu)選曱基；作為可被取代的烷fL^烷基， 例如優(yōu)選曱氧基甲基，另外，作為可被取代的芳H&烷基，例如優(yōu)選二甲 基苯IL^甲基，更具體而言，可以例示2-(2-甲基苯基)-N-曱基-2-氧代乙酰 胺、2-(2-甲基苯基)-2-氧代乙酸乙酯、2-(2-曱緣甲基苯基)-N-曱基-2-氧代 乙酰胺、2-(2-甲緣曱基苯基)-2-氧代乙酸乙酯、2-(2-(2,5-二甲基苯猛甲 基)苯基)-N-甲基-2-氧代乙酰胺、或2-(2-(2,5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-2-氧代乙酸曱酯。
本發(fā)明的方法中，在以所述鄰位取代苯乙醛酸化合物為底物的情況下， 能夠得到式(2)或式(2')的化合物，作為具體的化合物，可以分別得到2-(2-曱基苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺、2-(2-甲基苯基)-2-羥基乙酸乙酯、2-(2-甲緣甲基苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺、2-(2-甲絲曱基苯基)-2-羥基乙酸 乙酯、2-(2-(2,5-二曱基苯氧基曱基)苯基)-N-甲基-2-羥基乙酰胺、或 2-(2-(2,5-二甲基苯氡基曱基)苯基)-2-羥基乙酸曱酯的光學(xué)活性體。
上述方法通常在水及還原型尼克酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸(以下記為 NADPH)等輔酶的存在下進(jìn)行。此時(shí)所用的水可以是緩沖水溶液。作為該 緩沖水溶液中所用的緩沖劑，例如可以舉出磷酸鈉、磷酸鉀等磷酸堿金屬 鹽、乙酸鈉7jC溶液、乙酸鉀等乙酸堿金屬鹽及它們的混合物。
22在上述方法中，除水以外也可以共存有有機(jī)溶劑。作為可共存的有機(jī) 溶劑，例如可以舉出叔丁基甲基醚、二異丙醚、四氫呋喃等醚類，甲酸乙 酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯類，甲苯、
己烷、環(huán)己烷、庚烷、異辛烷等烴類，甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁 醇等醇類，二甲亞砜等有機(jī)硫化合物，丙酮等酮類，乙腈等腈類及它們的 混合物。上述方法中的反應(yīng)，例如可以在含有本發(fā)明蛋白質(zhì)或產(chǎn)生本發(fā)明 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體或其處理物并且含有水、鄰位取代的苯乙醛酸化合物及 NADPH，以及根據(jù)需要進(jìn)一步含有有機(jī)溶劑等的狀態(tài)下，通過(guò)攪拌、振 蕩等進(jìn)行混合來(lái)進(jìn)行。上述方法中反應(yīng)時(shí)的pH可以適當(dāng)選擇，但通常為 pH3 10的范圍。另外，反應(yīng)溫度可以適當(dāng)選擇，^a^f料及產(chǎn)物的穩(wěn)定 性、^JI速度的觀點(diǎn)考慮，通常為o-6ox:的范圍。>^應(yīng)的終點(diǎn)例如可以 通過(guò)利用液相色鐠等追蹤反應(yīng)液中鄰位取代的苯乙醛酸化合物的量來(lái)確 定。反應(yīng)時(shí)間可以適當(dāng)選擇，但通常為0.5小時(shí)~10天的范圍。從反應(yīng)液 中回收光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物，通過(guò)通常已知的任意方法 進(jìn)行即可。例如可以舉出通過(guò)將反應(yīng)液的有機(jī)溶劑萃取操作、濃縮操作等 后處理根據(jù)需要與柱層析、蒸餾等組合進(jìn)行來(lái)純化的方法。
本發(fā)明蛋白質(zhì)、產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體、或其處理物，可以以各種形 態(tài)在上述方法中使用。
作為轉(zhuǎn)化體或其處理物的具體形態(tài)，例如可以舉出包含本發(fā)明DNA 的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物，作為轉(zhuǎn)化體的處理物，例如可以舉出凍干轉(zhuǎn)化體、有 機(jī)溶劑處理轉(zhuǎn)化體、干燥轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)化體磨碎物、轉(zhuǎn)化體的自消化物、轉(zhuǎn) 化體的超聲波處理物、轉(zhuǎn)化⑩提物、轉(zhuǎn)化體的堿處理物、粗純化蛋白質(zhì)、 純化蛋白質(zhì)和酶蛋白質(zhì)的固定化物。作為獲得固定化物的方法，例如可以 舉出運(yùn)載體結(jié)合法(使本發(fā)明蛋白質(zhì)等吸附在硅膠或陶瓷等無(wú)機(jī)運(yùn)載體、纖 維素、離子交換樹(shù)脂等上的方法)及包嚢法(將本發(fā)明蛋白質(zhì)等限制在聚丙 烯酰胺、含硫多糖飽交(例如卡拉膠)、精氨酸凝膠、瓊脂凝膠等高分子的 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的方法)。
另外，如果考慮使用包含本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，則與 使用活轉(zhuǎn)化體相比，使用將該轉(zhuǎn)化體滅活的處理物的方法從制造設(shè)備的限 制少的觀點(diǎn)考慮優(yōu)選。作為該用于4吏細(xì)菌死亡的處理方法，例如可以舉出 物理殺菌法(加熱、干燥、冷凍、光線、超聲波、過(guò)濾、通電)或使用化學(xué) 藥品的殺菌法(堿、酸、卣素、氧化劑、硫、硼、砷、金屬、醇、酚、胺、
23硫化物、醚、醛、酮、氰及抗生素)。 一般而言，優(yōu)選選擇這些殺菌法中盡 量不使本發(fā)明蛋白質(zhì)的酶活性失活且在反應(yīng)體系中殘留、污染等的影響小 的處理方法。
另外，本發(fā)明的制造方法在NADPH等輔酶的存在下進(jìn)行，隨著鄰位 取代的苯乙醛酸化合物的不對(duì)稱還原反應(yīng)的進(jìn)行，該NADPH轉(zhuǎn)換為氧化 型P-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下記為NADP+)。轉(zhuǎn)換生成的NADP +可以通過(guò)具有將NADP +轉(zhuǎn)換為還原型(NADPH)的能力的蛋白質(zhì)恢復(fù)為 原來(lái)的NADPH，因此，上述方法的反應(yīng)體系內(nèi)也可以共存有具有將NADP +轉(zhuǎn)換為NADPH的能力的蛋白質(zhì)。
作為具有將氧化型P-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下記為NAD + )或 NADP +轉(zhuǎn)換為還原型P-尼克酰胺腺噪呤二核苷酸(以下記為NADH)或 NADPH的能力的蛋白質(zhì)，例如可以舉出葡萄糖脫氫酶、醇脫氫酶、搭脫 氫酶、^^酸脫氫酶及有機(jī)脫氫酶(蘋果酸脫氫酶等)等。另外，在具有將 NAD +或NADP+轉(zhuǎn)換為NADH或NADPH的能力的蛋白質(zhì)為葡萄糖脫氫 酶的情況下，通過(guò)4^^應(yīng)體系內(nèi)共存有葡萄糖等有時(shí)可增強(qiáng)該蛋白質(zhì)的活 性，例如，可以在反應(yīng)液中添加這些物質(zhì)。另外，該蛋白質(zhì)可以是酶本身，
^系內(nèi)。另外，也可以是包含具有下i^^序列的基因的轉(zhuǎn)化體或其處理 物，所述4^^序列對(duì)具有將NAD +或NADP+轉(zhuǎn)換為NADH或NADPH的 能力的蛋白質(zhì)的M酸序列進(jìn)行編碼。此處，處理物是指與前述的"轉(zhuǎn)化 體的處理物，，相同的處理物。另外，在本發(fā)明的光學(xué)活性的鄰位取代苯乙 醇酸化合物的制造方法中，也可以使用同時(shí)包含具有下述v5^^序列的DNA 的轉(zhuǎn)化體來(lái)進(jìn)行，所述^a^序列對(duì)葡萄糖脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、 ^J^酸脫氫酶及有機(jī)脫氫酶(蘋果酸脫氫酶等)等具有將NAD +或NADP +轉(zhuǎn) 換為NADH或NADPH的能力的蛋白質(zhì)的M酸序列進(jìn)行編碼。
在該轉(zhuǎn)化體中，作為將兩種DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，例如可以舉 出將包含兩種DNA的單一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法和利用將兩種DNA分 別導(dǎo)入復(fù)制起源不同的多種載體而得到的重組載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化 的方法等。另外，也可以將一種DNA或兩種DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞的染色 體中。另外，作為將包含兩種DNA的單一載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法， 例如，可以將啟動(dòng)子、終止子等參與表達(dá)調(diào)控的區(qū)域分別與兩種DNA連 接來(lái)構(gòu)建重組載體，或者構(gòu)建以像乳糖操縱子那樣含有多個(gè)順?lè)醋拥牟倏v子的形式進(jìn)行表達(dá)的重組載體。 實(shí)施例
以下，通過(guò)實(shí)施例等更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的任 何限制。
參考例l(染色體DNA的制備)
在兩個(gè)500ml燒瓶中分別"培養(yǎng)基(在水100ml中溶解葡萄糖2g、 聚蛋白胨(K5g、酵母提取物0,3g、肉提取物0,3g、硫酸銨0,2g、磷酸二氫 鉀O.lg、七水合硫酸鎂0.05g，用2N的HC1調(diào)節(jié)pH至7)各100ml，在121 1C滅菌15分鐘。向其中分別加入在相同組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(30X:、 48小 時(shí)、振蕩培養(yǎng))的野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)IF013551菌林 的培養(yǎng)液各0.31111，在30C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。然后，將得到的培養(yǎng)液離心 (8000rpm、 4匸、10分鐘)，收集產(chǎn)生的沉淀。將該沉淀用0.85%食鹽水50ml 洗滌，得到約3g的濕菌體。
使用QIAprep Genomic-tip System(Qiagen乂A司制)，從上述菌體中得 到染色體DNA(以下記為染色體DNA(A))。
實(shí)施例l(本發(fā)明DNA的獲得及其分析)
根據(jù)序列編號(hào)3所示的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種 (Xanthomonas campestris pv. Campestris ) ATCC33913菌林的推測(cè)還原 酶基因(GenBank登錄號(hào)AE0UU3(區(qū)域2600-3568))，合成具有序列編 號(hào)4所示的M序列的寡核香酸引物和具有序列編號(hào)5所示的磁JJf列的 寡核普酸引物。
使用具有序列編號(hào)4和序列編號(hào)5所示的磁J^序列的寡核苷酸引物， 以所述染色體DNA(A)為模板，在下述反應(yīng)液組成和反應(yīng)條件下進(jìn)行 PCR(使用羅氏診斷產(chǎn)品公司制造的高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)(Expand High Fidelity PLUS PCR System))。l^因擴(kuò)增PCR系 統(tǒng)9700中，在94n加熱2分鐘后，以94匸(10秒)-65C(30秒)-72X:(90秒) 為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，接著以94匸(10秒)-65匸(30秒)-72X:(1分鐘+ 5秒/循環(huán))為1個(gè)循環(huán)進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，再在721C保持7分鐘。
然后，取出一部分PCR反應(yīng)液，進(jìn)行瓊脂糖^^電泳，結(jié)果檢測(cè)到約 1000bp的DNA片段的條帶。將上述約1000bp的DNA片段連接到 pCR2.1-TOPO載體中已有的"PCR產(chǎn)物插入位點(diǎn)"(使用英杰公司制TOPO TA克隆試劑盒)中，用得到的連接糾;t^桿菌TOP10F，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
在含有50ng/ml氨千青霉素的LB(l。/。細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5。/。細(xì)菌用酵 母提取物、1%氯化鈉)瓊脂培養(yǎng)基上，涂布5-溴-4-氯-3-吲咮基-P-D-半乳糖 普(以下記為X-gal)4。/o水溶液30^1及0.1M的IPTG 30^1，將其上得到的 轉(zhuǎn)化體接種進(jìn)行培養(yǎng)。在形成的菌落中杏沐8個(gè)白色菌落，將該菌落接種 到含有50照/ml氨千青霉素的無(wú)菌LB培養(yǎng)基(2ml)中，在試管中振蕩培養(yǎng) (30t:、 24小時(shí))。4吏用QIAprepSpinMiniprep試劑盒(Qiagen^i^司制)， 從培養(yǎng)菌體中取出質(zhì)粒。
對(duì)向所得質(zhì)粒中插入的DNA片段的4^J^序列進(jìn)行分析。根據(jù)得到的 4^^序列，確定對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的M酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列(序列 編號(hào)2)，所述蛋白質(zhì)含于野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris) IF013551菌林中，具有將2-(2-(2,5-二甲基苯縣曱基)苯基)-N-曱基-2-氧 代乙酰胺不對(duì)稱還原而優(yōu)先產(chǎn)生(11)-2-(2-(2,5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-]\-甲基-2-羥基乙酰胺的能力。進(jìn)而根據(jù)序列編號(hào)2，確定該蛋白質(zhì)的氨基酸 序列(序列編號(hào)l)。另外，質(zhì)粒中插入的DNA片段的磁基序列的分析，通 過(guò)4吏用熒光標(biāo)記終止物循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒(Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit)(珀金埃爾默制)，以各質(zhì)粒為;^板進(jìn)行 測(cè)序反應(yīng)，利用DNA測(cè)序儀373A(珀金埃爾默制)分析得到的DNA的>5^ 序列來(lái)進(jìn)行。
實(shí)施例2(本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的制it^還原反應(yīng)例(之一))(l)本發(fā)明載體的制備
根據(jù)序列編號(hào)2所示的磁J^序列，合成具有序列編號(hào)6所示的M序 列的寡核苷酸引物和具有序列編號(hào)7所示的磁J^序列的寡核苷酸引物。
以具有序列編號(hào)6所示的g序列的寡核苷酸引物和序列編號(hào)7所示 的寡核苷酸引物為引物，以所述染色體DNA(A)為模板，在下述反應(yīng)液組 成和反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR(使用羅氏診斷產(chǎn)品公司制造的高保真PCR擴(kuò)增 系統(tǒng))。\-曱基-2-羥基乙酰胺的光學(xué)純度， 結(jié)果(R)體為100%e.e.。
(含量分析條件) 柱S麗ICHIRAL ODS A國(guó)212
流動(dòng)相A液0.1%三氟乙酸水溶液，B液含有0.1。/。三氟乙酸的乙腈溶 液
時(shí)間(分鐘)A液(。/。):B液(％)
0 80:20
20 IO:卯
30 1:99
30.1 80:20
流量0.5ml/分鐘 柱溫40*C 檢測(cè)290nm
28(光學(xué)純度測(cè)定條件)
柱CHIRALCEL OD畫(huà)H 流動(dòng)相己烷:2-丙醇=9:1 分才斤時(shí)間50分鐘 流量0.5ml/分鐘 柱溫40t: 檢測(cè)230腿
實(shí)施例3(本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的制造^L還原反應(yīng)例(之二))
(1) 為制備具有編碼具有將氧化型P-尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)換為 還原型的能力的蛋白質(zhì)的M,列的M序列的基因進(jìn)行的準(zhǔn)備
將巨大芽孢桿菌IFO12108菌林在無(wú)菌的LB培養(yǎng)基100ml中培養(yǎng)， 得到菌體0.4g。使用Qiagen Genomic Tip(Qiagen公司制)，按照其附帶的 手冊(cè)中記載的方法從該菌體中純化染色體DNA(以下記為染色體 DNA(B))。
(2) 具有編碼具有將氧化型P-尼克酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原 型的能力的蛋白質(zhì)的Jl^紗列的M序列的基因的制備
根據(jù)生物化學(xué)雜志第264巻，第11期，6381-6385頁(yè)(1989)中記栽的 巨大芽孢桿菌IWG3來(lái)源的葡萄糖脫氫酶的序列，合成具有序列編號(hào)8所 示的磁^^序列的寡核苷酸引物和具有序列編號(hào)9所示的磁基序列的寡核苷 酸引物。
使用具有序列編號(hào)8所示的M序列的寡核苷酸引物和具有序列編號(hào) 9所示的M序列的寡核普酸引物作為引物，以所述染色體DNA(B)為模 板，在下述反應(yīng)液組成、反應(yīng)^下進(jìn)行PCR(使用羅氏診斷產(chǎn)品公司制 造的高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng))。\-甲基-2-氧代乙酰胺的殘留量和(R)-2-(2-(2，5-二甲基苯氧基甲基)苯基)-N-曱 基-2-羥基乙酰胺的生成量，求出還原酶活性。
(含量分析彿 柱SUMICHIRAL ODS A誦212
流動(dòng)相A液0.1。/。三氟乙酸水溶液，B液含有0.1%三氟乙酸的乙腈溶 液
時(shí)間(分鐘)A液(。/。):B液(％) 0 80:20 20 10:90 30 1:9930.1 80:20
流量0.5ml/分鐘
柱溫40"C
檢測(cè)290nm
工業(yè)上的可利用性
根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)⒈揭胰┧峄衔锊粚?duì)稱還原而有效地得到光學(xué) 活性的苯乙醇酸化合物。
序列表純文本
序列編號(hào)4
為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物 序列編號(hào)5
為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物 序列編號(hào)6
為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物 序列編號(hào)7
為PCR設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物 序列編號(hào)8
為PCR設(shè)計(jì)的寡核普酸引物 序列編號(hào)9
為PCR設(shè)計(jì)的寡核苦酸引物 序列編號(hào)ll
為PCR設(shè)計(jì)的寡核普酸引物 序列編號(hào)12
為PCR設(shè)計(jì)的寡核普酸引物 序列編號(hào)13
為PCR設(shè)計(jì)的寡核普酸引物
權(quán)利要求
1.一種由下述的任何堿基序列構(gòu)成的DNA，a)編碼用序列編號(hào)1表示的氨基酸序列的堿基序列；b)用序列編號(hào)2表示的堿基序列。
2. —種DNA，其特征在于，以能夠發(fā)揮功能的形式將能夠在宿主細(xì) 胞內(nèi)發(fā)揮功能的啟動(dòng)子與由下述a) d)中任何M序列構(gòu)成的DNA連接而 形成，a) 編碼用序列編號(hào)1表示的M酸序列的磁基序列；b) 相對(duì)于由編碼序列編號(hào)1所示的Jl^酸序列的M序列構(gòu)成的DNA 具有至少卯％序列同源性的DNA的g序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì) 的氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙 醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸 化合物的能力；c) 在嚴(yán)^Hf下與由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的磁J^序列構(gòu) 成的DNA雜交的DNA的磁基序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的氨基酸 序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合 物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的 能力；和d) 用序列編號(hào)2表示的M序列。
3. —種重組載體，其特征在于，包含權(quán)利要求1或2所述的DNA。
4. 一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過(guò)將權(quán)利要求2所述的DNA或權(quán)利 要求3所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為微生物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
7. —種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含具有下述的任何4序列的DNA，a) 編碼用序列編號(hào)1表示的JL^酸序列的磁基序列；b) 相對(duì)于由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的M序列構(gòu)成的DNA 具有至少90%序列同源性的DNA的磁基序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì) 的JL^酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙 醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸 化合物的能力；c) 在嚴(yán)^Ht下與由編碼序列編號(hào)1所示的^酸序列的g序列構(gòu) 成的DNA雜交的DNA的4^序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的"IL^, 列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力；和d)用序列編號(hào)2表示的磁J^序列。
8. —種轉(zhuǎn)化體的制造方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求3所述的重 組栽體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的步驟。
9. 一種蛋白質(zhì)，具有下述的任何M,列，a) 用序列編號(hào)l表示的M酸序列；和b) 用序列編號(hào)1表示的Jl^酸序列中缺失或附加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的 M酸序列，并且是由具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái) 生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能力的蛋白質(zhì)的 M^列構(gòu)成的Jl&^列。
10. —種重組載體，其特征在于，包含1)由下述8) (1)中的任何>^^序列構(gòu)成的DNA和ii)具有對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的^J^酸序列進(jìn)行編碼的^ 序列的DNA，所述蛋白質(zhì)具有將氧化型P-煙酰胺腺噪呤二核苷酸或氧化型 p-煙酰胺腺噤呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力，a) 編碼用序列編號(hào)1表示的JL^酸序列的堿J^序列；b) 相對(duì)于由對(duì)序列編號(hào)1所示的M酸序列進(jìn)行編碼的磁基序列構(gòu)成 的DNA具有至少90%序列同源性的DNA的磁Jjf列，并且是對(duì)如下所 述蛋白質(zhì)的M^列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取 代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的 苯乙醇酸化合物的能力；c) 在嚴(yán)^Hf下與由編碼序列編號(hào)1所示的^J^酸序列的g序列構(gòu) 成的DNA雜交的DNA的堿基序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的"l1^^ 列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物 不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能 力；和d) 用序列編號(hào)2表示的4^^序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的重組載體，其特征在于，具有將氧化型p-煙酰胺腺噪呤二核普酸或氧化型P-煙酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原 型的能力的蛋白質(zhì)為葡萄糖脫氫酶。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組載體，其中，具有葡萄糖脫氫酶活 性的蛋白質(zhì)為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium )來(lái)源的葡萄糖脫氬酶。
13. 將權(quán)利要求10 ~ 12所述的重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化體
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主細(xì)胞為微生物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化體，其中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
16. —種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，包含由下述a) d)中的任何M序列的DNA，所述蛋白質(zhì)具有將氧化型|3-煙酰胺腺噪呤二核苷酸或氧化型卩-煙酖胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)換為還原型的能力，a) 編碼用序列編號(hào)1表示的^^酸序列的堿基序列；b) 相對(duì)于由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的磁基序列構(gòu)成的DNA 具有至少卯％序列同源性的DNA的磁基序列，并且是對(duì)如下所述蛋白質(zhì) 的Jl^酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙 醛酸化合物不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸 化合物的能力；c) 在嚴(yán);fMHf下與由編碼序列編號(hào)1所示的Jl&酸序列的M序列構(gòu) 成的DNA雜交的DNA的堿基序列，并Jbl對(duì)如下所述蛋白質(zhì)的M^ 列進(jìn)行編碼的堿基序列，所述蛋白質(zhì)具有將鄰位取代的苯乙醛酸化合物 不對(duì)稱還原來(lái)生產(chǎn)對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的能 力；和d) 用序列編號(hào)2表示的M序列。
17. —種光學(xué)活性的醇化合物的制造方法，其特征在于，使權(quán)利要求 9所述的蛋白質(zhì)、或權(quán)利要求4~7、 13~16中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體、或其 處理物，與前手性J^^化合物接觸。
18. —種式(2)所示的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的制造 方法，其特征在于，使式(l)所示的鄰位取代的苯乙醛酸化合物，與具有 將式(1)的化合物不對(duì)稱還原為光學(xué)活性的式(2)的化合物的能力且由下述 a) f)中的任何JL^^f列構(gòu)成的蛋白質(zhì)接觸，<formula>formula see original document page 4</formula>式(l)中，&表示可被取代的氨基或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代的Cl-8烷基，<formula>formula see original document page 5</formula>(2)式(2)中，Ri和R2表示與上i^目同的含義，帶*標(biāo)記的碳原子為手性^^、 子，a) 用序列編號(hào)1表示的M酸序列；b) 相對(duì)于由序列編號(hào)2所示的磁^^序列構(gòu)成的DNA具有至少卯％ DNA的序列同源性的磁基序列所編碼的M酸序列；c) 在嚴(yán)^MHf下與由序列編號(hào)2所示的磁J^序列構(gòu)成的DNA雜交的 DNA的M序列所編碼的M酸序列；d) 相對(duì)于由編碼序列編號(hào)1所示的M酸序列的g序列構(gòu)成的DNA 具有至少90%DNA的序列同源性的磁基序列所編碼的M酸序列；e) 在嚴(yán)^Hf下與由編碼序列編號(hào)1所示的^^酸序列的g序列構(gòu) 成的DNA雜交的DNA的堿基序列所編碼的^J^酸序列；和f) 用序列編號(hào)l表示的M酸序列中缺失、置換或附加l個(gè)或多個(gè)氨 基酸的JtJ^酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制造方法，其中，所述前手性g化合物 為式(l)所示的鄰位取代苯乙醛酸化合物，光學(xué)活性的醇化合物為式(2)所 示的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物，式(1)中，&表示可被取代的Jl^或可被取代的烷氧基，R2表示可被取代 的Cl-8烷基，<formula>formula see original document page 6</formula>式(2)中，&和R2表示與上i^目同的含義，帶*標(biāo)記的碳原子為手性碳原子。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠?qū)⑧徫蝗〈谋揭胰┧峄衔锊粚?duì)稱還原并以良好的光學(xué)收率制造光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的DNA、從該DNA制造該蛋白質(zhì)的方法以及使用該蛋白質(zhì)來(lái)將鄰位取代的苯乙醛酸化合物不對(duì)稱還原從而制造對(duì)應(yīng)的光學(xué)活性的鄰位取代的苯乙醇酸化合物的方法等。
文檔編號(hào)C12P7/02GK101679967SQ20088001665
公開(kāi)日2010年3月24日 申請(qǐng)日期2008年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月22日
發(fā)明者朝子弘之 申請(qǐng)人:住友化學(xué)株式會(huì)社