專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于產(chǎn)生1,2-丙二醇的代謝工程改造的微生物的制作方法用于產(chǎn)生1，2-丙二醇的代謝工程改造的微生物本發(fā)明涉及經(jīng)代謝工程改造的微生物及其用于制備1,2-丙二醇的用途。1,2-丙二醇或丙二醇，一種C3二醇，是廣泛使用的化學(xué)品。它是用于航空器的不飽和聚酯樹(shù)脂、液體洗滌劑、冷卻劑、抗凍和除冰流體的組分。自從1993-1994年以來(lái)，丙二醇作為乙烯衍生物的替代物已經(jīng)越來(lái)越多地被使用，所述乙烯衍生物被認(rèn)為比丙烯衍生物毒性更強(qiáng)。目前使用消耗大量水的環(huán)氧丙烷水合工藝通過(guò)化學(xué)手段產(chǎn)生1,2-丙二醇。環(huán)氧丙烷可以由兩種方法中的任一種產(chǎn)生，一種使用表氯醇(epichlorhydrin),另一種使用氫過(guò)氧化物。兩條途徑都使用高毒性物質(zhì)。此外，氫過(guò)氧化物途徑產(chǎn)生副產(chǎn)物如叔丁醇和1-苯基乙醇。為使丙烯生產(chǎn)成為有利可圖的，必須使用這些副產(chǎn)物。化學(xué)途徑通常產(chǎn)生消旋的1，2-丙二醇，而兩種立體異構(gòu)體(W)l，2-丙二醇和(5)l,2-丙二醇中每種對(duì)于某些應(yīng)用是感興趣的。用于產(chǎn)生1,2-丙二醇的化學(xué)方法的缺點(diǎn)使生物合成成為具有吸引力的替代方法。已表征了兩種途徑用于通過(guò)微生物由糖天然產(chǎn)生1，2-丙二醇。在第一個(gè)途徑中，將6-脫氧糖(例如L-鼠李糖或L-巖藻糖)裂解成磷酸二羥基丙酮和(5)-乳醛，其能進(jìn)一步還原至(。-l，2-丙二醇(Badia等，1985)。此途徑在大腸桿菌中有功能，但是因?yàn)槊撗跫禾堑母叱杀?，不能得到?jīng)濟(jì)上可行的工藝。第二個(gè)途徑是通過(guò)糖酵解途徑，然后是丙酮醛途徑來(lái)代謝普通糖(例如葡萄糖或木糖)。將磷酸二羥基丙酮轉(zhuǎn)化成丙酮醛，后者可以還原成乳醛或丙酮醇。然后這兩個(gè)化合物可以進(jìn)行第二次還原反應(yīng)，得到1，2-丙二醇。此途徑由(R)-1,2-丙二醇的天然生產(chǎn)菌使用，如楔形梭菌(C7oWnWwws//ze"o^e力和熱/解4唐熱厭氧庫(kù)干菌(77zermo"w"era6"cfer^ze/7wos"cc/"ra/yWcMW)。已經(jīng)7吏用楔形梭菌產(chǎn)生1，2-丙二醇，在磷酸鹽受限條件下效價(jià)(titer)為1.58g/1(TmnDin和Gottschalk，1985)。也已經(jīng)研究熱解糖熱厭氧桿菌用于產(chǎn)生1,2-丙二醇(Cameron和Cooney，1986，Sanchez-Rivera等，1987)。獲得的最佳性能是9g/1的效價(jià)和0.2g/g由葡萄糖的得率。然而，用這些生物獲得的性能的改進(jìn)可能由于缺少可用的遺傳工具而受到限制?，F(xiàn)有技術(shù)Cameron等(1998)研究了大腸桿菌作為平臺(tái)用于將糖轉(zhuǎn)化為1，2-丙二醇的代謝工程的用途。他們的理論分析顯示實(shí)際產(chǎn)物得率的上限(考慮質(zhì)量平衡和生長(zhǎng)所需能量的產(chǎn)生)取決于培養(yǎng)條件而顯著不同。在厭氧條件下，將產(chǎn)生乙酸(acetate)作為副產(chǎn)物，以循環(huán)還原輔因子，而最佳得率限制在1摩爾1，2-丙二醇每摩爾葡萄糖(0.42g/g)。在需氧條件下，使用氧作為終端電子受體通過(guò)呼吸鏈確保輔因子的循環(huán)，并且可能在沒(méi)有副產(chǎn)物產(chǎn)生的情況下產(chǎn)生1，2-丙二醇。在這些條件下，得率能到達(dá)最高1.42mol/mo1(0.6g/g)。考慮1,2-丙二醇的最大效價(jià)量，Cameron等討論了其對(duì)于產(chǎn)物和副產(chǎn)物毒性的依賴(lài)性。1,2-丙二醇的毒性顯著低于1,3-丙二醇，而且大腸桿菌在100g/11,2-丙二醇時(shí)表現(xiàn)出0.5h-'的殘余生長(zhǎng)速率。對(duì)生長(zhǎng)的抑制更可能是由于副產(chǎn)物乙酸，已知其高度抑制生長(zhǎng)。開(kāi)發(fā)以高效價(jià)和得率產(chǎn)生1,2-丙二醇的厭氧工藝將解決乙酸問(wèn)題。已經(jīng)提出了將乙酸轉(zhuǎn)化成抑制性較低而且容易原位去除的丙酮(WO2005/073364)。已纟至由Cameron小纟且(Cameron等，1998，Altaras牙口Cameron,1999,Altaras和Cameron,2000)和Bennett小組(Huang等，1999,Berrios-Rivera等，2003)進(jìn)行了幾項(xiàng)大腸桿菌遺傳修飾的研究，以獲得使用簡(jiǎn)單碳源的1,2-丙二醇產(chǎn)生菌。這些研究一方面依賴(lài)于從磷酸二羥基丙酮到1,2-丙二醇的途徑中一種或幾種酶活性的表達(dá)，另一方面依賴(lài)于去除宿主菌林中的NADH和碳的消耗途徑。由Cameron小組獲得的最佳結(jié)果是在厭氧搖瓶培養(yǎng)中產(chǎn)生1.4g/11,2-丙二醇，得率為0.2g/g消耗的葡萄糖。當(dāng)外推至厭氧補(bǔ)料批式發(fā)酵罐時(shí)，產(chǎn)生4.5g/11，2-丙二醇，由葡萄糖的得率為0.19g/g，與Cameron等的理論估計(jì)相差較大。已經(jīng)通過(guò)在缺乏編碼乳酸脫氬酶的基因(MzA)的菌林中過(guò)表達(dá)大腸桿菌的丙酮醛合酶基因(附g》、大腸桿菌的甘油脫氫酶基因(gWA)和大腸桿菌的1，2-丙二醇氧化還原酶基因(/k^O)而獲得了這些性能。在專(zhuān)利US6,087,140,US6，303，352和WO98/37204中還描述了用同樣的方法獲得但效價(jià)和得率更低的結(jié)果。Bennett小組還使用缺乏W/zA的大腸桿菌宿主菌林過(guò)表達(dá)來(lái)自丙酮丁醇梭菌的柳^基因和來(lái)自大腸桿菌的gWA基因。在厭氧條件下的搖瓶培養(yǎng)得到1.3g/1的效價(jià)和0.12g/g的得率，而微需氧培養(yǎng)得到1.4g/1的效價(jià)和0.13g/g的得率。在這個(gè)階段，所有這些結(jié)果都未能優(yōu)于用菌種熱解糖熱厭氧桿菌(7:Z/7em7aacc/2ara/j^CMW)獲4尋的結(jié)果。葡萄糖在大腸桿菌中通過(guò)糖酵解途徑分解代謝，在裂解1,6二磷酸果糖后，生成兩個(gè)磷酸丙糖分子，磷酸二羥基丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛。這兩個(gè)磷酸丙糖分子可以通過(guò)磷酸丙糖異構(gòu)酶活性而互相轉(zhuǎn)化。通常認(rèn)為DHAP轉(zhuǎn)化成GA3P，并且來(lái)自葡萄糖的兩個(gè)GA3P進(jìn)一步分解代謝。3—磷酸甘油醛脫氫酶，也稱(chēng)作GAPDH，是葡萄糖變?yōu)楸岬奶墙徒廪D(zhuǎn)化中涉及的關(guān)鍵酶之一。GAPDH催化下述反應(yīng)3-磷酸甘油醛+磷酸+NAD+—1,3-二磷酸甘油酸+NADH+H-編碼這個(gè)酶的基因于1983年在大腸桿菌中克隆(Branlant等，Gene，1983)并命名為"g，"。后來(lái)鑒定了編碼具有相同酶活性的產(chǎn)物的另一個(gè)基因并命名為g，5(Alefounder等，Microbiol.，1987)。缺失和gapi5基因的大腸桿菌菌抹的表征表明，雖然gap6不是必要的，但是ga/」是糖酵解必需的(Seta等，丄Bacter.,1997)。具有下調(diào)的gapJ基因的微生物在專(zhuān)利申請(qǐng)WO2004/033646中報(bào)道用于通過(guò)發(fā)酵由葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇。本申請(qǐng)的發(fā)明人顯示，需要2個(gè)因素的組合以獲得1,2-丙二醇產(chǎn)率的增加-1,2-丙二醇的生物合成途徑的活性提高(improved),和-GAPDH活性的削弱。本發(fā)明人還證明，增加胞內(nèi)磷酸烯醇丙酮酸濃度或者使用可替換的糖運(yùn)輸系統(tǒng)能進(jìn)一步促進(jìn)由微生物發(fā)酵進(jìn)行的1,2-丙二醇生產(chǎn)。發(fā)明描述本發(fā)明涉及用于從碳源產(chǎn)生1,2-丙二醇的微生物，其中所述微生物的特征為a)從磷酸二羥基丙酮到1,2-丙二醇的生物合成途徑的活性提高，和b)3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性削弱。通過(guò)增加所述生物合成途徑中涉及的至少一個(gè)酶的活性而獲得由DHAP到1，2-丙二醇的生物合成途徑的活性的提高。這可以通過(guò)增加編碼所述酶的基因的表達(dá)，特別是增加選自如下的至少一個(gè)基因的表達(dá)來(lái)獲得m^A、>^/zD、_yayB、_yc^iW、_y《/zE、_yeaE、j^/Z、yq;'O、fos、JK^.G、yofeC、g7<iA和/肌'()。優(yōu)選地，增加mgsA、j^/D和gWA三個(gè)基因的表達(dá)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過(guò)缺失e^或Wa基因或兩者都缺失來(lái)消除L':ntner-Doudoroff途徑。此外，通過(guò)缺失編碼由丙酮醛合成乳酸中涉及的酶的基因(比如g/oA、fl/dA、"/JB)，由丙酮酸(/WA)、曱酸fe/7A，p/7B)、乙醇("WE)和乙酸0cAA、pto、poxB)合成乳酸中涉及的酶的基因，來(lái)削弱不期望的副產(chǎn)物的合成。削弱3-磷酸甘油醛(脫氫酶)的活性，從而通過(guò)丙糖磷酸異構(gòu)酶的作用將可用的3-磷酸甘油醛的一部分重定向至1,2-丙二醇的合成。然后1，2-丙二醇對(duì)葡萄糖的得率能夠大于1摩爾/摩爾。然而，由于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的生產(chǎn)減少，PEP-依賴(lài)的糖輸入系統(tǒng)將受到負(fù)面影響。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)使用與PEP無(wú)關(guān)的糖輸入如由ga/P編碼的，或者通過(guò)向糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)提供更多的PEP，來(lái)增加糖輸入的效率。這可以通過(guò)消除消耗PEP的途徑像丙酮酸激酶(由/j汝A和/，F(xiàn)基因編碼)，和/或通過(guò)促進(jìn)PEP的合成，例如通過(guò)過(guò)表達(dá)編碼PEP合酶的p戸A基因而獲得。此外，這對(duì)于可將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA的酶抵抗厭氧條件下存在的高濃度NADH是有價(jià)值的。這可以通過(guò)在//^基因中的特異性突變而獲得。最后，為了節(jié)省(spare)NADH用于丙酮醇還原成為1,2-丙二醇，可以缺失和w/Zz基因。用于制備1，2-丙二醇的微生物選自細(xì)菌、酵母和真菌，但是優(yōu)選來(lái)自大腸桿菌或丙酮丁醇梭菌菌種。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過(guò)將修飾的微生物在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)并通過(guò)回收和純化產(chǎn)生的1,2-丙二醇來(lái)產(chǎn)生1,2-丙二醇的方法。附圖簡(jiǎn)述并入并構(gòu)成本說(shuō)明的一部分的附圖例示了本發(fā)明，并與說(shuō)明書(shū)一起，用于解釋本發(fā)明的原理。圖l描繪了由糖產(chǎn)生1，2-丙二醇的系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)中中央代謝的遺傳工程。發(fā)明詳述如本文所使用的，下述術(shù)語(yǔ)可以用于解釋權(quán)利要求和說(shuō)明書(shū)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)"、"生長(zhǎng)，，和"發(fā)酵，，可互換使用，以表示細(xì)菌在包含簡(jiǎn)單碳源的適當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"碳源，，表示碳的任何來(lái)源，其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用以支持微生物的正常生長(zhǎng)，并且其可以是己糖、戊糖、單糖、二糖、寡糖、淀粉或其衍生物、半纖維素、甘油，和它們的組合。術(shù)語(yǔ)"用于產(chǎn)生1,2-丙二醇"表示微生物產(chǎn)生所述目標(biāo)產(chǎn)物，優(yōu)選通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生。發(fā)酵是能在需氧、微需氧或厭氧條件下進(jìn)行的經(jīng)典工藝。短語(yǔ)"酶活性的削弱"指與進(jìn)行任何修飾之前的初始菌抹中的活性相比，修飾菌抹中目的酶的活性降低。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解多種方法以獲得此結(jié)果，可能的實(shí)例包括-向基因中導(dǎo)入突變，降低該基因的表達(dá)水平，或者降低編碼蛋白質(zhì)的活性水平。-由低強(qiáng)度的啟動(dòng)子取代基因的天然啟動(dòng)子，得到更低的表達(dá)。-使用使相應(yīng)信使RNA或蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的元件。-如果期望完全不表達(dá)則缺失基因。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"指基因序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其可以產(chǎn)生基因相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。有利地，3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性比在相同條件下在未修飾菌株中觀察到的活性低30%,更優(yōu)選低10%。術(shù)語(yǔ)"由磷酸二羥基丙酮到1,2-丙二醇的生物合成途徑的活性提高"指該途徑涉及的至少一種酶活性提高(見(jiàn)下文)。有利地，本發(fā)明的微生物經(jīng)過(guò)遺傳修飾以增加從磷酸二羥基丙酮到1,2-丙二醇的生物合成途徑中涉及的至少一個(gè)酶的活性。優(yōu)選地，通過(guò)增加編碼所述酶的基因的表達(dá)而獲得酶活性的增加。為了獲得目標(biāo)基因的過(guò)表達(dá)，本領(lǐng)域中的技術(shù)人員了解不同的方法，如-用更強(qiáng)的啟動(dòng)子替換內(nèi)源啟動(dòng)子。-向微生物導(dǎo)入攜帶所述目標(biāo)基因的表達(dá)載體。-向染色體中導(dǎo)入目標(biāo)基因的額外拷貝。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解幾種目前用于將DNA導(dǎo)入細(xì)菌菌林的技術(shù)。優(yōu)選的技術(shù)是電穿孔，其為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。有利地，將選自下組的至少一個(gè)目標(biāo)基因過(guò)表達(dá)wgx4、j^/B、，oE、少g/zZ、_y《/i￡\;;《/zZ)、j^i/z/7、少cd『、_yq/(9、_y<^'G、_yt/6C、fos、g/rfL4矛口>c(9?；蚓幋a丙酮醛合酶，其催化DHAP轉(zhuǎn)化成丙酮酪?；騳q/B、yeai、yg/Z、j《/z五、_y《/z￡)、yd/2i7、_ycd『、；^/0、y《G、_yc^C、tos編石馬能將丙酮醛轉(zhuǎn)化成丙酮醇的酶活性。gAi4基因編碼甘油脫氫酶，其催化丙酮醇轉(zhuǎn)化成1,2-丙二醇。/wcO基因編碼1，2-丙二醇氧化還原酶，其催化乳醛轉(zhuǎn)化成1，2-丙二醇。優(yōu)選的微生物攜帶可導(dǎo)致特別感興趣的三個(gè)基因wg^、j^/zD和g/c^的過(guò)表達(dá)的修飾。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，Entner-Doudoroff途徑中涉及的至少一個(gè)基因被削弱。Entner-Doudoroff途徑提供糖酵解之外將葡萄糖降解成為3-磷酸甘油醛和丙酮酸的另一種途徑。Entner-Doudoroff途徑的削弱確保大多數(shù)或最好是全部葡萄糖通過(guò)糖酵解而降解，并用于產(chǎn)生1,2-丙二醇。具體地，這個(gè)途徑的兩個(gè)基因e^/或eda中至少一個(gè)被削弱。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"基因表達(dá)的削弱"表示基因表達(dá)的部分或全部抑制，即所述的"削弱"。這種表達(dá)的抑制可以是抑制基因的表達(dá)，抑制基因的激活機(jī)制，缺失基因表達(dá)所需的全部或部分啟動(dòng)子區(qū)，或者缺失基因的編碼區(qū)。優(yōu)選地，基因的削弱基本上是基因的完全缺失，所述基因可以用促進(jìn)本發(fā)明菌抹的鑒定、分離和純化的選4奪標(biāo)記基因取代。優(yōu)選通過(guò)Datsenko,K.A.和Wanner,B.L.(2000)"One-stepinactivationofchromosomalgenesin^&c/zm.c/z/aco//K-12usingPCRproducts".Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:6640-6645所述的同源重組技術(shù)使基因失活。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，丙酮醛變成乳酸的轉(zhuǎn)化中涉及的至少一個(gè)基因被削弱。此削弱的目的在于可用的丙酮醛被細(xì)胞機(jī)構(gòu)(cellmachinery)使用，基本上用于合成1，2-丙二醇(參見(jiàn)圖1)丙酮醛變成乳酸的轉(zhuǎn)化中涉及的基因具體為-編碼乙二醛酶的基因，如編碼乙二醛酶I的g/oA基因，其催化從丙酮醛合成乳酰谷胱甘肽；-編碼乳醛脫氬酶的aWA和a^B基因(其催化從(。乳醛合成(5)乳酸)。在初始菌抹中，有利地削弱了這些基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)。優(yōu)選完全缺失g/oA基因。在本發(fā)明的微生物中，優(yōu)選的是副產(chǎn)物(如乳酸、乙醇和曱酸)的合成中涉及的至少一個(gè)酶被削弱。具體地，有利的是削弱編碼乳酸脫氫酶的基因W/zA的表達(dá)，其催化由丙酮酸合成乳酸，并且削弱編碼醇-醛脫氫酶的基因aWE的表達(dá)，其催化由乙酰-CoA合成乙醇。相似地，可能迫使微生物使用丙酮酸脫氫酶復(fù)合物以從丙酮酸產(chǎn)生乙酰-CoA、C02和NADH而不是乙酰-CoA和曱酸。這可以通過(guò)削弱編碼丙酮酸甲酸裂合酶的基因/7//A和/^B而實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明的另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，通過(guò)削弱乙S吏合成中涉及的至少一個(gè)酶來(lái)防止副產(chǎn)物乙酸的合成。優(yōu)選的是避免這樣的乙酸合成，以?xún)?yōu)化1，2-丙二醇的產(chǎn)生。為了防止產(chǎn)生乙酸，有利地削弱了選自ad:A、pto和poxB中的至少一個(gè)基因的表達(dá)，所有這些基因都編碼涉及不同的乙酸生物合成途徑的酶(參見(jiàn)圖1)。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的微生物中，增加糖輸入的效率。ga」M基因表達(dá)強(qiáng)力削弱使GAPDH反應(yīng)中碳流量降低超過(guò)50%，這將導(dǎo)致每摩爾輸入的葡萄糖合成小于1摩爾的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。PEP是通常用于向細(xì)胞中輸入簡(jiǎn)單糖的糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)所需要的，因?yàn)檩斎肱c從PEP轉(zhuǎn)移磷酸到葡萄糖得到6-磷酸葡萄糖的磷酸轉(zhuǎn)移偶聯(lián)。因此降低PEP的量將對(duì)糖輸入產(chǎn)生負(fù)面影響。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，可以通過(guò)不依賴(lài)于磷酸烯醇丙酮酸的糖輸入系統(tǒng)將糖輸入微生物?？梢岳糜蒰a/P基因編碼的半乳糖-質(zhì)子共運(yùn)輸體(symporter),其不涉及磷酸化。在這種情況下，輸入的葡萄糖必須由g儀基因編碼的葡萄糖激酶磷酸化。為了促進(jìn)此途徑，增加選自ga/尸和g儀中的至少一個(gè)基因的表達(dá)。結(jié)果，PTS變得不必要(dispensable)，而且可以通過(guò)削弱選自p&H、或crr中的至少一個(gè)基因的表達(dá)而消除。在本發(fā)明的另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，通過(guò)增加代謝物磷酸烯醇丙酮酸的利用率而增加糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的效率。由于削弱了ga/W活性和朝向丙酮酸的碳流量較低，所以本發(fā)明的修飾菌抹中PEP的量受到限制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中的葡萄糖量較低。存在多種可以用于增加微生物菌株中PEP利用率的方法。具體地，一種ii手段是削弱反應(yīng)PEP—丙酮酸。優(yōu)選地，在所述菌抹中削弱選自編碼丙酮酸激酶的pj汝A和py砂中的至少一個(gè)基因以獲得這一結(jié)果。另一種增加PEP的利用率的方法是，通過(guò)增加磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性來(lái)促成(favour)由所述酶催化的反應(yīng)丙酮酸外々—PEP。這個(gè)酶由/7戸A基因編碼。因此，優(yōu)選在微生物中，優(yōu)選增加p/wA基因的表達(dá)。兩種修飾可以同時(shí)存在于微生物中。特別是在厭氧或微需氧條件下，有利的是，將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDC)對(duì)于NADH的抑制具有低的敏感度。參照未修飾酶的敏感度確定更低的敏感度。這些特性可以通過(guò)如下方式獲得向/p"基因(編碼PDC的硫辛酰胺脫氫酶亞基)中導(dǎo)入特定突變，使酶的蛋白質(zhì)序列中的丙氨酸55替換為纈氨酸殘基。在厭氧或微需氧條件下，用于將前體還原成1,2-丙二醇的NADH的利用率得到有利地增加。這可以通過(guò)減輕由全局調(diào)控子ArcA(由wcA基因編碼)介導(dǎo)的對(duì)三羧酸循環(huán)的抑制而獲得。細(xì)胞中NADH的濃度也可以通過(guò)失活由基因w/Zz編碼的NADH脫氬酶II而增加。因此，優(yōu)選地，選自arcA和w函的至少一個(gè)基因被削弱。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的微生物選自細(xì)菌、酵母和真菌。更優(yōu)選地，微生物選自下組腸細(xì)菌科、芽孢桿菌科、梭菌科、鏈霉菌科和棒桿菌科。甚至更優(yōu)選地，微生物是大腸桿菌或丙酮丁醇梭菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于制備1，2-丙二醇的方法，其中微生物如先前丙二醇。在需氧、微需氧或厭氧條件下進(jìn)行l(wèi)，2-丙二醇的生產(chǎn)。發(fā)酵過(guò)程的培養(yǎng)條件可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。具體地，細(xì)菌在20。C-55。C,優(yōu)選在25。C-40。C，并且對(duì)于丙酮丁醇梭菌優(yōu)選在約35°C，對(duì)于大腸桿菌在約37。C的溫度發(fā)酵。這個(gè)方法可以以分糸b方法，#卜一+-分糸1:方法或連續(xù)方法進(jìn)4亍。"在需氧條件下，，表示通過(guò)將氣體溶于液相而向培養(yǎng)物供氧。這可以通過(guò)下述方式獲得(l)將含氧氣體(例如空氣)鼓泡入液相，或(2)震蕩包含培養(yǎng)基的容器，以將液上空間包含的氧傳遞入液相。在需氧條件而不是厭氧條件下發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)在于氧作為電子受體的存在改進(jìn)了菌抹以ATP形式為細(xì)胞過(guò)程產(chǎn)生更多能量的能力。因此菌株的普通代謝得到了改進(jìn)。微需氧條件定義為這樣的培養(yǎng)條件其中低百分比的氧(例如使用包含0.1-10%氧的氣體混合物，用氮補(bǔ)至100%)溶于液相中。厭氧條件定義為不向培養(yǎng)基供氧的培養(yǎng)條件。可以通過(guò)向培養(yǎng)基中鼓泡惰性氣體如氮?dú)?，去除痕量的其他氣體而獲得嚴(yán)格厭氧條件。可以使用氮?dú)庾鳛殡娮邮荏w以改進(jìn)菌抹的ATP生產(chǎn)，并改進(jìn)其代謝。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基"表示適合微生物生長(zhǎng)的分子組成已知的培養(yǎng)基。例如適合所用細(xì)菌的已知設(shè)定組成的無(wú)機(jī)培養(yǎng)基，其包含至少一種碳源。具體地，因此用于大腸桿菌的無(wú)機(jī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以與M9培養(yǎng)基(Ande腿，1946,編.Jed5W.園32:120-128)、M63培養(yǎng)基(Miller,1992;AShortCourseinBacterialGenetics:ALaboratoryManualandHandbookfori^c/zen'c/^aco//andRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)或^口Schaefer等(1999，J"a/.肌oc/zem.270:88-96)所定義的培養(yǎng)基有相同或相似的組成，并且具體地，命名為MPG的基本培養(yǎng)基如下所述K2HP041.4g/1氮川三乙酸0.2g/1痕量元素溶液*10ml/1(NH4)2S04lg/1NaCl0.2g/1NaHC030.2g/1MgS040.2g/1葡萄糖20至100g/1NaN030.424g/1硫胺素10mg/lFeS04，7H2050mg/1酵母提取物4g/1用氫氧化鈉將培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.4。*痕量元素溶液:檸檬酸4.37g/L,MnS043g/L，CaCl21g/L,CoCl2，2H200.1g/L,ZnS04,7H200.10g/L，CuS04,5H2010mg/L，H3B0310mg/L，Na2Mo048.31mg/L。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，用在包含簡(jiǎn)單碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的大腸桿菌菌抹進(jìn)行所述方法，其中簡(jiǎn)單碳源可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖。特別優(yōu)選的簡(jiǎn)單碳源是葡萄糖。13在本發(fā)明的另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用在包含簡(jiǎn)單碳源或復(fù)雜碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的丙酮丁醇梭菌菌林進(jìn)行所述方法。因此生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以與梭菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CGM,Wiesenbom等，Appl.Environm.Microbiol"54:2717-2722)或由Monot等(Appl.Environm.Microbiol.44:1318-1324)或Vasconcelos等(J.Bacteriol.,176:1443-1450)提出的基本生長(zhǎng)培養(yǎng)基具有相同或相似的組成。用于丙酮丁醇梭菌培養(yǎng)的碳源是簡(jiǎn)單或復(fù)雜碳。簡(jiǎn)單碳源可以是阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖或木糖。特別優(yōu)選的簡(jiǎn)單碳源是葡萄糖。復(fù)雜碳源可以是淀粉或半纖維素。特別優(yōu)選的復(fù)雜碳源是淀粉。有利地，進(jìn)一步純化回收的1，2-丙二醇。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解用于回收和純化1,2-丙二醇的多種方法。本發(fā)明在上文、下文和實(shí)施例中針對(duì)大腸桿菌描述。因此對(duì)于本發(fā)明的初始和進(jìn)化菌株的可以削弱、缺失或過(guò)表達(dá)的基因主要使用來(lái)自大腸桿菌的基因的名稱(chēng)(denomination)來(lái)定義。然而，這種指定根據(jù)本發(fā)明具有更一般的意義，并覆蓋了其他微生物中相應(yīng)的基因。使用來(lái)自大腸桿菌的基因的GcnBank參考符號(hào)(reference),本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員能確定大腸桿菌之外的其他生物體中的等同基因。鑒定同源序列和它們的百分比同源性的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的，并且具體包括可以在網(wǎng)站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上以網(wǎng)站上指示的默認(rèn)參數(shù)使用的BLAST程序。獲得的序列可以使用例如程序CLUSTALW(http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw/)以這些網(wǎng)站上指示的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行研究(比對(duì))。PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)(比對(duì)和隱藏的Markov才莫型的蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)，http:〃www.san2er.ac.uk/S0ftware/Pfam/)是蛋白質(zhì)序列比對(duì)的大集合。每個(gè)PFAM能夠顯示多重比對(duì)，查看蛋白質(zhì)域，評(píng)價(jià)生物體之間的分布，訪問(wèn)其他數(shù)據(jù)庫(kù)并顯示已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過(guò)比較源自代表了44個(gè)主要的系統(tǒng)發(fā)生系的66個(gè)完全測(cè)序基因組的蛋白質(zhì)序列而獲得COG(蛋白質(zhì):fc向同源纟且的l奚，http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)。每個(gè)COG由至少三個(gè)系定義，從而能夠鑒定古老的保守的域。參考文獻(xiàn)(按在本文中引用的順序)1.BadiaJ,RosJ，AguilarJ(1985)，《/Bacte"W.161:435-437.2.TranDinK和GottschalkG(1985),Jrc/z.A^cro^o/.142:87-923.CameronDC和CooneyCL(1986),5/o/Tec/wo/ogy，4:651-6544.Sanchez-RiveraF,CameronDC，CooneyCL(1987)，9:449-4545.AltarasNE和CameronDC(1999),五謂'r亂M'craZ^o/.65:1180-11856.CameronDC,AltarasNE,HoffmanML,ShawAJ(1998)，祝o/ec/mo/.尸rag.14:116-1257.AltarasNE和CameronDC(2000)，歷ofec/7"0/.戶(hù)rag.16:940-9468.HuangK,RudolphFB,BennettGN(1999),如/.五謂'簡(jiǎn).緣油.。/.65:3244-32479.Berrios-RiveraSJ,SanKY,BennettGN(2003)，//w/.Tl^cro^'o/.臉血'/z，/.30:34-4010.BranlantG,FleschG,BranlantC(1983),25:1-711.AlefounderPR和PerhamRN(1989)，Mo/.M/cra6/o/.，3:723-73212.SetaFD,Boschi-MullerF,VignaisML,BranlantG(1997)，乂Sacteno/.179:5218-522113.DatsenkoKA和WannerBL(2000)，尸rac.Ato/.Jcad"5^97:6640-664514.AndersonEHC1946)，尸rac.iVa"^cad5W.32:120-12815.Miller(1992),AShortCourseinBacterialGenetics:ALaboratoryManualandHandbookfor^^c/zeWc/H'"co//andRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork16.SchaeferU，BoosW,TakorsR,Weuster-BotzD(1999),Jwa/.270:88-9617.WiesenbomDP,RudolphRB，PapoutsakisET(1987)，E"Wra".Mc油W.，54:2717-272218.MonotF,MartinJR,PetitdemangeH,GayR(1982)，五謂'raw.M/c/油'o/.44:1318-132419.VasconcelosI，GirbalL，SoucailleP(1994),J5ac/en.o/.176:1443—145020.LemerCG和InouyeM(19卯)，7Vwc/e/c^c/Ai仏18:4631實(shí)施例實(shí)施例1:大腸桿菌MG1655PtrclG-ga^^cm&MElOlVBOl-j^/zD-mgW-g/c^y大腸桿菌MG1655Ptrcl6-ga/^::cm(pME101VB01扁少q/B-mgW-g/^4)和大腸桿菌MG1655Ptrc16-gap4:(pME101VBO1-wg"-gWJ)修飾菌林的構(gòu)建為了增加1,2-丙二醇的產(chǎn)生，使用trc啟動(dòng)子由質(zhì)粒pME101VB01表達(dá)基因的不同組合。a)大腸桿菌MG1655(pMElOlVBOl-j^/zD-wg^-g/^i)、MG1655(pME101VBO1-，yB畫(huà)mg^4-g/W)和MG1655(pME101VBO1的修飾菌抹的構(gòu)建質(zhì)粒pME101VB01的構(gòu)建質(zhì)粒pME101VB01衍生自質(zhì)粒pME101，并且攜帶多克隆位點(diǎn)，其中包含對(duì)于罕見(jiàn)限制內(nèi)切酶MzeI、S"aBI、尸acl、Sg/H、JwII、5*acII和^gel特異性的識(shí)別位點(diǎn)序列，其后為丙酮丁醇4炎菌ATCC824的adc轉(zhuǎn)錄終止子。為了從低拷貝載體進(jìn)行表達(dá)，如下構(gòu)建質(zhì)粒pME101。使用寡核苷酸PMEIOIF和PMEIOIR和來(lái)自載體；7)r^^(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway,N.J)的攜帶/acl基因的5wZ17I-Xm"I片段，對(duì)質(zhì)粒/CZJ"0(Lemer&Inouye,1990,NAR18,15p4631-GenBankAX085428)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將Zrc啟動(dòng)子插入到擴(kuò)增的載體中。PMEIOIF(SEQIDNO1):ccg3cagt肌g3cgggta3gcctgPMEIOIR(SEQIDNO2):agcttagtaaagccctcgctag使用包含多克隆位點(diǎn)和adc轉(zhuǎn)錄終止子的合成雙鏈核酸接頭產(chǎn)生pME101VB01。將互補(bǔ)側(cè)翼為(complementflankedby)TVcol或///m/in消化的限制性位點(diǎn)的兩個(gè)ioo堿基的寡核芬酸退火。將ioo-堿基對(duì)產(chǎn)物亞克隆入用/歷w^111消化的質(zhì)粒pME101，以產(chǎn)生pME101VB01。pME101VB011，由100個(gè)堿基組成(SEQIDNO:3):catgggctagctacgtattaattaaagatctcctagggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgccapME101VB012，由100個(gè)堿基組成(SEQIDNO:4):agcUggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctaggagatctttaattaatacgtagctagcc具有-對(duì)應(yīng)于多克隆位點(diǎn)的區(qū)域(帶下劃線(xiàn)的小寫(xiě)字母)-對(duì)應(yīng)于丙酮丁醇梭菌ATCC824(NC—001988)的"dc轉(zhuǎn)錄終止子(序歹'J179847至179814)的區(qū)域(大寫(xiě)字母)。(pME101VB01—>^/zD-wg^-gAi4、pME101VB01—yq/B-wgd-g7c^和pME101VBO1——￡-mgW-g/,使用表1給出的寡核苷酸從大腸桿菌MG1655的基因組DNAPCR擴(kuò)增不同的基因。表1.用于擴(kuò)增1,2-丙二醇途徑的基因的寡核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>用表1中提及的限制性酶剪切PCR擴(kuò)增的片段，并克隆入質(zhì)粒;A^7WFBW的限制性位點(diǎn)。構(gòu)建下述質(zhì)粒pME101VB01-;^/zD-mg^-g/cL4、pME101VB01-_ya/B-mgW-g/dL4和pME101VB01—j^/z五-mg^-gAi4。將質(zhì)粒導(dǎo)入菌抹大腸桿菌MG1655中。b)大腸桿菌MG1655Ptrcl6-ga/W::cm的修飾菌抹的構(gòu)建通過(guò)用FRT-CmR-FRT和工程改造的啟動(dòng)子取代上游ga/A序列的225pb從而用合成的短Ptrcl6啟動(dòng)子(SEQIDNO15:gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtgg)在菌才朱大腸^干菌MG1655中代替天然gapA啟動(dòng)子。使用的技術(shù)由Datsenko,K.A.&Wanner,B丄.(2000)描述。根據(jù)操作規(guī)程i用于替換天然gopA啟動(dòng)子的兩個(gè)寡核苷酸在表2中給出。操作規(guī)程1:導(dǎo)入PCR產(chǎn)物用于重組和選擇重組體使用表2中選擇和給出的用于替換基因或基因間區(qū)域的寡核苷酸從質(zhì)粒pKD3擴(kuò)增氯霉素抗性盒，或者從質(zhì)粒pKD4擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner,B丄.(2000)。然后將獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)電穿孔導(dǎo)入攜帶質(zhì)粒pKD46的受體菌抹中，該質(zhì)粒中表達(dá)的系統(tǒng)Red(..外源(exo))可極大促成同源重組。然后選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化體并用表3中給出的合適的寡核苷酸通過(guò)PCR分析;險(xiǎn)查抗性盒的插入。將得到的菌林命名為大腸桿菌MG1655Ptrcl6-ga;^4::cm。分別將這3個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入菌抹大腸桿菌MG1655Ptrcl6-gapJ::cm。表2.用于以PCR產(chǎn)物通過(guò)重組替換菌抹大腸桿菌MG1655中染色體區(qū)域的寡核苷酸區(qū)域名稱(chēng)寡核香酸名稱(chēng)SEQID與染色體同源的區(qū)域gopj啟動(dòng)子Ptrc-gapAFN0161860478-1860536(Ptrcl6-ga;^4)Ptrcl6-gapARN0171860762-1860800e必和g(ia基因DeddFN0181932582-1932501DedaRN0191930144-1930223g/o4基因GLOADfN0201725861-1725940GLOADRN0211726268-1726189a/t^基因AldADfN0221486256-1486336aldADrN0231487695-1487615AldBDfN0243752603-3752682aldBDrN0253754141-3754062DldhAFN0261440865-1440786DldhARN0271439878-1439958<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例2:能以高產(chǎn)量產(chǎn)生1，2-丙二醇的大腸桿菌MG1655Ptrcl6-go^4，Ae必-油，Ag/a4，A/;^iAp;;A:F(pME101VB01，/LD-，W-g/(i4),(pJB137-Pg—大腸桿菌MG1655Ptrcl6-g—,油，A/o4'ApyLiA/;^F(pME101VB01-yq/B-mg^-gW^),(pJB137-Pga;^-p;^y4」和大腸桿菌MG1655Ptrcl6-gaj^4，Ae必-油，Ag7oJ，Apy"/V少/fcF(pME101VB01-月/^-mgW-g/cH)，(pJB137-Pgap4-;9pW」修飾菌抹的構(gòu)建使用操作規(guī)程1中所述的技術(shù)，用表2中給出的寡核苷酸，通過(guò)插入卡那霉素抗生素抗性盒并缺失相關(guān)基因的大部分而使菌抹大腸桿菌MG1655中的基因e必-Wa失活。將獲得的菌林命名為MG1655Ae必-^fo.v細(xì)。才艮據(jù)操作^見(jiàn)程2將缺失轉(zhuǎn)移至菌一朱大腸桿菌MG1655Ptrcl6-gaj^::cm。操作規(guī)程2:用噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)以缺失基因通過(guò)用噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)，通過(guò)由抗性盒(卡那霉素或氯霉素)代替受體大腸桿菌菌抹中的基因而缺失所選的基因。操作規(guī)程有兩個(gè)步驟，(i)在缺失單基因的菌抹MG1655上制備噬菌體裂解物和(ii)用這個(gè)噬菌體裂解物轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌林。噬菌體裂解物的制備-用單一基因缺失的菌抹MG1655的100pl過(guò)夜培養(yǎng)物接種10mlLB+Cm30昭/ml+葡萄糖0.2%+CaCl25mM。-在37。C震蕩培養(yǎng)30分鐘。-加入由野生型菌抹MG1655制備的100(il噬菌體裂解物Pl(約lx109個(gè)噬菌體/ml)。-在37。C震蕩3小時(shí)直至所有細(xì)胞裂解。-加入200^氯仿，并漩渦震蕩。-在4500g離心10分鐘，以去除細(xì)胞石爭(zhēng)片。-將上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌管中，并加入200/il氯仿。-在4。C保存裂解物。拉-將LB培養(yǎng)基中大腸桿菌受體菌抹的5ml過(guò)夜培養(yǎng)物在1500g離心1020分鐘。-將細(xì)胞沉淀懸浮于2.5mlMgS0410mM,CaCl25mM中。-對(duì)照管100(il細(xì)胞包含單基因缺失的菌抹MG1655的100(il噬菌體Pl-管測(cè)試100|il細(xì)胞+包含單基因缺失的菌抹MG1655的100噬菌體P1-在3(TC無(wú)震蕩培養(yǎng)30分鐘。-在每個(gè)管中加入100jil檸檬酸鈉，并漩渦震蕩。-力口入1mlLB。-在37。C震蕩培養(yǎng)1小時(shí)。-將管在7000rpm離心3分鐘后涂布于LB+Cm30jig/ml的平板上。-在37。C過(guò)夜溫育。然后選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化體，并用合適的寡核苷酸通過(guò)PCR分析檢查缺失的插入。將得到的菌抹命名為大腸桿菌MG1655Ptrcl6-ga/7^::cm,AecW-Wa::km。然后根據(jù)操作規(guī)程3消除抗生素抗性盒。操作規(guī)程3:抗性盒的消除根據(jù)下述技術(shù)消除氯霉素和/或卡那霉素抗性盒。通過(guò)電穿孔將攜帶在氯霉素和/或卡那霉素抗性盒的FRT位點(diǎn)作用的FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20導(dǎo)入重組菌抹。在42。C系列培養(yǎng)后，通過(guò)PCR分析用表3中給出的寡核苷酸檢查抗生素抗性盒的丟失。根據(jù)操作規(guī)程1，用表2中給出的寡核苷酸構(gòu)建菌抹MG1655zlg/^4.vcm,并根據(jù)操作規(guī)程2將這個(gè)缺失轉(zhuǎn)移至先前構(gòu)建的菌抹中。將得到的菌抹命名為大腸桿菌MG1655Ptrcl6-ga/^4，Aedd-edq,Ag/a4::cm。根據(jù)操作規(guī)程1,用表2中給出的寡核苷酸，通過(guò)插入卡那霉素抗生素抗性盒而失活先前菌抹中的基因；^W。將得到的菌抹命名為大腸桿菌MG1655Prc7(5-ga一，/Wc/-e<^，Zlg7oyl'.'cw，傘yA:Hm。然后根據(jù)操作規(guī)程3消除抗生素抗性盒。根據(jù)操作規(guī)程1，用表2中給出的寡核苷酸，通過(guò)插入氯霉素抗生素抗性盒而失活先前菌林中的基因pj^F。將得到的菌抹命名為大腸桿菌MG1655然后根據(jù)操作規(guī)程3消除抗生素抗性盒。在每個(gè)步驟，使用表3中給出的寡核苷酸檢查先前建立的所有缺失是否存在。為了增加磷酸烯醇丙酮酸的產(chǎn)生，使用ga;A啟動(dòng)子由質(zhì)粒pJB137表達(dá)基因p，丄為了構(gòu)建質(zhì)粒pJB137-P^p4-;^M，使用下述寡核苷酸從大腸桿菌MG1655的基因組DNAPCR擴(kuò)增基因p戸A1.gapA-ppsAF，由65個(gè)堿基組成(SEQIDNO64)ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC具有(大寫(xiě)字母)，網(wǎng)站http:〃genolist.pasteur.fr/Colibri/上的參照序列，和-與ga/A啟動(dòng)子(1860794-1860761)同源的區(qū)域(小寫(xiě)字母)。2.ppsAR,由43個(gè)堿基組成(SEQIDNO65)aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC具有-與基因p/W(1785136至1782758)的序列(1782758-1782780)同源的區(qū)域(大寫(xiě)字母)-限制性位點(diǎn)歷mffll(帶下劃線(xiàn)的字母)。同時(shí)使用下述寡核苷酸擴(kuò)增大腸桿菌基因gopA的gapA啟動(dòng)子區(qū)域1.gapA-ppsAR，由65個(gè)石咸基組成(SEQIDNO66)GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtg具有(大寫(xiě)字母)，和-與《"/八啟動(dòng)子(1860794-1860761)同源的區(qū)域(小寫(xiě)字母)。2.ppsAF,由33個(gè)堿基組成(SEQIDNO67)ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc具有.--與基因ga/x4啟動(dòng)子(1860639-1860661)同源的區(qū)域(小寫(xiě)字母)。-限制性位點(diǎn)SWGI(帶下劃線(xiàn)的字母)。隨后使用寡核苦酸ppsAR和gapAF將兩個(gè)片段融合(Horton等，1989Gene77:61-68)。用限制性酶///wffll和Smal剪切PCR擴(kuò)增的片段，并克隆入載體/x/B"7(EMBL登錄號(hào)U75326)的歷m/inASmal位點(diǎn)中，產(chǎn)生載體將不同的pME101VB01質(zhì)粒和pJB137-Pgo^4-^W導(dǎo)入菌抹大腸桿菌MG1655Ptrcl6-go/x4，Aet^-e內(nèi)，Ag/d,Apj^iAp，尺將獲得的菌抹分別命名為大腸桿菌MG1655Ptrcl6-g"/v4，AedJ-e(^，Ag/a4，Ap_y￡4，Ap;^F，pME101VB01畫(huà)j^/2D-mgW-g/(^，pJB137-Pga/^-p/^4(菌抹1),大腸桿菌MG1655尸加/6-g—,Ae必-喊'Ag/a4,Ap;MApj^pME101VB01，/B-附g^-gW/tpJB137-Pg"/^-/^W(菌抹2)和大腸桿菌MG1655Ptrcl6-ga/W,Ae必-喊，Ag/W，Ap盧，Apy^;pME101VB01-—g風(fēng)pJB137-(菌抹3)。實(shí)施例3:能以高于1摩爾/摩爾葡萄糖的得率產(chǎn)生1，2-丙二醇的大腸桿菌MG1655Ptrcl6陽(yáng)ga;x4,Ae必e叔Ag7o力，Aa/W,Aa雄，A緣AA/^/7錢(qián)A(3(i/^,Aac^4-;to,A/oxB,A/_yL4，A/>^F(pME101VB01-j^/zD-mgs爿-g/(i^」，(pJB137-PgopJ-p/w^)、大腸桿菌MG1655Ptrcl6-gapj,Ae^/畫(huà)eda，Ag/a4，Aa/cL4'Aa/戲AW/l4,A/y/戲zW/iE，AacL4-/to,Apox6，Ap_y"Ap_yA:F(pME101VB01-_yq/S-wg^-g/^4人(pJB137-尸ga;^-p戸々和大腸桿菌MG1655Ptrcl6-ga/j，AefiW-e(ia，Ag7a4，Aa/ci4，Aa/諷A雄AAp^L46，A<a^￡,Aac/^-pto,Apox雙Apy/biA;;^F(pME101VB01-gW力，(pJB137腿戶(hù)ga/^-p戸J)修飾菌抹的構(gòu)建根據(jù)操作規(guī)程1，用表2中給出的寡核苷酸構(gòu)建菌抹MG1655A"/^4::km、MG1655Aa/必::cm、MG1655Ap/L4B::km、MG1655zW級(jí):cm、MG1655AacW-pto::cm,并根據(jù)操作規(guī)程2將這些缺失轉(zhuǎn)移至先前構(gòu)建的菌抹中。必要時(shí)，根據(jù)操作規(guī)程3消除抗生素抗性盒。根據(jù)操作規(guī)程1，用表2中給出的寡核苷酸，通過(guò)插入氯霉素抗生素抗性盒而使先前構(gòu)建的菌抹中的基因W/7v4和；o;c5失活。必要時(shí)，根據(jù)操作規(guī)程3消除抗生素抗性盒。在每個(gè)步驟，使用表3中給出的寡核苷酸檢查先前建立的所有缺失是否存在。將得到的菌抹命名為大腸桿菌MG1655Ptrcl6-gapj,Ae^/-e*，Ag/oJ,Aa/W，A"緣'AM^,A/^/7哉Afl^/z五，△acW-pto,ApoxS,Apy風(fēng)Ap^尺將不同的pME101VB01質(zhì)粒和pJB137-Pga/^-p;^導(dǎo)入菌株大腸桿菌MG1655Ptrcl6-ga盧，Ae必-喊，Ag/a4,Aa/刮，Aa/戲AAi/^4,ApyL4S'Aac/認(rèn),AacL4-pto,A/ox雙A;少A^，Ap;^尺將獲得的菌林分別命名為大腸桿菌MG1655Ptrcl6-g(apj，zWd-e*'A_g/o4，AaW4,A"/趙A/(i/2爿，A/yL4B,AW/iE'Aac^4-/to，A/xx/,A/少yb4，Apy^;pME101VB01-;^/zD-wg^4-g/a^,pJB137-Pga/^-;/w爿，大腸桿菌MG1655Ptrcl6陽(yáng)gfl/^4,Ae^/-efl^,Ag/a4，Aa/(i4,A"^^，AW/^,A//^B'Aa<i/z￡'Aac^4-pto,A/oxB,4P_yL4,A/;^fpME101VB01-;^/B-wg5爿-g/(iApJB137-Pga/^-p/wJ和大腸才干菌MG1655Ptrcl6-go^4,Ae^Z-o^,Ag/oiA<a/(i4，Aa/諷A綠J，A/yL4S,Aad/7五，AacL4-/to，A/oxS，ApyL4，Apy化pME101VB01-j^/z￡-mgs」-g/ci4，pJB137-Pga;^-p戸v4。實(shí)施例4:在需氧條件下不同菌抹的1，2-丙二醇生產(chǎn)的比較在需氧條件下，在錐形瓶實(shí)驗(yàn)中，在以葡萄糖作為碳源的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)如實(shí)施例2中所述獲得的菌林(菌抹1、2和3)和對(duì)照菌抹(對(duì)照1:MG1655pME101VB01-yqhD-mgsA-gldA，對(duì)照2:MG1655pMElOlVBOl-yaffl-mgsA-gldA，對(duì)照3:MG1655pME101VB01-yqhE-mgsA-gldA和對(duì)照4:MG1655Ptrcl6-gapA，Aedd-ed馬，AgloA,ApykA,ApykF)。在34。C或37。C進(jìn)行培養(yǎng)，并通過(guò)用MOPS緩沖培養(yǎng)基來(lái)保持pH。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，通過(guò)HPLC分析發(fā)酵液中的1，2-丙二醇、丙酮醇和殘余的葡萄糖，并計(jì)算1,2-丙二醇對(duì)葡萄糖的得率和l,2-丙二醇+丙酮醇對(duì)葡萄糖的得率。然后選擇最佳菌林用于發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)。菌抹1,2-丙二醇效價(jià)(g/1)丙酮醇效^介(g/1)1，2-丙二醇得率(g/g葡萄糖)1，2-丙二醇+丙酮醇得率(g/g葡萄糖)對(duì)照l(shuí)0.0200.0040細(xì)對(duì)照20000對(duì)照30.0100.0020.002對(duì)照40.050.3400.04菌林l2.251.400.140.23菌林21.641.310.100.18菌抹30.770.470.060.10實(shí)施例5:用最佳菌抹在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中產(chǎn)生1，2-丙二醇使用補(bǔ)料分批操作規(guī)程在21發(fā)酵罐中培養(yǎng)前面實(shí)驗(yàn)中選擇的最佳菌抹。將培養(yǎng)的溫度在37。C保持恒定，并使用NH4OH溶液將pH永久地調(diào)至6.5-8的值。在分批階段中，攪拌速率保持在200-300rpm，并在補(bǔ)料分批階段結(jié)束時(shí)，增加多至1000rpm。通過(guò)使用氣體控制器，將溶氧的濃度保持在30-40%飽和度的值。當(dāng)光密度達(dá)到三-五的值時(shí)，以0.3-0.5ml/h的初始流速開(kāi)始補(bǔ)料分批培養(yǎng)，并逐漸增加至2.5-3.5ml/h的流速值。在此時(shí)使流速保持恒定24至48小時(shí)。分批培養(yǎng)的培養(yǎng)基基于包含濃度為300-500g/1的葡萄糖的基本培養(yǎng)基。權(quán)利要求1.用于從碳源產(chǎn)生1，2-丙二醇的微生物，其中所述微生物的特征為-從磷酸二羥丙酮到1，2-丙二醇的生物合成途徑的活性提高，和-3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性削弱。2.根據(jù)權(quán)利要求l的微生物，其中所述微生物經(jīng)過(guò)遺傳修飾而增加從磷酸二羥丙酮到1,2-丙二醇的生物合成途徑中涉及的至少一種酶的活性。3.根據(jù)權(quán)利要求2的微生物，其中通過(guò)增加編碼所述酶的基因的表達(dá)而獲得至少一種酶的活性的增加。4.根據(jù)權(quán)利要求3的微生物，其中選自下組的至少一個(gè)基因的表達(dá)增力口mgsA、_yq/B、少eaE、_yg^Z、_y《/2E、_y《/zD、_y6//F、_ycJW、_yayO、_y^/G、_y<iZC、Za"g/WA和/"cO。5.根據(jù)權(quán)利要求4的微生物，其中三個(gè)基因m^A、；;一D、和gWA的表達(dá)增力口。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的微生物，其中Entner-Doudoroff途徑中涉及的至少一個(gè)酶的活性削弱。7.根據(jù)權(quán)利要求6的微生物，其中下述基因中至少一個(gè)的表達(dá)削弱e必、8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的微生物，其中丙酮醛到乳酸的轉(zhuǎn)化中涉及的至少一個(gè)酶的活性削弱。9.根據(jù)權(quán)利要求8的微生物，其中下述基因中至少一個(gè)的表達(dá)削弱g/oA、a/c/A、a/t/B。10.根據(jù)權(quán)利要求1至9的微生物，其中乳酸、曱酸或乙醇的合成中涉及的至少一個(gè)酶的活性削弱。11.根據(jù)權(quán)利要求IO的微生物，其中下述基因中至少一個(gè)的表達(dá)削弱雄A、p^7A、；y7B、a艦。12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)的微生物，其中乙酸合成中涉及的至少一個(gè)酶的活性削弱。13.根據(jù)權(quán)利要求12的微生物，其中下迷基因中至少一個(gè)的表達(dá)削弱14.根據(jù)權(quán)利要求1至13的微生物，其中糖輸入的效率增加。15.根據(jù)權(quán)利要求14的微生物，其中使用不依賴(lài)磷酸烯醇丙酮酸的糖輸入系統(tǒng)。16.根據(jù)權(quán)利要求15的微生物，其中選自ga/P和g汰的至少一種基因的表達(dá)增力口。17.根據(jù)權(quán)利要求14的微生物，其中通過(guò)增加代謝物'磷酸烯醇丙酮酸'的利用率而改進(jìn)糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的效率。18.權(quán)利要求17的微生物，其中至少一種丙酮酸激酶的活性削弱。19.根據(jù)權(quán)利要求18的微生物，其中選自pj^A和py好的至少一種基因的表達(dá)削弱。20.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的微生物，其中磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性增加。21.根據(jù)權(quán)利要求20的微生物，其中/戸A基因的表達(dá)增加。22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的微生物，其中利于丙酮酸代謝成為乙酰-CoA的酶對(duì)于NADH的抑制的敏感度低于未修飾的酶。23.根據(jù)權(quán)利要求22的微生物，其中/;%/基因具有引起丙氨酸55被繩氨酸取代的點(diǎn)突變。24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)的微生物，其中選自wrA和w//z的至少一種基因的表達(dá)削弱。25.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)的微生物，其中微生物選自下組細(xì)菌、酵母和真菌。26.根據(jù)權(quán)利要求25的微生物，其中微生物選自下組腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、芽孑包一干菌牙牛(Bacillaceae)、才復(fù)菌牙牛(Clostridiaceae)、4連霉菌牙牛(Streptomycetaceae)禾口一奉^]犬4干菌牙牛(Corynebacteriaceae)。27.根據(jù)權(quán)利要求26的微生物，其中微生物是大腸桿菌(Eyc/^r/c//"co//)或丙酉同丁醇才炎菌(C7o^nWwmacetoZw/^//cwm)。28.用于制備1，2-丙二醇的方法，其中根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)的微生物在包含碳源的合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且回收產(chǎn)生的1，2-丙二醇。29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中微生物是大腸桿菌，并且碳源是簡(jiǎn)單碳源。30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中微生物是丙酮丁醇梭菌，并且碳源是31.根據(jù)權(quán)利要求28至30中任一項(xiàng)的方法，其中將回收的1,2-丙二醇進(jìn)一步純化。全文摘要用于從碳源產(chǎn)生1，2-丙二醇的微生物，其中所述微生物的特征為從磷酸二羥丙酮到1，2-丙二醇的生物合成途徑的活性提高，和3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性削弱，本發(fā)明還涉及用根據(jù)本發(fā)明的微生物通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生1，2-丙二醇的方法。文檔編號(hào)C12N1/21GK101679940SQ200880017107公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年3月21日優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日發(fā)明者弗朗索瓦·沃爾克,菲利普·索凱勒,雷納·菲格申請(qǐng)人:代謝探索者公司